xây dựng quy trình tạo b cyclodextrin bằng phương pháp enzyme

i

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM
SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ



BÁO CÁO NGHIỆM THU
(Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu)

XÂY DỰNG QUY TRÌNH
TẠO β-CYCLODEXTRIN
BẰNG PHƢƠNG PHÁP ENZYM


CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI
(Ký tên)



CƠ QUAN QUẢN LÝ CƠ QUAN CHỦ TRÌ
(Ký tên/đóng dấu xác nhận) (Ký tên/đóng dấu xác nhận)






THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
THÁNG 12/ 2012

ii
TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
β-cyclodextrin (β-CD), oligosac
α-1-4 glycosid, đƣợc sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực
phẩm, dƣợc phẩm, mỹ phẩm và nông nghiệp. β-
enzym cyclodextrin glucanotransferase β-
- -
. Trong báo cáo này, chúng tôi nghiên cứu quy trình tạo β-
CD với CGTase (Toruzyme 3.0L) cố định trên các chất mang khác nhau nhƣ Al
2
O
3
,
Q-Sepharose, Purolite, Eupergit C, chitosan và alginat với cơ chất là tinh bột sắn và
dịch xử lý tinh bột sắn với Termamyl 120L. Kết quả cho thấy, quy trình tạo β-CD tối
ƣu với CGTase cố định trên alginat (33,16 U/g chất mang) là dịch xử lý tinh bột sắn
26% (từ tinh bột sắn 40%), thời gian 61 h, lƣợng enzym 2,91KU/L với hiệu suất
chuyển đổi là 34%, độ tinh khiết 98%. Sản phẩm β-CD thu đƣợc có độc tính cấp
>10.000 mg/ kg thể trọng chuật và đạt tiêu chuẩn dƣợc dụng.

iii
SUMMARY OF RESEARCH CONTENT
β- cyclodextrins, cyclic oligosaccharide composed of 7 α-1,4-linked glucose units, is
widely used in food, pharmaceutical, cosmetic, and agricultural industries. They are
produced by the catalytic action of cyclodextrin glucanotransferase. The enzyme
displays its cyclic action on substrates with α-1,4-glycosyl chain, such as starch,
amylose, amylopectin, dextrins, matodextrins, or glycogen. In this study, Conditions of
β-CD production from cassava starch and hydrolyzed cassava starch (with Termamyl
120L) with immobilized CGTase on different carriers such as Al

2
O
3
, Q-Sepharose,
Purolite, Eupergit C, chitosan và alginat were investigated. The result showed that the
optimal conditions of β-CD production on hydrolyzed starch with immobilized
CGTase on alginate (33.16 U/g carrier) were hyrolyzed starch 26% (from cassava
40%), reaction time 61h, enzym CGTase concentration 2,91 KU/L with convertion
yield to β-CD was 34% and β-CD purity was higher than 98%. And, acute toxicity of
β-CD product was higher than 10.000 mg/ kg body of mice and this product met
pharmaceutical standards.




iv
MỤC LỤC
TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ii
SUMMARY OF RESEARCH CONTENT iii
viii
DANH MỤC HÌNH ix
DANH MỤC BẢNG x
MỞ ĐẦU xii
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2
1.1. Cyclodextrin và sản xuất cyclodextrin 2
1.1.1. Lịch sử phát triển cyclodextrin 2
1.1.2. Cấu trúc của cyclodextrin 3
1.1.3. Tính chất 4
1.1.4. Độc tính của các CD 8

1.1.5. Ứng dụng 10
1.1.6. CGTase 12
13
: 14
1.1.9. Sản xuất CD 14
1.2. Enzym cố định 17
1.2.1. Khái niệm 17
1.2.2. Đặc điểm của enzym cố định 18
1.2.3. Phƣơng pháp cố định enzym 19
1.3. Tình hình nghiên cứu 22
1.3.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nƣớc: 22

v
1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc: 23
CHƢƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP 25
2.1. Cố định CGTase trên giá mang rắn 25
2.1.1. Mô tả nội dung: 25
2.1.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 25
2.1.3. Các chỉ tiêu theo dõi: 36
2.1.4. Sản phẩm nội dung cần đạt: 37
2.2. Thăm dò các thông số của phản ứng tạo β-CD 37
2.2.1. Mô tả nội dung: 37
2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 37
β-CD theo Kaneko 38
2.2.4. Các chỉ tiêu theo dõi 39
2.2.5. Sản phẩm nội dung cần đạt 39
2.3. Tối ƣu hóa quy trình tạo β-CD thô 39
2.3.1. Mô tả nội dung: 39
2.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 39
2.3.3. Các chỉ tiêu theo dõi 41

2.3.4. Sản phẩm nội dung cần đạt 42
2.4. Xây dựng quy trình tinh chế sản phẩm 42
2.4.1. Mô tả nội dung: 42
2.4.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 42
2.4.3. Các chỉ tiêu theo dõi 45
2.4.4. Sản phẩm nội dung cần đạt 45
2.5. Xây dựng quy trình thu hồi enzym và dung môi 45
2.5.1. Mô tả nội dung: 45
2.5.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 45

vi
2.5.3. Các chỉ tiêu theo dõi 46
2.5.4. Sản phẩm nội dung cần đạt 47
- 47
2.6.1. Mô tả nội dung: 47
2.6.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 47
2.6.3. Các chỉ tiêu theo dõi 47
2.6.4. Sản phẩm nội dung cần đạt 47
β-CD 48
2.7.1. Mô tả nội dung: 48
2.7.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 48
48
2.7.4. Sản phẩm nội dung cần đạt 48
2.8. Độc tính cấp của β–CD 48
2.8.1. Mô tả nội dung: 48
2.8.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 49
2.8.3. Các chỉ tiêu theo dõi 50
2.8.4. Sản phẩm nội dung cần đạt 50
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ 51
3.1. Cố định CGTase trên một số giá mang rắn 51

3.1.1. Xây dựng đƣờng chuẩn protein 51
3 3.0L 51
3.1.3. Cố định trên Al
2
O
3
52
3.1.4. Cố định trên Q-Sepharose 53
3.1.5. Cố định trên Purolite A100 55
3.1.6. Cố định trên Chitosan 57
3.1.7. Cố định trên Eupergit C 59

vii
3.1.8. Cố định trên Alginat 61
nghiên cứu 63
β-CD 65
65
3.2.2. Khảo sát lƣợng dung môi sử dụng 66
3.2.3. Khảo sát ảnh hƣởng của pH 67
3.2.4. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ: 67
3.3. Tối ƣu hóa quy trình tạo β-cyclodextrin 68
β- 68
β- 70
3.4. Xây dựng quy trình thu hồi enzym và dung môi 75
3.4.1. Quy trình thu hồi enzym 75
3.4.2. Quy trình thu hồi dung môi 79
3.5. Xây dựng quy trình tinh chế sản phẩm β-cyclodextrin 81
3.5.1. Nghiên cứu làm sạch sơ bộ cyclodextrin bằng than hoạt tính 81
β-CD 82
- 83

3.7. Tiêu 86
β-CD 87
β-CD 90
91
3.8. Độc tính cấp của β-CD 91
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 95
4.1. Kết luận 95
4.2. Đề nghị 96

viii
VIẾT TẮT
BSA : Bovine Serum Albumine
CD : Cyclodextrin
α-CD : α-Cyclodextrin
β-CD : β-Cyclodextrin
γ-CD : γ-Cyclodextrin
CGTase : Cyclodextrin glucanotransferase
2,3-DHP-β-CD : 2,3-dihydroxypropyl-β-Cyclodextrin
2-HE-β-CD : 2-hydroxyethyl-β-Cyclodextrin
2-HP-β-CD : 2-hydroxypropyl-β- Cyclodextrin
3-HE-β-CD : 3-hydroxypropyl-β- Cyclodextrin
Ac-β-CD : β- Cyclodextrin đƣợc acetyl hóa ngẫu nhiên
CME-β-CD : O-carboxymethyl-O-ethyl-β- Cyclodextrin
DE-β-CD : 2,6-di-O-ethyl-β-Cyclodextrin
DMA-β-CD : Per-2,6-di-O-methyl-β-Cyclodextrin
DM-β-CD : 2,6-di-O-methyl-β-Cyclodextrin
G
1
-β-CD : Glycosyl-β-Cyclodextrin
G

2
-β-CD : Maltosyl-β-Cyclodextrin
GUG-β-CD : Glucuronyl-glucosyl-β-Cyclodextrin
Me-β-CD : β-Cyclodextrin đƣợc methyl hóa ngẫu nhiên
SBE4-β-CD: : β-Cyclodextrin sulfobutylet, thế mức độ 4
SBE7-β-CD : β-Cyclodextrin sulfobutylet, thế mức độ 7
TA-β-CD : Per-2,3,6-tri-O-acyl-β-Cyclodextrin
TB-β-CD : Per-2,3,6-tri-O-butanoyl-β- Cyclodextrin
TE-β-CD : Per-2,3,6-tri-O-ethyl-β-Cyclodextrin
TM-β-CD : Per-2,3,6-tri-O-methyl-β-Cyclodextrin
TO-β-CD : Per-2,3,6-tri-O-octyl-β-Cyclodextrin
TV-β-CD : Per-2,3,6-tri-O-valeryl-β-Cyclodextrin
kl/ tt :
tt/ tt :
kl/ kl :
rpm : round per minute


ix
DANH MỤC HÌNH
1891. 2
Hình 1.2. Sự tƣơng quan giữa giá và sản lƣợng của β-CD 3
Hình 1.3. Cấu trúc phân tử của α-, β-, γ- cyclodextrin 3
β-Cyclodextrin. 4
Hình 1.5. 8
Hình 1.6. Sự thủy phân tinh bột bởi CGTase tạo cyclodextrin 13
Hình 1.7. β-CD sau khi thu nhận và kết tinh 24
Hình 2.1. Quy trình cố định CGTase trên Al
2
O

3
30
Hình 2.2. Quy trình cố định CG Tase lên Q-Sepharose 31
Hình 2.3. Quy trình cố định CGTase trên Purolite A100 31
Hình 2.4. Quy trình cố định CGTase trên chitosan 34
Hình 2.5. Quy trình cố định CGTase trên alginat 36
-Behnken 40
Hình 3.1. . 51
Hình 3.2. β-CD. 52
- ) CGTase 54
Hình 3.4. Chitosa ) CGTase 58
) CGTase 60
Hìn 62
Hình 3.7. Hiệu suất chuyển đổi β-CD từ các loại tinh bột 65
Hình 3.8. 66
Hình 3.9. Ảnh hƣởng của pH đến quá trình sản xuất β-CD 67
β-CD 69
- 72
Hình 3.12. Tƣơng tá β-
CD 73
Hình 3.13. Hiệu suất chuyển đổi β-CD từ tinh bột với enzym tự do và cố định 76
Hình 3.14. Hiệu suất sản xuất β- 78
- 84
- 3L 86
Hình 3.17. Hình ảnh nội tạng chuột 93


x
DANH MỤC BẢNG
. 5

. 5
Bảng 1.3. Các CD thƣờng sử dụng trong bào chế 6
Bảng 1.4. Dƣợc động học, độc tính cấp của các CD trên chuột 10
Bảng 1.5. Một số CD đƣợc dùng tăng độ ổn định của hoạt chất 10
Bảng 1.6. Một số CD cải thiện độ tan và độ hòa tan 11
13
Bảng 1.8. Tỉ lệ % kết tủa của các CD với dung môi 16
Bảng 2.1. Giai mẫu protein cho đƣờng chuẩn 26
Bảng 2.2. Giai mẫu xây dựng đƣờng chuẩn. 27
Bảng 2.3. Cách pha mẫu để xác định hoạt tính enzym 27
Bảng 2.4. Thiết kế thí nghiệm đáp ứng bề mặt (RSM) từ phần mềm DX V7.1 40
Bảng 2.5. Liều thử nghiệm LD
50
50
51
Bảng 3.2. Nồng độ ẩm enzym ban đầu 51
β-CD. 52
Bảng 3.4. 52
Bảng 3.5. Hiệu suất protein cố định theo pH 52
-Sepharose 53
trên Q-Sepharose 54
Bảng 3.8. Khả năng tái sử dụng của CGTase cố định trên Q-Sepharose 54
Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của pH lên quá trình cố định CGTase trên Purolite 55
Bảng 3.10. 55
Bảng 3.11. Ảnh hƣ 56
Bảng 3.12. Khả năng tái sử dụng của CGTase cố định trên Purolite A100 56
57
Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của pH cố định enzym CGTase trên chitosan 57
58
Bảng 3.16. Khả năng tái sử dụng của CGTase cố định trên chitosan 58

59
Bảng 3.18. Ảnh hƣởng của pH cố định enzym CGTase trên Eupergit C 59
60
Bảng 3.20. Khả năng tái sử dụng của CGTase cố định trên Eupergit C 61
2
61
62
63
Bảng 3.24. Khả năng tái sử dụng của CGTase cố định trên alginat 63

xi
64
Bảng 3.26. Kết quả sản xuất β-CD từ các loại tinh bột 65
β- 66
Bảng 3.28. Ảnh hƣởng của pH đến quá trình sản xuất β-CD 67
Bảng 3.29. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến quá trình sản xuất β-CD 67
Bản β- 68
Bảng 3.31. Kết quả đánh giá độ tƣơng thích của mô hình 70
Bảng 70
Bảng 3.33. ịch tinh bộ 71
Bả ủa dịch tinh bộ 71
72
- 74
- 74
- 75
β- nh trên các chất mang 76
β- 77
β-CD 78
β- 79
Bảng 3.43. Thu hồi dung môi sau phản ứng 80

Bảng 3.44. Sản xuất β-CD sử dụng dung môi thu hồi 80
Bảng 3.45. Ảnh hƣởng của tỉ lệ than hoạt tính Z1 đến màu của dịch 81
- 82
Bảng 3.47. Ảnh hƣởng của thời gian tới quá trình kết tinh -CD 25
o
C 82
- 83
- 86
Bảng 3.50. Kết quả thử nghiệm độc tính cấp β-CD 92
Bảng 3.51. Cân nặng cơ thể chuột của liều thử nghiệm cao nhất 93


xii
MỞ ĐẦU
Tên đề tài: XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO β –CYCLODEXTRIN BẰNG PHƢƠNG
PHÁP ENZYM
Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. Trần Cát Đông
Cơ quan chủ trì: Trung tâm Khoa Học Công nghệ Dƣợc Sài Gòn
Thời gian thực hiện đề tài: 12/2010 đến 10/2012
Kinh phí đƣợc duyệt: 550 triệu đồng
Kinh phí đã cấp:
1:300 triệu đồng theo TB số: 226/TB-SKHCN ngày 26/11/2010
2: 195.000.000 đồng. Theo TB số: 61 /TB-SKHCN ngày 11/06/2012
Mục tiêu:
Mục tiêu tổng quát: Xây dựng quy trình tạo β-cyclodextrin ở quy mô pilot.
Mục tiêu cụ thể:
- Xây dựng quy trình cố định enzym CGTase
- Xây dựng quy trình tạo β-CD với enzym tự do
- Xây dựng quy trình tạo β-CD với enzym cố định
Nội dung:

- Cố định cyclomaltodextrin glucanotransferase trên giá mang rắn
- Thăm dò các thông số của phản ứng tạo β-CD
- Tối ƣu hóa quy trình tạo β-CD
- Xây dựng quy trình tách và tinh chế sản phẩm
- Xây dựng quy trình thu hồi dung môi
- Xây dựng quy trình tạo β-CD thành phẩm
- Xây dựng tiêu chuẩn và phƣơng pháp kiểm định sản phẩm
- Thử nghiệm độc tính cấp

xiii
Những nội dung thực hiện (đối chiếu với hợp đồng đã ký)


Cố định CGTase trên giá mang rắn
- Xác định các thông số cần tối ƣu
hóa cho qui trình cố định CGTase:
vật liệu cố định, cỡ hạt, điều kiện
phản ứng cố định
- Chế phẩm CGTase đã cố định
- Cố định CGTase trên Alginat, Purolite A100,
Chitosan.
-
mang.
Thăm dò các thông số của phản ứng tạo β-CD
Xác định các điều kiện và thông số
nhƣ: nhiệt độ, pH, loại tinh bột, lựa
chọn dung môi và tỷ lệ dung môi
- Cơ chất thích hợp là tinh bột sắn mì
- Dung môi cyclohexan, tỷ lệ 30 ml/100 ml
dung dịch phản ứng

- pH 7
- Nhiệt độ tối ƣu cho sản xuất là 25oC
Tối ƣu hóa qui trình tạo β-
Xác định các thông số: nồng độ tinh
bột, tỷ lệ cơ chất-enzym và thời gian
phản ứng để cho hiệu suất chuyển
hóa β-cyclodextrin cao nhất
- Nồng độ tinh bột sắn: 7,3%
- Enzym CGTase : 1,08 KU/L
- Thời gian phản ứng: 5 ngày (120 giờ)
- :43,97%
Tối ƣu hóa qui trình tạo β- 15
Xác định các thông số: nồng độ tinh
bột, tỷ lệ cơ chất-enzym và thời gian
phản ứng để cho hiệu suất chuyển
hóa β-cyclodextrin cao nhất
- =15: 26%.
- Enzym CGTase: 2,91 KU/L
- Thời gian phản ứng: 61giờ.
- : 51%.
Xây dựng qui trình tách và tinh chế sản phẩm β-CD
Sản phẩm β-cyclodextrin tinh chế đạt
tiêu chuẩn dƣợc dụng
.

xiv


β- > 98%
Xây dựng qui trình thu hồi enzym và dung môi

Hiệu suất thu hồi enzym > 75%
Hiệu suất thu hồi dung môi > 75%
-
Lƣợng dung môi
thu hồi đƣợc lớn hơn 85% so với lƣợng dung
môi sử dụng ban đầu.
Xây dựng qui trình tạo β-CD thành phẩm
sử dụng của CGTase theo
phƣơng pháp chuyển hóa gián đoạn
( 5 lần), hiệu suất thu hồi sản phẩm
( 30%)
-
98%
Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và phƣơng pháp kiểm định
Độ tinh khiết 98%, độ ẩm 15%,
đƣờng khử 0,2%.Chỉ tiêu VSV:
tổng số VK hiếu khí 103/g, không
có Salmonella và E. coli
Độ tinh khiết 98%, độ ẩm 15%, đƣờng khử
<0,2%.
Chỉ tiêu VSV: tổng số VK hiếu khí 84/g,
không có Salmonella và E. coli
Thử nghiệm độc tính cấp
Báo cáo độc tính cấp
β-CD > 10000 mg/kg
Bài báo
2 Bài báo


xv

Sản phẩm của đề tài
TT
Tên sản phẩm
Yêu cầu khoa học, kinh tế
1.
Báo cáo khoa học về kết
quả nghiên cứu

CD, Tài liệu
2.
Qui trình cố định CGTase
Sơ đồ quy trình, các thông số công nghệ của
từng công đoạn, năng suất quy trình (>100 g),
hiệu suất cố định protein ( 50%), hiệu suất
thu hồi hoạt tính enzym ( 25%), giá thành sản
phẩm CGTase đã cố định
3.
Chế phẩm CGTase cố
định
Các tính chất của chế phẩm, điều kiện và thời
gian bảo quản. Có thể tái sử dụng 5 lần.
4.
Qui trình thu hồi enzym
và dung môi
Sơ đồ quy trình, các thông số kỹ thuật, năng
suất ( 0,5 kg/mẻ).
Hiệu suất thu hồi enzym > 75%
Hiệu suất thu hồi dung môi > 75%
5.
Qui trình tạo

β-cyclodextrin
Sơ đồ quy trình, các thông số kỹ thuật, năng
suất ( 0,5 kg/mẻ), số lần tái sử dụng của
CGTase theo phƣơng pháp chuyển hóa gián
đoạn ( 10 lần), hiệu suất thu hồi sản phẩm
( 80%), giá thành.
6.
β-cyclodextrin
Độ tinh khiết 98%, độ ẩm 15%, đƣờng khử
0,2%, tổng số vi khuẩn hiếu khí 10
3
/g,
không có Salmonella và E. coli
Đạt tiêu chuẩn dƣợc dụng
7.
Tiêu chuẩn cơ sở β-
cyclodextrin
Qui trình và phƣơng pháp kiểm định có thể
thực hiện đƣợc trong nƣớc
8.
Bài báo khoa học
2 bài báo


1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Cyclodextrins (CD) là các oligosaccharide dạng vòng, không khử, chúng có nhiều
ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, dƣợc phẩm và hóa học. Trên thế giới, CD đã
đƣợc ứng dụng từ rất lâu và trong nhiều lĩnh vực do cấu trúc đặc biệt của chúng. Trong
công nghiệp thực phẩm CD đƣợc dùng để che giấu mùi, vị khó chịu, để ổn định và bảo

vệ các thành phần chức năng nhƣ acid amin, vitamin trong thực phẩm, làm phụ gia
độn, tạo độ nhớt,… Trong mỹ phẩm chúng đƣợc dùng để tạo ra các dạng hƣơng liệu,
nƣớc hoa có mùi bền. Trong công nghiệp hóa CD đƣợc ứng dụng trong việc tách chiết
các đồng phân quang học, làm cột sắc ký hay giá mang của phản ứng. Đối với ngành
dƣợc CD là một tá dƣợc quan trọng giúp tăng độ tan của các dƣợc chất không tan
trong nƣớc, giúp tăng độ hấp thu và sinh khả dụng hoặc kiểm soát tốc độ phóng thích
thuốc, ngoài ra nó còn giúp che dấu mùi, vị khó chịu của nhiều hoạt chất. [7, 48]
Tuy nhiên, tá dƣợc này rất đắt tiền và hiện nay phải nhập ngoại hoàn toàn. Việc sản
xuất đƣợc β-cyclodextrin trong nƣớc sẽ giúp tự chủ đƣợc nguồn nguyên liệu làm thuốc
và tạo điều kiện để công nghiệp dƣợc phẩm trong nƣớc ứng dụng bào chế các chế
phẩm có chất lƣợng cao, cạnh tranh đƣợc với các sản phẩm ngoại nhập. Mặt khác
nguyên liệu để sản xuất β-cyclodextrin từ tinh bột giúp tạo ra giá trị gia tăng mới cho
tinh bột, qua đó thúc đẩy sự phát triển ngành công nghiệp chế biến nông sản.
Hiện nay, CD đƣợc sản xuất bằng cách chuyển hóa tinh bột với enzym
cyclodextrin glucanotransferase (CGTase) làm xúc tác. Việc sản xuất CD theo phƣơng
pháp cổ điển là sử dụng enzym ở dạng tự do làm cho sản phẩm thu đƣợc không đƣợc
tinh khiết do chúng bị lẫn enzym, đồng thời chi phí cho việc sản xuất CD cao. Vì vậy,
việc sử dụng enzym cố định là cần thiết để thu đƣợc CD tinh khiết hơn và tiết kiệm chi
phí sản xuất do enzym có thể tái sử dụng đƣợc nhiều lần. [6, 10]
Từ những lý do thực tiễn trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Xây dựng quy
trình sản xuất β-cyclodextrin bằng phƣơng pháp enzym” nhằm khảo sát một số
chất mang sử dụng để cố định enzym, nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất và xác
định các thông số tối ƣu cho quá trình sản xuất để thu đƣợc sản phẩm β-cyclodextrin
đạt tiêu chuẩn dƣợc dụng.

2
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Cyclodextrin và sản xuất cyclodextrin
1.1.1. Lịch sử phát triển cyclodextrin
Năm 1891, Villier và cộng sự quan sát thấy sự hình thành của một số chất tinh

thể không xác định ở quá trình lên men tinh bột và giả định rằng chất này là một loại
cellulose, đặt tên là "cellulosine". Khoảng 15 năm sau, Schardinger
Bacillus macerans - vi khuẩn này tạo ra hai chất kết tinh riêng biệt khi nuôi cấy
đặt tên α-dextrin β-dextrin.

Tng số ấn bản liên quan
Các giai đoạn phát triển của cyclodextrin

Hình 1.1. 1891.
30, Freudenberg và cộng sự -
α- -
1 lần. Năm
1973 giá của 1 kg β-
. Hiện nay, tổng sản lƣợng c β-
.

3

Giá của β- CD
(USD/ kg)
Sản lƣợng (tấn/ năm)


Hình 1.2. Sự tƣơng quan giữa giá và sản lƣợng của β-CD
Các α-CD và γ-CD, cũng nhƣ một số dẫn xuất (hydroxypropyl-β-CD và γ-CD,
methyl hóa ngẫ - β-CD, maltosyl-β-CD…) đƣợc sản xuất trong
1- /
, trong chẩn đ
, chất xúc tác… [37, 48]
1.1.2. Cấu trúc của cyclodextrin

Cyclodextrin có nhiều tên gọi khác nhau nhƣ oligosaccharid vòng, cycloamylose,
glucan vòng, Schardinger dextrin. CD là một nhóm các sản phẩm có liên quan về mặt
cấu trúc đƣợc tạo nên trong quá trình tiêu hủy cellulose của các loại vi khuẩn.
1.1.2.1. :
Cyclodextrin là các oligosaccharid vòng có số đơn vị D-glucose xác định nối với
nhau qua liên kết α-
lodextrin glucanotransferase (CGTase).
Tùy thuộc vào số đơn vị glucose tạo thành mà đƣờng kính các vòng khác nhau. Dạng
phổ biến của các CD trong tự nhiên là α-CD, β-CD, γ-CD chứa lần lƣợt 6, 7 và 8 phân
tử D-(+)-glucopyranose nối với nhau qua liên kết α-1,4 glycosid.

Đơn vị D-glucopyranosid
Liên kết 1, 4-Glycosid
α-Cyclodextrin
β-Cyclodextrin
γ-Cyclodextrin

Hình 1.3. Cấu trúc phân tử của α-, β-, γ- cyclodextrin

4
1.1.2.2.

4
C
1
của các đơn vị glucopyranose, các nhóm hydroxy
bậc nhất đều hƣớng ra bên ngoài mạch vòng. K ra bởi các nguyên tử
hydro và cầu glycosid-oxy tƣơng ứng .
-
- -

- - -
h thành , do đó β-CD
cấu trúc khá cứng. là không đầy đủ trong các phân tử α-CD,
bởi vì một đơn vị . Do đó, thay vì sáu ,
chỉ có bốn có thể đƣợc thành lập cùng một lúc, nhóm hydroxy
có thể tƣơng tác với nƣớc, cung cấp khả năng hòa tan lớn hơn. γ- cấu
trúc linh hoạt hơn, không đồng phẳng, nên tan nhiều . [37, 43, 48]






Nhóm hydroxy sơ cấp
Lõi kỵ nƣớc
Vỏ ngoài thân nƣớc
Mặt cắt ngang của một đơn vị đƣờng
Nhóm hydroxy thứ cấp

Hình 1.4 3 ch β-Cyclodextrin.
1.1.3. Tính chất
1.1.3.1.

CD tan đƣợc trong nƣớc và không tan trong hầu hết các dung môi hữu cơ nhƣ: alcol,
ceton, ether, các hydrocacbon thơm và béo… tăng khi nhiệt độ
tăng. β-CD tan trong nƣớc ít nhất, γ- . liên
k
.

5

Cyclodextrin là các oligosaccharid vòng không có tính khử. Bằng cách oxy hóa
để tách lần lƣợt các glucose trong vòng ngƣời ta không thu đƣợc acid formic hay
formaldehyd. Các CD rất bền và dễ tan trong dung dịch kiềm. Dƣới khí quyển nitơ,
các CD bền tới 250
o
C.
Bảng 1.1. .
Dung môi
(%)
Dung môi
(%)
Dimethylsulfoxid
41
Tetrahydrofural
0
Dimethylformamid
28,3
Methyl isopropyl keton
0
N -Methylpyrrolidon
14,8
Aceton
0
Ethylen glycol
7,0
Alcohol
0
Cyclodextrin bị thủy phân bởi axid
-
- - -

- -
- : γ-CD
> β-CD > α-CD. [40, 55].
Bảng 1.2. .

α-CD
β-CD
γ-CD
Công thức
C
36
H
60
O
30

C
42
H
70
O
35

C
48
H
80
O
40

Khối lƣợng phân tử
972,85
1135,00
1297,14
Độ tan (25
0
C, g/ 100ml H
2
O)
14,5
1,85
23,2
Độ ẩm (%)
10,2
13-15
8-18
[α].
D
20

+150,5
+162,0
+177,4
Điểm chảy (
0
C)
250-260
255-265
240-245
pKa 25

0
C
12,331
12,202
12,081

6
1.1.3.2. Một số dẫn chất của cyclodextrin
Trong các CD, mỗi đơn vị glucopyranose có ba
(pH,
nhiệt độ, thuốc thử). Ở β-CD, 21 nhóm hydroxy có
-
- - - - -
- .
:
- (và phức của nó).
-
.
- .
- -
ký.
Trong sản xuất công nghiệp thƣờng sử dụng các dẫn xuất β-
β-CD đặc biệt - heptakis (2,6-di- - - -
.
Các dẫn xuất CD đƣợc quan tâm trong lĩnh vực bào chế bao gồm các dẫn xuất
hydroxypropyl của β-CD và γ-CD, β-CD đƣợc methyl hóa ngẫu nhiên, sulfobutylete β-
CD và các CD phân nhánh chẳng hạn glucosyl-β-CD. [37, 48, 52]
Bảng 1.3. Các CD thƣờng sử dụng trong bào chế
Dẫn chất
Đặc điểm

Ứng dụng (theo dạng phân
liều)
Các dẫn chất thân nƣớc
β-CD methyl hóa
Me-β-CD
Tan trong nƣớc lạnh và trong
dung môi hữu cơ.
Thuốc uống, qua da, niêm mạc
DM-β-CD
Thuốc tiêm, uống, niêm mạc
DMA-β-CD
Tan trong nƣớc, tiêu huyết thấp
Thuốc tiêm, uống, niêm mạc

7
Dẫn chất
Đặc điểm
Ứng dụng (theo dạng phân
liều)
β-CD hydroxyalkyl hóa
2-HE-β-CD
Hỗn hợp vô định hình với
nhiều mức độ thế khác nhau
Thuốc tiêm, uống, niêm mạc
2-HP-β-CD
3-HE-β-CD
Tan nhiều trong nƣớc (>50%)
2,3-DHP-β-CD
Độc tính thấp
β-CD phân nhánh

G
1
-β-CD
Tan nhiều trong nƣớc (>50%)
Độc tính thấp
Thuốc tiêm, uống, niêm mạc
G
2
-β-CD
GUG-β-CD
Các dẫn chất thân dầu
β-CD alkyl hóa
DE-β-CD
Không tan trong nƣớc, tan
trong dung môi hữu cơ, chất
diện hoạt
Đƣờng uống, tiêm dƣới da
(phóng thích chậm)
TE-β-CD
β-CD acyl hóa
TA-β-CD
Không tan trong nƣớc, tan
trong dung môi hữu cơ
Đƣờng uống, thuốc tiêm (phóng
thích chậm)
TB-β-CD
Có tính bám dính niêm mạc
TV-β-CD
Có thể tạo phim
Các dẫn chất có thể ion hóa

Các β-CD anion
CME-β-CD
pK
a
= 3-4, có thể tan ở pH > 4
Đƣờng uống, qua da hay niêm
mạc (phóng thích trễ)
β-CD-sulfat
pK
a
> 1, tan trong nƣớc
Đƣờng uống, niêm mạc
SBE4-β-CD
Tan trong nƣớc
Thuốc tiêm, uống
SBE7-β-CD
Al-β-CD sulfat
1.1.3.3. (host-
guest):
Năm 1894, Emil Fisher đề xuất nguyên lý ổ khóa chìa khóa cho tƣơng tác của
enzym với cơ chất. Nguyên lý này khai sinh ra -guest là nền tảng cho hóa
học đại phân tử. Các phân tử host trong tự nhiên đƣợc phát hiện nhƣ cyclic
oligosaccharid cyclodextrin và cyclic oligopeptid valinomycin.
Host là nhiều

8
phức. Trong đó phân tử có kích thƣớc lớn hơn chứa các phân tử có kích thƣớc
gọi là chủ thể và phân tử . Đại phân tử tạo thành
do sự kết hợp giữa host-gues .
Đặc tính chú ý nhất của CD là khả năng tạo đƣợc phức vùi rắn với nhiều chất

ở dạng rắn, lỏng và khí. Trong quá trình tạo phức, không có bất kỳ liên kết đồng hóa
trị hoặc liên kết ion thành. Trong dung dịch, sự hình thành hay phân ly phức
là một quá trình cân bằng động học. .
một phân tử lạ với các CD chính là cấ
. Kích thƣớc, cấu trúc phải phù hợp với đƣờng kính của
khoang, trong đó đƣờng kính đƣợc quyết định bởi số đơn vị glucose có trong
vòng. Các phân tử lạ sẽ đƣợc giữ lại trong khoang của các CD. Khoang này có tính
thân dầu, nó tạo ra một vi môi trƣờng trong đó phần không phân cực của chất có kích
thƣớc thích hợp có thể đi vào để hình thành ra phức . Với những phân tử lớn hơn
thì chỉ có một phần phân tử đi vào đƣợc trong khoang.
Động lực chính cho việc tạo phức này là lực Van der Waals, các tƣơng tác k nƣớc,
sự thay đổi năng lƣợng solvat hóa của cả hai thành phần và có liên quan đến
các liên kết hydro. Sự ổn định của phức phụ thuộc vào đặc tính kị nƣớc của phân tử lạ.
Các phân tử phân cực mạnh tạo thành phức yếu. [40]


CD
Phân tử
Phân tử -
CD

Hình 1.5.
1.1.4. Độc tính của các CD
Các CD có khối lƣợng phân tử trung bình từ 1000-2000 Da và thân nƣớc thông qua
các liên kết hydro và hầu nhƣ không đƣợc hấp thu qua đƣờng tiêu hóa. Các α-CD và β-
CD không bị thủy phân bởi men amylase nƣớc bọt và tuyến tụy (khác với -CD).
Việc dùng α-CD đƣờng uống không gây ra tác dụng phụ bất lợi đáng kể nào, chỉ có
các phân đoạn nhỏ của α-CD đƣợc hấp thu qua đƣờng tiêu hóa và bài tiết dạng nguyên
vẹn qua nƣớc tiểu khi dùng đƣờng tiêm tĩnh mạch.

9
β-CD đƣợc dùng ở nhiều dạng bào chế dùng đƣờng uống, thuốc đặt. β-CD không
dùng đƣờng ngoài ruột do độ hòa tan kém và những độc tính trên thận nhƣng sẽ không
gây tác dụng phụ nếu dùng đƣờng uống. Sau khi uống, nồng độ không gây tác dụng
độc hại β-CD đƣợc xác định là 0,7-0,8 g/kg/ngày ở chuột và khoảng 2 g/kg/ngày ở
chó.
Quá trình chuyển hóa của γ-CD giống nhƣ tinh bột và dextrin. Chỉ có lƣợng rất nhỏ
γ-CD đƣợc hấp thu theo đƣờng tiêu hóa và chủ yếu bài tiết dạng không thay đổi qua
nƣớc tiểu sau khi tiêm tĩnh mạch. Sử dụng 8 g γ-CD hoặc maltodextrin đƣờng uống
không cho thấy bất kỳ sự khác biệt về dung nạp đƣờng tiêu hóa của hai oligosaccharid
này.
Các CD thân nƣớc nhƣ HP-β-CD và SBE-β-CD, đƣợc coi nhƣ không độc hại ở mức
thấp đến trung bình khi dùng liều uống và tiêm tĩnh mạch. HP-β-CD tan nhiều trong
nƣớc hơn β-CD nên ít độc tính hơn. HP-β-CD có thể đƣợc tìm thấy trong các công
thức một số loại thuốc dùng đƣờng uống trên thị trƣờng, với liều dùng đƣờng uống lên
đến 8 g/ngày và tiêm tĩnh mạch liều đến 16 g/ngày (itraconazole).
Các công bố về khả năng gây độc tính của SBE-β-CD còn rất ít, nhƣng dung dịch
voriconazole 10 mg/ml (Vfend
®
) đƣợc bán trên thị trƣờng có chứa 16% SBE-β-CD
(kl/tt).
Các thông tin về độc tính trên G
2-
β-CD và HP-γ-CD có rất ít. G
2
-β-CD là chƣa có
trong một sản phẩm nào trên thị trƣờng nhƣng HP-γ-CD đƣợc tìm thấy trong hai sản
phẩm, một thuốc nhỏ mắt và một sản phẩm chẩn đoán.
Các CD thân dầu nhƣ các CD đƣợc methyl hóa đƣợc hấp thu nhiều hơn do đó ghi
nhận đƣợc nhiều tác dụng phụ hơn khi dùng đƣờng uống, và việc sử dụng các dẫn xuất

này cũng hạn chế. Tác dụng tán huyết của CD methyl hóa trên hồng cầu của ngƣời
trong đệm phosphat theo thứ tự: β-CD > HP-β-CD ≈ G
2
-β-CD > α-CD > γ-CD > HP-γ-
CD > SBE-β-CD. Ở ngƣời, sự dung nạp các CD tự nhiên và RM-β-CD đƣợc chấp
nhận là 1,4 g với α-CD, 0,35 g với β-CD, 10 g với γ-CD và 0,07 g với Me-β-CD. [19]

10
Bảng 1.4. Dƣợc động học, độc tính cấp của các CD trên chuột
Loại CD
Dƣợc động học trên chuột
Độc tính cấp, LD
50

trên chuột (g/kg)
T
1/2
IV
(phút)
Tỉ lệ bài tiết
nguyên vẹn qua
đƣờng tiểu
Hấp thu qua
đƣờng uống
IV
Đƣờng
uống
α-CD
25
~ 90%

2 - 3%
0,5 - 0,8
> 10
β-CD
20
~ 90%
1 - 2%
1
19
HP-β-CD
20
~ 90%
≤ 3%
10
> 2
SBE-β-CD



> 15
> 10
Me-β-CD
18
> 95%
0,5 - 12%
1,5 - 2,1
> 8
G
2
-β-CD

23


> 5

γ-CD
20
90%
< 0,02%
4
> 8
HP-γ-CD



> 2

1.1.5. Ứng dụng
1.1.5.1. Dƣợc phẩm
Đa số các dƣợc chất tan trong nƣớc thƣờng đƣợc kết hợp với các dung môi hữu
cơ, chất diện hoạt và điều kiện pH… để cải thiện độ tan, tuy nhiên các yếu tố này
thƣờng gây kích ứng hoặc các phản ứng bất lợi khác. Trong khi các CD rất hiệu quả
trong việc tăng độ tan biểu kiến và/hoặc tăng tốc độ hòa tan của hoạt chất, thông qua
cơ chế tạo phức vùi. thuốc đi vào khoang kỵ nƣớc
đó tránh cho thuốc tiếp xúc với nƣớc, giúp tăng độ ổn định và cũng nhƣ tính tan trong
nƣớc. Do đó, các CD đóng vai trò quan trọng công thức bào chế các hoạt chất kém tan
trong nƣớc. [7]
Bảng 1.5. Một số CD đƣợc dùng tăng độ n định của hoạt chất
Tác dụng
Hoạt chất

Loại CD
Tăng độ ổn định với ánh sáng
Promethazine
Flutamid
HP-β-CD, DM-β-CD
β-CD
Tăng hạn dùng đến 4 năm
Glibenclamide
β-CD
Tăng độ ổn định với nhiệt
Natri diclofenac
β-CD
Giảm sự thủy phân
Ganciclovir, Rutin
Paclitaxel
HP-β-CD
γ-CD, HP-γ-CD, HP-β-CD
Giảm sự acyl hóa và sự phân hủy
Spiranolacton
SBE-α-CD, β-CD, HP-β-
CD, SBE-β-CD, γ-CD,
Giảm sự thủy phân bởi acid và
phân hủy bởi ánh sáng
Doxorubicin
HP-β-CD, HP-γ-CD
Ức chế phản ứng đóng vòng
Quynaril
β-CD, HP-β-CD