Nghiên cứu tính đa hình AND của các dòng vải thiều Thanh Hà bằng kỹ thuật sinh học phân tử

MỞ ĐẦU
Hải Dương là nơi xuất xứ của giống vải thiều Thanh Hà nổi tiếng. Đây
là giống vải quí của nước ta, với những ưu điểm hạt nhỏ, cùi dày, chất lượng
quả ngon, có vị thơm đặc trưng… mà các giống vải khác không có.
Hiện nay, ở thôn Thuý Lâm, xã Thanh Sơn, huyện Thanh Hà, tỉnh Hải
Dương vẫn còn cây vải tổ của giống vải này. Theo Hội những người làm
vườn Việt Nam cho biết thì đây là cây vải thiều lâu năm nhất của nước ta.
Tuổi của nó vào khoảng 180 năm [14].
Qua tìm hiểu, chúng tôi thấy rằng tất cả các cây vải thiều trồng ở Thuý
Lâm từ xưa tới nay đều là các thế hệ con cháu (cành chiết) của cây vải tổ này.
Tìm hiểu các xã khác của huyện Thanh Hà, các địa phương khác của tỉnh Hải
Dương và các tỉnh khác như Bắc Giang, Bắc Ninh, Hà Tây, Hoà Bình, Quảng
Ninh..., chúng tôi được nhân dân cho biết họ đều lấy giống vải thiều ở xã
Thanh Sơn, huyện Thanh Hà, tỉnh Hải Dương về trồng.
Với nhu cầu về cây giống phục vụ cho việc mở rộng diện tích trồng vải
ngày càng cao đã dẫn tới tình trạng cây dùng làm giống bị kiệt sức do chiết
cành quá nhiều. Trước đây, ở huyện Thanh Hà các cây vải cổ thụ dùng để
chiết cành làm giống thì nay hầu như không dùng được nữa. Thay vào đó là
sử dụng thế hệ con cháu của các cây vải này. Mặt khác, vải là giống cây thụ
phấn chéo nên hạt phấn lẫn tạp không thuần. Với những lý do đó có thể dẫn
đến sự thoái hoá của giống bán ra, có những cây chất lượng quả không tốt
bằng giống gốc. Vì vậy, vấn đề đặt ra cho chúng ta là phải nghiên cứu tính đa
hình ADN của quần thể vải thiều trồng ở huyện Thanh Hà, tỉnh Hải Dương
để đánh giá mức độ lẫn tạp và xác định sự chuẩn xác của giống.
Có rất nhiều phương pháp khác nhau được sử dụng để phân tích tính đa
hình ADN hệ gen như RFLP, AFLP, SSR... Tuy nhiên, các phương pháp này
1
rất phức tạp, yêu cầu thông tin về trình tự cần nghiên cứu và đòi hỏi một
lượng lớn ADN hệ gen nên chỉ có kỹ thuật RAPD (Random Amplified
Polymorphic DNA - đa hình các đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên) là
được sử dụng phổ biến.

Nói chung, RAPD là kỹ thuật đơn giản, ít tốn kém và có độ nhạy cao,
dựa trên nguyên tắc của phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) với các mồi ADN
không đặc thù để nhân bản các đoạn ADN một cách ngẫu nhiên. Các đoạn
ADN nhân ngẫu nhiên có thể đa hình bởi các đoạn nhân có thể có trong mẫu
ADN của cá thể này nhưng lại không có trong mẫu ADN của cá thể khác
[56].
Bằng kỹ thuật này, Sun và cộng sự đã khảo sát tính đa hình ADN của
các giống lúa mì xuân kháng bệnh Fusarium, Tongpamnak và cộng sự đã xác
định tính đa hình di truyền của các giống vải trồng tại Thái Lan... Các kết quả
thu được từ các nghiên cứu này không chỉ giúp các nhà khoa học đánh giá
một cách chính xác mối quan hệ di truyền, tiến hoá giữa chúng mà còn tạo cơ
sở cho công tác lai tạo giống [1], [66], [67].
Có thể nói rằng, kỹ thuật RAPD là một công cụ hữu hiệu cho phân tích
tính đa hình ADN, lập bản đồ gen liên kết, xác định chỉ thị phân tử để phân
biệt các giống khác nhau cũng như phân tích con lai F1 của nhiều loài động
vật, thực vật và vi sinh vật [15], [20], [26].
Xuất phát từ những cơ sở nêu trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài
“Nghiên cứu tính đa hình AND của các dòng vải thiều Thanh Hà bằng kỹ
thuật sinh học phân tử”
2
Chơng 1. Tổng quan tài liệu
1.1. Giới thiệu chung về cây vải
1.1.1. Phân loại, nguồn gốc và phân bố
1.1.1.1. Phân loại
Cây vải có tên khoa học là Litchi chinensis Sonn., thuộc họ bồ hòn
Sapindaceae, bộ bồ hòn Sapindales [2].
Họ bồ hòn là một họ lớn có khoảng 140 chi, với 1600 loài, phân bố chủ
yếu ở vùng nhiệt đới và á nhiệt đới, đặc biệt ở châu á và châu Mỹ. ở nớc ta,
hiện chỉ biết 25 chi, 91 loài mọc khắp cả nớc. Trong họ này có nhiều cây ăn quả
nh cây vải, cây nhãn và chôm chôm [8].

1.1.1.2. Nguồn gốc, phân bố
Nguồn gốc cây vải là ở miền Nam Trung Quốc. Hiện nay, ở núi Tạ Hải
Sơn (tỉnh Quảng Đông), núi Lôi Hồ Lĩnh, Kim Cổ Lĩnh (đảo Hải Nam), ở vùng
phía nam của Xi Suang Ba Na (Vân Nam) còn có những cánh rừng có nhiều cây
vải dại. Đặc biệt núi Kim Cổ Lĩnh ở đảo Hải Nam vải dại mọc thành rừng. Lâm
trờng Bạch Tinh đã chặt 534 ha rừng vải già để trồng cây khác, hiện còn 50 ha
vải rừng xanh tốt. Kim Cổ Lĩnh ở độ cao 600 - 700 m so với mặt biển, tại đây
có những cây vải già có chu vi thân 7,5 m [8].
Trung Quốc là nơi thuần hóa cây vải trớc tiên cách đây hơn 2000 năm.
Đời Hán Vũ Đế Nguyên Đinh năm thứ 6 (111 năm trớc Công nguyên) đã cho
lập vờn vải trong cung vua, lấy cây từ Lĩnh Nam lên. Đời nhà Tống, vào năm
1059, Thái Tơng viết quyển Lệ Chi Phổ mô tả lịch sử vùng trồng, đặc điểm
giống, kỹ thuật trồng trọt, chăm sóc và chế biến. Đây đợc coi là công trình xuất
bản đầu tiên trên thế giới về cây vải [14], [37].
Cây vải có mặt ở Myanma, ấn Độ vào cuối thế kỷ 17, các nớc ở Đông ấn
vào thế kỷ 18, Ôxtrâylia, Nam Phi, Hawaii vào cuối thế kỷ 19... Ngày nay, vải
3
đợc trồng ở các nớc nằm trong phạm vi 20 - 30 vĩ độ Bắc và Nam đờng xích đạo
gồm có các vùng sau [37]:
Châu á: Trung Quốc, ấn Độ, Thái Lan, Việt Nam, Myanma, Lào,
Campuchia, Malaixia, Philipine, Inđonexia, Srilanka, Nhật Bản, Ixarael.
Châu Phi: Nam Phi, Môrithiuyt, Madagatca, Gabông, Cônggô.
Châu Mỹ: Hoa Kỳ, Hoduras, Panama, Cuba, Pooctorico, Braxin.
Châu úc: Ôxtrâylia, Niuzilân.
1.1.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ vải trên thế giới
Trên thế giới hiện nay có trên 20 nớc trồng vải, trong đó các nớc châu á
có diện tích và sản lợng lớn nhất. Sản xuất vải có tính thơng mại gồm các nớc:
Trung Quốc, ấn Độ, Thái Lan, ôxtrâylia, Reunion, Nam Phi, Mađagatxca,
ixrael, Việt Nam Diện tích vải trên thế giới năm 1990 là 183.700 ha với sản l -
ợng 251.000 tấn, năm 1999 sản lợng vải của thế giới khoảng 1,6 - 1,8 triệu tấn

[14].
Trung Quốc là nớc đứng đầu về diện tích và sản lợng vải, trong đó tỉnh
Quảng Đông là tỉnh đứng đầu về cả diện tích và sản lợng. Năm 1999, tỉnh
Quảng Đông có 530.000 ha vải, diện tích cây cho quả mới chỉ 55,5% mà sản l-
ợng đã lên đến 950.000 tấn, chiếm gần 50% sản lợng vải của thế giới. Năng
suất bình quân đạt 42,75 tạ/ha. Dự báo 10 năm đầu của thế kỷ 21, sản lợng vải
của tỉnh này sẽ đạt 0,8 - 1 triệu tấn [37].
ấn Độ là nớc đứng thứ hai về diện tích và sản lợng vải. Theo Menzel và
Simpson, năm 1986 diện tích vải ở ấn Độ là 10.333 ha nhng đến năm 1998 diện
tích vải đã lên tới 56.000 ha với sản lợng là 310.000 tấn [36]. ấn Độ chỉ trồng
vải đợc ở vùng Đông Bắc, 95% diện tích vải là ở vùng đồng bằng rộng lớn bang
Bihar. Trên loại đất cát pha có nhiều canxi, pH = 8, tầng dày, tới tiêu thuận lợi
4
nên cây vải sinh trởng và cho quả tốt. Sản lợng vải của ấn Độ cha cao, dân số
lại đông nên chỉ cung cấp cho thị trờng trong nớc [36].
Theo Subhadrabandhu (1993), năm 1991, diện tích vải ở Thái Lan là
15.045 ha, sản lợng 24.000 tấn trồng ở 9 tỉnh phía Bắc. Trong đó, 90% diện tích
vải toàn quốc tập trung ở Chiềng Mai và Chiềng Rai.
ở Thái Lan, vải là một trong những cây ăn quả có hiệu quả kinh tế, chủ
yếu cho nội tiêu, xuất khẩu khoảng 10%. Năm 1993, xuất khẩu 1.477 tấn vải
thu đợc 2,368 triệu đôla Mỹ, đứng thứ 4 (sau nhãn 11,908 triệu USD, sầu riêng
10,964 triệu USD, bởi 2,876 triệu USD) trong 9 loại hoa quả nhiệt đới xuất
khẩu. Năm 2002, diện tích vải của Thái Lan lên tới 23.000 ha với sản lợng vải
thu hoạch là 80.000 tấn [36].
Trong những năm gần đây, diện tích và sản lợng vải của Việt Nam ngày
càng tăng. Tính đến năm 1998, toàn bộ diện tích vải đã lên tới 25.000 ha và sản
lợng đạt 25.000 tấn (trong đó có 10.000 ha vải cha cho quả) [68].
Bảng 1. Diện tích trồng và sản lợng vải của một số nớc trên thế giới
(Thông tin khoa học kỹ thuật trồng vải, Quảng Đông, Trung Quốc 1990)
Tên nớc Diện tích trồng (ha) Sản lợng (tấn)

Trung Quốc
Thái Lan
ấn Độ
Đài Loan
Ôxtrâylia
Mađagatca
Nam Phi
Mauritius
Reunion
Mỹ
161.681
13.550
11.410
8.386
1.400
800
180
200
200
100
223.680
8.410
91.860
111.981
450
2.000
1.800
200
180
40

1.1.3. Cây vải ở Việt Nam
5
1.1.3.1. Nguồn gốc, phân bố, tình hình sản xuất và triển vọng.
ở Việt Nam, theo các tài liệu và th tịch cũ, cây vải đã đợc trồng cách đây
gần 2000 năm. Dới thời Bắc thuộc, vải là một trong những cống vật hàng năm
Việt Nam phải nộp cho các vua Trung Quốc. Năm 722, Mai Thúc Loan hiệu
triệu những ngời dân phu phải đi gánh vải nộp cho chính quyền nhà Đờng nổi
dậy khởi nghĩa [14].
Điều đó cho thấy, cây vải có ở nớc ta và là một sản vật quý. Vậy Việt
Nam có phải là quê hơng của cây vải không? Theo tài liệu của Pháp để lại thì có
những cây vải dại mọc ở sờn núi Ba Vì, tỉnh Hà Tây. Vào năm 1982, Giáo s Vũ
Công Hậu đã gặp ở chân núi Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc một số cây vải dại có cùi
mỏng ăn chua và cho rằng Việt Nam cũng là một trong những nơi đã thuần
hóa và trồng vải sớm, có điều kiện tự nhiên thích hợp để phát triển cây vải
[37].
Vùng phân bố tự nhiên cây vải của nớc ta từ 18 - 19
0
vĩ Bắc trở ra. ở
miền Nam khí hậu đặc trng nhiệt đới, mùa đông nhiệt độ quá cao, vải không
phân hóa mầm hoa đợc nên không có quả. Vùng trồng vải chủ yếu của Việt
Nam là vùng đồng bằng sông Hồng, trung du, miền núi Bắc Bộ và một phần
khu 4 cũ. Những vùng trồng vải lớn, nổi tiếng trong nớc nh Lục Ngạn (Bắc
Giang), Thanh Hà, Chí Linh (Hải Dơng), Đông Triều (Quảng Ninh) có diện tích
vải từ 3.000 - 7.000 ha. Ngoài ra, còn có vờn vải giống chín sớm dọc sông Đáy,
thuộc các huyện Đan Phợng, Hoài Đức, Chơng Mỹ, Thanh Oai, Quốc Oai (tỉnh
Hà Tây) [8].
Vải là cây ăn quả đặc sản của miền Bắc, có giá trị dinh dỡng cao. Nếu là
giống tốt, phần ăn đợc (cùi) chiếm 70 - 80%, vỏ từ 8 - 15%, hạt từ 4 - 18% khối
lợng quả. Trong 100 g phần ăn đợc có: nớc - 77,69 g, năng lợng - 335 kJ,
protein - 0,94 g, lipit - 0,29 g, hydratcacbon - 20,77 g, xơ - 0,16 g, tro - 0,37 g,

các chất khoáng (Ca - 4 mg, Fe - 0,37 mg, Mg - 16 mg, P - 35 mg, K - 255 mg,
6
Na - 7 mg) và các vitamin (vitamin C - 40,2 mg, B - 0,035 mg, B
2
- 0,084 mg,
PP - 1,91 mg). Nớc ép từ cùi ra có độ Brix cao 19 - 21 (đu đủ, cam, quít, bởi chỉ
có 9 - 12). Độ chua từ 0,2 - 0,5. Tỷ lệ đờng vào loại tốt, thích hợp cho khẩu vị
cả ngời châu á lẫn ngời châu Âu, có mùi thơm thanh khiết, do đó từ lâu vải đã
đợc coi là một trong những loại quả nhiệt đới ngon nhất. Sách Trung Quốc viết
Vải bổ não, khoẻ ngời, khai vị, có thể chữa bệnh đờng ruột, là một thực phẩm
quí đối với phụ nữ và ngời già [14]
Quả vải ngoài ăn tơi còn đợc chế biến thành các sản phẩm có giá trị: nớc vải,
vải hộp, vải khô... Vỏ quả, thân cây và rễ có nhiều tanin có thể dùng làm nguyên
liệu trong chế biến các loại thuốc và một số ngành công nghiệp khác.
Trồng vải không phải chỉ để lấy quả mà còn để phục vụ cho việc nuôi
ong lấy mật. Hoa vải là nguồn mật nuôi ong có chất lợng cao, trong một vụ hoa
vải nếu đặt một thùng ong có thể thu đợc 20 - 30 kg mật. Hạt vải còn đợc dùng
làm thuốc chữa một số bệnh đờng ruột, mụn nhọt... Hạt vải chứa nhiều tinh bột
(37%) nên còn có thể dùng để lên men rợu, làm giấm [6].
Gỗ vải là một loại gỗ quí, bền, không bị mọt đục, có thể dùng xây dựng
nhà cửa, để đóng đồ gỗ. Cây vải trồng làm cây cảnh rất đẹp. Tán tròn, tự tạo
lấy, không phải đốn tỉa phức tạp, màu lá xanh thẫm, mặt trên bóng, bốn mùa tơi
tốt góp phần cải thiện điều kiện môi trờng.
Ưu thế lớn của cây vải là tính thích ứng mạnh, dễ trồng. Vải lại chịu đất
chua, đất dốc là loại đất phổ biến ở vùng đồi núi phía Bắc nớc ta. Tác hại do bão
lụt cũng ít do quả chín vào tháng 5, 6 khi bão mới chỉ bắt đầu. Tháng 11, 12,
khi đọt hoa bắt đầu hình thành thì trời bắt đầu rét và hạn giúp kích thích ra hoa.
Tháng 4, 5, khi quả sắp chín cần nhiều nớc lại là lúc bắt đầu mùa ma, khí hậu
ẩm ít khi thiếu nớc [6].
7

Trồng vải trong vờn gia đình mang lại thu nhập khá cao so với các cây ăn
quả khác (cam, chuối, hồng xiêm ). Nhân dân cho biết cùng trên một đơn vị
diện tích, nếu trồng vải thiều sẽ thu giá trị kinh tế gấp 6 lần trồng lúa.
ở huyện Lục Ngạn (Bắc Giang) nhờ trồng vải thiều mà từ một huyện
miền núi đói nghèo đã trở thành một huyện giàu có. Năm 1998, hàng chục hộ
nông dân có thu nhập từ 20 - 90 triệu đồng. Năm 1998, giá trị thu nhập của
huyện đạt 105 tỷ đồng, riêng vải thiều đạt 65 tỷ, gấp 4 lần so với năm 1994.
Năm 1998, Lục Ngạn có 7092 ha vải đạt đợc che phủ đất khoảng 35% trong khi
đó chỉ tiêu quốc gia về độ an toàn che phủ là 40% [14].
Mấy năm gần đây phong trào làm vờn đang phát triển mạnh. Nhiều tỉnh
nh Thái Nguyên, Hoà Bình, Hà Tây, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Yên Bái, Lào Cai,
Lạng Sơn, Thanh Hoá, Nghệ An, đang có kế hoạch tăng diện tích cây trồng
và coi vải thiều nh một cây chủ lực trong cơ cấu cây ăn quả trong vờn. Theo số
liệu của Tổng cục Thống kê năm 1997, diện tích trồng vải thiều ở miền Bắc là
25.114 ha, trong đó có 10.313 ha đang ở độ tuổi cho thu hoạch, sản lợng đạt
27.193 tấn. Căn cứ vào số liệu này, Việt Nam đợc coi là nớc đứng thứ hai trong
danh sách nêu ở bảng 1 về diện tích và sản lợng vải.
Do diện tích vải ngày càng tăng và mở rộng ở nhiều tỉnh phía Bắc, sản l-
ợng cao, chín tập trung, chủ yếu tiêu thụ trong nớc nên giá bán thấp. Vì vậy,
chiến lợc phát triển của nớc ta hiện nay là nâng cao diện tích trồng song song
với việc nâng cao chất lợng giống, tìm các giống khác nhau để rải vụ, cải tiến
công nghệ sau thu hoạch và tăng cờng xuất khẩu.
Xuất phát từ nhận thức này và do nớc ta là một nớc nông nghiệp với
khoảng 80% dân số sống ở vùng nông thôn nên các nghiên cứu cơ bản nhằm
tìm kiếm và phát hiện ra các nguồn gen quí trong quỹ gen của các giống cây
trồng có giá trị kinh tế cao trong sản xuất nông nghiệp, nh cây ăn quả đặc sản
vải thiều Thanh Hà, sẽ không chỉ có ý nghĩa khoa học cơ bản, mà còn góp phần
8
thiết thực vào việc bảo tồn và phát triển sự đa dạng sinh học của các cây ăn quả
nói riêng và các giống cây trồng ở nớc ta nói chung.

1.1.3.2. Giống vải thiều Thanh Hà
ở Việt Nam, hiện có 3 nhóm giống vải chủ yếu đó là: vải chua, vải nhỡ
và vải thiều. Vải chua hay còn gọi là vải ta là giống vải địa phơng, trồng từ lâu
đời bằng hạt nên đặc tính không ổn định, ăn quả có vị chua, chất lợng nói chung
thấp hơn vải thiều. Vải nhỡ (vải lai) là giống vải lai giữa vải chua và vải thiều.
Vải thiều còn gọi là vải Tàu vì ngời ta cho rằng nó đợc đa từ Trung Quốc sang.
Giống vải này hiện nay có hai loại là vải thiều Phú Hộ (Phú Thọ) và vải thiều
Thanh Hà (Hải Dơng) [14].
Hình 1. Cây vải thiều tổ tại thôn Thuý Lâm
(ảnh: Nguyễn Văn Hợi)
Cây vải thiều Thanh Hà có tán tròn, cành và lá nhỏ, nhiều chùm quả nh-
ng quả tha, quả hình cầu, cuống quả cắm xiên, gai trung bình. Quả chín có màu
đỏ trên nền hơi vàng. Quả nặng 18 - 20 g. Tỷ lệ cùi 72 - 76%. Độ Brix 19 - 20.
Quả cha chín hẳn ăn đã tốt, độ chua 0,4%.
Vải thiều Phú Hộ là giống nhập nội từ trớc năm 1945 ở Trung tâm nghiên
cứu chè và cây ăn quả Phú Hộ (Phú Thọ). Chùm nhiều quả, quả to 25-27 g nhng
ít chùm. Khi chín quả có màu đỏ sẫm, hình trái tim, vai quả hơi nghiêng, hình
gai nhiều cạnh, độ lớn không đều. Hạt cũng vậy, to nhỏ không đều (hạt to nhất
3,5 g, hạt bé nhất 0,4 g), trọng lợng trung bình 1,8 g. Tỷ lệ phần ăn đợc trên dới
9
70%, độ khô 20 - 21%, cao hơn vải thiều Thanh Hà, độ chua cũng cao hơn.
Theo đánh giá của nhà máy hoa quả Tơng Mai (Hà Nội) thì vải thiều Phú Hộ
làm đồ hộp rất tốt, tuy nhiên không bằng vải thiều Thanh Hà.
Hiện nay, cha có ai nghiên cứu tuổi thọ của cây vải thiều ở nớc ta nhng
theo Hội những ngời làm vờn Việt Nam (VACVINA) thì cây vải thiều lâu năm
nhất của nớc ta đợc trồng ở thôn Thuý Lâm, xã Thanh Sơn, huyện Thanh Hà,
tỉnh Hải Dơng. Đây là cây vải thiều đầu tiên đợc trồng ở Việt Nam và vì vậy đ-
ợc gọi là cây Vải Tổ của giống vải thiều Thanh Hà. Cây vải này có nguồn gốc
từ Thiều Châu - Trung Quốc, nên giống vải Thanh Hà đợc gọi là vải thiều
Thanh Hà [14].

Qua tìm hiểu thấy rằng tất cả các cây vải thiều trồng ở Thuý Lâm từ xa
tới nay đều là các thế hệ con cháu (cành chiết) của cây vải tổ này. Tìm hiểu các
xã khác của huyện Thanh Hà, các địa phơng khác của tỉnh Hải Dơng và các tỉnh
khác nh Bắc Giang, Hà Tây, Hoà Bình, chúng tôi đợc nhân dân cho biết họ đều
lấy giống vải thiều từ xã Thanh Sơn, huyện Thanh Hà. Hiện nay, ở Thanh Sơn
có một bộ su tập sống các cây vải thiều có tuổi cây từ vài năm đến khoảng
180 năm tuổi. Một số cây đợc dùng làm giống gốc để chiết cành, nhng do chiết
quá nhiều cành nên cây vải mẹ bị kiệt sức, thoái hoá giống và lợng cây giống
không đủ cung cấp cho việc mở rộng diện tích trồng.
Vì vậy, vấn đề đặt ra cho các nhà khoa học là phải nghiên cứu tính đa
hình ADN hệ gen của quần thể vải thiều Thanh Hà để đánh giá mức độ lẫn tạp,
xác định phẩm chất của giống, bảo tồn và phát triển nguồn gen quí.
Hiện nay, một trong những kỹ thuật tỏ ra có tính u việt để đánh giá tính
đa hình di truyền của sinh vật nói chung và tính đa hình ADN hệ gen của các
quần thể vải nói riêng là kỹ thuật RAPD.
1.2. kỹ thuật PCR - RAPD
1.2.1. Phản ứng PCR
10
1.2.1.1. Lịch sử của phơng pháp
Phơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction - phản ứng tổng hợp dây
chuyền nhờ polymerase) do Kary Mullis và cộng sự phát minh vào năm 1985 đã
góp phần tạo ra cuộc cách mạng trong sinh học phân tử. Kỹ thuật PCR là một
phơng pháp hoàn toàn mới trong việc nghiên cứu và phân tích gen. Sử dụng kỹ
thuật PCR có thể tạo ra một số lợng lớn các bản sao của đoạn ADN cần tổng
hợp mà không phải tách dòng, nhân dòng hay sử dụng các sinh vật sống nh
E.coli hoặc nấm men [4].
1.2.1.2. Nguyên tắc của phơng pháp PCR
Về cơ bản PCR là một phơng pháp in vitro cho phép nhân bản nhanh một
đoạn ADN dựa trên cơ sở đặc tính hoạt động của các ADN polymerase. ADN
polymerase có mặt tự nhiên trong các cơ thể sống. Chúng thực hiện chức năng

sao chép ADN trớc khi tế bào phân chia. Chúng liên kết với một sợi ADN đơn
và tổng hợp nên một sợi đơn mới bổ sung với sợi ban đầu, từ vị trí mồi (một
trình tự ADN ngắn) đã bắt cặp sẵn với khuôn.
ở phơng pháp mà Kary Mullis đa ra ban đầu, enzym đợc sử dụng in
vitro. Khi nâng nhiệt độ lên khoảng 96
o
C để biến tính và tách ADN sợi đôi
thành hai sợi đơn thì ADN polymerase bị mất hoạt tính. Cho nên việc bổ sung
thêm enzym sau giai đoạn gia nhiệt của mỗi chu kỳ đã làm cho phơng pháp
này trở thành phơng pháp kém hiệu quả, tốn thời gian, yêu cầu một lợng ADN
polymerase quá lớn và phải theo dõi liên tục trong suốt quá trình PCR [4].
Về sau phơng pháp này đợc cải tiến bằng cách sử dụng ADN polymerase
tách từ vi khuẩn a nhiệt sống ở các suối nớc nóng trên 110
o
C. ADN polymerase
tách từ các vi khuẩn này bền nhiệt (bền vững ở nhiệt độ cao) và trong phản ứng
PCR nó không bị mất hoạt tính khi hỗn hợp gia nhiệt để tách các sợi ADN. Do
vậy, không cần thiết phải bổ sung thêm ADN polymerase mới vào mỗi chu kỳ
11
và quá trình nhân bản một sợi ADN cần lựa chọn có thể đợc đơn giản hoá và
thực hiện tự động [56].
Phản ứng PCR là một quá trình tơng đối đơn giản, gồm một chuỗi các
phản ứng với nhiều chu kỳ lặp lại, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn [4]:
+ Giai đoạn 1 (biến tính): ADN đợc biến tính ở nhiệt độ khoảng 95
0
C
trong thời gian khoảng 1 phút, khi đó các liên kết hidro bị đứt và sợi ADN kép
tách thành hai sợi đơn.
+ Giai đoạn 2 (gắn mồi): ở nhiệt độ từ 30
0

C đến 65
0
C trong khoảng 30
giây đến 1 phút thì các mồi bắt cặp với sợi ADN khuôn theo nguyên tắc bổ sung
ở hai đầu đoạn ADN cần nhân. Nhiệt độ của bớc gắn mồi tùy thuộc vào từng
loại mồi cụ thể, đợc tính toán dựa trên nhiệt độ nóng chảy (Tm) của đoạn mồi.
Công thức tính nhiệt độ nóng chảy (Tm) của đoạn mồi:
Tm = 81,5 + 16,6(log
10
{J
+
}) + 0,41(%G + C) - (600/I) - 0,63(%FA)
Trong đó: {J
+
}: nồng độ của các cation hóa trị I
FA : chất dùng để gây biến tính ADN
I : chiều dài của mồi
+ Giai đoạn 3 (tổng hợp ADN): ở nhiệt độ khoảng 72
0
C, trong khoảng
thời gian từ 30 giây đến nhiều phút (tuỳ thuộc vào chiều dài đoạn ADN cần
tổng hợp), khi đó, enzym Taq polymerase hoạt động và quá trình tổng hợp
ADN diễn ra trên những đoạn giữa cặp mồi theo chiều từ 5- 3.
Một chu kỳ gồm 3 bớc trên đợc lặp đi lặp lại nhiều lần và qua mỗi lần
làm tăng gấp đôi số mẫu lần trớc. Sự tăng lợng mẫu này theo cấp số nhân, nên
sau n chu kì số mẫu thu đợc là:
A = x . 2
n
Trong đó A: Tổng số bản sao ADN
x: Số lợng phân tử ADN làm khuôn ban đầu

12
n: Số chu kỳ
Số chu kỳ lặp lại của phản ứng PCR trung bình vào khoảng 30 - 40 chu
kỳ, tuỳ theo yêu cầu.
1.2.1.3. Thành phần của phản ứng PCR
Các thành phần cơ bản của một phản ứng PCR gồm: ADN khuôn, hai
đoạn mồi để xác định các điểm bắt đầu tổng hợp ADN, Taq polymerase, hỗn
hợp bốn tiền chất deoxyribonucleotit, dung dịch đệm chứa một số cation hóa trị
1, ion Mg
2+
và dung môi (nớc khử ion, vô trùng) [4], [56].
- ADN khuôn (template)
ADN khuôn là vật liệu khởi đầu cho phản ứng PCR nên đòi hỏi phải có
độ tinh sạch cao. ADN khuôn có thể là sợi đơn hoặc sợi đôi của chuỗi ADN hay
ARN, đợc biết trớc trình tự ở hai đầu để thiết kế mồi. Thông thờng nồng độ của
ADN khuôn đợc đa vào phản ứng PCR khoảng 10 - 500 ng.
- Đoạn mồi (primer)
Trong kỹ thuật PCR, các đoạn mồi đợc chọn để chặn hai đầu của đoạn
ADN cần nhân lên, sao cho các sợi ADN tổng hợp mới đợc bắt đầu tại mỗi
đoạn mồi và kéo dài về phía đoạn mồi nằm trên sợi kia.
Các đoạn mồi thực chất là các oligonucleotit dài khoảng 6 - 10 nucleotit
(đối với mồi ngẫu nhiên) hoặc khoảng 12 - 24 nucleotit (đối với mồi đặc trng)
nhng không quá 50 nucleotit. Việc lựa chọn độ dài của đoạn mồi và nhiệt độ để
tách chúng phụ thuộc vào một số điều kiện. Thứ nhất, nhiệt độ nóng chảy của
một đoạn mồi (không đợc nhầm lẫn với nhiệt độ nóng chảy của ADN trong bớc
đầu tiên của phản ứng PCR) đợc xác định thấp hơn nhiệt độ mà mồi sẽ bắt cặp
với ADN khuôn và cao hơn nhiệt độ mà mồi sẽ tách ra khỏi ADN khuôn. Thứ
hai, nhiệt độ nóng chảy tăng theo độ dài của mồi. Những mồi quá ngắn sẽ bắt
cặp tại một vài vị trí trên sợi ADN khuôn dài và nh vậy sẽ tạo ra các bản sao
không đặc hiệu. Mặt khác, độ dài của mồi bị giới hạn bởi nhiệt độ cần thiết để

13
làm nóng chảy nó. Nếu nhiệt độ nóng chảy quá cao (trên 80
o
C) cũng có thể là
nguyên nhân của các vấn đề vì ADN polymerase sẽ giảm hoạt động. Vì vậy,
chiều dài thích hợp của mồi khoảng 20 nucleotit với nhiệt độ nóng chảy vào
khoảng từ 50
o
C - 60
o
C.
Nói chung, cặp mồi đặc trng cần đáp ứng các yêu cầu sau:
+ Không có sự bắt cặp giữa mồi xuôi và mồi ngợc.
+ Mồi không có cấu trúc thứ cấp.
+ Trình tự nằm giữa mồi xuôi và mồi ngợc không quá lớn, tối u
với các đoạn nhỏ hơn 1Kb.
+ Tm của mồi xuôi và mồi ngợc không chênh nhau quá xa.
+ Các cặp mồi chọn phải đặc trng cho trình tự ADN cần nhân,
không trùng với trình tự lặp lại trên gen.
Nồng độ mồi thích hợp để tiến hành phản ứng PCR là từ 10 - 20 pM/25
l hỗn hợp phản ứng. Lợng mồi đa vào phản ứng PCR phải phù hợp với lợng
ADN cần tổng hợp (thờng 10
6
phân tử ADN cần 10
8
phân tử mồi). Nếu nồng độ
mồi quá thấp thì mồi sẽ hết trớc khi số chu kỳ kết thúc, còn nồng độ mồi quá
cao thì sẽ dễ làm tăng sản phẩm không đặc hiệu.
Các đoạn mồi cần có tính đặc thù để làm tăng tính đặc hiệu của phản
ứng. Mồi phải đợc thiết kế sao cho không đợc bổ trợ lẫn nhau, số lợng 4 loại

bazơ nitơ trong mồi nên xấp xỉ nhau, lợng G - C giữa hai mồi phải bằng nhau,
tránh những vùng trình tự không bình thờng nh polypurine hoặc polypymidine
hay các trình tự lặp.
- Taq polymerase
ADN polymerase bền nhiệt đầu tiên đợc tách từ vi khuẩn Thermus
aquaticus và đợc gọi là Taq. Hiện nay Taq ADN polymerase đợc sử dụng rất
rộng rãi trong các phản ứng PCR. Tuy nhiên, sự sao chép nhờ Taq ADN
14
polymerase có tỷ lệ sai sót khá cao (10
-4
, có nghĩa là cứ 10.000 nucleotit thì
enzym gắn sai một nucleotit). Đặc tính này không gây ảnh hởng nghiêm trọng
nếu ta chỉ cần xem xét kích thớc hay sự có mặt của một sản phẩm khuếch đại,
nhng có ý nghĩa rất lớn nếu cần xác định chính xác trình tự nucleotit của ADN.
Ngày nay, nhiều enzym loại polymerase chịu nhiệt đã đợc đa ra thị trờng
với nhiều chức năng chuyên biệt và hoàn thiện nh Tth polymerase, Pwo và Pfu.
Tth pol đợc tách chiết từ Thermus thermophilus có khả năng hoạt động nh một
enzym phiên mã ngợc khi có mặt ARN khuôn và ion Mn
2+
, nhng với sự có mặt
của ADN khuôn và ion Mg
2+
thì Tth pol lại xúc tác phản ứng khuếch đại ADN.
Enzym này cho phép khuếch đại bản mẫu là ARN thông qua sự hình thành
cADN. Pwo và Pfu đợc tách từ các Archaea, có cơ chế đọc và sửa lỗi do vậy có
khả năng làm giảm đáng kể số lợng các đột biến xảy ra trong trình tự ADN đợc
nhân bản. Hiện nay ngời ta thấy rằng, việc kết hợp giữa các enzym này và Taq
polymerase có thể tạo ra phân tử ADN có độ chính xác và độ tin cậy cao.
Enzym Taq có trọng lợng phân tử là 94 kDa, không mất hoạt tính ở nhiệt
độ cao trong giai đoạn gây biến tính ADN nhng giảm 50% hoạt tính sau 150

phút ở nhiệt độ 92,5
0
C, sau 40 phút ở nhiệt độ 95
0
C và sau 5 - 6 phút ở nhiệt độ
97
0
C. Nếu nhiệt độ tăng lên tới 95
0
C trong 20 giây để biến tính ADN kép thành
sợi đơn thì hoạt tính enzym Taq còn lại 65% sau 50 chu kì phản ứng [56].
Nồng độ enzym Taq tối u cho phản ứng PCR là 0,5 - 2,5 đơn vị, nhng
nếu nồng độ enzym quá cao sẽ làm giảm hiệu xuất xúc tác của phản ứng. Ngoài
ra, nồng độ Mg
2+
và dNTP cũng ảnh hởng đến hoạt tính của enzym.
- Các nucleotit (dNTPs)
Hỗn hợp dNTPs bao gồm bốn loại deoxyribonucleotit (dATP, dTTP,
dGTP, dCTP). Tuỳ thuộc vào mục đích nghiên cứu, các nhà khoa học còn có thể
sử dụng một số nucleotit đã đợc thay đổi nh gắn thêm biotin hoặc digoxigenin...
Nồng độ phản ứng của các dNTPs thờng dùng vào khoảng 200 mM mỗi loại,
15
tuy nhiên ở nồng độ dNTPs thấp (10 - 100 mM), Taq ADN polymerase hoạt
động chính xác hơn. Hơn nữa, nồng độ tối u của chúng phụ thuộc vào rất nhiều
yếu tố nh:
+ Nồng độ Mg
2+

+ Nồng độ chất mồi
+ Độ dài của sản phẩm đợc khuếch đại

+ Số chu kỳ của phản ứng
- Dung dịch đệm PCR (buffer)
Thành phần của dung dịch đệm PCR phụ thuộc vào loại enzym
polymerase đợc sử dụng. Trong dung dịch đệm quan trọng nhất là ion Mg
2+
. Ion
Mg
2+
làm tăng nhiệt độ nóng chảy (Tm) của ADN mạch đôi, tạo ra phức chất
tan với dNTPs để hình thành cơ chất mà enzym polymerase có thể nhận ra, điều
này rất cần thiết cho quá trình liên kết của các dNTPs. Nồng độ Mg
2+
trong hỗn
hợp phản ứng cuối cùng biến đổi từ 0,5 - 5,0 mM (nồng độ này có thể thay đổi
khi cần thiết). Nồng độ ion Mg
2+
quá thấp sẽ làm giảm khả năng tổng hợp của
enzym polymerase, còn nếu nồng độ quá cao sẽ tạo ra những phân đoạn không
đặc hiệu.
Nhìn chung, nồng độ MgCl
2
có ảnh hởng nhiều tới hiệu quả và tính đặc
thù của phản ứng. Ngoài Mg
2+
còn một số chất khác trong dung dịch đệm nh
AMSO, DMSO, formamide đợc thêm vào nh các chất phụ gia nhằm tạo ra các
sản phẩm PCR có kính thớc lớn [56].
1.2.1.4. ứng dụng của phơng pháp PCR
Từ khi đợc Kary Mullis đề xuất và hoàn thiện, phơng pháp PCR đã có
những ứng dụng hết sức rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau, cả trong khoa

học công nghệ và đời sống xã hội.
Phơng pháp PCR đủ nhạy để tìm ra lợng ADN ít ỏi trong mọi loại mẫu.
Nó đợc sử dụng để tách dòng các đoạn ADN từ các xác ớp và những động vật
16
tuyệt chủng nh loài voi mamut có lông, qua đó tạo ra các lĩnh vực mới về khảo
cổ học phân tử và cổ sinh vật học phân tử. Ngoài lợi ích đối với việc tách dòng
ADN, nó còn là một công cụ hữu hiệu trong pháp y. Nó cũng đợc sử dụng để
chuẩn đoán virut trớc khi chúng gây nên các triệu chứng hay gây ra các đáp ứng
miễn dịch trông thấy hoặc trong phát hiện các bệnh di truyền trớc khi sinh [56].
Những ứng dụng thực tiễn đa dạng của phơng pháp PCR thật vô cùng tận.
Nếu nh năm 1985 mới có 3 công trình đợc công bố về PCR thì chỉ 5 năm sau,
kỹ thuật này đã đợc sử dụng trong hàng nghìn phòng thí nghiệm trên khắp thế
giới. Ngay ở nớc ta, kỹ thuật PCR cũng đang đợc dùng trong nhiều trờng đại
học, viện nghiên cứu và ngày càng trở nên phổ biến. Phản ứng chuỗi trùng hợp
thực sự đã đa lại một cuộc cách mạng trong lĩnh vực ứng dụng thực tế của di
truyền học phân tử [4].
Hiện nay, kỹ thuật PCR giúp ích hữu hiệu cho việc xác định trình tự
nucleotit của các đoạn ADN đợc nhân, giúp phát hiện đột biến, cho phép phân
tích liên kết gen từ những tế bào riêng lẻ thậm chí có thể giúp nghiên cứu quá
trình tiến hoá ở mức độ phân tử. Một trong những ứng dụng của phản ứng PCR
trong phân tích quá trình tiến hoá là kỹ thuật RAPD.
1.2.2. Kỹ thuật RAPD
1.2.2.1. Nguyên lý của phơng pháp RAPD
Trong những năm qua, với sự ra đời của sinh học phân tử và công nghệ
gen, một ngành khoa học mới đã xuất hiện: Phân loại học phân tử (molecular
taxonomy), chủ yếu dựa trên các kỹ thuật phân tích ADN. Các kỹ thuật điểm
chỉ ADN phân tích và so sánh trình tự nucleotit của các đoạn ADN đã giúp cho
việc phát hiện các loài mới, giải quyết các mối nghi ngờ về vị trí phân loại, đánh
giá đầy đủ về tính đa dạng di truyền, quan hệ chủng loại và tiến hoá của nhiều
loài động, thực vật và vi sinh vật [56].

17
Các kỹ thuật đợc sử dụng trong phân loại phân tử bao gồm: kỹ thuật
isozym (đồng enzym), các kỹ thuật phân tích đoạn ADN nh phơng pháp đa hình
chiều dài các đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism -
RFLP), các kỹ thuật trên cơ sở của phản ứng PCR nh ADN tiểu vệ tinh (Simple
Sequence Repeats - SSR), đa hình các đoạn ADN nhân bản ngẫu nhiên (RAPD -
Random Amplified Polymorphic DNA), đa hình chiều dài các đoạn ADN nhân
bản (Amplified Fragment Length Polymorphism - AFLP), kỹ thuật điểm chỉ
ADN đa locus, lai ADN, phân tích trình tự ADN...
- Kỹ thuật AFLP cho phép ta phát hiện đợc tính đa dạng về chiều dài các
đoạn ADN đợc nhân bản chọn lọc - cắt ra bởi enzym giới hạn. Sử dụng kỹ thuật
này có thể nhân cùng một lúc một cách đặc trng với số lợng lớn các đoạn ADN
có kích thớc giới hạn. Kỹ thuật AFLP kết hợp đợc những u điểm của RFLP và
RAPD nên nó có hiệu quả trong việc phát hiện đa hình ADN. Ngoài ra, kỹ thuật
này có thể phân tích tính đa hình một cách nhanh chóng, ổn định và đáng tin
cậy [42].
- Kỹ thuật RFLP đợc sử dụng để tạo nên các đoạn cắt có chiều dài khác
nhau, đợc phân biệt bằng phơng pháp điện di. Nhợc điểm của kỹ thuật này là
quy trình phức tạp, cồng kềnh, khó tự động hoá, tốn kém và sử dụng chất đồng
vị phóng xạ gây nguy hiểm cho ngời thao tác [4], [9].
- Kỹ thuật SSR dựa trên các đoạn ADN có sự lặp lại của một trật tự
nucleotit đơn giản nào đó. Kỹ thuật SSR cho phép phát hiện đợc tính đa hình về
độ dài các trật tự nucleotit đơn giản. Nhợc điểm của kỹ thuật SSR là tốn kém về
tiền của, công sức trong việc xây dựng cặp mồi đặc hiệu cho mỗi locus đa hình
(để xây dựng các cặp mồi đặc hiệu cần tách dòng và đọc trình tự một số lợng
lớn các đoạn ADN hệ gen chứa đoạn lặp lại) [9].
- Kỹ thuật RAPD là kỹ thuật phối hợp phản ứng sử dụng polymerase của
phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) với các mồi ADN không đặc thù để nhân các
đoạn ADN một cách ngẫu nhiên. Các đoạn ADN nhân ngẫu nhiên có thể đa
18

hình bởi các đoạn nhân có thể có trong mẫu ADN của cá thể này nhng lại
không có trong mẫu ADN của cá thể khác [73].
Năm 1990, William và cộng sự đã phát triển kỹ thuật RAPD dựa trên cơ
sở của phơng pháp PCR. Về cơ bản, kỹ thuật này sử dụng những đoạn mồi ngắn
khoảng 4 - 10 nucleotit ngẫu nhiên để tiến hành phản ứng PCR. Sản phẩm PCR
khi dùng với mồi ngẫu nhiên thờng đa dạng, có chiều dài từ 100 - 5000
nucleotit và khi điện di trên gel agarose đợc phân tách thành các phân đoạn
khác nhau. Tính đa dạng thu đợc nhờ kỹ thuật RAPD là đáng tin cậy vì khi có
các đột biến hay sự sắp xếp lại một số nucleotit nào đó ở vị trí gắn mồi thì nó sẽ
ngăn cản việc gắn kết của mồi vào ADN khuôn. Ngoài ra, sự mất đoạn nhiễm
sắc thể, sự thêm bớt điểm gắn mồi cũng nh sự xen vào của một gen nào đó có
thể sẽ làm thay đổi kích thớc của đoạn ADN đợc nhân bản. Do vậy, mỗi đoạn
mồi có thể tạo ra một hoặc một vài sự đa dạng, có thể phát hiện đợc và cho ra
phổ điện di đặc trng trên biểu đồ RAPD [7].
Thông qua các biểu đồ RAPD Apostol và cộng sự (1993), đã xây dựng
kỹ thuật phân nhóm để thiết lập mối quan hệ giữa các loài hay nhóm loài [18].
Nguyên lý qui trình này dựa trên 3 bớc:
B1: So sánh từng cặp đối tợng trong nghiên cứu bằng cách tính toán
khoảng cách quan hệ giữa chúng.
B2: Lập ma trận gồm tất cả những giá trị tính đợc trớc đó.
B3: Giải ma trận và biểu diễn thành một biểu đồ đặc trng. Các giá trị biểu
diễn khoảng cách giữa các cá thể đợc thiết lập theo hệ số tơng đồng của Nei và
Li (1985).
S = 2 N
AB
/ (N
A
+ N
B
)

Trong đó: N
AB
là số phân đoạn có mặt ở cả hai loài A và B; N
A
: là số
phân đoạn chỉ có ở loài A; N
B
: là số phân đoạn chỉ có ở loài B.
19
Ngày nay, các nhà nghiên cứu đã thiết lập đợc phần mềm máy tính để tự
động vẽ nên biểu đồ mối quan hệ hay độ tơng đồng di truyền của các đối tợng
nghiên cứu sau khi nhập dữ liệu về các phân đoạn đợc nhân bản của các cá thể.
NTSYS Version 2.0 (Applied Biostatistics Inc. USA, 1998) là tên của một ch-
ơng trình thuộc kiểu trên để tạo các biểu đồ hình cây. Biểu đồ thu đợc sẽ thể
hiện mức độ gần nhau của các cá thể cho phép đánh giá đợc mối quan hệ di
truyền giữa các cá thể đợc nghiên cứu. Công trình này cho phép giảm bớt thời
gian tính toán và có độ chính xác cao nên nó là một phần mềm có hiệu quả
trong việc phân tích kỹ thuật RAPD.
1.2.2.2. ứng dụng của kỹ thuật RAPD trong đánh giá đa hình ADN
Kỹ thuật RAPD đợc sử dụng để phân tích và xác định mối quan hệ thân
thuộc giữa các loài hay giữa các cá thể để phục vụ cho công tác lai tạo hoặc
phân loại. Chúng cũng đợc sử dụng nh những chỉ thị phân tử để xác định những
gen kiểm soát hoặc có liên quan đến một tính trạng nào đó ở cây trồng, nh tính
trạng chất lợng chất lợng sợi ở cây bông, tính trạng kháng virut ở cà chua [9],
[30].
Ưu điểm của kỹ thuật này là nhanh, rẻ và cho phép tiến hành với số lợng
mẫu lớn. Kỹ thuật RADP không yêu cầu mẫu dò ADN, không cần biết thông
tin về trình tự đoạn ADN cần nghiên cứu, quy trình tiến hành nhanh, chỉ cần
một lợng nhỏ ADN khuôn và có thể thực hiện tự động [33]. Với một bộ mồi ta
có thể sử dụng đợc với các loài khác nhau trong khi các mẫu dò RFLP chỉ có

thể dùng đợc cho các loài có quan hệ gần gũi. Tính đa dạng thu đợc từ các chỉ
thị RAPD đợc đánh giá cao hơn so với kỹ thuật RFLP trong trờng hợp thực hiện
trên cùng một vật liệu và cho phép phát hiện đợc tính đa dạng ngay cả trong các
đoạn chứa các trật tự nucleotit lặp lại [21], [33].
20
Bên cạnh đó, RAPD còn là một kỹ thuật lấy dấu ADN có độ nhạy cao, có
hiệu quả trong việc xác định kiểu gen, lập bản đồ di truyền, lập bản đồ gen liên
kết và phân tích con lai F1. Bằng phơng pháp này có thể xác định đợc ngay các
gen liên kết của quần thể F1 mà không cần chờ các tính trạng của thế hệ F1
biểu hiện khi trồng và thu hoạch. Nhợc điểm của kỹ thuật này là: chỉ thị RAPD
có tính chất trội do đó những gen điều khiển tính trạng nào đó có tính lặn sẽ
khó tìm thấy sự đa hình trên gel điện di [26], [45], [71].
Hiện nay, kỹ thuật RAPD đợc sử dụng trong nhận biết, phân loại và phân
tích đa hình di truyền của các loài khác nhau nh phân tích sự đa dạng ADN giữa
các giống Saccharum [35], xác định và phân loại các kiểu di truyền của các
giống đậu Hà Lan [59], phân tích mối quan hệ di truyền giữa các loài
Orobanche [55], phân tích các biến đổi di truyền trong loài cỏ ba lá trắng ở Bắc
Mỹ [34].
Hai nhà khoa học Yang và Quiros đã sử dụng 28 đoạn mồi có trình tự 10
nucleotit để nghiên cứu sự khác biệt của 28 giống cần tây và đợc chia làm ba
nhóm. Kết quả thu đợc càng trùng hợp khi sử dụng 6 chỉ thị protein để phân loại
các giống cần tây trên [72]. Tơng tự, nhiều tác giả đã sử dụng RAPD để lập cây
chủng loại phát sinh của ngô, lúa gạo, lúa mì... [1], [60].
Kỹ thuật RAPD còn là một công cụ rất hiệu quả trong việc tìm ra các chỉ
thị phân tử để phân biệt các giống hay các loài khác nhau. Sun và cộng sự
(2003) đã sử dụng 160 mồi RAPD để phân tích tính đa hình ADN của 35 giống
lúa mì xuân kháng bệnh FHB (Fusarium head blight) và phát hiện ra 3 chỉ thị
RAPD liên quan đến tính kháng bệnh FHB [66].
Orozco và cộng sự (1994) đã ứng dụng kỹ thuật RAPD để khảo sát mối
quan hệ di truyền và tiến hoá của các giống cà phê đợc lai tạo từ các loài bố, mẹ

ở các vùng sinh thái khác nhau làm cơ sở cho việc ghép cặp lai với mục đích tạo
con lai có đặc điểm quý. Bùi Mạnh Hùng cùng cộng sự (2000) cũng cho biết
21
khi sử dụng kỹ thuật RAPD đã phân biệt đợc hai giống đậu Vetch và Lentil
cùng giống nhau về hình thái (trọng lợng 1000 hạt, màu sắc, kích thớc...). Điều
này có một ý nghĩa lớn trong việc xác định độ thuần di truyền cũng nh mức độ
lẫn tạp cơ giới của các loại giống cây trồng [7], [48].
Lansium domesticum Corr. (Bòn bon) là loài cây ăn quả đợc trồng phổ
biến ở Malaysia. Các giống đợc trồng tại đây là giống Dokung, Duku,
Langsat , chúng khác nhau ở một số đặc điểm hình thái học, sinh học hay vùng
phân bố. Ngoài ra, cũng có những giống khác nhau do chúng là dạng con lai
hoặc do sự đặt tên khác nhau của ngời dân địa phơng. Sự phức tạp này đã gây ra
hiện tợng mất tên hoặc sai tên của một số loài. Để giải quyết vấn đề này, Song
và cộng sự (2000) đã sử dụng kỹ thuật RAPD để phân tích mối quan hệ di
truyền giữa chúng. Công trình này đã làm sáng tỏ mối quan hệ di truyền và
cung cấp những kiến thức sâu hơn để tìm ra các loại L. domesticum khác nhau
[61].
Đối với cây vải, khi kỹ thuật RAPD cha ra đời, việc phân tích tính đa
hình di truyền thờng sử dụng các dấu chuẩn isozyme. Dấu chuẩn kiểu này đã đ-
ợc Aradhya và cộng sự (1995) sử dụng để xác định mối quan hệ di truyền trong
quần thể vải nghiên cứu thông qua hệ thống 8 enzym [74]. Bên cạnh đó,
Spranger và cộng sự (1998) đã phân tích các hợp chất phenol có trong vỏ quả
bằng kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp lỡng cực (diode array HPLC) để xác định mối
quan hệ di truyền của các giống vải (Litchi chinensis Sonn.) dựa trên chơng
trình thống kê ứng dụng (NTSYS-pc program) [19], [44], [62].
Về sau, các nghiên cứu đa hình di truyền của các quần thể vải chủ yếu sử
dụng kỹ thuật RAPD. Bằng kỹ thuật này, Lee và cộng sự (2001) đã phân tích
mối quan hệ di truyền của 13 giống vải Đài Loan. Các giống vải này đợc trồng
từ rất lâu trên một diện tích lớn đã có những biến đổi dẫn đến nhận biết và phân
loại rất khó khăn. Vì vậy, 18 dòng vải của 13 giống vải đã đợc sử dụng để xác

22
định mối quan hệ di truyền nhằm cung cấp cơ sở cho công tác phân loại và lai
giống [39].
Cũng bằng kỹ thuật RAPD, nhiều quần thể vải đã đợc phân tích mối quan
hệ di truyền và lập bản đồ liên kết gen trong các công trình nghiên cứu của
nhiều nhà khoa học nh Chiangda và cộng sự (1998) [21], Anuntalabhochai và
cộng sự (2002) [17], Tongpamnak và cộng sự (2002) [41], [58], [67].
Ngoài việc phân tích đa hình ADN của quần thể vải, kỹ thuật RAPD
cũng đợc sử dụng trong lập bản đồ liên kết gen của vải. Ding X.D. và cộng sự
(2001) đã lập bản đồ liên kết gen dựa trên quần thể F1 đợc tạo ra từ sự lai tạo
giữa hai giống vải khác nhau. Từ bản đồ liên kết gen có thể sẽ xác định đợc
kiểu gen của cây bố mẹ và định vị đợc các gen điều khiển các tính trạng nh
phẩm chất quả, kích thớc quả, sức sống của cây, tính kháng bệnh và khả năng
chịu đựng các điều kiện môi trờng khác nhau mà không cần trồng thế hệ F1 để
theo dõi [26].
ở Việt Nam, kỹ thuật RAPD cũng đã đợc sử dụng để nghiên cứu tính đa
dạng di truyền của nhiều giống cây trồng khác nhau. Đinh Thị Phòng (2001) đã
sử dụng kỹ thuật RAPD để đánh giá tính đa hình ADN của các dòng lúa đợc tạo
ra bằng các kỹ thuật tạo dòng chịu hạn [7]. Nguyễn Văn Thiết và cộng sự
(1999) đã sử dụng kỹ thuật RAPD để nghiên cứu mối quan hệ di truyền giữa
các giống nhãn trồng ở Việt Nam và tìm ra 19 marker ADN đặc hiệu cho từng
giống nhằm phục vụ nhu cầu chọn giống, xác định và đánh giá chất lợng giống
[3], [11], [12].
Khi nghiên cứu mối quan hệ giữa cây vải cổ thụ ở huyện Kim Bôi, Hoà
Bình với cây vải tổ ở huyện Thanh Hà, Hải Dơng và giống vải chua bằng kỹ
thuật RAPD, Nguyễn Văn Thiết và cộng sự cho rằng, về mặt di truyền cây vải
cổ thụ này thuộc giống vải thiều và có quan hệ rất gần gũi với cây vải tổ ở thôn
23
Thuý L©m. C¶ hai c©y nµy ®Òu cã mèi quan hÖ di truyÒn nh nhau víi gièng v¶i
chua [13].

24
Chơng 2. Nguyên liệu và phơng pháp
2.1. Nguyên liệu nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu thực vật
Vật liệu thực vật đợc sử dụng trong nghiên cứu này là 41 dòng vải thiều
Thanh Hà đợc thu thập ở huyện Thanh Hà tỉnh Hải Dơng và một số dòng vải
chua, vải lai và vải thiều cổ thụ tại nông trờng Thanh Hà, Kim Bôi, Hoà Bình làm
đối chứng. Danh sách các dòng vải nghiên cứu đợc trình bày ở bảng 2.
2.1.2. Thiết bị và hóa chất
Công trình nghiên cứu đợc thực hiện tại Phòng Công nghệ Tế bào thực vật
thuộc Viện Công nghệ Sinh học.
Thiết bị và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu là của các hãng sản xuất
chuyên dụng cung cấp nh: Máy ly tâm (Beckman), máy PCR System 9700
(Pharmacia), máy điện di (Biorad), máy đo quang phổ Diode Array
Spectrophotometer của hãng Hewlett - Packard, máy chụp ảnh gel - Doc
(Pharmacia), máy ổn nhiệt, máy soi UV, lò vi sóng, các hóa chất tách chiết ADN,
hóa chất PCR, mồi...
2.2. Phơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Điều tra về diện tích trồng vải và giống vải thiều Thanh Hà
- Điều tra về diện tích
- Điều tra về cơ cấu giống
2.2.2. Phơng pháp phân tích các chỉ tiêu sinh học
2.2.2.1. Điều tra các đặc điểm sinh lý
- Tuổi cây
- Tình hình sinh trởng
- Dáng tán, chu vi tán
- Hình dạng lá, màu sắc lá
- Thời gian chín quả, màu sắc quả, trọng lợng quả và các thành phần
25