Nghiên cứu thu nhận gen mã hóa kháng thể đặc hiệu kháng nguyên ung thư tiền liệt tuyến EPCA bằng công nghệ gen

Nghiên cứu thu nhận gen mã hóa kháng thể
đặc hiệu kháng nguyên ung thư tiền liệt tuyến
EPCA bằng công nghệ gen
Nguyễn Kim Hoàn
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Luận văn ThS. ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30
Người hướng dẫn: PGS.TS. Lê Quang Huấn
Năm bảo vệ: 2012
Abstract. Nghiên cứu Gen scFv mã hóa kháng thể đặc hiệu kháng nguyên ung thư
tiền liệt tuyến EPCA được khuếch đại bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu và
chu trình nhiệt phù hợp, sau đó được đưa vào vector phagemid pHEN2 để tạo vector
tái tổ hợp. Vector tái tổ hợp pHEN2-scFv sẽ được biến nạp vào tế bào vi khuẩn
E.Coli chủng TG1 có bổ sung kháng sinh ampicillin, các khuẩn lạc mọc trên đĩa
được kiểm tra và chọn lọc các dòng mang vector. Kháng thể phage-scFv tạo ra kết
hợp với kháng nguyên EPCA trong huyết thanh bệnh nhân bị bệnh và không bị bệnh
để kiểm tra ái lực thông qua phản ứng ELISA. Bước đầu có thể sử dụng để chẩn
đốn các bệnh nhân là dương tính hay âm tính với ung thư tiền liệt tuyến.
Keywords. Sinh học thực nghiệm; Cơng nghệ gen; Gen mã hóa; Ung thư tiền liệt
tuyến

Content
LỜI MỞ ĐẦU
Hiện nay, ung thư được coi là căn bệnh đe dọa nguy hiểm và trầm trọng nhất đối với
con người. Trong số đó, ung thư tuyến tiền liệt là loại ung thư thường gặp và có tỉ lệ tử vong
cao ở nam giới. Ung thư tuyến tiền liệt gây ảnh hưởng lớn đến sức khỏe và sinh hoạt của nam
giới, nhưng nếu được phát hiện sớm và điều trị kịp thời sẽ hạn chế được rất nhiều tác hại của
bệnh. Ngày nay cùng với sự phát triển của y học và sinh học phân tử, đã có thêm nhiều
phương pháp chẩn đoán cũng như điều trị mới. Một trong các phương pháp hữu hiệu đó là
phương pháp sử dụng kháng thể phage-scFv đặc hiệu kháng nguyên ung thư tuyến tiền liệt
trong chẩn đoán và điều trị một cách nhanh chóng và hiệu quả.
Kháng thể scFv là chuỗi hợp nhất giữa một vùng biến thiên trên chuỗi nặng (VH) và

một vùng biến thiên trên chuỗi nhẹ (VL) của kháng thể nhờ chuỗi peptide ngắn (10-25 axit
amin). Với cấu trúc này, scFv vẫn giữ được các đặc trưng của kháng thể như ban đầu, mặc dù
đã loại bỏ các vùng hằng định và có thêm sự xuất hiện chuỗi peptide làm cầu nối giữa vùng
VH và VC.
Do đó, với mong muốn góp phần nghiên cứu nhằm đưa kháng thể vào ứng dụng trong
chẩn đoán và điều trị ung thư tiền liệt tuyến chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu thu


nhận gen mã hóa kháng thể đặc hiệu kháng nguyên ung thƣ tiền liệt tuyến EPCA bằng
công nghệ gen.”
CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN
1.1. TUYẾN TIỀN LIỆT VÀ BỆNH UNG THƢ TUYẾN TIỀN LIỆT
1.1.1. Giới thiệu chung về tuyến tiền liệt.
Tuyến tiền liệt là một cơ quan nằm ở bụng dưới hay cổ bàng quang (hình 1). Là tuyến
bao quanh đoạn đầu niệu đạo. Tuyến tiền liệt là một khối hình nón mà đáy ở trên, đỉnh ở
dưới. Tuyến rộng 4cm, cao 3cm và dày 2,5cm, nặng trung bình 15-20g và thường to lên theo
tuổi (hình 2) [1].
Tuyến tiền liệt tiết ra chất dịch có màu trắng sữa, mang tính kiềm và chứa acid citric,
calcium, acid phosphat, enzyme làm đơng vón và profibrinolysin. Trong thời gian phóng tinh,
các túi của tuyến tiền liệt co bóp cùng với co bóp của ống dẫn tinh để đẩy dịch tiết của nó gộp
với dịch từ ống dẫn tinh làm tăng thể tích tinh dịch. Dịch tiết của nó có tính kiềm sẽ trung hịa
bớt độ acid trong tinh dịch (độ acid do sự hiện diện của các sản phẩm trao đổi chất của tinh
trùng), vì vậy mà giúp tinh trùng đạt được khả năng vận động và thụ tinh ở mức tối ưu.
Một chức năng khác của tuyến tiền liệt là giúp kiểm soát nước tiểu bằng cách tạo áp lực
trực tiếp đối với phần niệu đạo mà tuyến tiền liệt bao quanh’
Ung thư tiền liệt tuyến (UTTLT) là loại ung thư phổ biến ở nước ta cũng như các nước
trên thế giới. Bệnh chiếm 10% trong số các ung thư ở nam giới, ở các nước tiên tiến tỷ lệ này
là 15% và là nguyên nhân tử vong thứ hai của bệnh ung thư, sau ung thư phổi. Theo thống kê,
hàng năm ở Mỹ có đến 132.000 người Mỹ bị UTTLT, và khoảng 34.000 người tử vong vì
căn bệnh này.

Ung thư tuyến tiền liệt là khối u ác tính phát triển từ tế bào của tuyến tiền liệt. Khối u
thường phát triển chậm và kéo dài trong nhiều năm. Trong suốt thời gian này, khối u thường
có rất ít hoặc khơng có biểu hiện triệu chứng bất thường khi khám bệnh. Tuy nhiên, khi ung
thư tiến triển, khối u lớn lên và xâm lấn sang mô xung quanh (lan rộng tại chỗ). Hơn nữa, ung
thư cũng có thể di căn (lan xa hơn) đến các vùng khác của cơ thể như xương, phổi, gan. Triệu
chứng ở những nơi di căn kết hợp với triệu chứng của UTTLT [8].
Nguyên nhân gây ra UTTLT vẫn chưa được nghiên cứu rõ, UTTLT khơng liên quan đến
phì đại tuyến tiền liệt lành tính. Các yếu tố nguy cơ bị UTTLT bao gồm: lớn tuổi, di truyền,
ảnh hưởng của nội tiết tố cũng như chất độc trong môi trường, hóa chất và các sản phẩm cơng
nghiệp.
Tầm sốt UTTLT là việc cần được làm thường xuyên và cách đều nhằm phát hiện
UTTLT giai đoạn sớm. Nếu kết quả tầm sốt bình thường thì coi như hiện tại khơng mắc
bệnh, nếu kết quả bất thường thì nghi ngờ có bệnh và cần làm thêm một số xét nghiệm khác
để chẩn đốn. Khi có một hoặc hai xét nghiệm tầm sốt có bất thường thì UTTLT được nghi
ngờ đầu tiên. Các thăm khám tầm soát này bao gồm:
 Thăm khám tuyến tiền liệt bằng ngón tay qua ngả trực tràng: Qua ngả trực tràng, người
thăm khám có thể sờ thấy bề mặt sau chiếm đến 75% diện tích chung của tuyến, nằm
phần cuối của ruột già. Qua đó có thể sờ thấy khối u to ra, mật độ không đều, chỗ cứng
chỗ mềm rất dễ phát hiện [7].
 Siêu âm nội trực tràng: để tìm chính xác độ lớn, vị trí khối u giúp bác sỹ chích sinh thiết
và tế bào tuyến để khám nghiệm cơ thể bệnh lý học [7].
 Xét nghiệm PSA (kháng nguyên đặc hiệu của tiền liệt tuyến): Đây là xét nghiệm đơn giản,
dễ thực hiện và tương đối chính xác.
PSA là một enzyme glucỏpotein, được tiết ra duy nhất của biểu mơ tuyến tiền liệt, có
trọng lượng phân tử khoảng 30.000, chứa 240 axit amin với 7% carbonhydrat, có vai trị làm


loãng tinh dịch. Đây là kháng nguyên đặc hiệu của tuyến tiền liệt, trong bệnh nhân bị UTTLT
thì nồng độ PSA thường tăng cao và tỷ lệ với thể tích khối ung thư. Tuy nhiên không chỉ đặc
hiệu riêng với UTTLT, nồng độ PSA còn tăng khi bị viêm tuyến tiền liệt.

Xét nghiệm dùng để phát hiện lượng PSA, tuy nhiên PSA có giá trị như một xét nghiệm
tầm sốt UTTLT. Vì vậy các bác sỹ thường khuyên những người đàn ông trên 50 tuối nên đi
làm xét nghiệm PSA mỗi năm một lần để phát hiện sớm bệnh UTTLT. Ở những người có
nguy cơ UTTLT bác sỹ khuyên nên bắt đầu làm xét nghiệm PSA sớm hơn ngay ở tuổi 40.
1.1.2. Các phƣơng pháp điều trị bệnh UTTLT.
Để quyết định điều trị cho bệnh nhân, bác sỹ sẽ xếp loại UTTLT như còn tại chỗ, u lớn
nhưng chưa lan ra hay di căn. Chọn lựa điều trị tùy theo mức độ lan ra của ung thư, nếu ung
thư khu trú tại chỗ điều trị bao gồm: phẫu thuật, xạ trị, hormone liệu pháp, đông lạnh và các
biện pháp này có thể kết hợp với nhau. Cịn đối với các trường hợp UTTLT đã di căn thường
không điều trị được. Điều trị UTTLT di căn bao gồm: hormone liệu pháp, hóa trị, tuy nhiên
vẫn chỉ là tạm thời. Mục tiêu của điều trị tạm thời là làm cho khối u chậm phát triển, giảm
triệu chứng cho người bệnh.
1.2. KHÁNG NGUYÊN
1.2.1. Khái niệm
Kháng nguyên (antigen) được định nghĩa là một chất tương tác với các phân tử kháng
thể và thụ thể trên các tế bào lympho. Một chất gây miễn dịch là một kháng nguyên được cơ
thể nhận biết như một chất ngoại lai và kích thích phản ứng miễn dịch thích ứng.
1.2.2. Kháng nguyên EPCA ( Early Prostate Canner Antigen).
EPCA là một protein có trong chất nền của nhân tế bào. Điều đặc biệt là EPCA được
biểu hiện mạnh trong các mơ ung thư và các mơ bình thường sát kề mô ung thư ở bệnh nhân
ung thư tuyến tiền liệt, nhưng lại không biểu hiện ở mô tuyến tiền liệt của người không bị
ung thư, do vậy xác định chỉ thị EPCA sẽ làm giảm nguy cơ các trường hợp âm tính giả khi
sinh thiết. EPCA có khối lượng phân tử khoảng 40kDa và điểm đẳng điện khoảng 6,73. Sử
dụng kháng nguyên EPCA có thể phát hiện mầm bệnh ở bệnh nhân sớm hơn 1-2 năm trước
khi có biểu hiện về hình thái ung thư tuyến tiền liệt. Các kháng thể kháng EPCA có hiệu quả
như một yếu tố góp phần nghiên cứu bệnh lý của các mẫu sinh thiết tiền liệt tuyến để phát
hiện ung thư tuyến tiền liệt sớm hơn so với làm sinh thiết nhiều lần, cũng như có tiềm năng
giới hạn số lần làm sinh thiết ở một bệnh nhân [26].
1.3. KHÁNG THỂ
1.3.1. Cấu trúc

Kháng thể là một sản phẩm đặc hiệu được hệ miễn dịch tổng hợp giúp cơ thể tấn công
các tác nhân gây bệnh. Các kháng thể là các immunoglobulin (có bản chất glycoprotein), do
các tế bào lympho B, các tương bào (biệt hoá từ lympho B) tổng hợp và tiết ra giúp hệ miễn
dịch nhận biết và vơ hiệu hố các tác nhân lạ, chẳng hạn các vi khuẩn hoặc virus [4].
Chuỗi nhẹ
Có trọng lượng phân tử 25kDa, chứa khoảng 211 – 221 axit amin. Có hai loại chuỗi nhẹ là
kappa (Қ) và lambda (λ). Mỗi phân tử Ig chỉ chứa hoặc hai chuỗi nhẹ Қ hoặc hai chuỗi nhẹ λ
mà không bao giờ chứa cả hai loại. Mỗi chuỗi nhẹ của Ig chứa hai vùng axit amin: vùng biến
đổi (VL) nằm ở đầu phía đầu amin (-NH2) của phân tử và vùng cố định (CL) nằm ở phía đầu
cacboxyl (-COOH) [4,6
Chuỗi nặng
Trọng lượng phân tử của chuỗi nặng khoảng 50 kDa, chứa khoảng 450 axit amin. Có 5 loại
chuỗi nặng là γ, μ, α, δ và ε ứng với 5 lớp kháng thể IgG, IgM, IgA, IgD và IgE [6]. Mỗi
chuỗi nặng có 4 vùng axit amin: một vùng biến đổi (VH) nằm ở phía đầu amin và ba vùng cố
định nằm ở phía đầu cacboxyl ký hiệu là CH1, CH2, CH3. Hai vùng biến đổi của chuỗi nặng
và chuỗi nhẹ nằm kề nhau tạo thành vị trí kết hợp kháng nguyên hay paratop do vậy đảm bảo
tính đa dạng của phân tử kháng thể [6].


1.3.2. Mảnh kháng thể
Hai mảnh kháng thể được thiết kế gắn với kháng nguyên – Fab và Fv được tách dòng
và bộc lộ trên phage. Mảnh kháng thể lớn hơn – Fab gồm các phần VH – CH và VL – CL liên
kết với nhau bằng cầu disulfide, còn mảnh kháng thể nhỏ hơn – Fv chỉ bao gồm vùng VH và
VL. Dạng tái tổ hợp của Fv là mảnh biến đổi đơn chuỗi được nối với nhau bằng một đoạn
peptide, thường gồm 15 axit amin có trình tự (Gly4Ser)3 và được biểu hiện như một chuỗi
polypeptide đơn. Đoạn nối cho phép vùng biến đổi của chuỗi nặng (VH) kết hợp với vùng
biến đổi của chuỗi nhẹ (VL) tạo thành phân tử đơn chuỗi. Phân tử tái tổ hợp tạo ra vẫn bảo tồn
hoạt tính nhận biết và liên kết đặc hiệu với kháng nguyên đích [45]. Đặc điểm của các mảnh
kháng thể khác nhau được tóm tắt trong bảng 2.
1.3.3. Kháng thể tái tổ hợp

Kháng thể tái tổ hợp là thuốc thử cần thiết cho nghiên cứu, chẩn đoán và điều trị [25].
Nhu cầu sử dụng kháng thể trong nghiên cứu khoa học, trong chẩn đoán và điều trị bệnh ngày
càng lớn, đặc biệt là các kháng thể đặc hiệu có nguồn gốc từ người, nhưng nguồn kháng thể
người thường khó kiếm được. Vì vậy, phương pháp chung để thu nhận được các kháng thể là
từ động vật gây miễn dịch và sau đó nhân tính hố để hạn chế tối đa phản ứng miễn dịch khi
sử dụng.
1.3.4. Kháng thể đặc hiệu các loại kháng nguyên
Phản ứng kháng nguyên - kháng thể rất đặc hiệu, vì vậy để thu nhận được các kháng thể
đặc hiệu kháng nguyên đích ta cần hiểu rõ mối tương tác kháng nguyên - kháng thể, xác định
nét đặc trưng của kháng thể đối với các kháng nguyên có nguồn gốc, bản chất khác nhau.
1.3.5. Các phƣơng pháp tạo kháng thể.
Nhu cầu sử dụng kháng thể trong nghiên cứu khoa học, trong chẩn đoán và điều trị bệnh
ngày càng lớn, đặc biệt là các kháng thể đặc hiệu có nguồn gốc của người. Vì vậy, phương
pháp chung để nhận được các kháng thể là từ động vật gây miễn dịch và sau đó nhân tính hóa
để hạn chế tối đa phản ứng miễn dịch khi sử dụng.
Đáp ứng miễn dịch dịch thể của cơ thể được hình thành khi có kháng ngun xâm nhập
và cảm ứng tạo ra các loại kháng thể. Các kháng thể trong huyết thanh của động vật gây miễn
dịch với kháng nguyên đích sau khi tinh sạch được sử dụng như một công cụ nghiên cứu rất
hiệu quả và đôi khi được sử dụng trực tiếp trong điều trị. Tuy nhiên các kháng thể đa dịng có
tính đặc hiệu khơng cao, vì đó là tập hợp các kháng thể nhận biết các epitope khác nhau của
kháng ngun đích. Vì vậy, việc tìm ra phương pháp tạo kháng thể đơn dịng của Kohler và
Milstein đã đóng vai trị quan trọng trong nghiên cứu thu nhận các kháng thể đơn dịng với
tính đặc hiệu cao.
Phương pháp thu nhận kháng thể đơn dòng của Kohler và Milstein (1975) bao gồm các
bước:
- Gây miễn dịch cho chuột bằng kháng nguyên đích.
- Tạo tế bào lai bằng cách dung hợp tế bào lympho B (đã hoạt hóa bằng kháng ngun đích
là kháng ngun đã sử dụng để gây miễn dịch) được tách từ lách chuột với tế bào
myeloma của chuột.
- Chọn lọc các tế bào lai có khả năng sản xuất kháng thể đơn dịng đặc hiệu kháng ngun

đích.
Sử dụng dịng tế bào lai chọn được để sản xuất kháng thể đơn dòng bằng cách tạo báng ở
chuột hoặc nuôi cấy tế bào trong môi trường đặc biệt
1.4. THƢ VIỆN KHÁNG THỂ BỘC LỘ TRÊN THỰC KHUẨN THỂ
Trước đây, cách gây miễn dịch ở động vật theo kỹ thuật tế bào lai đã từng được sử dụng
để tạo ra kháng thể đơn dòng kháng lại kháng ngun (có tính đa dạng cao). Những tiến bộ
trong sinh học phân tử đã cho phép sử dụng vi khuẩn Escherichia coli trong việc sản xuất
kháng thể tái tổ hợp. Với kích thước giới hạn các mảnh kháng thể như Fab, Fv, scFv không


chỉ được biểu hiện trên bề mặt tê bào vi khuẩn mà còn được bộc lộ trên bề mặt thực khuẩn
thể (phage) bằng cách dung hợp với protein vỏ phage
Phage hình sợi là một nhóm virus gây nhiễm vi khuẩn lớn, chúng gây nhiễm nhiều vi
khuẩn Gram âm khác nhau. Đặc điểm chung của chúng là hệ gen mạch vòng đơn được bao
bọc bởi lớp vỏ dài dạng ống, tương đối linh động và được cấu tạo bởi hàng nghìn bản sao của
một loại protein chủ yếu và một vài loại protein thứ yếu phân bố ở hai đầu ống
Hệ gen của phage hình sợi nhỏ, có khoảng hơn 10 gen phân bố sát nhau và một vùng
khơng mã hóa (vùng IG) chứa trình tự cần thiết cho sự nhân bản và đóng gói của phage.
Khơng giống với các virus gây nhiễm vi khuẩn khác, phage hình sợi được tổng hợp và giải
phóng ra khỏi tế bào vi khuẩn chủ mà không làm tan tế bào chủ. Hầu hết các thơng tin về
phage hình sợi đều nhận được từ các nghiên cứu về phage f1, M13, fd và một phần nhỏ từ
phage Ike. Các phage f1, M13, fd đã được sử dụng để biểu lộ các chuỗi polypeptide. Hệ gen
của các phage hình sợi có sự tương đồng với nhau hơn 98% và các sản phẩm gen của chúng
có thể thay thế cho nhau và vì vậy các phage này được gọi chung là phage Ff
Tính đặc hiệu của bất kỳ kháng thể nào phụ thuộc vào các vùng quyết định tính bổ trợ
(CDR): 3 vùng CDR trên chuỗi nặng và 3 vùng CDR
chuỗi sử dụng trong chẩn đoán và điều trị ung thư, (ii) phân tách kháng thể từ người
bệnh do virus để hiểu tốt hơn về đáp ứng miễn dịch trong quá trình xâm nhiễm của virus, (iii)
làm sáng tỏ tính đặc hiệu của kháng thể tự miễn và nghiên cứu sự tương tác giữa các phân tử.
Các đoạn kháng thể dạng Fab và scFv đều có thể được bộc lộ trên bề mặt của thực khuẩn thể

M13 mà khơng mất đi ái lực và tính đặc hiệu kháng nguyên.
Về cơ bản, để tạo ra thư viện kháng thể cần khuếch đại các đoạn gen mã hóa chuỗi
nặng và chuỗi nhẹ từ mô bạch huyết hoặc lympho bào máu ngoại biên bằng phiên mã ngược
và PCR. Cắt sản phẩm PCR bằng các enzyme giới hạn và tách dòng vào vector phagemid để
có thể biểu hiện khi dung hợp với protein của phage [27]. Thơng thường các trình tự gen tái
tổ hợp mã hóa các đoạn kháng thể được nối với đầu N của gen mã hóa protein vỏ pIII và
pVIII hoặc cũng có thể gắn với đầu N của protein vỏ pVII, pIX.
Chất lượng thư viện có thể được kiểm tra theo các thông số sau:
 Số lượng các dòng chứa phagemid mang đoạn scFv.
 Số lượng dòng biểu hiện phage mang scFv.
 Số lượng dòng biểu hiện kháng thể scFv hòa tan.
Một số thư viện đã được tạo ra và sử dụng phổ biến là Nissim Library, được tạo ra trong
phịng thí nghiệm của Dr.G.Winter tại Cambridge (1994), và thư viện của De Kruif và cộng
sự (1995). Nổi bật nhất là thư viện tổng hợp Fab và scFv do Griffiths và cộng sự tạo ra.
Cách đơn giản và thường được sử dụng nhất là cố định các phân tử đích trên giá thể và
cho dung dịch chứa phage đi qua. Một số biến thể của phương pháp này đã được sử dụng
thành công bao gồm cố định tên các ống hoặc phiến kính có bề mặt biến đổi hóa học, trong
các cột hoặc trên bề mặt các hạt từ. Có thể cố định một số phân tử sinh học bằng phương
pháp hấp phụ thụ động trên ống polystyrene có bề mặt được biến đổi thích hợp như MaxiSorp
TM hoặc sử dụng đích được biotin hóa. Các phương pháp sàng lọc tân tiến hơn cũng đã được
áp dụng bao gồm sàng lọc với toàn bộ tế bào sống, với phân đoạn mơ cố định hoặc thậm chí
trong động vật sống
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU.
2.1.1. Sinh phẩm
- Gen mã hóa kháng thể scFv đặc hiệu kháng nguyên UTTLT được cung cấp từ nguồn
gen thiết kế thuộc phịng Cơng nghệ tế bào động vật, viện Công nghệ sinh học.


- Phagemid pHEN2.

- E.coli chủng TG1 do trung tâm Công nghệ Protein MRC Vương Quốc Anh cung cấp.
- Kháng thể cộng hợp kháng M13 (anti-M13 horseradish peroxidase-conjugate) của
hãng Amersham Biosciences, USA.
- 31 mẫu máu của bệnh nhân ung thư tiền liệt tuyến do khoa hóa sinh, bệnh viện Bạch
Mai cung cấp.
2.1.2. Hóa chất
Hóa chất sử dụng là các hóa chất tiêu chuẩn chuyên dùng cho sinh học phân tử do các
hãng hóa chất có uy tín như Invitrogen, Fermentas… cung cấp và các hóa chất khác của
phịng thí nghiệm trọng điểm công nghệ Gen – Viện Công nghệ sinh học: Cao nấm men
(Yeast extract), Tryptone, Agar, Ampicillin, Tris-HCl, EDTA, NaOH, SDS, EtBr, Phenol,
Chloroform, isoamyl alcohol, acid acetic, nước khử ion vô trùng, BSA, Taq buffer, CaCl2…
2.1.3. Trang thiết bị
 Máy ly tâm lạnh (Eppendorf, CHLB Đức).
 Máy lắc ổn nhiệt.
 Bể ổn nhiệt.
 Lị vi sóng (Samsung).
 Tủ lạnh sâu (-200C, -850C);
 Máy Voltex (Rotolab, OSI).
 Máy điện di.
 Máy đo pH.
 Tủ cấy vô trùng.
 Pipetman các loại (Gilson, Pháp).
 Máy soi chụp gel (Pharmacia) và các thiết bị khác chủ yếu thuộc phịng thí nghiệm
trọng điểm, Viện Cơng nghệ Sinh học.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Nhân bản gen bằng kĩ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
2.2.2. Phƣơng pháp cắt và gắn DNA
2.2.3. Phƣơng pháp tạo tế bào khả biến E.coli TG1.
2.2.4. Biến nạp Plasmid vào tế bào E.coli
2.2.5. Phƣơng pháp nuôi cấy vi sinh vật

Các chủng vi khuẩn được ni cấy trong bình tam giác với thể tích từ 20 – 50 ml chứa 515ml mơi trường thích hợp cho từng loại. Bình ni cấy được đặt trong máy lắc ổn nhiệt ở
370C với tốc độ lắc 220v/ph.
2.2.6. Phƣơng pháp giữ chủng
Các khuẩn lạc đơn được trải trên môi trường thạch thích hợp, ủ 370C qua đêm. Sau đó, có
thể giữ đĩa thạch chứa các chủng này tại 40C trong vòng 2 tuần.
2.2.7. Phƣơng pháp điện di trên gel Agarose
DNA tích điện âm có khả năng chuyển động trong điện trường theo chiều từ cực âm
đến cực dương. Tốc độ chuyển động của chúng trong điện trường có hiệu điện thế không đổi
phụ thuộc vào các yếu tố: Dạng tồn tại của DNA, kích thước DNA, nồng độ agarose trong gel
và hiệu điện thế giữa hai cực. Các DNA có kích thước càng lớn thì chuyển động càng chậm,
các DNA dạng siêu xoắn cũng chuyển động nhanh hơn DNA dạng thẳng. Trong một phạm vi
nhất định của nồng độ gel agarose. Thường các đoạn gen có kích thước từ 300 – 10.000 bp có
thể được phân tách trên gel agarose 0,8%. Đoạn gen càng nhỏ thì nồng độ agarose càng phải
tăng lên.
2.2.8. Xác định trình tự nucleotide của DNA bằng máy giải trình tự trên cơ sở phƣơng
pháp dideoxy (Sanger)


Nguyên tắc: Sử dụng dideoxynucleotide (ddNTP) có đánh dấu huỳnh quang để làm
ngừng các mạch đơn DNA đang được tổng hợp một cách ngẫu nhiên. Enzyme DNA
polymerase xúc tác gắn các nucleotide vào mạch đơn DNA đang tổng hợp ở vị trí 3’- OH, khi
gặp ddNTP (khơng có nhóm 3’- OH) thì phản ứng tổng hợp bị ngừng lại.
2.2.9. Chuẩn bị thƣ viện phage.
2.2.10. Bộc lộ mảnh kháng thể scFv trên phage M13.
2.2.11. Phƣơng pháp ELISA
ELISA là một kỹ thuật hóa sinh sử dụng chủ yếu trong miễn dịch học để phát hiện sự
có mặt của một kháng thể hoặc một kháng nguyên trong mẫu. ELISA được sử dụng như một
cơng cụ phân tích trong y học và bệnh học, cũng như là một phép kiểm tra chất lượng trong
nhiều ngành công nghiệp khác nhau. Trong ELISA, một lượng kháng nguyên chưa biết được
cố định trên một bề mặt, và sau đó kháng thể đặc hiệu được đưa vào để chúng có thể liên kết

với kháng nguyên. Những kháng thể này được gắn với một enzyme, và trong bước cuối cùng
cơ chất được thêm vào để enzyme có thể chuyển chúng thành tín hiệu phát hiện. Vì thế trong
trường hợp của ELISA fluorescence, khi ánh sáng với bước sóng thích hợp chiếu vào mẫu,
bất kỳ phức hệ kháng nguyên-kháng thể nào cũng phát sáng đủ để lượng kháng nguyên trong
mẫu có thể đo được thơng qua cường độ phát sáng.
CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả nhân bản gen mã hóa mảnh kháng thể scFv bằng PCR.
Để có thể thu được gen mã hóa mảnh kháng thể scFv đặc hiệu kháng nguyên EPCA của
bệnh ung thư tiền liệt tuyến đủ cho việc thiết kế vector biểu hiện, chúng tôi thực hiện phản
ứng nhân gen bằng kỹ thuật PCR với 2 mồi đặc hiệu:
TTLF: 5’GGCCCCATGGCCATTGCGGGCCTG – 3’
TTLR: 5’- GATGTGCGGCCGCACGTTTGATTTC – 3’
Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gen agarose như hình 1:

M

1

500
bp

Hình 1: Điện di sản phẩm PCR
M: Marker DNA 1kb ( Fermentas), G1: Sản phẩm PCR.
Hình ảnh điện di trên cho thấy sản phẩm PCR thu được khá đặc hiệu, kết quả phù hợp
với tính tốn lý thuyết, băng thu được có kích thước như mong muốn là 496 bp. Như vậy, có
thể khẳng định chúng tôi đã nhân bản thành công gen scFv mã hóa cho mảnh kháng thể scFv


đặc hiệu kháng nguyên EPCA của UTTLT, gen thu được mang hai vị trí cắt của hai enzyme
giới hạn NcoI và NotI.

3.2. Kết quả tạo vector tái tổ hợp pHEN2 - scFv
Từ nguồn sản phẩm PCR thu được ở trên, chúng tôi đã sử dụng các enzyme giới hạn
NotI và NcoI xử lý chúng để tạo hai đầu dính giúp cho việc gắn gen vào phagemid được dễ
dàng hơn. Tương tự, phagemid pHEN2 cũng được xử lý với hai enzyme trên tạo hai đầu dính
bổ sung. Hỗn hợp phản ứng được ủ trong bể ổn nhiệt 37oC trong thời gian 16 giờ. Sau đó, sản
phẩm cắt được điện di trên gel agarose và tiến hành tinh sạch từ gel để thu được gen scFv và
phagemid pHEN2 có hai đầu dính đảm bảo cho phản ứng nối gen.
Sau đó nhờ enzyme nối T4 ligase nối hai đầu dính của đoạn gen scFv vào vector mở
vòng pHEN2. Thực hiện biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt vector tái tổ hợp pHEN2 vào
vi khuẩn E.coli chủng TG1 theo quy trình 2.2.4 như đã trình bày ở trên. Phagemid pHEN2 có
chứa đoạn gen kháng kháng sinh ampicillin nên khi vector này được biến nạp vào vi khuẩn
E.coli thành cơng thì những tế bào chứa phagemid sẽ sống sót trên mơi trường có ampicillin.
Cịn những tế bào không nhận vector sẽ không mọc được trên đĩa LB có bổ sung ampicillin.

Hình 2: Kết quả biến nạp sản phẩm nối ghép giữa phagemid pHEN2 với gen scFv
vào E.coli chủng TG1
Kết quả biến nạp cho thấy trên đĩa LB-agar, các khuẩn lạc trắng mọc riêng rẽ có thể
phân biệt bằng mắt thường. Như vậy, quá trình biến nạp vector tái tổ hợp vào E.coli TG1
thành công. Tuy nhiên, sự xuất hiện của các khuẩn lạc này mới chỉ khẳng định được trong tế
bào vi khuẩn TG1 thu được có chứa phagemid pHEN2 cịn pHEN2 đã chứa gen scFv hay
chưa thì chưa xác định được. Do đó, chúng tơi tiến hành kiểm tra chọn dịng tế bào TG1 chứa
phagemid tái tổ hợp 3.3. Chọn dòng phagemid tái tổ hợp mang gen scFv đặc hiệu UTTLT
Để tiến hành chọn dòng phagemid tái tổ hợp mang gen scFv đặc hiệu UTTLT chúng tôi
sử dụng phương pháp PCR khuẩn lạc. 7 khuẩn lạc được chọn để tiến hành PCR cùng
phagemid gốc với cặp mồi của vector pHEN2 có tên là LabF/R và chu trình nhiệt phù hợp.
Cặp mồi LabF/R được thiết kế nằm về hai phía của vùng cắt gắn đa điểm, nếu vector gốc
chưa gắn thêm đoạn gen ngoại lai thì sau khi PCR với mồi Lab sẽ thu được sản phẩm khoảng
200 bp, nếu vector gắn thêm đoạn gen ngoại lai thì sản phẩm PCR thu được sẽ có kích thước
bằng kích thước của gen ngoại lai cộng với 200 bp.
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR được thể hiện trên hình 18:

1
M

2

3

4

5

6

7


700bp

750bp

Hình 3: Kết quả PCR từ khuẩn lạc chọn dịng chủng TG1 chứa phagemid tái tổ hợp pHEN2scFv
G1-7: Các khuẩn lạc từ 1-7
Kết quả điện di trên hình 18 cho thấy các khuẩn lạc 1,2,3,5 cho băng điện di có kích
thước mong muốn là khoảng 700bp, trong khi 3 khuẩn lạc 4,6,7 khơng nhìn thấy băng. Điều
đó chứng tỏ khả năng 4 dòng tế bào 1,2,3,5 đều chứa phagemid tái tổ hợp pHEN2-scFv. Tuy
nhiên, để khẳng định chắc chắn chúng tơi tiến hành tách chiết phagemid và xác định trình tự,
đồng thời kiểm tra gen mã hóa scFv đặc hiệu kháng nguyên EPCA của UTTLT gắn vào
pHEN2 có đúng chiều và khung đọc hay khơng.
3.4. Xác định trình tự gen scFv trong phagemid tái tổ hợp pHEN2/scFv.

Trong 4 dòng TG1 có khả năng mang phagemid tái tổ hợp đã xác định sơ bộ bằng
phương pháp PCR từ khuẩn lạc, chúng tôi chọn khuẩn lạc số 2 cho băng sắc nét nhất để nhân
ni trong mơi trường LB lỏng có bổ sung ampicilline (100 μg/ml) và tách chiết phagemid.
Kết quả tách chiết phagemid tái tổ hợp được thể hiện trên hình 4.

1
2

Hình 4. Kết quả tách chiết phagemid tái tổ hợp
Giếng 1,2: Các phagemid tách chiết từ khuẩn lạc số 2.
Phagemid thu được được tiến hành xác định trình tự với mồi LabF sử dụng kit “Big
Dye Terminator sequencing kit” (ABI, Mỹ) và thực hiện trên máy xác định trình tự ABI


PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer theo phương pháp Sanger và cs. Kết quả thu được
được thể hiện trên hình 5.
1 ATCCTATTGC CTACGGCAGC CGCTGGATTG TTATTACTCG CGGCCCAGCC
51 GGCCATGGCC ATTGCGGGCC TGGCGACCCC GGGCTGGAGC
CATTGGCTGG
101 CGCTGACGCC ATGGCCCAGG TGCAGCTGCA GGTCGACCTC
GAGTGGTGGA
151 GGCGGTTCAG GCGGAGGTGG CTCTGGCGGT AGTGCACTTG
AGATTGTGAT
201 GACCCAGACT CCACTCTCCT CACCTGTCAC CCTTGGACAG
CCGGCCTCCA
251 TCTCCTGCAG GTCTAGTCAA AGCCTCGTAC ACAGTGATGG
AAACACCTAC
301 TTGAGTTGGC TTCAGCAGAG GCCAGGCCAG CCTCCAAGAC
TCCTAATTTA
351 TAAGATTTCT AACCGGTTCT CTGGAGTGCC AGATAGGTTC

AGTGGCAGCG
401 GGTCAGGGAC AGATTTCACA CTGAAAATCA GCAGGGTGGA
AGCTGAGGAT
451 GTCGGGGTTT ATTACTGCAT GCAAGCTGCA CAATTTCGCC
GTTCTACGTT
501 CGGCCAGGGG ACCAAGCTGG AAATCAAACG TGCGGCCGCA
CTCGAGCACC
551 ACCACCACCA CCACTGA
Hình 5: Trình tự gen scFv đặc hiệu kháng nguyên EPCA của UTTLT
Các chữ màu đỏ: trình tự gen scFv; chữ màu đen: 1 phần trình tự phagemid pHEN2
Từ trình tự gen thu được để tiến hành kiểm tra xem gen scFv gắn vào phagemid pHEN2
đã đúng chiều đúng khung đọc hay chưa, chúng tôi tiến hành suy diễn ra trình tự amino acid
bằng phần mềm chuyên dụng, kết quả thu được như sau:
1 ILLPTAAAGL LLLAAQPAMA IAGLATPGWS HWLALTPWPR CSCRSTSSGG
51 GGSGGGGSGG SALEIVMTQT PLSSPVTLGQ PASISCRSSQ SLVHSDGNTY
101 LSWLQQRPGQ PPRLLIYKIS NRFSGVPDRF SGSGSGTDFT LKISRVEAED
151 VGVYYCMQAA QFRRSTFGQG TKLEIKRAAA LEHHHHHH*
Hình 6: Trình tự amino acid suy diễn
Kết quả thu được giúp chúng tơi khẳng định chắc chắn rằng gen mã hóa cho scFv đặc
hiệu kháng nguyên EPCA đã được gắn vào phagemid pHEN2 theo chiều đúng khung đọc
đảm bảo cho quá trình bộc lộ scFv trên bề mặt phage.
3.5. Kết quả bộc lộ mảnh kháng thể scFv trên phage M13
E.coli chủng TG1 chứa phagemid-scFv đã chọn được ở trên được nhân nuôi ở 37oC
đến khi đạt OD600 = 0,5 và sau đó được hiễm helper phage M13 vào để hỗ trợ việc hình thành
phage-scFv một cách hồn chỉnh theo phương pháp 2.2.10. Một trong những điểm mạnh của
kỹ thuật phage display là mối tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình, trong đó bộ gen của
phage thực chất là phagemid vector (pHEN2 vector).


M

1

2

750bp

700bp

Hình 7 : Kết quả điện di sản phẩm PCR
M: Marker DNA 1kb ( Fermetas); G 1,2: Mẫu PCR kiểm tra với 2 nồng độ khuôn
khác nhau.
Từ kết quả trên hình 7 cho thấy đã thu được băng có kích thước mong muốn là
khoảng 700bp. Chứng tỏ kháng thể scFv đã biểu hiện được thành công trên bề mặt phage. Để
xác định chính xác lượng kháng thể tạo ra chúng tôi tiến hành đo nồng độ trên máy
nanodrope ở bước sóng 269nm. Kết quả sau 3 lần chuẩn phage và tính giá trị trung bình cho
chúng tơi kết quả là 3.10 mũ 7 phân tử kháng thể trong 1 ml dịch thu phage. Như vậy, chứng
tỏ quá trình bộc lộ kháng thể ung thư tiền liệt tuyến scFv trên bề mặt phage M13 đã thành
công.
3.6. Kết quả thực hiện phản ứng ELISA kháng thể phage-scFv với huyết thanh bệnh
nhân.
Với kháng thể phage-scFv thu được chúng tôi sử dụng để chẩn đoán bệnh nhân ung thư
tiền liệt tuyến bằng cách thực hiện phản ứng ELISA kết hợp với huyết thanh trong máu bệnh
nhân. Huyết thanh của bệnh nhân bị bệnh có chứa kháng nguyên ung thư tiền liệt tuyến
EPCA sẽ kết hợp đặc hiệu với kháng thể thu được. Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng
20 mẫu huyết thanh của những bệnh nhân bị bệnh ung thư tiền liệt tuyến và u xơ tiền liệt
tuyến lành tính được cung cấp từ bệnh viện Bạch Mai.
Bảng 2: Kết quả ELISA mẫu huyết thanh bệnh nhân:
Huyết OD450 Huyết
OD450

Huyết
OD450
Huyết
OD450
thanh
nm
thanh
nm
thanh
nm
thanh
nm
1
2
3
4
5
6
7
8

0,157
0,195
0,167
0,179
0,183
0,187
0,147
0,156

9
10
11
12
13
14
15
16

0,048
0,030
0,027
0,027
0,026
0,031
0,035
0,028

17
18
19
20
21
22
23
24

0.035
0.032
0.029

0.037
0.043
0.046
0.039
0.040

25
26
27
28
29
30
31
32

0.029
0.037
0.036
0.037
0.039
0.042
0.043
0.035


Kết quả biểu thị trên sơ đồ:
OD 450

20 mẫu huyết thanh bệnh nhân
10 mẫu huyết thanh

thường

Hình 8: Kết quả phản ứng ELISA đo ở bước sóng 450nm.
Kết quả cho thấy: Trong 7 mẫu bệnh nhân, các mẫu từ số 1-8 là những bệnh nhân bị bệnh có
ái lực cao hơn hẳn so với các mẫu còn lại từ 9-20 là những bệnh nhân âm tính với UTTLT.
Các giếng đối chứng từ 21-31 cũng cho giá trị OD thấp tương đương với các mẫu khơng bị
bệnh. Mặt khác, có thể thấy tất cả các giếng của những người bình thường khơng có kháng
nguyên EPCA (9-31) và giếng đối chứng đều cho giá trị OD450 dưới 0.05, trong khi các mẫu
bị bệnh cho giá trị OD450 cao hơn 0.15. Điều đó chứng tỏ sử dụng kháng thể phage-scFv
trong chẩn đoán bệnh ung thư tiền liệt tuyến cho kết quả khá ổn định và chính xác, hồn tồn
có thể thử nghiệm thành cơng với số lượng bệnh phẩm lớn có ý nghĩa thống kê.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1.

KẾT LUẬN
Đã thiết kế thành công phagemid tái tổ hợp pHEN2 mang gen mã hóa kháng thể scFv
đặc hiệu kháng nguyên EPCA của bệnh ung thư tuyến tiền liệt.
 Đã thu nhận được kháng thể tái tổ hợp phage-scFv gắn đặc hiệu với kháng nguyên ung
thư tiền liệt tuyến EPCA bằng kỹ thuật phage display.
 Kiểm tra thành cơng tính đặc hiệu của kháng thể scFv thu được bằng phản ứng ELISA.
2.
KIẾN NGHỊ
 Tiếp tục nghiên cứu quy trình chẩn đốn bệnh ung thư tiền liệt tuyến bằng kĩ thuật
ELISA chính xác hơn nữa để ứng dụng vào trong y học.
 Nghiên cứu biểu hiện kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên ung thư tiền liệt
tuyến trong chẩn đoán.


References
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. />2. />3. />4. Lê Quang Huấn, Lã Thị Huyền (2009) - Kháng thể tái tổ hợp và ứng dụng, NXB Khoa
học tự nhiên và công nghệ Hà Nội, 2009.
5. Nguyễn Văn Tuấn, Ung thư tuyến tiền liệt và vấn đề thông tin y khoa.
6. Phạm Văn Ty (2004) - Miễn dịch học, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội.
7. Tôn Thất Hứa (2005), Ung thư tiền liệt tuyến : Phát hiện sớm – kết quả tốt, Đại học y
khoa Wuerzburg, CHLB Đức.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
8. A. Heidenreich, M. Bolla, S. Joniau et al....(2010), Guidelines on Prostate Cancer,
European Association of Urology.
9. Andris-Widhopf, Steinberger, Barbas, (2001), “Bacteriophage display of combinatorial
antibody libraries”, Encyclopedida of Life Sciences.
10. Anna M. Wu, Tove Olafsen, Andrew A. Raubitschek (2007), Engineered anti- CD20
antibody fragments for in vivo targeting and therapeutics, United States Patent
Application Publication, Pub. No US 2007/0280882. Pub date Dec. 6. 2007 p 1-12.
11. Clackson T, Hoogenboom HR, Griffiths AD, Winter G. (1991), “Making antibody
fragments using phage display libraries”, Nature. 352: 624–8.
12. David M Glodenberg, Robert M Sharkey, Jaques Barbet, Jean Francois Chatal ( 2007),
Radioactive antibodies: selective targeting and treatment of cancer and other diseases,
Appl Radiol 2007; 36(4).
13. Drudge-Coates L, Turner B. (2012), “Prostate cancer overview. Part 2: metastatic prostate
cancer”, pp.11-24.
14. Gregore and Louis (2005). Review on “ Monoclonal antibody therapy of cancer”. Nature
Biotechnology. 23, 1147-1157.
15. Griffiths, Dand Duncan, (1998), “Strategies for selection of antibodies by phageDisplay”,
Curr. Opin. Biotechnol. Vol. 9, pp. 102–108.
16. Griffiths, Andrew, David Hoogenboom, Hendricus, Renerus, Jacobus, Mattheus Marks,
James, David McCafferty, John Winter, Gregory, Paul Grigg, Geoffrey, Walter (1993),
“Productiion of anti-sefl antibodies from antibody segment repertories and displayed on

phage” WIPO.
17. Guan, Zhang, Wang, (1995), “Electrostatic potential distribution of the gene V protein
from Ff phage facilitates cooperative DNA binding: a model of the GVP-ssDNA
complex”, Protein Sci. 4:187.
18. Hoogenboom, Chames, P (2000), “Natural and designer binding sites made by phage
display technology”, Immunology Today. 21, 371.
19. Hoogenboom, de Bruine AP, Hufton SE, Hoet RM, Arends JW, Roovers RC (1998),
“Antibody phage display technology and its applications”, Immunotechnology. 4:1–20.
20. Jame boye, T. Elter & A. Engert ( 2003). An overview of the current clinical use of the
anti- CD20 monoclonal antibody rituximab Annals of Oncology. 14 p 520- 535, 2003.
21. J. Ramon Denis (Eds). (2007), Prostate cancer, Belgium.
22. Janice M R, et al ( 2005). Monoclonal antibody successes in the clinic. Nature
Biotecnology, 23(9), p.1073-1078.
23. Jingjing You, Paul Cozzi, Bradley Walsh, Mark Willcox, John Kearsley, Pamela Russell,
Yong Li (2009), Innovative biomarkers for prostate cancer early diagnosis and
progression, Introduction p11.


24. Johns. M, George, Ritter (2000), “In vivo selection of scFv from phage display libraries”,
J. Immunol. Meth. 239:137-151.
25. Jordan E., Hust M., Roth A., Biedendieck R., Schirrmann T., Jahn D., Dübel S. (2007)
“Production of recombinant antibody fragments in Bacillus megaterium”, Microbial Cell
Factories.
26. Jurol., Hansel DE, DeMarzo AM, Platz EA, Jadallah S, Hicks J, Epstein JI, Partin
AW, Netto GJ (2007) May, “Early prostate cancer antigen expression in predicting
presence of prostate cancer in men with histologically negative biopsies”, 177(5):173640.
27. Kehoe, J. Wash, Kay, (2005), “Filamentous phage display in the new millennium”, Chem.
Rev. 105:4056-4072.
28. Knappick, L.; Honegger, A.; Pack, P.; Fischer, M.; Wellnhofer G.; Hoess A,; Wolle; Pluă
ckthun, A.; Virnekas, B (2000), Fully synthetic human combinatorial antibody libraries

(HuCAL) based on modular consensus frameworks and CDRs randomized with
trinucleotides”, J. Mol. Biol. 296.
29. Kohler G., Milstein C. (1975), “Continuous cultures of fused cells secreting antibody of
predefined specificity”, Nature, 256, pp.495- 497.
30. Kohler, Milstein (1975).Continuous cultures of fused cells secreting antibody of
predefines specificity. Nature 256, 495-497.
31. Konings, Folmer, Folkers, P. J Nilges, Hilbers, (1995), “Three-dimensional structure of
the single-stranded DNA-binding protein encoded by gene V of the filamentous
bacteriophage M13 and a model of its complex with single-stranded DNA”, FEMS
Microbiol. Rev. 17:57-72.
32. Mead DA, Kemper B (1988), “Chimeric single-stranded DNA phage-plasmid cloning
vectors”, Biotechnology. 10:85–102.
33. Morrow AL, Rangel JM Semin Pediatr Infect Dis. 2004 “Human milk protection against
infectious diarrhea: implications for prevention and clinical care”.
34. Muyldermans, S (2001), “Single domain camel antibodies: current status”, J. Biotechnol.
74, 277.
35. Nakamura, M., Tsumoto, K., Kumagai, I., Ishimura, K (2003), “A morphologic study of
filamentous phage infection of Escherichia coli using biotinylated phages”, FEBS Lett.
536:167-172.
36. Neri D, Petrul H, Roncucci G (1995), “Engineering recombinant antibodies for
immunotherapy”, Cell Biophys. 27:47–61.
37. Nissim A, Hoogenboom HR, Tomlinson IM, et al. (1994), “Antibody fragments from a
’single pot’ phage display library as immunochemical reagents”, EMBO. 13:692–8.
38. Pacini, L., Vitelli, A., Filocamo, G., Bartholomew, L., Brunetti, M., et al. 2000. In vivo
selection of protease cleavage sites by using chimeric Sindbis virus libraries. J. Virol.
74:10563-10570.
39. Philipp Holliger & Peter Hudson, (2005), Engineered antibody fragment and the rise of
single domains, natural biotechnology.
40. Rader, C (2001), “Antibody libraries in drug and target discovery”, Drug Discovery
Today. 6, 36.

41. Riechmann, L., Holliger, P (1997) "The C-terminal domain of TolA is the coreceptor for
filamentous phage infection of E. coli”, Cell. 90:351-360.
42. Rodney J.Y.HO, Milo Gibaldi ( 2003), Biotechnology and Biopharmaceuticals,
transforming proteins and genes into drugs, Wiley- liss, p 271- 311.
43. Skerra A, Pluăckthun A (1988), Assembly of a functional immunoglobulin Fv fragment
in Escherichia coli”, Science. 240:1038–41.


44. Soderlind. E; Simonsson; Borrebaeck (1992), “Phage display technology in antibody
engineering: design of phagemid vectors and in vitro maturation systems”, Immunol. Rev.
130, 109.
45. Tordsson JM, Ohlsson LG, Abrahmsen LB, Karlstrom PJ, Lando PA, Brodin TN (2000),
“Phage-selected primate antibodies fused to superantigens for immunotherapy of
malignant melanoma”, Cancer Immunol Immunother. 48:691–702.
46. Urban, Schneider, Compte, M., Finger, C., Cichutek, K., et al. (2005), “Selection of
functional human antibodies from retroviral display libraries” J. Nucleic Acids Res.
33:e35.
47. Vaughan, Williams ; Pritchard, K.; Osbourn, J.K.; Pope, A.R.; Earnshaw, J.C.;
McCafferty, J.; Hodits, R.A.; Wilton, J.; Johnson, K.S (1996), “Human antibodies with
sub-nanomolar affinities isolated from a large non-immunized phage display library”,
Nature Biotechnol. 14.
48. Watters, Telleman, P., Junghans, (1997), “An optimised method for cell based phage
display panning”, Immunotechnology. 3:21-29.
49. Wezenbeek, Hulsebos, Schoenmakers, (1980), “Nucleotide sequence of the filamentous
bacteriophage M13 DNA genome: comparison with phage fd”, Gene. 11:129-148.
50. Willats, Wurrel. G (2002), “Phage display: practicalities and prospects”, Plant Mol. Biol.
50:837-854.
51. Winter G, Griffiths AD, Hawkins RE, Hoogenboom HR (1994), “Making antibodies by
phage display technology”, Annu Rev Immunol. 12:433–55.
52. Zhigang Zhao and Guohua Zeng (2010), “increased serum level of early prosate cancer

antigen is associated with subsequent cancer risk in men with high-grade prostatic
intraepithelial neoplasia” . 17: 505-512.