NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME TIÊU HÓA TỪ NỘI TẠNG CÁ TRA

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA



VƯƠNG BẢO THY



NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME TIÊU HÓA
TỪ NỘI TẠNG CÁ TRA
(PANGASIUS HYPOPHTHALMUS)


Chuyên ngành: Chế Biến Thực Phẩm và Đồ Uống
Mã số: 62540201


TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ KỸ THUẬT



Tp. Hồ Chí Minh, 2014
Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa
– ĐHQG-HCM


Người hướng dẫn khoa học 1: TS. TRẦN BÍCH LAM
Người hướng dẫn khoa học 2: GS.TSKH.VS. LƯU DUẨN

Phản biện độc lập 1: GS. TS. ĐẶNG THỊ THU
Phản biện độc lập 2: PGS. TS. TRANG SỸ TRUNG

Phản biện 1: GS. TS. TRẦN THỊ LUYẾN
Phản biện 2: PGS. TS. ĐỒNG THỊ THANH THU
Phản biện 3: PGS. TS. LÊ VĂN VIỆT MẪN


Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án họp tại
………………………………………………………………
………………………………………………………………
Vào lúc giờ ngày tháng năm 2014



Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
- Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp.HCM
- Thư viện Trường Đại học Bách Khoa –ĐHQG-HCM
DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ
[1]. Vương Bảo Thy, Trần Bích Lam, Lưu Duẩn. “Preparation, purification
and properties of lipase from hepatopancreas of Tra (Pangasius
hypophthalmus) catfish”, Tạp chí phát triển Khoa Học và Công Nghệ,
NXB Đại Học Quốc Gia TP.HCM, tập 14, K3, trang 5-11, 2011
[2]. Vương Bảo Thy, Trần Bích Lam, Lưu Duẩn. “Properties of digestive
enzymes from visceral organs of Tra (Pangasius hypophthalmus)
catfish”, Tạp chí phát triển Khoa Học và Công Nghệ, NXB Đại Học Quốc
Gia TP.HCM, tập 14, K4, trang 34-43, 2011
[3]. Vương Bảo Thy, Trần Bích Lam, Lưu Duẩn. “Purification and
characterization of proteases from hepatopancreas of Tra (Pangasius

hypophthalmus) catfish”, Tạp chí Khoa Học và Công Nghệ, Bộ Khoa Học
và Công Nghệ, tập 49, 5A, trang 290-297, 2011
[4]. Vương Bảo Thy, Trần Bích Lam, Lưu Duẩn. “Thông số động học và tính
chất của protease tinh sạch từ gan tụy cá Tra (Pangasius
hypophthalmus)”, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, Bộ Nông
nghiệp và phát triển nông thôn, kỳ 1 tháng 12/2013, trang 60-63, 2013
[5]. Vương Bảo Thy, Trần Bích Lam, Lưu Duẩn. “Tính chất động học và đặc
điểm thủy phân của lipase tinh sạch từ gan tụy cá Tra (Pangasius
hypophthalmus)”, Tạp chí phát triển Khoa Học và Công Nghệ, NXB Đại
Học Quốc Gia TP.HCM, tập 16, K4, trang 85-91, 2013
[6]. Vương Bảo Thy, Trần Bích Lam, Lưu Duẩn. “Nghiên cứu tách lấy
pancreatin từ gan tụy cá Tra (Pangasius hypophthalmus)”, Tạp chí
Phân tích Hóa Lý và Sinh học, Hội Khoa học Kỹ thuật Phân tích Hoá lý và
Sinh học VN, tập 18 (4), trang 178-186, 2013
[7]. Vương Bảo Thy, Phan Trung Thành, Trần Bích Lam, Lưu Duẩn. “Nghiên
cứu thu nhận enzym lipase từ gan tụy cá Tra (Pangasius
hypophthalmus) bằng phương pháp lọc màng membrane”, Tạp chí
Khoa Học và Công Nghệ, Bộ Khoa Học và Công Nghệ, tập 51 (5C), trang
21-25, 2013
[8]. Vương Bảo Thy, Trần Bích Lam, Lưu Duẩn. “Nghiên cứu thu nhận chế
phẩm enzyme từ gan và tụy cá Tra (Pangasius hypophthalmus) bằng
phương pháp kết tủa”, Tạp chí Khoa Học và Công Nghệ, Bộ Khoa Học
và Công Nghệ, tập 52 (5C), trang , 2014
1
MỞ ĐẦU
TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Nghiên cứu enzyme tiêu hóa của các loài cá được đặc biệt quan tâm
trong vài thập kỷ vừa qua. Do cá sống trong môi trường nhiệt độ thấp nên
để duy trì sự sống, chúng cần phải có hệ enzyme tương đối mạnh.
Trong các enzyme nội tạng cá, lipase ngày càng được quan tâm do có

khả năng ứng dụng cao trong y học và công nghệ thực phẩm. Một số lipase
từ nội tạng cá đã được thế giới nghiên cứu như lipase cá mập, cá mòi, cá hồi,
cá tráp, cá ngừ vây xanh, cá đối, cá rô, Riêng lipase cá tra (Pangasius
hypophthalmus), hiện nay chưa có nghiên cứu nào được công bố. Trong khi
đó, về lý thuyết, ở cá tra có mô mỡ rất phát triển so với các loại cá da trơn
khác, như vậy ở loài cá này enzyme lipase phải đóng vai trò quan trọng
trong quá trình trao đổi chất. Vì vậy việc thu nhận, tinh sạch và nghiên cứu
tính chất của lipase gan tụy cá tra có giá trị khoa học và cần đặc biệt quan
tâm. So với lipase thì protease nội tạng cá đã được nghiên cứu ở nhiều loài
như protease cá mòi, cá hồi trứng, cá hồi bạc, cá trồng, cá thu. Tuy nhiên,
về cá da trơn ở Việt Nam cho đến nay ngoài một số khảo sát chung về
protease nội tạng chưa có công bố nào phân tích riêng tính chất protease gan
tụy cá tra.
Theo dự báo của VASEP (Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản
Việt Nam) đến năm 2015 sản lượng cá tra nguyên liệu khoảng 1,8 triệu tấn
thì riêng phần nội tạng ước tính khoảng 100.000 tấn, đây là nguồn nguyên
liệu dồi dào, nhiều tiềm năng để thu nhận các chế phẩm enzyme tiêu hóa
ứng dụng trong y học, công nghệ thực phẩm.
Đề tài “Nghiên cứu thu nhận enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá tra
(Pangasius hypophthalmus)” nhằm góp phần giải quyết các vấn đề trên.
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Xác định đặc tính phân bố, phân lập và xác định tính chất của các
enzyme tiêu hóa trong nội tạng cá tra (Pangasius hypophthalmus).
2
Xác định phương pháp thu nhận chế phẩm enzyme tiêu hóa từ nguồn
nội tạng cá tra sẵn có để đưa vào ứng dụng.
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu của luận án là các enzyme tiêu hóa có trong cơ
quan nội tạng của cá tra (Pangasius hypophthalmus) nhưng chủ yếu tập

trung vào enzyme lipase và protease.
Phạm vi nghiên cứu
Phạm vi nghiên cứu của luận án là nghiên cứu đặc điểm phân bố của
các enzyme protease, lipase và amylase trong các cơ quan nội tạng; thu
nhận, tinh sạch và xác định tính chất của lipase và protease từ nội tạng của
cá tra (Pangasius hypophthalmus).
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương pháp nghiên cứu để thực hiện luận án là phương pháp nghiên
cứu thực nghiệm khoa học kết hợp với phương pháp phân tích lý thuyết và
tổng hợp tài liệu.
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
1. Khảo sát hệ enzyme tiêu hóa trong các cơ quan nội tạng cá tra
2. Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme tiêu hóa từ gan tụy cá tra
3. Nghiên cứu tinh sạch và xác định tính chất protease gan tụy cá tra
4. Nghiên cứu tinh sạch và xác định tính chất lipase gan tụy cá tra
5. Nghiên cứu khả năng ứng dụng chế phẩm enzyme tiêu hóa
Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN
Ý nghĩa khoa học
Là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách có hệ thống,
phân tích chuyên sâu về hệ enzyme protease, lipase từ gan tụy cá tra
(Pangasius hypophthalmus), đóng góp những dẫn liệu khoa học quan trọng
về hệ enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá tra.
3
Đã xác định được đặc điểm cấu tạo và tính chất của protease và lipase
từ gan tụy cá tra; đưa ra điều kiện trích ly và phương pháp thu nhận chế
phẩm enzyme gan tụy cá tra bằng phương pháp kết tủa và phương pháp lọc
màng; đề xuất phương pháp tinh sạch protease và lipase từ gan tụy cá tra.
Ý nghĩa thực tiễn
Là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu thu nhận, tinh sạch các
enzyme tiêu hóa từ nguồn phế liệu nội tạng của ngành chế biến cá tra

(Pangasius hypophthalmus), góp phần làm phong phú thêm nguồn thu các
chế phẩm enzyme nói chung và protease, lipase nói riêng. Chế phẩm
enzyme từ nội tạng cá tra có thể ứng dụng có hiệu quả cao trong sản xuất
pepton, hỗ trợ tiêu hóa. Kết quả nghiên cứu là giải pháp thiết thực từ thực tế
sản xuất của ngành chế biến cá tra, tạo sản phẩm có giá trị gia tăng từ nguồn
phế liệu cá, góp phần phát triển bền vững công nghiệp cá tra của Việt Nam.
BỐ CỤC CỦA LUẬN ÁN
Luận án gồm 120 trang bao gồm: Mở đầu 3 trang; Chương 1: Tổng
quan 28 trang; Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 14
trang; Chương 3: Kết quả và bàn luận 73 trang; Kết luận và kiến nghị 2
trang, 150 tài liệu tham khảo. Trong luận án có 24 bảng, 62 hình và đồ thị.

CHÖÔNG 1 TOÅNG QUAN
1.1. Tình hình nghiên cứu enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá
Hiện nay, các nghiên cứu về hệ tiêu hóa của các loài cá nói chung và cá
da trơn nói riêng chủ yếu tập trung vào việc khảo sát thói quen về ăn uống
của chúng. Ngoại trừ enzym pepsin từ dạ dày cá đã được nhiều tác giả trên
thế giới nghiên cứu thu nhận, tinh sạch, xác định tính chất và đưa vào ứng
dụng, các hiểu biết về hệ enzyme tiêu hóa từ tụy tạng cá vẫn còn khá hạn
chế. Nghiên cứu về protease tụy tạng cá cho thấy đây là các protease kiềm,
có hai loại protease là trypsin và chymotrypsin. Trypsin và các enzyme
giống trypsin có hoạt độ protease đã được tinh sạch và định tính ở một số
4
loài cá như: cá mòi, cá ốt vảy nhỏ, cá tuyết đảo băng, cá tuyết Đại Tây
Dương, cá hồi trứng, cá hồi Đại Tây Dương, cá hồi bạc, cá trồng. Ngoài
trypsin và chymotrypsin, các nghiên cứu cũng đặc biệt quan tâm đến
protease kiềm từ nội tạng cá. Nghiên cứu về các enzyme protease trong hệ
tiêu hoá của các loài cá khác nhau đã cho thấy rằng các serine protease từ
cá cũng tương tự với các enzyme này ở động vật máu nóng về kích thước
phân tử, thành phần acid amin và sự nhạy cảm với các chất có tác động ức

chế các serine protease.
Một số lipase từ nội tạng cá khác đã được nghiên cứu như lipase cá mập,
cá tuyết, cá tráp, cá đối, cá rô. Jonh S. Patton tìm thấy hai loại lipase gan tuỵ
ở dạng hoạt hoá ở cá mập, một loại lipase được hoạt hoá bởi muối mật có thể
đặc hiệu cho các acid béo không bão hoà bất kể vị trí cũng như tính đặc hiệu
nhóm cho các ester. Lie và Lambertsen cho thấy các enzyme lipase thu được
từ cá tuyết Đại Tây Dương (Gadus morhua) thuỷ phân chủ yếu các PUFA và
cho thấy chúng có tính đặc hiệu acid béo hoàn toàn đối lập với các enzyme
lipase vi sinh vật. Alberta N.A. Aryee đã thu nhận phân đoạn lipase từ nội
tạng cá đối (Mugil cephalus). Poonsuk Prasertsan đã khảo sát hoạt độ của
lipase trên đối tương nghiên cứu là nội tạng của 3 loại cá ngừ.
Nguồn enzyme tiêu hóa tiềm năng từ nội tạng cá tra
Cá tra (Pangasius hypophthalmus) là loài cá có giá trị kinh tế cao ở Việt
Nam. Riêng phần nội tạng, là phế liệu của ngành chế biến cá tra, ước tính
khoảng 100.000 tấn/ năm. Đây là nguồn nguyên liệu dồi dào, nhiều tiềm
năng để thu nhận các enzyme tiêu hóa như lipase, protease ứng dụng trong y
học, công nghệ thực phẩm. Việc thu nhận enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá tra
được đánh giá là mang tính khả thi cao do có những điểm mạnh như: (1) nội
tạng cá tra là nguồn nguyên liệu giàu enzyme; (2) trữ lượng nguồn nguyên
liệu này ở nước ta rất lớn; (3) có cơ sở lý thuyết về enzyme tiêu hóa, có thể
ứng dụng các kỹ thuật hiện đại trong nghiên cứu và thu nhận enzyme từ nội
tạng cá tra; (4) giá trị sản phẩm cao; (5) dự đoán nhu cầu sử dụng enzyme
5
tiêu hóa tăng cao trong tương lai; (6) khác với tụy tạng lợn, bò hay gia cầm,
sử dụng chế phẩm enzyme từ cá khơng gặp cản trở về tơn giáo hay dịch bệnh.
1.2. Phƣơng pháp thu nhận và tinh sạch enzyme từ nội tạng cá
Cho đến nay các chế phẩm enzyme tiêu hóa chủ yếu được thu nhận và
tinh sạch theo phương pháp truyền thống qua các cơng đoạn trích ly, kết tủa
và tinh sạch. Nhưng xu hướng mới để thu nhận enzyme cơng nghiệp hiện
nay là phương pháp lọc màng (membrane). Ưu điểm của phương pháp lọc

màng là ít gây ơ nhiễm mơi trường hơn phương pháp kết tủa truyền thống
vì khơng sử dụng hóa chất là muối trung tính hay dung mơi hữu cơ như
aceton, ethanol, hoặc isopropanol (thể tích gấp 3 - 4 lần thể tích dịch
enzyme) để kết tủa enzyme. Nhược điểm của phương pháp lọc màng là
kích thước phân tử phân riêng giao động trong khoảng lớn, do đó phương
pháp lọc màng khơng tách riêng hồn tồn được các protein. Kỹ thuật lọc
màng vì vậy được ứng dụng hiệu quả trong cơng nghiệp thu nhận chế phẩm
thơ, nhưng kém hiệu quả trong việc thu nhận chế phẩm tinh khiết.
1.3. Ứng dụng của các enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá
Các enzyme tiêu hóa thu nhận từ nội tạng cá được nghiên cứu ứng dụng
trong xử lý thịt, trích ly dầu cá từ ngun liệu thơ, sản xuất acid béo ω-3
dạng concentrate, dùng làm enzyme chống oxy hóa, tách loại da cá, tinh sạch
trứng cá, tách bỏ vỏ của động vật có vỏ, sản xuất nước chấm từ cá, sản xuất
thức ăn gia súc từ cá, sản xuất protein thủy phân từ cá, tận thu các hợp chất
màu từ phế phẩm của động vật có vỏ, khử mùi ơi do oxy hố ở sữa.
CHƯƠNG 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tƣợng nghiên cứu
Nội tạng cá tra (Pangasius hypophthalmus) do cơng ty chế biến thủy
sản ở Vĩnh Long cung cấp. Ngay sau khi giết mổ, nội tạng được bảo quản ở
-20
0
C để hạn chế sự biến tính enzyme.
2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu
Phương pháp xác định đặc điểm phân bố các enzyme trong nội tạng
6
Nguyên liệu nội tạng được chia thành 3 loại sau: (1) gan tụy, (2) ruột,
(3) nội tạng hỗn hợp. pH trích ly từ 6-11. Các enzyme khảo sát: lipase,
protease và amylase. Mục tiêu: chọn thành phần nội tạng, pH trích ly tối ưu
để hoạt độ protease, lipase, amylase tính trong 1g chất khô nguyên liệu cao
nhất.

Phương pháp trích ly enzyme từ nội tạng cá tra
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự hòa tan enzyme: (1) tỷ lệ nguyên
liệu/dung môi từ 1/1 – 1/5; (2) nhiệt độ từ 5 - 45
0
C; (3) thời gian từ 0,5 –
2,5 giờ. Hàm mục tiêu: hoạt độ, hoạt độ riêng protease, lipase/g chất khô
nguyên liệu cao nhất.
Phương pháp lọc màng trong thu nhận protein enzyme
Trong dịch trích ly enzyme thô, ngoài enzyme còn có các chất hòa tan,
protein tạp, các hạt lipid…Để thu nhận enzyme, chúng tôi sử dụng kết hợp
02 kỹ thuật lọc màng là: (I) vi lọc (MF) với màng 1 và 0,1 μm và (II) siêu
lọc (UF). Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lọc UF: (1) nồng độ
chất tan trong dòng nhập liệu với tỷ lệ pha loãng dịch enzyme từ 1/1 -1/3;
(2) áp suất lọc từ 4 -8 psi; (3) thời gian lọc từ 90 -150 phút. Hàm mục tiêu:
hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch củ
sau lọc UF đạt giá trị cao nhất.
Phương pháp kết tủa trong thu nhận protein enzyme
Từ dịch trích ly enzyme thô, sử dụng tác nhân dung môi hữu cơ (aceton,
ethanol, isopropanol) hoặc muối amoni sulfate bổ sung vào dịch enzyme để
kết tủa protein. Ứng với mỗi tác nhân kết tủa, khảo sát (1) các tỷ lệ dung môi
và dịch trích enzyme từ 1/1 – 5/1 (v/v) hoặc (2) nồng độ bão hòa muối amoni
sulfate từ 40 – 80% bổ sung vào dịch enzyme. Hàm mục tiêu: chọn tác nhân
cho hiệu suất thu hồi cao để thu nhận chế phẩm enzyme; chọn tác nhân cho độ
tinh sạch cao để tiếp tục tách riêng các enzyme tinh sạch.
Phương pháp tinh sạch enzyme
Chế phẩm enzyme thô gồm hỗn hợp nhiều enzyme, thông thường phải
7
kết hợp 2-3 phương pháp tinh sạch mới tách riêng được các enzyme. Sử
dụng kết hợp các phương pháp như: (1) Thẩm tích để loại muối và các chất
có phân tử lượng nhỏ; (2) Sắc ký trao đổi ion; (3) Sắc ký lọc gel Sephadex.

Trong nghiên cứu này, enzyme được chọn tinh sạch bằng thẩm tích; sắc ký
trao đổi ion DEAE-cellulose; sắc ký lọc gel Sephadex G-75/ G-100. Mục
tiêu: thu nhận protease/ lipase tinh sạch từ hỗn hợp enzym ban đầu.
Phương pháp xác định tính chất các enzyme tinh sạch
Các enzyme tinh sạch được xác định thành phần cấu tạo, phân tử
lượng; xác định các thông số động học như pH tối ưu, nhiệt độ tối ưu, độ
bền pH, độ bền nhiệt theo thời gian, các chất làm tăng hoặc làm giảm hoạt
độ enzyme; xác định giá trị Km và Vmax.
Phương pháp nghiên cứu ứng dụng chế phẩm enzyme
Chế phẩm enzyme được ứng dụng trong sản xuất pepton, hỗ trợ tiêu hóa.
2.3 Công thức tính toán
Hoạt độ riêng là số đơn vị hoạt độ enzyme được tính trên 1mg protein
của chế phẩm. Hoạt độ tương đối là tỷ lệ phần trăm giữa hoạt độ enzyme
còn lại và hoạt độ enzyme ban đầu. Hiệu suất thu hồi là tỷ lệ giữa tổng hoạt
độ enzyme thu được sau quá trình tinh sạch và tổng hoạt độ enzyme trong
mẫu trước khi đem tinh sạch. Độ tinh sạch được tính theo tỷ lệ giữa hoạt độ
riêng của enzyme thu được sau quá trình tinh sạch và hoạt độ riêng của mẫu
enzyme trước khi đem tinh sạch.
Sử dụng phần mềm Stargaphic Plus 4.0 để xử lý thống kê.
CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1 Khảo sát hệ enzyme tiêu hóa trong nội tạng cá tra
3.1.1 Tỷ lệ khối lượng các thành phần trong nội tạng cá tra
Nội tạng cá tra theo kết quả nghiên cứu, chiếm tỷ lệ khối lượng 5,83%,
cao hơn so với cá ngừ (5,44%) nhưng thấp hơn so với cá thu (8%) ở các
nghiên cứu khác, nội tạng các loại cá này là phế liệu ngành chế biến thủy
sản và cũng đang được nghiên cứu tận thu enzyme.
8
3.1.2 Sự phân bố lipase, protease và amylase trong các cơ quan nội tạng
Hoạt độ của các enzyme tiêu hóa phụ thuộc vào bản chất của nguyên
liệu nội tạng, do mỗi enzyme tập trung ở một số cơ quan nhất định. pH

trích ly thì ảnh hưởng lên sự hòa tan của enzyme. Trong nghiên cứu này đã
khảo sát ảnh hưởng của loại nguyên liệu nội tạng (nội tạng hỗn hợp, gan
tụy, ruột) và pH dung môi (6-11) đến hoạt độ của các enzyme lipase,
protease, amylase. Kết quả tổng hợp thể hiện ở bảng 1.
Bảng 1: Hoạt độ lipase, protease và amylase tại pH trích ly tối ưu

Thành phần
pH
trích ly
tối ưu
Lipase
Hoạt độ
(U/g ck)
Hoạt độ riêng
(U/mg pr)
Nội tạng
8
491,33
b


13,44
b

Gan tụy
8
674,02
a

18,44

a

Ruột
8
364,61
c


12,02
b



Protease
Hoạt độ
(U/g ck)
Hoạt độ riêng
(U/mg pr)
Nội tạng
8
29,43
b
0,80
b

Gan tụy
8
84,28
a
2,30

a

Ruột
10
9,86
c
0,37
c



Amylase
Hoạt độ
(U/g ck)
Hoạt độ riêng
(U/mg pr)
Nội tạng
8
252,25
b

6,89
b

Gan tụy
8
419,69
a
11,47
a

Ruột
8
152,62
c
5,03
c

Các chữ số khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa
thống kê ở mức p < 0,05; ck: chất khô nguyên liệu
9
Theo kết quả bảng 1, tại giá trị pH trích ly tối ưu, cho thấy trong các
thành phần nội tạng, mẫu gan tụy có hoạt độ enzyme lipase, protease và
amylase cao hơn mẫu nội tạng hỗn hợp và mẫu ruột, khác biệt có ý nghĩa
về mặt thống kê ở mức p < 0,05, có thể do tụy tạng là cơ quan chính sản
sinh các enzyme tiêu hóa. Hoạt độ riêng của các enzyme tiêu hóa từ gan tụy
cá tra là khá cao khi so sánh với các loài cá khác.
Trong nghiên cứu này chúng tôi quan tâm chủ yếu đến hai loại enzyme
chính là lipase và protease. Từ kết quả thí nghiệm này chọn nguyên liệu là
gan tụy, pH trích ly là pH8 cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2 Khảo sát quá trình trích ly enzyme
Kết quả nghiên cứu đã xác định điều kiện tốt nhất để trích ly enzyme
protease và lipase từ gan tụy cá tra như sau: với dung môi là đệm Tris-HCl
(0,05N) pH 8, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi trích ly là 1/2, nhiệt độ trích ly
5
0
C, thời gian trích ly là 1 giờ.
3.3 Khảo sát quá trình thu nhận enzyme bằng công nghệ lọc màng
Kết quả khảo sát cho thấy công nghệ lọc màng chỉ đạt hiệu quả cao
trong thu nhận lipase và không hiệu quả đối với protease. Nên từ dịch trích

enzyme, tiến hành các bước sau: (1) lọc thô; (2) ly tâm; (3) lọc MF với 2
màng kích thước lần lượt 1 và 0,1 µm; (4) lọc UF, phân đoạn 10 KDa, vật
liệu màng polysunfone, mô hình lọc cross-flow. Đánh giá hiệu suất thu hồi
và độ tinh sạch lipase trong dòng retentate sau lọc UF.
Bảng 2: Kết quả thu lipase sau quá trình lọc MF
Giai
đoạn
xử lý
Nồng độ
protein
(mg pr/ml)
Hoạt độ
lipase
(U/ml)
Hoạt độ
riêng lipase
(U/mg pr)
Tổng hoạt
độ lipase
(U)
Hiệu suất
thu hồi
(%)
Độ tinh
sạch
(lần)
Pha
loãng
1,09
a

-
20,76
b
43424
100
1
1 µm
1,06
a
23,11
a
21,83
b
39056
89,94
1,05
0,1 µm
0,79
b
20,15
b
25,47
a
31636
72,85
1,23
10
Từ kết quả bảng 2 cho thấy độ tinh sạch lipase tăng sau khi lọc MF qua
2 màng kích thước 1 và 0,1 µm chứng tỏ quá trình lọc MF hiệu quả.
3.3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng dịch enzyme thô đến hiệu suất thu

hồi và độ tinh sạch lipase sau lọc UF
Bảng 3: Kết quả thu lipase trong dòng retentate theo tỷ lệ pha loãng
Tỷ lệ
Nồng độ
protein
(mg pr/ml)
Hoạt độ
lipase
(U/ml)
Hoạt độ
riêng lipase
(U/mg pr)
Tổng
hoạt độ
lipase (U)
Hiệu suất
thu hồi
(%)
Độ tinh
sạch
(lần)
1:2
0,90
a
32,59
a
36,19
a
7040
87,34

ab
1,42
b
1:3
0,73
b
24,89
b
34,07
a
7516
93,26
a
1,57
a
1:4
0,52
c
14,52
c
27,94
b
5159
63,95
c
1,19
c
Kết quả bảng 3 chọn tỷ lệ pha loãng 1/3 cho nghiên cứu tiếp theo.
3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của áp suất vận hành đến hiệu suất thu hồi và
độ tinh sạch lipase sau lọc UF

Bảng 4: Kết quả thu lipase trong dòng retentate theo áp suất vận hành
Áp
suất
(psi)
Nồng độ
protein
(mg pr/ml)
Hoạt độ
lipase
(U/ml)
Hoạt độ
riêng lipase
(U/mg pr)
Tổng
hoạt độ
lipase (U)
Hiệu suất
thu hồi
(%)
Độ tinh
sạch
(lần)
4
0,37
b
17,78
b
48,44
ab
6364

78,97
b
1,90
ab
6
0,41
ab
21,04
a
51,31
a
7216
89,52
a
2,01
a
8
0,44
a
19,26
ab
43,70
b
5913
73,36
b
1,72
bc
Kết quả bảng 4 chọn áp suất 6 psi cho nghiên cứu tiếp theo.
3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lọc đến hiệu suất thu hồi và độ

tinh sạch lipase sau lọc UF
Bảng 5: Kết quả thu lipase trong dòng retentate theo thời gian lọc
Thời
gian
(phút)
Nồng độ
protein
(mg pr/ml)
Hoạt độ
lipase
(U/ml)
Hoạt độ
riêng lipase
(U/mg pr)
Tổng
hoạt độ
lipase (U)
Hiệu suất
thu hồi
(%)
Độ tinh
sạch
(lần)
90
0,40
bc
18,67
bc
46,86
c

6888
85,46
ab
1,84
b
120
0,42
ab
22,22
a
52,70
a
7466
92,64
a
2,07
a
150
0,45
a
20,15
b
44,55
bc
6306
78,24
b
1,75
b
11

Kết quả bảng 5 chọn thời gian lọc 120 phút.
Hiệu quả của quá trình lọc UF trong tinh sạch lipase thể hiện ở bảng 6.
Bảng 6: Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của lipase sau lọc UF

Công
đoạn
Xử lý
Nồng độ
protein
(mg pr/ml)
Hoạt độ
lipase
(U/ml)
Hoạt độ
riêng lipase
(U/mg pr)
Tổng
hoạt độ
lipase (U)
Hiệu suất
thu hồi
(%)
Độ tinh
sạch
(lần)
0,1 µm
0,79
a
20,15
b

25,47
b
8060
100
1
UF
0,42
b
22,22
a
52,70
a
7466
92,6
2,07
Trên mỗi bảng 2, 3, 4, 5, 6, các chữ số khác nhau trong cùng một cột thể
hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức p < 0,05
Kết quả chọn thông số quá trình lọc UF phân đoạn 10 KDa là tỷ lệ pha
loãng dịch enzyme/nước cất 1/3, áp suất lọc 6psi, thời gian lọc 120 phút.
Bên cạnh những thế mạnh phương pháp lọc màng vẫn còn những thiếu
sót như: (1) do pha loãng dịch enzyme gây bất lợi cho qua trình tạo chế
phẩm; (2) phương pháp chỉ có hiệu quả cao đối với quá trình tinh sạch
enzyme lipase. Trong khi protease trong dịch enzyme cũng rất đáng được
quan tâm. Do đó, ở nội dung thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi nghiên cứu
tinh sạch cả protease và lipase theo phương pháp kết tủa truyền thống.
3.4 Khảo sát quá trình kết tủa enzyme
Khảo sát quá trình kết tủa với 4 loại tác nhân là: amoni sulfate, ethanol,
aceton và isopropanol với các nồng độ và tỷ lệ khác nhau bổ sung vào dịch
enzyme. Đánh giá hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch enzyme đối với mỗi tác
nhân kết tủa.

Kết quả nghiên cứu cho thấy với tác nhân kết tủa là amoni sunfate,
chọn nồng độ muối amoni sulfate bão hòa 60% cho hiệu suất thu hồi và độ
tinh sạch protease, lipase cao nhất. Với tác nhân kết tủa là ethanol, chọn tỷ
lệ ethanol/ dịch trích ly là 3/1 (v/v). Với tác nhân kết tủa là aceton, chọn tỷ
lệ aceton/dịch trích ly là 4/1. Với tác nhân kết tủa là isopropanol, chọn tỷ lệ
isopropanol/dịch trích ly là 4/1 cho hiệu quả kết tủa tốt nhất.
12
So sánh kết quả của các phương pháp kết tủa












Hình 1: So sánh hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch protease của các tác nhân
kết tủa

Hình 2: So sánh hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch lipase của các tác nhân
kết tủa
Trên các hình 1,2, các chữ số khác nhau trong cùng một hệ trục thể hiện sự
khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức p < 0,05
88.33
84.40
91.43
87.78
88.80
2.21
3.07
2.02
1.87
2.09
80.00
82.00
84.00
86.00
88.00
90.00
92.00
SA SA+ thẩm
tích
Ethanol aceton isopropanol
tác nhân kết tủa
Hiệu suất thu hồi (%)

0
1
2
3
4
5
6
Độ tinh sạch (lần)
Hiệu suất thu hồi lipase (%) Độ tinh sạch (lần)
ab
bc
c
cd
a
b
bc
d
b
a
86.3
81.71
90.72
88.54
86.67
2.15
2.97
1.94
1.89
2.04
80.0

82.0
84.0
86.0
88.0
90.0
92.0
SA SA+ thẩm
tích
Ethanol aceton isopropanol
tác nhân kết tủa
Hiệu suất thu hồi (%)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Độ tinh sạch (lần)
Hiệu suất thu hồi protease (%) Độ tinh sạch (lần)
ab
a
b
bc
cd
a
b
bc

d
c
13
Từ kết quả hình 1-2 chọn phương pháp kết tủa bằng ethanol cho hiệu
suất thu hồi cao để sản xuất chế phẩm enzyme; chọn phương pháp kết tủa
bằng amoni sunfate cho độ tinh sạch cao để nghiên cứu tiếp thu nhận
protease, lipase tinh sạch.
Chế phẩm enzyme có hoạt độ protease: 49,26 U/g chế phẩm; Hoạt độ
riêng protease 1,42 U/mg protein; Hoạt độ lipase: 587,85 U/ g chế phẩm;
Hoạt độ riêng lipase: 16,91 U/mg protein.
3.5 Nghiên cứu tinh sạch và xác định tính chất protease gan tụy
Kết quả khảo sát cho thấy quá trình tinh sạch protease từ dịch trích ly
enzyme bao gồm các bước sau: (1) kết tủa phân đoạn bằng muối amoni
sunfate 60% nồng độ bảo hòa; (2) thẩm tích bằng màng cellophane 12
KDa; (3) tinh sạch bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose; (4) kết hợp
sắc ký lọc gel Sephadex G-75. Kết quả sắc ký đồ thể hiện ở hình 3, 4.











Hình 3: Sắc ký đồ trao đổi ion của protease gan tụy cá tra trên cột
DEAE-cellulose với gradient nồng độ dung dịch NaCl 0-0,3M
Từ kết quả hình 3 cho thấy mẫu enzyme sau khi qua cột đã phân tách ra

thành 3 peak lớn và một số peak nhỏ, trong đó peak có diện tích lớn nhất
thể hiện hoạt độ protease gồm 15 phân đoạn (ống 15-29) với hoạt độ
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43
phân đoạn (3ml/ống)
Hàm lượng protein (mg/ml)
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
Hoạt độ protease (U/ml)
Hàm lượng protein (mg/ml) Hoạt độ protease (U/ml)
NaCl
0.3 M
14
protease cao nhất là 4,86 U/ml; kiểm tra 15 phân đoạn này đều có thể hiện
hoạt độ lipase, kiểm tra độ tinh sạch bằng phương pháp chạy điện di trên
gel SDS-PAGE cho thấy phân đoạn này chỉ có hai loại protein có phân tử
lượng khác nhau (hình 5). Điều đó chứng tỏ phương pháp rửa giải theo
gradient nồng độ NaCl 0-0,3M đã thu nhận được hỗn hợp gồm một loại
protease và một loại lipase. Các peak còn lại hầu hết chỉ là các protein tạp
thể hiện hoạt độ lipase, protease rất thấp.

Từ kết quả hình 4 cho thấy mẫu enzyme sau khi qua cột đã phân tách ra
thành 3 peak, trong đó có một peak diện tích lớn thể hiện hoạt độ protease
gồm 10 phân đoạn (ống 16-26) với hoạt độ protease cao nhất là 2,33 U/ml.
Vậy sau khi qua cột sắc ký lọc gel sephadex G75 đã tách được protease ra
khỏi lipase, kết quả kiểm tra độ tinh sạch và phân tử lượng protease thể
hiện ở hình 5.











Hình 4: Sắc ký lọc gel của protease gan tụy cá tra trên Sephadex G-75
Hiệu quả quá trình tinh sạch protease thể hiện ở bảng 7. Kết quả bảng
này cho thấy sau quá trình tinh sạch thu nhận protease có hoạt độ riêng
28,59 U/mg, độ tinh sạch cao gấp 22,41 lần so với dịch enzyme thô. Hiệu
suất thu hồi protease đạt 23,67%.
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40
phân đoạn (3ml/ống)
Hàm lượng protein (mg/ml)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Hoạt độ protease (U/ml)
Hàm lượng protein (mg/ml) Hoạt độ protease (U/ml)
15
Bảng 7: Tóm tắt quá trình tinh sạch protease gan tụy cá tra

Công đoạn
Protein
tổng
(mg)
Tổng hoạt
độ (U)
Hoạt độ
riêng
(U/mg pr)
Độ tinh
sạch
(lần)
Hiệu suất
thu hồi
(%)
Enzyme thô

*
202,5
258,3
1,28
1,0
100
Kết tủa
82,35
223,2
2,71
2,12
86,41
Thẩm tích
56,7
201,15
3,55
2,78
77,87
Sắc ký ion
DEAE-cellulose
4,59
122,81
26,78
20,99
47,55
Sắc ký lọc gel
Sephadex-G75
2,14
61,14
28,59

22,41
23,67
* Nguyên liệu gan tụy: 50g ** Kết quả trung bình 3 lần thí nghiệm
Kiểm tra độ tinh sạch và xác định phân tử lượng của protease gan tụy
Kết quả hình 5 xác định protease gan tụy tinh sạch và phân tử lượng 31 KDa










Hình 5: Kết quả điện di trên gel SDS–PAGE
Cột b: thang protein chuẩn, cột a: phân đoạn thu từ sắc ký trao đổi ion
DEAE-cellulose, cột c: phân đoạn thu từ sắc ký lọc gel Sephadex G75
3.5.3 Xác định một số tính chất của protease gan tụy tinh sạch
3.5.3.1 Nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt theo thời gian của protease
16








Hình 6: Độ bền nhiệt theo thời gian của protease

Kết quả nghiên cứu cho thấy nhiệt độ tối ưu của protease gan tụy cá tra
là 55
0
C. Theo kết quả hình 6, ở nhiệt độ thấp 35-50
0
C, protease bền nhiệt
hơn ở nhiệt độ cao 55-70
0
C, tại nhiệt độ tối ưu 55
0
C sau thời gian 120 phút
hoạt độ protease giảm 43,16%. Khi nhiệt độ cao hơn 55
0
C tốc độ giảm hoạt
độ protease nhanh hơn, ở nhiệt độ 60
0
C sau 120 phút hoạt độ protease giảm
60,37%, ở nhiệt độ 70
0
C sau 15 phút hoạt độ protease giảm 86,42%.
3.5.3.2 pH tối ưu và độ bền pH theo thời gian của protease

Hình 7: Độ bền pH theo thời gian của protease
Kết quả nghiên cứu cho thấy protease gan tụy có pH tối ưu là 8,5, ổn
định ở pH 7-9. Theo kết quả hình 7, sau 120 phút hoạt độ tương đối protease
trên 80%. Ở pH 7 sau 120 phút hoạt độ protease giảm 12,84%. Ở pH 9 sau
0
20
40
60
80
100
0 15 30 45 60 90 120
Thời gian (phút)
Hoạt độ tương đối (%)
35 độ C
45 độ C
50 độ C
55 độ C
60 độ C
70 độ C
70
75
80
85
90
95
100
105
0 30 60 90 120
Thời gian (phút)
Hoạt độ tương đối (%)

pH 7
pH 7.5
pH 8
pH 8.5
pH 9
17
120 phút hoạt độ protease giảm 19,32%. Nhìn chung, protease gan tụy cá tra
khá bền ở pH 7-9 trong khoảng thời gian 2-3 giờ, phù hợp để nghiên cứu
ứng dụng trong y học làm thuốc hỗ trợ tiêu hóa.
3.5.3.3 Ảnh hưởng của một số ion kim loại đến hoạt độ của protease
Kết quả cho thấy hoạt độ của protease gan tụy cá tra bị kìm hãm bởi
các ion kim loại nặng như Zn
2+
, Cu
2+
, Mg
2+
, kích thích khi có mặt ion Ca
2+
.
3.5.3.4 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt độ của protease
Theo đồ thị Lineweaver- Burk, giá trị K
m
và V
max
của protease tinh sạch
khi thủy phân cơ chất BSA được xác định với K
m
= 897 mg/L và V
max

= 15,7
mg/L.phút.
3.5.3.5 Thành phần acid amin của protease gan tụy
Từ kết quả cho thấy protease tinh sạch có 14 loại acid amin với tỷ lệ
khác nhau, trong đó, các amino acid có hàm lượng cao là serine với 0,714
mg/g, aspartic với 0,651 mg/g, tiếp theo là glutamic với 0,416 mg/g,
glysine với 0,355 mg/g và leucine với 0,303 mg/g.
3.6 Nghiên cứu tinh sạch và xác định tính chất lipase gan tụy cá tra
Khảo sát quá trình tinh sạch lipase bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-
cellulose kết hợp sắc ký lọc gel Sephadex G-75










Hình 8: Sắc ký đồ trao đổi ion của lipase gan tụy cá tra trên cột DEAE-
cellulose với gradient nồng độ dung dịch NaCl 0-0,3M
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
0.00

0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43
Hoạt độ lipase (U/ml)
Hàm lượng protein (mg/ml)
phân đoạn (3ml/ống)
Hàm lượng protein (mg/ml)
Hoạt độ lipase (U/ml)
NaCl
0.3 M
18
Từ kết quả hình 8 cho thấy mẫu enzyme sau khi qua cột đã phân tách ra
thành 3 peak lớn và một số peak nhỏ, trong đó peak có diện tích lớn nhất
thể hiện hoạt độ lipase gồm 15 phân đoạn (ống 15-29) với hoạt độ lipase
cao nhất là 5,67 U/ml; kiểm tra 15 phân đoạn này đều có thể hiện hoạt độ
protease, kiểm tra độ tinh sạch bằng phương pháp chạy điện di trên gel
SDS-PAGE cho thấy phân đoạn này chỉ có hai loại protein có phân tử
lượng khác nhau (hình 10). Điều đó chứng tỏ phương pháp rửa giải theo
gradient nồng độ NaCl 0-0,3M đã thu nhận được hỗn hợp gồm một loại
lipase và một loại protease. Tiếp tục nghiên cứu tách riêng lipase ra khỏi
hỗn hợp bằng sắc ký lọc gel Sephadex G-75.

Hình 9: Sắc ký lọc gel của lipase gan tụy trên gel Sephadex G75
Từ kết quả hình 9 cho thấy mẫu enzyme sau khi qua cột đã phân tách ra
thành 2 peak lớn, trong đó có một peak diện tích lớn thể hiện hoạt độ lipase
gồm 9 phân đoạn (ống 4-12) với hoạt độ lipase cao nhất là 5,17 U/ml. Kết
quả kiểm tra độ tinh sạch và xác định phân tử lượng lipase bằng phương
pháp điện di trên gel SDS-PAGE thể hiện ở hình 10.
Hiệu quả quá trình tinh sạch lipase thể hiện ở bảng 8. Kết quả bảng này
cho thấy sau quá trình tinh sạch thu nhận lipase có hoạt độ riêng 509,71
U/mg, độ tinh sạch cao gấp 37,95 lần so với dịch enzyme thô. Hiệu suất thu
hồi lipase đạt 40,08%.
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
0.16
0.18
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40
phân đoạn (3ml/ống)
Hàm lượng protein (mg/ml)
0.0
1.0
2.0

3.0
4.0
5.0
6.0
Hoạt độ lipase (U/ml)
Hàm lượng protein (mg/ml) Hoạt độ lipase (U/ml)
19
Bảng 8: Tóm tắt quá trình tinh sạch lipase gan tụy cá tra

Công đoạn
Protein
tổng
(mg)
Tổng hoạt
độ
(U)
Hoạt độ
riêng
(U/mg pr)
Độ tinh
sạch
(lần)
Hiệu suất
thu hồi
(%)
Enzyme thô
*
202,5
2719,8
13,43

1,0
100
Kết tủa
82,35
2493,45
30,28
2,25
91,68
Thẩm tích
56,7
2293,2
40,44
3,01
84,32
Sắc ký ion
DEAE-cellulose
4,59
1735
378,29
28,17
63,79
Sắc ký lọc gel
SephadexG75
2,14
1090
509,71
37,95
40,08
* Nguyên liệu gan tụy: 50g ** Kết quả trung bình 3 lần thí nghiệm
Kiểm tra độ tinh sạch và xác định phân tử lượng của lipase gan tụy

Kết quả điện di xác định lipase gan tụy tinh sạch và có phân tử lượng
57 KDa









Hình 10: Kết quả điện di trên gel SDS– PAGE
Cột c: thang protein chuẩn, cột b: phân đoạn thu từ sắc ký trao đổi ion
DEAE-cellulose, cột a: phân đoạn thu từ sắc ký lọc gel Sephadex G-75
3.6.3 Xác định một số tính chất của lipase tinh sạch
3.6.3.1 Nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt theo thời gian của lipase
20








Hình 11: Độ bền nhiệt theo thời gian của lipase
Kết quả nghiên cứu cho thấy nhiệt độ tối ưu của lipase gan tụy là 50
0
C.
Enzym này bền ở nhiệt độ 35-55

0
C. Theo kết quả hình 11, tại nhiệt độ tối ưu
50
0
C sau thời gian 120 phút hoạt độ lipase giảm 44,7%. Khi nhiệt độ cao
hơn 55
0
C tốc độ giảm hoạt độ lipase nhanh hơn, ở nhiệt độ 60
0
C sau 120
phút hoạt độ lipase giảm 70,61%, ở nhiệt độ 70
0
C sau 15 phút hoạt độ lipase
giảm 78,68% .
3.6.3.2 pH tối ưu và độ bền pH theo thời gian của lipase








Hình 12: Độ bền pH theo thời gian của lipase
Lipase từ gan tụy cá tra họat động thủy phân ở pH tối ưu là pH 8. Mặt
khác, kết quả nghiên cứu độ bền pH của enzym này cho thấy lipase gan tụy
cá tra bền ở khoảng pH 7-9, trong thời gian 120 phút còn trên 70% hoạt lực,
rất thích hợp để nghiên cứu ứng dụng trong y học làm thuốc hỗ trợ tiêu hóa.
0
20

40
60
80
100
120
0 15 30 45 60 90 120
Thời gian (phút)
Hoạt độ tương đối (%)
35 độ C
45 độ C
50 độ C
55 độ C
60 độ C
70 độ C
60
65
70
75
80
85
90
95
100
105
0 30 60 90 120
Thời gian (phút)
Hoạt độ tương đối (%)
pH 7
pH 7.5
pH 8

pH 8.5
pH 9
21
3.6.3.3 Ảnh hưởng của một số ion kim loại đến hoạt độ lipase
Kết quả nghiên cứu cho thấy lipase gan tụy cá tra bị kìm hãm bởi các
ion kim loại nặng như Zn
2+
, Cu
2+
và Cd
2+
. Ngược lại, lipase gan tụy cá tra
tăng hoạt độ khi môi trường phản ứng hiện diện ion Ca
2+
.

Đặc tính này
giống lipase gan tụy các loài cá khác. Ngoài ra, ion Ca
2+
còn đóng vai trò
khác trong phản ứng lipase. Vai trò chính của Ca
2+
là phản ứng với acid
béo tự do sinh ra trong phản ứng để tạo muối.
3.6.3.4 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt độ của lipase
Theo đồ thị Lineweaver- Burk, giá trị K
m
và V
max
của lipase tinh sạch

khi thủy phân cơ chất triolein được xác định với K
m
= 1,381 mg/L và V
max
= 0,063 mg/L.phút.
3.6.3.5 Xác định thành phần acid amin của của lipase gan tụy
Kết quả cho thấy lipase tinh sạch có 14 loại acid amin, trong đó, các
amino acid có hàm lượng cao là aspartic với 0,927 mg/g, glutamic với
0,792 mg/g, tiếp theo là serine với 0,489 mg/g và threonine với 0,453 mg/g.
3.6.3.6 Ảnh hưởng của nồng độ NaTC đến hoạt độ lipase gan tụy
Kết quả cho thấy tại nồng độ muối mật NaTC 0,015M thì hoạt độ
lipase cao nhất, gấp 3,08 lần so với mẫu đối chứng (không bổ sung).
3.6.3.7 Ảnh hưởng của loại cơ chất đến hoạt độ lipase gan tụy
Kết quả nghiên cứu cho thấy lipase gan tụy cá tra có tính đặc hiệu cơ
chất, thủy phân liên kết ester ở vị trí 1,3 của triolein.
3.7 Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm enzyme
3.7.1 Ứng dụng chế phẩm enzyme trong sản xuất pepton
Kết quả khảo sát cho thấy khi sử dụng chế phẩm enzyme thủy phân cơ
chất cá tra (phế phẩm), cá thát lát, thịt bò thì thời gian thủy phân thích hợp
là 6 giờ. Từ kết quả bảng 9 cho thấy các pepton thu được bằng cách sử
dụng chế phẩm enzyme để thủy phân thịt bò và cá thác lác có tỷ lệ N
amin
/
N
tổng
lần lượt là 22,15% và 20,97%. Các sản phẩm pepton này đạt yêu cầu
của loại pepton-pancreatic (theo Dược điển Việt Nam).
22
Bảng 9: Hàm lượng nitơ tổng và nitơ amin của các pepton
Cơ chất

thủy phân
Hàm lượng nitơ
tổng (g/l)
Hàm lượng
Nitơ amin (g/l)
N
amin
/ N
tổng
(%)
Cá tra
4,57
0,85
18,53
a
Cá thác lác
4,83
1,01
20,97
b
Thịt bò
5,16
1,14
22,15
c
3.7.2 Khả năng ứng dụng chế phẩm enzyme trong hỗ trợ tiêu hóa

Hình 17: khả năng thủy phân của chế phẩm enzyme trên một số protein

Hình 13: khả năng thủy phân của chế phẩm enzyme trên một số protein









Hình 14: Khả năng thủy phân của chế phẩm enzyme trên một số loại dầu
Kết quả hình 13, 14 cho thấy chế phẩm có khả năng thủy phân tương
đương pancreatin từ tụy lợn (Enzyplex) nên có thể ứng dụng để hỗ trợ tiêu
hóa như bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, làm dược liệu bào chế thuốc, ứng
dụng trong phòng chống suy dinh dưỡng protein năng lượng ở trẻ em.
96
122
89
100
105
129
132
112
97
126

100
94
87
116
0
20
40
60
80
100
120
140
dầu mè dầu phộng dầu gấc dầu oliu dầu nành dầu hạt cải dầu dừa
loại dầu
hoạt tính tương đối (%)
pancreatin Enzyplex
19.78
17.28
20.63
16.54
14.37
12.56
9.32
10.79
8.22
7.12
0
5
10
15

20
25
cá tra cá thác lác thịt bò tôm trứng
cơ chất
Tỷ lệ N amin/ N tổng (%)
Pancreatin
Enzyplex