khảo sát tình hình nhiễm các tuýp hpv (human papillomavirus) ở phụ nữ tp.hcm bằng kỹ thuật sinh học phân tử

SỞ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ MÔI TRƯỜNG
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH










KHẢO SÁT TÌNH HÌNH NHIỄM CÁC
TÝP HPV (HUMAN PAPILLOMAVIRUS)
Ở PHỤ NỮ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI : TS.BS Vũ Thò Nhung BV Hùng
Vương
CƠ QUAN PHỐI HP CHÍNH :
1.Đại học Khoa học tự nhiên-ĐHQG-HCM, Khoa Sinh học,
bộ môn Vi sinh-sinh học phân tử
2.Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh, Khoa Y, bộ môn Vi sinh.
CƠ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI :
Sở Khoa Học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh


(Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội Đồng nghiệm thu đề tài ngày
15/9/2006)

Năm 2006

ii
MỤC LỤC



Trang
Trang phụ bìa………………………………………………………………………………………………………………… ………… i
Mục lục…………………………………………………………………………………………………………………………………………. ii
Danh mục các chữ viết tắt…………………………………………………………………………………………………… iii
Bảng đối chiếu Việt –Anh…………………………………………………………………………………………………… iv
Danh mục các bảng …………………………………………………………………………………………………………………. v
Danh mục các hình ………………………………………………………………………………………………………………… vi
MỞ ĐẦU …………………………………………………………………………………………………………………………. ………… 1
CHƯƠNG I : Tổng quan tài liệu……………………………………………………………………………… ………. 3
A) NHỮNG ĐẶC ĐIỂM CỦA HPV …………………………………………………………………… 3
1. Cấu tạo…………………………………………………………………………………………………………. 3
2. Bộ gene HPV…………………………………………………………………………………………… 4
3. Dòch tễ học của HPV……………………………………………………………………………… 8
4. Các týp HPV ……………………………………………………………………………………………… 9
5. Cơ chế sinh bệnh …………………………………………………………………………………… 12
6. Những yếu tố nguy cơ nhiễm HPV ………………………………………………… 16

B) XÉT NGHIỆM TẦM SOÁT HPV……………………………………………………………… 16
CHƯƠNG II : ĐỐI TƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… ………………………. 21
CHƯƠNG III : KẾT QUẢ………………………………………………………………………………………………………………. 39
CHƯƠNG IV : BÀN LUẬN ……………………………………………………………………………………………………………. 50
KẾT LUẬN…………………………………………………………………………………………………………………… ……………………… 58
ĐỀ NGHỊ ………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………………………………………………………………………. 60
PHỤ LỤC ………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 65


iii


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT


ASCUS Atypical squamous cells of undetermined significance
CIN
Cervical Intraepithelial Neoplasia
CIN1 grade 1
Cervical Intraepithelial Neoplasia

CIN2 grade 2
Cervical Intraepithelial Neoplasia

CIN3 grade 3
Cervical Intraepithelial Neoplasia

CNV Công nhân viên
CTC Cổ tử cung

DCTC Dụng cụ tử cung
GPB Giải phẫu bệnh
HPV Human papilloma virus
HSIL High grade of squamous intraepithelial lesion
LSIL
Low grade of squamous intraepithelial lesion
ORF Open reading frame

PCR Polymerase Chain Reaction
TC Tử cung
TP HCM Thành phố Hồ Chí Minh
URR
Upstream Regulatory Region
XN Xét nghiệm




iv



BẢNG ĐỐI CHIẾU VIỆT - ANH



ASCUS Tế bào gai không điển hình không rõ ý nghóa
CIN
Dò sản
CIN1 Dò sản nhẹ

CIN2 Dò sản vừa
CIN3 Dò sản nặng
HSIL Tổn thương trong thượng mô gai mức độ cao
IARC Cơ quan nghiên cứu Ung thư Thế giới
LSIL
Tổn thương trong thượng mô gai mức độ thấp
Pap Phết tế bào âm đạo – cổ tử cung
WHO Tổ chức Y tế Thế giới














v





DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng Tên bảng Trang

3.1 Phân bố theo nhóm tuổi 38
3.2 Phân bố theo các đặc điểm khác của đối tượng nghiên cứu 39
3.3 Phân bố theo các đặc điểm khác của đối tượng nghiên cứùu 40
3.4 Tình trạng bệnh Phụ khoa của đối tượng nghiên cứu 40
3.5 Kết quả Giải phẫu bệnh cổ tử cung 41

3.6 Kết quả tế bào học cổ tử cung 41
3.7 Kết quả PCR tầm soát và đònh týp HPV 42
3.8 Tình hình nhiễm các týp HPV 43
3.9 So sánh Kết quả Giải phẫu bệnh cổ tử cung và kết quả
theo PCR 44
3.10 Liên quan giữa GPB và độ nguy cơ của các nhóm HPV 45
3.11 So sánh Kết quả tế bào cổ tử cung và kết quả theo PCR 45
3.12 Liên quan giữa tình trạng kinh tế và HPV 46
3.13 Liên quan giữa nhóm tuổi và HPV 47
3.14 Liên quan giữa nhóm tuổi và Các tổn thương 47
tiền ung thư Cổ tử cung


vi





DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình Tên hình Trang


1 Cấu trúc, hình dạng HPV 4
2 Cấu trúc bộ gene của HPV 5
3 Bộ gene HPV dạng mạch thẳng 7
4 Sự tiến triển của tổn thương cổ tử cung do HPV 11
5 Chu kỳ sống của HPV 12
6
Quy trình phát hiện và đònh type HPV 17
7 Quy trình tầm soát tổn thương tiền ung thư cổ tử cung 19













1
Mở đầu

Ung thư cổ tử cung là bệnh lý phổ biến, đứng hàng thứ ba trong số các ung thư

ở phụ nữ trên thế giới và là một trong những nguyên nhân tử vong hàng đầu của giới
nữ , nhất là ở những nước đang phát triển mặc dù thực tế thì đây là bệnh có thể
phòng ngừa được
[12]
. Mỗi ngày có khoảng 1400 phụ nữ được chẩn đoán mắc bệnh
Ung thư cổ tử cung, 750 người chết vì bệnh này
[5]
. Như vậy, hàng năm có 500.000
trường hợp mắc mới và có khoảng 270.000 người tử vong vì ung thư cổ tử cung
[5]
.Đặc
biệt là khoảng 50% các trường hợp ung thư cổ tử cung xảy ra ở Châu Á. Theo IARC
thì tỷ lệ và tử suất ung thư cổ tử cung ở các nước đang phát triểàn tăng cao vì những
nơi đó không có chương trình tầm soát ung thư cổ tử cung
[30]
.
Tại Việt Nam , theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới năm 2.000 thì tỷ lệ ung
thư cổ tử cung vào khoảng 16-24/100.000 . Tại TP. Hồ Chí Minh, đây là bệnh có tỷ lệ
mắc cao nhất ở người phụ nữ (tỷ lệ mắc chuẩn theo tuổi là 28,6/100.000 dân)
[37ø]
.
Trong thập niên 70, Human papillomavirus (HPV) được mô tả như là một trong những
tác nhân gây biến đổi tế bào cổ tử cung (dò sản cổ tử cung), tiền đề của ung thư cổ tử
cung
[12]
.Người ta cho là nguy cơ do HPV chiếm khoảng 82% ở các nước đang phát
triển
[38]
. Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã khẳng đònh sự liên quan mật thiết giữa
HPV và ung thư cổ tử cung. Ngoài ra nó còn có vai trò trong ung thư vùng hậu môn,

âm hộ, âm đạo và dương vật cũng như một số ung thư vùng hầu họng. Người ta phân
biệt các týp có nguy cơ thấp ít khi làm tiến triển đến ung thư và các týp nguy cơ cao
thường gây ung thư. Ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu dòch tễ học mang tính đại
diện được tiến hành trên đề tài này.
Như vậy , việc tìm hiểu về tình trạng nhiễm các genotýp HPV ở phụ nữ là vấn đề
rất đáng quan tâm vì nhờ đó có thể góp phần tiên lượng khả năng diễn tiến bệnh khi

2
chưa tiến đến ung thư để các Bác só lâm sàng có thể có thái độ xử trí thích hợp , có lợi
cho ngươi bệnh Đó là lý do chúng tôi thực hiện nghiên cứu “Khảo sát tình hình
nhiễm các týp HPV (Human Papilloma Virus) ở phụ nữ thành phố Hồ Chí Minh
bằng kỹ thuật sinh học phân tử”
Mục tiêu nghiên cứu :
• Mục tiêu tổng quát :
Nghiên cứu dòch tễ học các genotýp HPV ở phụ nữ thành phố Hồ Chí Minh độ
tuổi 18-69.
• Mục tiêu chuyên biệt :
1.Xác đònh tỉ lệ nhiễm HPV ở phụ nữ thành phố Hồ Chí Minh độ tuổi 18-69.
2.Xác đònh tỉ lệ nhiễm các týp HPV nguy cơ cao.
3.Xác đònh mối tương quan giữa hình ảnh tế bào học, mô bệnh học với các týp
HPV.
4. Đánh giá xét nghiệm PCR chẩn đoán và đònh týp HPV.

3
CHƯƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

A) NHỮNG ĐẶC ĐIỂM CỦA HPV (HUMAN PAPILLOMA VIRUS)
1. Cấu tạo :
Human Papilloma Virus (HPV), một virus có vật liệu di truyền là DNA, gây
bệnh ở người thuộc họ Papovaviridae
[14]
. Khác với các loại virus như viêm gan siêu vi
A, C, SARS coronavirus có cấu tạo di truyền RNA. Bởi vì virus này không thể phát
triển trong thực nghiệm và không có xét nghiệm huyết thanh nào đáng tin cậy, nên sự
nhận diện Human PapillomaVirus và đònh týp HPV căn cứ vào tiêu chuẩn Nucleic
Acid. Một đặc điểm rất quan trọng của virus này là chúng không phát triển trong
điều kiện nuôi cấy ở phòng thí nghiệm
[22]
nên để nghiên cứu, chỉ có thể dựa trên
nghiên cứu invivo trên người hay động vật bò nhiễm. Những mẫu nhiễm này có thể
lưu trữ ở -20
o
C trong một thời gian dài mà không làm giảm khả năng hoạt động của
virus.
HPV có cấu trúc capsid không vỏ, đối xứng xoắn ốc. Virion có đường kính
52-55nm, vỏ gồm 72 đơn vò capsomer. Mỗi đơn vò là một pentamer của protein cấu
trúc L1 kết hợp với một protein L2 (protein này có thành phần kháng nguyên được sử
dụng trong phản ứng miễn dòch đặc hiệu). Riboxom có hệ số lắng là 21S. Tiểu phần

lớn có một vòng xoắn cuộn có thể chuyển đổi thành tiểu phần nhỏ trong quá trình sao
chép. Ngoài ra, một tiểu phần thứ 3 có hệ số lắng là 14S sẽ xuất hiện chòu trách
nhiệm sao chép lại DNA tế bào chủ khi bao trong Virion. Khi đó, capsid chứa DNA tế
bào chủ được gọi là Virion giả hay Pseudovirion
[14]
.



4

Hình 1: Cấu trúc, hình dạng HPV
2. Bộ gen HPV
2.1. Cấu trúc bộ gen của HPV
Đó là một DNA mạch đôi không hoàn chỉnh, tồn tại ở dạng siêu xoắn hình vòng,
chứa khoảng 7800-8000 cặp base, có 10 khung đọc mở ORF
[22]
. Sự sao chép, phiên
mã xảy ra trên một mạch và theo một chiều duy nhất.
Bộ gen được phân làm 3 vùng
[22]
:
• Vùng điều hoà URR (Upstream Regulatory Region) hay cũng còn gọi
là vùng điều hoà dài LCR (Long Control Region): chiếm 10% chiều
dài bộ gen, chứa khoảng 800-1000 cặp base tùy từng týp. Đây cũng
là vùng biến động nhất trong bộ gen HPV. Trình tự vùng URR bao
gồm:
o Trình tự tăng cường: là nơi gắn của các nhân tố phiên mã (AP-
1, NF1, oct 1, TEF1, TEF2, YY1 …).
o Promoter (gen khởi động) cho sự phiên mã tổng hợp RNA

(được gọi là P97 ở HPV16, và P105 ở HPV18). Promoter này
bao gồm một hộp TATA và vùng khởi đầu phiên mã.
o Điểm khởi đầu sao chép ORI. . .
Protein capsid (L1)

Acid nucleic (DNA)


5


Hình 2: Cấu trúc bộ gen của HPV
• Vùng gen sớm: gồm 6 gen, ký hiệu là E1, E2, E4, E5, E6, E7 và các
khung đọc mở ORF.
• Vùng gen muộn: gồm 2 gen, ký hiệu là L1, L2.
2.2. Chức năng các vùng gen và protein của chúng
[ 10,14 ,19,44]

2.2.1. Gen E1:
Là một trong 2 vùng bảo tồn nhất ở HPV (cùng với vùng L1). Chức năng
chính của E1 là mã hóa cho protein gắn đặc hiệu vào DNA. E1 có hoạt động tháo
xoắn không phụ thuộc ATP, rất cần thiết cho sự sao chép của virus.
2.2.2. Gen E2:
Đây là gen mã hóa chủ yếu cho các nhân tố phiên mã của tế bào. Bên
cạnh đó, E2 còn tương tác với E1, giúp E1 dễ dàng gắn với điểm khởi đầu sao chép
và có thể bắt đầu sao chép tăng cường hơn. Các thí nghiệm cho thấy rằng ở nồng độ
Phá vỡ chu
trình tế bào

Điề

u khiển sự sao
chép và biểu hiện
gen của virus
Protein
capsid
Sự sao chép
của virus
Phóng thích HPV

Protein tín hiệu màng
Sự biểu hiện gen



6
thấp, E2 tăng cường sự phiên mã, nhưng ở nồng độ cao, nó lại ức chế sự phiên mã. Sự
chèn DNA virus vào bộ gen của vật chủ thường làm gián đoạn gen E2 làm ảnh hưởng
tới khả năng ức chế sự biểu hiện protein E6, E7.
2.2.3. Gen E4:
Gen E4 mã hóa cho protein E4, có vai trò trợ giúp trong sự trưởng thành
và phóng thích HPV ra khỏi tế bào mà không làm tan tế bào chủ.
2.2.4. Gen E5:
Để có thể xâm nhập và tồn tại trong tế bào chủ, HPV sẽ rất cần đến sản
phẩm protein E5 do gen này sản xuất. Protein E5 tác động ngay trong giai đoạn đầu
của sự xâm nhiễm, chúng tạo ra các phức hợp với các thụ thể của nhân tố tăng trưởng
và biệt hóa, từ đó kích thích sự phát triển của tế bào. Mặt khác, protein E5 còn có vai
trò trong việc ngăn chặn sự chết theo chương trình (apoptosis) của tế bào khi có sự sai
hỏng DNA do chính virus gây ra.
2.2.5. Gen E6:
Gen này mã hóa protein E6, cực kỳ quan trọng trong vai trò gây ung thư,

nhất là ở những týp được xếp vào nhóm nguy cơ cao gây ung thư. Protein E6 gồm 151
acid amin hình thành 4 cấu trúc Cys-X-X-Cys gắn với kẽm điều hòa. Ba chức năng
chủ yếu của E6 cũng là những chức năng rất nguy hiểm đối với tế bào chủ:
1. Liên kết hoặc không liên kết với protein E7 đều có khả năng kích
thích tế bào chủ phân bào mạnh mẽ vã sự phân chia này là mãi mãi,
tức tế bào chủ sẽ là những tế bào bất tử hóa.
2. Gắn kết với protein p53, một protein ức chế khối u của tế bào chủ, làm
tăng sự phân giải của p53 bởi hệ thống phân giải protein ubiquitin của
tế bào và làm giảm khả năng ức chế khối u của protein này.

7
3. Liên kết với gen ras trong quá trình bất tử hoá tế bào cơ bản của chuột
và kích thích sự phát triển của tế bào NIH 3T3, đồng thời hoạt hoá
promoter E2 của Adenovirus.


2.2.6. Gen E7:
Tuy nhỏ hơn E6, protein E7 được mã hóa từ gen này chỉ gồm 98 acid amin
và hình thành 2 cấu trúc gắn kẽm, nhưng E7 cũng có vai trò không kém phần quan
trọng trong việc gây ung thư ở tế bào chủ. Trước hết là sự tương đồng ở cấu trúc gắn
kẽm với E6, đều là cấu trúc Cys-X-X-Cys, góp phần liên kết chặt chẽ với E6 hơn, hỗ
trợ nhau tác động lên sự bất tử hoá tế bào chủ.
Nếu như E6 cản trở quá trình tự sửa sai của tế bào chủ thông qua liên kết
với p53 hì E7 thực hiện vai trò này thông qua kiên kết với pRB, cũng là một gen ức
chế khối u. Ái lực liên kết này cao gấp 10 lần ở những týp thuộc nhóm nguy cơ cao so
với nhóm nguy cơ thấp. Điều này làm giải phóng số lượng lớn nhân tố phiên mã E2F
tự do, kích thích quá trình phiên mã, kéo dài tuổi thọ tế bào.
2.2.7. Gen L1 và L2:
Đây là 2 vùng gen cấu trúc.Vùng L1 mã hóa protein L1 là thành phần chủ yếu
cấu tạo vỏ capsid của virus. L1 có trọng lượng phân tử 56-60 kDa, được phosporyl hóa

Nguồn: Expert Reviews in Molecular Medicine

Hình 3: Bộ gen HPV dạng mạch thẳng


8
yếu và không gắn với DNA. Vùng L2 mã hóa protein vỏ capsid phụ, có trọng lượng
phân tử 49-60 kDa, lại được phosphoryl hóa cao và có khả năng gắn DNA.

Hiện nay, xét nghiệm PCR (Polymerase Chain Reaction) và lai DNA là
những phương pháp ít tốn công nhất và có thể dùng thường qui trong phòng xét
nghiệm để tìm HPV. HPV gồm hơn 100 týp, Vò trí xâm nhập và khu trú đầu tiên là
vùng thượng bì (tầng trên của lớp biểu mô), chủ yếu ở những biểu mô sừng hoá hay
những biểu mô gai vì HPV có tính hướng rất cao với tế bào biểu mô da và niêm mạc,
nhất là ở những vùng niêm mạc ẩm ướt, nhầy
[44]
.chúng có thể gây những tổn thương u
nhú dạng mụn cóc thường lành tính ở thanh quản, da tay, chân, niêm mạc miệng, bộ
phận sinh dục .Tuy nhiên, có một số týp thường kết hợp với ung thư. Nhiễm HPV là
một trong những bệnh lây truyền qua đường tình dục phổ biến nhất. Có trên 30 týp
lây truyền từ người sang người qua quan hệ tình dục. Người ta chia HPV ra làm 2
nhóm : nhóm nguy cơ cao và nhóm nguy cơ thấp. Những nhóm nguy cơ cao thường có
mối liên hệ với bệnh ung thư cổ tử cung.
3. Dòch tễ học của HPV
Hầu hết các trường hợp nhiễm HPV không có triệu chứng. Đó là lý do tại
sao số trường hợp mắc bệnh không được ghi nhận. Ngoài ra, những xét nghiệm tầm
soát HPV cũng mới được thực hiện nên những báo cáo về các trường hợp bệnh mới
mắc thường thấp hơn thực tế. Vì vậy, dự đoán về số ca mới hàng năm vào khoảng
900.0000 người. Theo thống kê có được thì có vào khoảng 269 triệu phụ nữ trên thế

giới nhiễm HPV.Tình trạng viêm nhiễm này dẫn đến 440.000 người bò ung thư cổ tử
cung hàng năm (Châu u có 23.000 – 35.000 ở Châu Mỹ Latin và 18.000 người ở
Bắc Mỹ)
[26]
Số phụ nữ cóù nguy cơ nhiễm HPV khoảng 2 tỷ người. Đỉnh tuổi nhiễm HPV
thay đổi tùy đòa phương. Thí dụ như ở Phần Lan, nhiễm HPV thường xảy ra trong độ
tuổi 20 –29 tuổi. Nghiên cứu trên 10.758 phụ nữ tuổi từ 20-29 của Susanne K Kjaer ở

9
Copenhagen tỷ lệ nhiễm HPV là 14%
[26]
cũng như một nghiên cứu khác của Anna
R.Giuliano ở vùng biên giới Hoa Kỳ- Mexico cho tỷ lệ nhiễm HPV là 14,4% trong
nhóm 2319 phụ nữ từ 15-79 tuổi
[1]
.Có nghiên cứu cho thấy nguy cơ nhiễm HPV là
79% Phụ nữ. Tỷ lệ này cũng tương đương trong nam giới. Cách truyền bệnh chủ yếu
qua quan hệ tình dục
[26]
.
4. Các týp HPV
HPV là một trong những virus có nhiều týp nhất. Đã có gần 120 týp được
biết đến, trong đó 20-30% là những týp chưa được phân loại vì bộ gen chỉ mới được
giải trình tự một phần.
Sự đònh týp
[22]
HPV không dựa vào huyết thanh như sự đònh týp ở
những loại virus khác (virus gây viêm gan, HIV …) mà dựa trên sự tương đồng DNA.
Khi một týp HPV có ít nhất 10% gen vùng E6, E7, L1 khác với các týp đã biết trước
đó thì sẽ được xem là một týp mới. Ngoài ra, người ta còn phân loại đến mức týp phụ

và những dạng dễ thay đổi. Được xếp vào týp phụ khi bộ gen của chúng khác nhau 2-
10% trong cùng 1 týp đã biết. Nếu sự khác nhau chiếm 1-2% nằm trong vùng mã hóa,
hoặc 5% trong vùng không mã hóa thì được xem là dạng dễ thay đổi. Mỗi týp có một
sự thích nghi cao với một loại biểu mô nhất đònh. Ví dụ như týp 1, 2, 3, 10, 27 …
thường gây bệnh ở da, còn týp 16, 11, 18 … lại chủ yếu tấn công cơ quan sinh dục
người. Điều này phụ thuộc vào cách tác động khác nhau của những vùng gen khác
nhau ở mỗi týp đối với protein bao phủ tế bào chủ tại những vò trí khác nhau trên cơ
thể
[19,44]
. Người ta xác đònh có đến hơn 38 týp HPV xâm nhiễm tế bào biểu mô gai ở
vùng cơ quan sinh dục người. Trong đó, phổ biến nhất là các týp 6, 11, 16, 18, 42, 43,
44, 31, 33, 35, 45, 51, 52, 56. . .
[22]

Tùy thuộc vào khả năng dẫn đến ung thư (tạo khối u ác tính) người ta chia
các týp HPV làm 2 nhóm:

10
• Nhóm “nguy cơ thấp” (low-risk): những týp HPV thuộc nhóm này chỉ
gây những mụn cóc hoặc khối u lành tính. Bộ gen của chúng tồn tại độc
lập với tế bào chủ. Các týp HPV trong nhóm nguy cơ thấp thường gặp là
:
 L1 : 6, 42,43,81
 L2 : 11, 61,70,71
• Nhóm “nguy cơ cao” (high-risk): bao gồm những týp có khả năng gắn
xen DNA của chúng vào bộ gen của người, gây ra những rối loạn hình
thành các khối u ác tính. Mối liên quan giữa HPV và ung thư cổ tử cung
được nói đến lần đầu tiên vào những năm 70. Những yếu tố nguy cơ
chính là týp HPV (16, 18, 31, 45), lớùn tuổi và mức độ tổn thương cổ tử
cung

Các týp HPV trong nhóm nguy cơ cao là :
 H1: 16,18, 31, 45
 H2 : 33,35,39, 52
 H3 : 51, 56, 66, 68
 H4 : 53, 58, 59, 82.
Điều dẫn đến sự khác nhau trong hoạt động của chúng là do vùng gen E6,
E7. Ở nhóm nguy cơ thấp, protein E6, E7 liên kết rất yếu với p53, pRb của người và
không có khả năng gắn xen vào DNA tế bào chủ.
Mặc dù có sự khác biệt về tần suất nhiễm các týp HPV giữa các vùng đòa
lý nhưng týp 16,18 thường gây ung thư ở hầu hết các nơi trên thế giới
[ 21,27]

Hầu hết những trường hợp nhiễm HPV là tạm thời . Nếu bệnh nhân có sức đề
kháng mạnh thì có thể khỏi bệnh. Do cơ chế nào chưa rõ , có khoảng 5-10% phụ nữ
nhiễm HPV nhóm nguy cơ cao sẽ còn tồn tại tình trạng nhiễm HPV này. Những bệnh
nhân ấy có khả năng tiến triển sang các tổn thương tiền ung thư cổ tử cung , nếu

11
không điều trò sẽ tiến đến ung thư. Kết quả của chương trình tầm soát ung thư cổ tử
cung ở British Colombia cho thấy sự thoái triển của tổn thương CIN còn tuỳ thuộc
vào tuổi của bệnh nhân. Phụ nữ dưới 32 tuổi thì tỷ lệ thoái triển là 84%, trong khi đó
đối với người trên 32 tuổi thì tỷ lệ này là 40%
[23]
. Theo nghiên cứu của Rozendaal L
(1996), bệnh nhân có phết tế bào cổ tử cung với HPV týp nguy cơ cao (+) sẽ có nguy
cơ tiến triển sang CIN3 gấp 116 lần so với nhóm có phết tế bào không bò nhiễm HPV
týp nguy cơ cao
[26]
. Gần đây, các nhà khoa học đã tìm thấy sự hiện diện của HPV

trong 93-100% các trường hợp carcinom tế bào gai ở cổ tử cung. Một số týp gây nên
những u nhú quanh bộ phận sinh dục, hậu môn thường gọi là bệnh mào gà
(condylomata acuminatum) đó là týp 6, 11 thường xuất hiện vài tuần hoặc nhiều
tháng tế bào nhân to, nhiều thùy nhiều năm sau khi tiếp xúc. Khảo sát vi thể các tổn
thương gây ra do HPV cho thấy lớp tế bào bề mặt có hình ảnh nghòch sừng
(dyskeratosis), cận sừng (parakeratosis)ù và những tế bào rỗng (koilocyte) có nhân to,
đa nhân, tăng sắc là đặc trưng của tế bào nhiễm HPV
[25]
.
Loại ung thư cổ tử cung thông thường nhất là ung thư tế bào gai và thường do
HPV 16,18. Ung thư tế bào tuyến thì ít , chủ yếu có liên quan đến HPV 18
[25]
.

12
Sự tiến triển của bệnh
Niêm mạc
bình thường
Nhiễm HPV;
Tế bào rỗng
CIN I
Tổn thương thượng mô gai mức
độ thấp (LSILs)
CIN II
CIN III
Tổn thương thượng mô gai mức
độ cao (HSILs)
Carcinoma
Tầm soát
Điều trò

Thời gian
Thập niên
Nhiều năm
Tháng
The virus

Hình 4 : Sự tiến triển của tổn thương cổ tử cung do HPV

5. Cơ chế sinh bệnh
HPV có cấu trúc DNA, sau khi sát nhập vào bộ gen tế bào ký chủ thì vùng
gen E6, E7 điều khiển tổng hợp protein E 6, E 7 theo chiều hướng bất thường làm kích
hoạt những chất sinh ung thư , bất hoạt những gen ức chế sự tạo khối u mà
HPV không
giết chết tế bào chủ.
. Các protein này gắn kết và vô hiệu hóa chức năng của protein
điều hòa tăng trưởng tế bào dẫn đến sự phân chia tế bào liên tục một cách bất thường
và hậu quả là phát sinh ung thư. Vì cần có diễn tiến qua nhiều giai đoạn của cơ chế
sinh ung như vậy nên thật ra chỉ có một tỷ lệ thấp phụ nữ nhiễm HPV nguy cơ cao sẽ bò
ung thư cổ tử cung.


13


Hình 5 : Chu kỳ sống của HPV
Chu kỳ sống của HPV có thể chia làm 4 giai đoạn:
Giai đoạn xâm nhập:
Chỗ xâm nhiễm đầu tiên của HPV là những tế bào nằm ở những vò trí dễ bò
tổn thương, có thể chỉ là những vết thương rất nhỏ gây ra do quan hệ tình dục (bề mặt
trong môi nhỏ ở nữ giới, bao quy đầu ở nam giới). Khả năng virus xâm nhập vào

những tế bào đáy này là rất cao. Sau đó, chính sự làm lành lặn ở chỗ vết trầy xướt
này bằng việc kích thích sự phân chia những tế bào đáy sẽ dẫn đến làm tăng nhanh
thêm sự sao chép của HPV trong tế bào chủ vì đây là giai đoạn mà HPV chỉ sao chép
được khi tế bào chủ sao chép. Chính vùng dễ bò tổn thương nhất trong cơ quan sinh
dục trở thành nơi phổ biến nhất cho virus phát triển.
Giai đoạn tiềm ẩn:
Đây là giai đoạn có sự xâm nhiễm của HPV nhưng các kỹ thuật xét nghiệm
tế bào học, hình thái học, soi phóng đại đều cho kết quả tế bào bình thường. Chỉ
Chu trình sống HPV

Xâm nhiễm
Các tế bào biểu
mô phát tán virus.


Virus được
“đóng gói”
Tế bào
bình
thường

DNA virus tồn
tại trong tế bào
dạng episome
Lớp tế bào
đáy
Thành lập
Papilloma

14
những xét nghiệm sinh học phân tử có độ nhạy cao như PCR, lai phân tử mới có khả
năng phát hiện thấy HPV.
Thời kỳ này có thể kéo dài 1-8 tháng, tuỳ tình trạng sức khoẻ mỗi người. Trong
giai đoạn này, người ta không xác đònh được là hệ miễn dòch có hoạt động hay không.
Cũng có ý kiến cho rằng lúc này hệ miễn dòch không hoạt động vì đòi hỏi sự phát
triển số lượng virus và những sản phẩm xâm nhiễm đến một giới hạn nào đó mới kích
thích được hệ miễn dòch hoạt động. Hầu hết những bệnh nhân đều chỉ có những biểu
hiện thoáng qua và không xác đònh được.
Giai đoạn nhân bản mạnh:
Nếu như ở giai đoạn trên, HPV chỉ sao chép cùng tế bào chủ thì bước vào giai
đoạn này, HPV sẽ là tác nhân kích thích tế bào chủ phân chia mạnh. Từ sự hiện diện
thấp lượng DNA virus ở những tế bào đáy , sẽ có sự gia tăng mạnh số lượng DNA
virus lẫn những sản phẩm xâm nhiễm ở những tế bào biểu mô gần bề mặt nhất (sự
tích lũy protein và những dạng virion của chúng…).
Sự xâm nhiễm có hiệu lực 3-8 tháng trước khi hệ miễn dòch bắt đầu hoạt
động. Chúng phát triển mạnh các mạch máu bao quanh (nhất là ở những týp 6, 11)
hình thành mụn nhỏ, dẹt, phẳng hoặc lồi, đến những biểu hiện ban đầu của bệnh
condyloma, cận sừng (acanthosis) , bệnh tế bào rỗng (koilocytosis) , loại không điển
hình nhân (nuclear atypia) ….
Giai đoạn có hoạt độâng của tế bào chủ:
Đây là giai đoạn quan trọng quyết đònh sự thành công hay thất bại của hệ
miễn dòch khi đối phó với virus.Thời gian này thường từ 3-6 tháng, sau khi đã qua giai
đoạn nhân bản mạnh của virus, có thể nhanh hơn hoặc là không bao giờ. Nguyên
nhân là vì HPV không xuyên xuống màng đáy biểu mô, chúng chỉ xâm nhập vào các
tế bào biểu mô lớp trên, mà các tế bào này lại rất kém trong hoạt động trình diện

15
kháng nguyên. Nhờ đó, HPV có nhiều thuận lợi không bò hệ miễn dòch của tế bào chủ
nhận diện và tiêu diệt. Chúng chỉ việc tồn tại an toàn trong những tế bào biểu mô

nguyên vẹn. Chỉ khi có những tổn thương tế bào (do cọ xát hay hóa chất điều trò) làm
lộ HPV cho hệ miễn dòch nhận diện. Khi đó, hệ thống miễn dòch sẽ được hoạt hóa và
tấn công các tế bào bò nhiễm, khởi đầu là hoạt động của các đại thực bào
(macrophages), bạch cầu đơn nhân (monocytes)… Chúng sẽ giải phóng các cytokine
như interferon α, β, γ, interleukine… Interferon có tác dụng làm chậm sự phát triển
của virus, làm giảm những sản phẩm xâm nhiễm của chúng. Cytokine thì tấn công
như là một tác nhân hóa học bằng những phần tử dính kết lên tế bào cạnh mạch máu,
kêu gọi bạch cầu đến tiêu diệt vùng bò nhiễm.
Kết quả của tất cả những hoạt động này là sự gia tăng cytokine của những tế
bào langerhan hay tế bào nhánh (dendritic) . Tế bào dendritic hoạt động di chuyển
qua mạch lymphô đến vùng hạch lympho, nơi mà chúng thể hiện kháng nguyên HPV
lên bề mặt để lympho T nhận diện. Khi đó sẽ hình thành các dòng lympho T đặc hiệu
HPV, chúng di chuyển theo dòng máu đến vùng bò nhiễm. Đầu tiên, chúng sẽ tiếp cận
các tế bào nội mô trong những mạch máu bên dưới vùng rối loạn do HPV gây ra
thông qua phân tử dính kết trên bề mặt kháng nguyên, từ đó, theo sự khác biệt nồng
độ cytokine qua thành mạch máu vào bên trong biểu mô nhiễm HPV. Tế bào T đặc
hiệu và tế bào giết tự nhiên (natural kill cell) sẽ vào bên trong những mụn cóc, tiêu
diệt tế bào bò nhiễm HPV. Bạch cầu đơn nhân và đa nhân sẽ tiêu huỷ những mảnh
vụn tế bào, bao gồm cả DNA của HPV. Sự liên kết những yếu tố này giúp làm giảm
kích thước mụn cóc, làm sạch vùng bò nhiễm. Tế bào T đặc hiệu sẽ trở thành tế bào
nhớ ngăn chặn sự xâm nhiễm trở lại.
Sau khoảng 9 tháng, bệnh nhân được chia thành 2 nhóm: hết bệnh hoặc bệnh
vẫn tiếp diễn. Tuy nhiên ở những bệnh nhân hết bệnh, khả năng hết hoàn toàn HPV

16
và khả năng HPV quay lại giai đoạn tiềm ẩn là không xác đònh được, nên vẫn phải
tiếp tục theo dõi và hạn chế lây nhiễm. Còn ở những bệnh nhân không thuyên giảm
thì khả năng chuyển sang ung thư ác tính là cực kỳ cao.
6. Những yếu tố nguy cơ nhiễm HPV :
 Hành vi quan hệ tình dục : số bạn tình, bạn tình bò nhiễm HPV, mắc

bệnh lây truyền qua đường tình dục (Chlamydia,Neisseria,Trichomonas,
Herpes Simplsex virus)
 Tuổi : dưới 25 tuổi thì tỷ lệ nhiễm HPV cao nhất.

Tình trạng hệ thống miễn nhiễm của cơ thể : dễ bò nhiễm HPV đối với
những người có HIV (+), thai phụ, người được cấy ghép mô, tiểu đường,
đang được hoá trò, hút thuốc lá ( do sự tích tụ nhiều chất nicotin trong
chất nhầy cổ tử cung và tình trạng miễn dòch ở người hút thuốc kém hơn
người không hút thuốc), điều trò Corticoid.

B) XÉT NGHIỆM TẦM SOÁT HPV
Ở các phương pháp chẩn đoán lâm sàng, kết quả xác đònh là dựa trên sự thay
đổi bất thường của tế bào khi có virus nhiễm gây ra. Còn ở phương pháp chẩn đoán
cận lâm sàng, kết quả xác đònh dựa trên sự có hay không có DNA của virus trong
mẫu bệnh phẩm, bất kỳ mẫu bệnh phẩm đó đang ở giai đoạn phát triển nào của bệnh.
Các phương pháp chẩn đoán cận lâm sàng này được gọi chung là phương pháp
“xét nghiệm HPV” (HPV testing) ra đời từ những năm đầu thập niên 1990 và không
ngừng phát triển.
Sự ra đời của các phương pháp chẩn đoán đều nhằm mục tiêu có thể phát hiện
sự nhiễm HPV ở giai đoạn sớm. Điều này giúp bệnh nhân có một hướng điều trò kòp
thời cũng như ngăn chặn sự lây nhiễm HPV. Nhiều tác giả đã thực hiện các công trình
nghiên cứu đánh giá hiệu quả của các phương pháp chẩn đoán trên.

17

Hình 6 :QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH TÝP HPV

Phương pháp tủa
(Chomczynski & Sacchi, 1987)

Mồi MY11/09
(Bauer & cs, 1992)
Phản ứng có bổ sung DIG-dUTP
Microtitter plate phủ streptavidin
Probe gắn biotin
(Van den Brule & cs, 2002)
“PCR-ELISA DIG detection kit”
(Roche)
Mồi đặc hiệu týp và MY09
(Van den Brule & cs, 2002)
Mẫu âm tính
Lai đònh týp
kiểm chứng
Màng lai biodyne C
Probe gắn amino
(Van den Brule & cs, 2002)
Enzyme ankaline phosphatase
Cơ chất NBT/BCIP
Thu nhận và xử lí
mẫu bệnh phẩm
Tách chiết DNA

Thực hiện PCR
Mồi MY11/09
(Bauer & cs, 1992)

Điện di

Mẫu dương tính
Giải trình tự
kiểm chứng
Thực hiện PCR
đánh dấu DIG
Thực hiện ELISA
đònh group
Thực hiện PCR
đònh týp

18
 Tình hình nghiên cứu trên thế giới :
Một số kỹ thuật phân tử như PCR, lai tại chỗ (in situ hybridization) được phát
triển gần đây để phát hiện sự hiện diện của DNA HPV trong tế bào cổ tử cung. Các
kỹ thuật phân tử này còn cho phép xác đònh được các týp và phân biệt các thương tổn
cổ tử cung không liên quan đến HPV. Đặc biệt kỹ thuật PCR, với độ nhạy và độ đặc
hiệu cao, được phát triển với hai hệ thống primer thông dụng là hệ MY09-MY11
(Bauer & cs, 1992) và hệ GP5+-GP6+ (Snijders & cs, 1990). Các hệ primer này được
thiết kế dựa trên trình tự gen L1, cho phép phát hiện sự hiện diện của nhiều týp HPV
trong bệnh phẩm.
Nhằm xác đònh chính xác các týp HPV hiện diện trong mẫu khảo sát, nhiều
công trình sử dụng phối hợp các bộ mồi consensus và mồi đặc hiệu týp trong phản
ứng nested PCR (Harwood & cs, 1999
[9]

) hoặc phối hợp PCR và kỹ thuật cắt bằng
enzyme cắt giới hạn (Nelson & cs, 2000
[21]
). Hybrid Capture Test (Digen
Corporation), đã được thương mại hóa ở Hoa Kỳ, là thử nghiệm dựa trên kỹ thuật lai
phân tử giữa mẫu dò (probe) với DNA HPV phát hiện bằng kháng thể với phản ứng
hóa quang .
Nhiều công trình khác đònh týp bằng cách sử dụng phối hợp PCR với lai phân
tử, trong đó sản phẩm PCR consensus được lai với các probe đặc hiệu cho týp được cố
đònh trên giá thể rắn, kiểu lai có tên là reverse blotting (Ylitalo & cs, 1995; Gravitt &
cs, (2000))
[7]
Những công trình sau đó so sánh hiệu quả phát hiện và đònh týp của các
phương pháp đã được công bố cho thấy sự kết hợp PCR với reverse blotting có nhiều
ưu điểm nhất (Vernon & cs, 2000 ; Van Den Brule & cs, 2002)
[ 29]
.
Gần đây đã xuất hiện các công trình không những chỉ phát hiện và đònh týp mà
còn đònh lượng virus có trong mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật Real-time PCR (Hart &
cs, 2001
[8]
). Kỹ thuật PCR được sử dụng nhiều nhất với các bộ mồi được chọn vùng

19
gen bảo tồn cao giữa các týp (E1 và L1) (Karlsen & cs 1996
[17]
; Gravitt & cs 2000
[8]
).
Để xác đònh các týp HPV, Harwood & cs 1999

[9]
dùng phản ứng nested PCR; Nelson
&cs (2000)
[21]
phối hợp PCR và kỹ thuật cắt bằng enzym giới hạn.
Tháng 4/2002 Hiệp hội Soi cổ tử cung và Bệnh học cổ tử cung của Mỹ
(American Society for Colposcopy and Cervical Pathology) đã đưa ra hướng dẫn lâm
sàng khuyến cáo thử HPV-DNA cho những phụ nữ có kết quả Pap test không xác
đònh. Các tác giả Hàn quốc (Lee và Seo 2002)
[13]
tầm soát ung thư cổ tử cung theo 3
giai đoạn : tầm soát ban đầu, trong quản lý bệnh nhân có tế bào học bất thường ở mức
độ thấp, và trong theo dõi sau điều trò những tổn thương tiền ung thư nêu ra thử
nghiệm HPV-DNA có độ nhạy cao hơn tế bào học kinh điển bởi vì nó đánh giá chính
tình trạng nhiễm HPV. Các tác giả Đức (Petry & cs 2003)
[18]
đưa xét nghiệm HPV-
DNA vào tầm soát thường quy ung thư cổ tử cung ở phụ nữ trên 29 tuổi chứng tỏ
HPV-DNA có giá trò trong việc tầm soát hay loại trừ tân sản trong biểu mô cổ tử
cung (CIN).

Kết quả HPV và PAP




HPV (-) HPV (+) HPV (-) HPV (+) PAP
PAP (-) PAP (- ) ASC-US ASC-US ≥
≥≥
≥ LSIL

Lập lại Pap & HPV Soi cổ tử cung


3 năm 6-12 tháng 12 tháng


Hình 7 : Quy trình tầm soát tổn thương tiền ung thư cổ tử cung