nghiên cứu trình tự gen 5’ – utr và ứng dụng trong chẩn đoán sớm csfv (classical swine fever virus) gây bệnh dịch tả heo

THÀNH ĐOÀN TP.HCM

SỞ KH & CN TP.HCM

CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KH-CN TRẺ

Báo cáo nghiệm thu đề tài :

NGHIÊN CỨU TRÌNH TỰ GEN 5'-UTR VÀ
ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN SỚM CSFV
(CLASSICAL SWINE FEVER VIRUS) GÂY BỆNH
DỊCH TẢ HEO
(Bản đã chỉnh sửa theo ý kiến Hội đồng nghiệm thu)

CNÑT

: CN. Huỳnh Ngọc Vi Ca

Cơ quan chủ trì : TT Phát triển KH&CN Trẻ

Năm 2006


LỜI CẢM ƠN
Chúng tôi xin chân thành cám ơn Sở Khoa Học và Công Nghệ và Trung Tâm
Phát Triển Khoa Học và Công Nghệ Trẻ TĐ, Trung Tâm Khoa Học và Công Nghệ
Sinh học Trường ĐHKHTN, Tp.HCM đã giúp đỡ về kinh phí và tạo điều kiện thuận
lợi cho chúng tôi thực hiện đề tài này.
Chúng em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy Trần Linh Thước đã cho
chúng em nhiều lời khuyên q báu trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Xin cảm ơn anh Đinh Minh Hiệp, các anh chị và các bạn đồng nghiệp đã giúp

đỡ, động viên chúng tôi hoàn tất đề tài.


LỜI MỞ ĐẦU
Việt Nam là nước nông nghiệp phát triển, nông dân có truyền thống chăn nuôi.
Gần đây, cùng với nhu cầu phát triển của xã hội, ngành chăn nuôi ngày càng phát
triển, đặc biệt là nuôi heo. Do đó, việc kiểm soát bệnh trong chăn nuôi là một nhu
cầu bức thiết. Việt Nam có đầu heo khoảng 16 triệu con, chủ yếu dùng để tiêu thụ
trong nước, chưa xuất khẩu được do chúng ta chưa kiểm soát được bệnh dịch tả heo
và một số bệnh khác. Vì vậy, vấn đề kiểm soát bệnh thú y nói chung, và bệnh dịch tả
heo nói riêng là một vấn đề cần được giải quyết nhằm thúc đẩy sự phát triển của
ngành chăn nuôi ở nước ta.
Bệnh dịch tả heo đã tồn tại trên 100 năm nay. Hiện nay vẫn được coi là bệnh
nguy hiểm cho ngành chăn nuôi heo. Việc dùng kháng sinh để trị bệnh không có tác
dụng, chỉ có thể phòng ngừa bằng vắc-xin và các biện pháp vệ sinh chuồng trại.
Bệnh gây chết hàng loạt, gây thiệt hại kinh tế cho ngành chăn nuôi heo hằng năm,
chiếm 50-60% thiệt hại trong chăn nuôi heo. Một đặc điểm đáng lưu ý là bệnh xảy ra
âm ỉ, lẻ tẻ, triệu chứng và bệnh tích không điển hình. Diễn biến của bệnh ngày càng
phức tạp. Những biểu hiện lâm sàng và bệnh tích không rõ ràng tuy kết quả xét
nghiệm bệnh là dương tính (Nguyễn Lương Hiền, Ngô Thanh Long, 1999).
Bệnh dịch tả heo do Classical swine fever virus (CSFV), thuộc chi Pestivirus,
gây ra. Pestivirus được xếp vào họ Flaviviridae (Mulphy et al., 1995), gồm các loài
virus gây bệnh cho heo và động vật nhai lại, như CSFV gây bệnh dịch tả heo, Bovine
viral diarrhoea virus (BVDV) gây bệnh dịch tả bò và Border disease virus (BDV) gây
bệnh cho cừu. Mặc dù hiện nay việc phân loại Pestivirus chủ yếu dựa vào loài vật
chủ bị nhiễm bệnh, nhưng có nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng Pestivirus không có
tính chuyên biệt vật chủ cao. Cụ thể BVDV có thể gây nhiễm không chỉ cho trâu bò
mà còn gây nhiễm cho cừu; BDV gây nhiễm cho cả heo; CSFV chủ yếu gây bệnh
cho heo nhưng cũng thấy ở trâu bò và dê. Cũng có trường hợp người ta phát hiện
được Pestivirus ở trâu và hươu.

Để phát hiện CSFV gây bệnh dịch tả heo có thể sử dụng nhiều phương pháp
khác nhau như dựa trên bệnh tích, tiêm truyền qua heo… Các phương pháp này có
nhược điểm là chỉ phát hiện được bệnh khi đã có xuất hiện các triệu chứng lâm sàng.
Khi đó bệnh đã có nguy cơ lây lan cao do đó không đáp ứng yêu cầu kiểm soá t dịch
bệnh. Vì vậy nhu cầu có một phương pháp chẩn đoán, phát hiện bệnh gây ra bởi
CSFV một cách nhanh chóng, chính xác, độ tin cậy cao là cấp bách và cần thiết.
Hiện nay, phương pháp RT-PCR là phương pháp chẩn đoán đang được tổ chức Thú y
thế giới (OIE) khuyến khích sử dụng do có các ưu điểm như: độ nhạy cao, cho kết
quả nhanh, độ chuyên biệt cao, có thể phát hiện bệnh sớm khi chưa có biểu hiện
triệu chứng và bệnh tích … Do vậy, phương pháp RT-PCR được xem là một phương
pháp chẩn đoán có nhiều tiềm năng ứng dụng và việc thiết lập một quy trình phát
hiện bệnh dịch tả heo bằng phương pháp RT-PCR tại Việt Nam là rất cần thiết.


Đồng thời, trong các chẩn đoán phát hiện CSFV, việc phân biệt chính xác bệnh
do CSFV hay một loài khác trong chi Pestivirus gây ra thường gặp nhiều khó khăn.
Các phương pháp phát hiện CSFV dựa trên nguyên tắc kháng nguyên – kháng thể
không cho phép phân biệt CSFV và BDV hay BVDV. Thực tế, việc chẩn đoán, phát
hiện chính xác CSFV có ý nghóa quan trọng nhằm định hướng các biện pháp xử lý
tránh lây nhiễm, tiêu diệt ổ bệnh và vắc-xin phòng chống. Đáp ứng nhu cầu thực tiễn
này, hiện nay kỹ thuật RT-PCR đã được ứng dụng nhằm phát hiện nhanh và chuyên
biệt CSFV dựa trên trình tự 5’UTR.
Trong RNA bộ gen của virus CSFV, vùng 5’UTR là vùng đặc trưng chuyên biệt
cho CSFV. Dựa vào trình tự 5’UTR người ta có thể phân biệt CSFV với những loài
khác trong chi Pestivirus như BDV, BVDV. Vì vậy, phản ứng RT-PCR với cặp mồi
đặc hiệu cho vùng 5'UTR của CSFV cho phép chẩn đoán chính xác bệnh dịch tả heo.
Ngoài ra, khảo sát xác định trình tự vùng 5’UTR của CSFV còn có ý nghóa lớn trong
nghiên cứu phân loại CSFV. Hiện nay, một số trình tự 5’UTR của một số chủng
CSFV như chủng Alfort/187 (Switzerland), chủng C (Trung Quốc), … đã được xác
định và công bố lưu trữ trong ngân hàng gen. Tuy vậy, chưa có công bố nào về trình

tự 5’UTR của CSFV phân lập tại Việt Nam. Vì vậy, mục tiêu đề ra của chúng tôi là
xác định trình tự 5’UTR của chủng CSFV phân lập tại Việt Nam nhằm phục vụ cho
nghiên cứu phân loại và hỗ trợ cho phương pháp phát hiện CSFV bằng RT-PCR. So
sánh trình tự đoạn 5’UTR của một số chủng CSFV khác trong Ngân hàng gen.
Để thực hiện các mục tiêu này, chúng tôi tiến hành các nội dung nghiên cứu
bao gồm:
- Thu nhận đoạn gen 5'UTR từ virus CSFV.
- Tạo dòng gen 5'UTR trong E. coli.
- Giải trình tự gen 5'UTR, so sánh với các trình tự đã công bố trên thế giới.
- Thiết kế mồi để phát hiện CSFV bằng RT-PCR.
- Xây dựng quy trình chẩn đoán sớm, nhanh, nhạy CSFV bằng RT-PCR.


MỤC LỤC
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các hình & bảng
Phần I: Tóm tắt các nội dung chính của đề tài ......................................................... - 1 1.1. Mở đầu ........................................................................................................ - 1 1.2. Tóm tắt tình hình nghiên cứu ngoài nước có liên quan .............................. - 2 1.3. Tóm tắt tình hình nghiên cứu trong nước có liên quan ............................... - 2 1.4. Mục tiêu đề tài ........................................................................................... - 3 1.5. Nội dung nghiên cứu................................................................................... - 3 Phần II: Tổng quan tài liệu ....................................................................................... - 4 2.1. Tình hình bệnh dịch tả heo ......................................................................... - 4 2.2. Sự lây nhiễm ............................................................................................... - 5 2.3. Triệu chứng lâm sàng ................................................................................. - 6 2.4. Bệnh tích ..................................................................................................... - 7 2.5. Đặc điểm của virus dịch tả heo, Classical Swine Fever Virus – CSFV ...... - 8 2.6. Các phương pháp chẩn đoán bệnh dịch tả heo ......................................... - 11 2.7. Phương pháp RT-PCR............................................................................... - 14 2.8. Kó thuật tạo dòng ...................................................................................... - 20 Phần III: Vật liệu – Phương pháp ........................................................................... - 26 3.1. Hóa chất và Môi trường............................................................................ - 26 3.2. Vật liệu và Phương pháp .......................................................................... - 28 Phần IV: Kết quả – Biện luận ................................................................................ - 42 4.1. Tạo dòng đoạn gen mã hóa vùng 5'UTR của CSFV ................................ - 42 4.2. Giải trình tự đoạn gen 5’UTR ................................................................... - 45 4.3. Xây dựng quy trình phát hiện CSFV bằng RT-PCR................................. - 49 4.4. Kiểm chứng quy trình phát hiện CSFV bằng phương pháp RT-PCR ....... - 54 Phần V: Kết luận – Đề nghị ................................................................................... - 60 5.1. Kết luận .................................................................................................... - 60 5.2. Đề nghị ..................................................................................................... - 60 Phần VI: So sánh các nội dung đăng ký và kết quả đạt được ................................ - 61 Phần VII: Các thành viên tham gia thực hiện đề tài ............................................. - 62 Phần VIII: Các công trình khoa học có liên quan đến đề tài ................................ - 63 Tài liệu tham khaûo .................................................................................................. - 64 -


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Amp

:

Ampicillin

BDV

:

Border disease virus

bp

:

base pair, cặp base

BVDV

:

Bovine viral diarrhoea virus

cDNA

:

complementary DNA

CSFV

:

Classical Swine Fever Virus

ddNTP

:

dideoxyribonucleotide triphosphate

dH2O

:

nước cất

DNA

:

Deoxyribonucleic cid

dNTP

:

Deoxynucleotide triphosphate

DTT

:

Dithiothreitol

EDTA

:

Ethylene diamin tetraacetic Acid

ELISA

:

Enzyme linked immuno sorbent assay

HCV

:

Hog cholera virus

IPTG

:

Isopropylthio- - D- Galactosidase

kDa

:

kilo Dalton

Mab

:

Monoclonal antibody

MCS

:

Multi cloning site

MMLV

:

Moloney Murine Leukemia Virus, enzyme phiên mã
ngược

OD

:

Opical density

pB

:

pBluescript II SK (+)

PCR

:

Polymerase Chain Reaction

RE

:

Restriction enzyme, enzyme cắt giới hạn

RNA

:

Ribonucleic Acid

RNase

:

Ribonuclease, enzyme thuỷ phân RNA

RNasine

:

RNase inhibitor

RT-buffer

:

Reverse transcript buffer

RT-PCR

:

Reverse transcription- polymerase chain reaction

SDS

:

Sodium dodecyl sulfate

UTR

:

Untranslated region

X-gal

:

5-Bromo-4-chloro-3-indolyl- -D-galactopyranoside


DANH MỤC CÁC HÌNH & BẢNG
Hình 1: Thận heo nhiễm bệnh dịch tả heo với các điểm xuất huyết trên

vỏ thận ............................................................................................... 8
Hình 2: Tụ huyết và xuất huyết màng não tủy ở heo bệnh ............................. 8
Hình 3: Cấu tạo bộ gen RNA của Pestivirus .................................................. 10
Hình 4: Sơ đồ tổng quát một quy trình RT-PCR .............................................. 15
Hình 5: Sơ đồ plasmid pBluescript II SK (+) ................................................... 28
Hình 6: Sơ đồ dòng hoá gen 5’UTR ................................................................ 33
Hình 7: Sơ đồ và vị trí mồi để giải trình tự gen 5’UTR ................................... 36
Hình 8: Sơ đồ quy trình RT-PCR phát hiện virus CSFV ................................ 39
Hình 9: Kết quả phản ứng RT-PCR ................................................................ 42
Hình 10: Kết quả phản ứng mở vòng pBlue bằng EcoRV ............................... 43
Hình 11: Kiểm tra khuẩn lạc dự tuyển mang gen 5’UTR bằng phương pháp PCR
khuẩn lạc .......................................................................................... 44
Hình 12: Kiểm tra thể biến nạp bằng cặp mồi T3/T7 .................................... 45
Hình 13: Kết quả so sánh trình tự 5’UTR của virus dịch tả heo chủng Việt Nam với
một số chủng trong ngân hàng gen ...........................................................46-48
Hình 14: RNA tổng số thu nhận bằng phương pháp 1 và phương pháp 2....... 49
Hình 15: Thiết lập phản ứng RT-PCR ............................................................ 50
Hình 16: Khảo sát nồng độ MMLV ................................................................ 50
Hình 17: Khảo sát nồng độ mồi CSR .............................................................. 51
Hình 18: Khảo sát nồng độ dNTP .................................................................... 51
Hình 19: Khảo sát nồng độ mẫu ...................................................................... 52
Hình 20: Khảo sát nồng độ dNTP trong phản ứng PCR ...................................52
Hình 21: Khảo sát nồng độ mồi ........................................................................53
Hình 22: Khảo sát nồng độ Mg2+ ...................................................................... 53
Hình 23: Khảo sát nhiệt độ bắt cặp .................................................................. 53
Hình 24: Khảo sát thời gian bắt cặp ................................................................. 54
Hình 25: Khảo sát thời gian kéo dài ................................................................. 54
Hình 26: Kiểm chứng quy trình phát hiện CSFV ............................................. 55
Hình 27: Kết quả điện di sản phẩm của phản ứng RT-PCR thực hiện trên các mẫu
bệnh nhiễm Salmonella..................................................................................... 57

Hình 28: Kết quả sản phẩm PCR trên các mẫu lấy từ thực địa ........................ 57
---/--Bảng 1: Thành phần cơ bản của phản ứng RT ............................................... 38
Bảng 2: Thành phần cơ bản của phản ứng PCR .............................................. 28
Bảng 3: Kết quả kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của plasmid sau tách chiết
............................................................................................................ 42
Bảng 4: Phân tích độ tinh sạch của RNA bằng quang phổ hấp thu .................. 49
Bảng 5: Kiểm chứng quy trình phát hiện CSFV bằng RT-PCR ....................... 55
Bảng 6: Kết quả phản ứng RT-PCR với cặp mồi chuyên biệt đối với CSFV thực hiện
trên 21 mẫu bệnh phẩm nhiễm Salmonella ........................................ 56


PHẦN I: TÓM TẮT CÁC NỘI DUNG CHÍNH CỦA ĐỀ TÀI
1.1. MỞ ĐẦU
Việt Nam là nước nông nghiệp phát triển, nông dân có truyền thống chăn nuôi. Gần
đây, cùng với nhu cầu phát triển của xã hội, ngành chăn nuôi ngày càng phát triển, đặc
biệt là nuôi heo. Do đó, việc kiểm soát bệnh trong chăn nuôi là một nhu cầu bức thiết.
Việt Nam có đầu heo khoảng 16 triệu con, chủ yếu dùng để tiêu thụ trong nước, chưa
xuất khẩu được do chúng ta chưa kiểm soát được bệnh dịch tả heo và một số bệnh khác.
Vì vậy, vấn đề kiểm soát bệnh thú y nói chung, và bệnh dịch tả heo nói riêng là một vấn
đề cần được giải quyết nhằm thúc đẩy sự phát triển của ngành chăn nuôi ở nước ta.
Bệnh dịch tả heo đã tồn tại trên 100 năm nay. Hiện nay vẫn được coi là bệnh nguy
hiểm cho ngành chăn nuôi heo. Việc dùng kháng sinh để trị bệnh không có tác dụng, chỉ
có thể phòng ngừa bằng vắc-xin và các biện pháp vệ sinh chuồng trại. Bệnh gây chết
hàng loạt, gây thiệt hại kinh tế cho ngành chăn nuôi heo hằng năm, chiếm 50-60% thiệt
hại trong chăn nuôi heo. Một đặc điểm đáng lưu ý là bệnh xảy ra â m ỉ, lẻ tẻ, triệu chứng
và bệnh tích không điển hình. Diễn biến của bệnh ngày càng phức tạp. Những biểu hiện
lâm sàng và bệnh tích không rõ ràng tuy kết quả xét nghiệm bệnh là dương tính (Nguyễn
Lương Hiền, Ngô Thanh Long, 1999).
Bệnh dịch tả heo do Classical swine fever virus (CSFV), thuộc chi Pestivirus, gây
ra. Pestivirus được xếp vào họ Flaviviridae (Mulphy et al., 1995), gồm các loài virus gây

bệnh cho heo và động vật nhai lại, như CSFV gây bệnh dịch tả heo, Bovine viral
diarrhoea virus (BVDV) gây bệnh dịch tả bò và Border disease virus (BDV) gây bệnh
cho cừu. Mặc dù hiện nay việc phân loại Pestivirus chủ yếu dựa vào loài vật chủ bị
nhiễm bệnh, nhưng có nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng Pestivirus không có tính
chuyên biệt vật chủ cao. Cụ thể BVDV có thể gây nhiễm không chỉ cho trâu bò mà còn
gây nhiễm cho cừu; BDV gây nhiễm cho cả heo; CSFV chủ yếu gây bệnh cho heo nhưng
cũng thấy ở trâu bò và dê. Cũng có trường hợp người ta phát hiện được Pestivirus ở trâu
và hươu.
Để phát hiện CSFV gây bệnh dịch tả heo có thể sử dụng nhiều phương pháp khác
nhau như dựa trên bệnh tích, tiêm truyền qua heo… Các phương pháp này có nhược điểm
là chỉ phát hiện được bệnh khi đã có xuất hiện các triệu chứng lâm sàng. Khi đó bệnh đã
có nguy cơ lây lan cao do đó không đáp ứng yêu cầu kiểm soát dịch bệnh. Vì vậy nhu
cầu có một phương pháp chẩn đoán, phát hiện bệnh gây ra bởi CSFV một cách nhanh
chóng, chính xác, độ tin cậy cao là cấp bách và cần thiết. Hiện nay, phương pháp RTPCR là phương pháp chẩn đoán đang được tổ chức Thú y thế giới (OIE) khuyến khích sử
dụng do có các ưu điểm như: độ nhạy cao, cho kết quả nhanh, độ chuyên biệt cao, có thể
phát hiện bệnh sớm khi chưa có biểu hiện triệu chứng và bệnh tích … Do vậy, phương
pháp RT-PCR được xem là một phương pháp chẩn đoán có nhiều tiềm năng ứng dụng và
việc thiết lập một quy trình phát hiện bệnh dịch tả heo bằng phương pháp RT-PCR tại
Việt Nam là rất cần thiết.
Đồng thời, trong các chẩn đoán phát hiện CSFV, việc phân biệt chính xác bệnh do
CSFV hay một loài khác trong chi Pestivirus gây ra thường gặp nhiều khó khăn. Các
-1-


phương pháp phát hiện CSFV dựa trên nguyên tắc kháng nguyên – kháng thể không cho
phép phân biệt CSFV và BDV hay BVDV. Thực tế, việc chẩn đoán, phát hiện chính xác
CSFV có ý nghóa quan trọng nhằm định hướng các biện pháp xử lý tránh lây nhiễm, tiêu
diệt ổ bệnh và vắc-xin phòng chống. Đáp ứng nhu cầu thực tiễn này, hiện nay kỹ thuật
RT-PCR đã được ứng dụng nhằm phát hiện nhanh và chuyên biệt CSFV dựa trên trình tự
5’UTR.

Trong RNA bộ gen của virus CSFV, vùng 5’UTR là vùng đặc trưng chuyên biệt
cho CSFV. Dựa vào trình tự 5’UTR người ta có thể phân biệt CSFV với những loài khác
trong chi Pestivirus như BDV, BVDV. Vì vậy, phản ứng RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu
cho vùng 5'UTR của CSFV cho phép chẩn đoán chính xác bệnh dịch tả heo. Ngoài ra,
khảo sát xác định trình tự vùng 5’UTR của CSFV còn có ý nghóa lớn trong nghiên cứu
phân loại CSFV. Hiện nay, một số trình tự 5’UTR của một số chủng CSFV như chủng
Alfort/187 (Switzerland), chủng C (Trung Quốc), … đã được xác định và công bố lưu trữ
trong ngân hàng gen. Tuy vậy, chưa có công bố nào về trình tự 5’UTR của CSFV phân
lập tại Việt Nam. Vì vậy, mục tiêu đề ra của chúng tôi là xác định trình tự 5’UTR của
chủng CSFV phân lập tại Việt Nam nhằm phục vụ cho nghiên cứu phân loại và hỗ trợ
cho phương pháp phát hiện CSFV bằng RT-PCR. So sánh trình tự đoạn 5’UTR của một
số chủng CSFV khác trong Ngân hàng gen.

1.2. TÓM TẮT TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU NGOÀI NƯỚC CÓ LIÊN QUAN
Theo Hanson (1957), bệnh dịch tả heo được ghi nhận từ năm 1810 tại Tennessce.
Sau đó ổ dịch được phát hiện tại Pháp năm 1822, tại Ohio vào đầu năm 1833, Đức năm
1835, Anh năm 1862 và sau đó lan rộng khắp Châu Âu, Nam Mỹ và Nam Phi.
Năm 1885, Xanmon và Smit cho rằng bệnh do một loài vi khuẩn gây ra. Hai ông đặt
tên vi khuẩn này là Bacillus cholera suis (hay còn gọi là Samonella cholera suis). Đến
năm 1903, Schweinitz và Dorset đã chứng minh bệnh gây ra bởi virus, còn vi khuẩn
Bacillus cholera suis chỉ đóng vai trò phụ. Năm 1907, Dorset, McBryde và W.B. Niles đã
sử dụng huyết thanh miễn dịch để phòng trị bệnh dịch tả heo. Năm 1935, Dorset,
McBryde, và C.G. Cole tạo ra vaccine vô hoạt bằng tím kết tinh (crystal violet). Năm
1951, J.A. Baker phát triển một loại vaccine virus sống biến đổi (modified live vaccine)
để phòng ngừa bệnh dịch tả heo thu được hiệu quả bảo vệ cao.
Đầu thập niên 60, phương pháp tiêm truyền qua heo hoặc thỏ được sử dụng để chẩn
đoán bệnh dịch tả heo. Năm 1963, Mengeling, E.C. Pirtle, và J.P. Torrey phát triển
phương pháp miễn dịch huỳnh quang để chẩn đoán bệnh nhanh. Từ đó đến nay, các kỹ
thuật chẩn đoán được liên tục cải tiến giúp phát hiện bệnh nhanh chóng. Đặc biệt, với sự
ra đời của phương pháp PCR, các nhà nghiên cứu đã có thêm một công cụ mạnh để chẩn

đoán, phát hiện bệnh nhanh chóng, cũng như trong việc nghiên cứu sự đa dạng di truyền,
trong phân loại, … Từ năm 1997-1999, vùng 5’-UTR của CSFV từ 27 chủng phân lập tại
Lào được phân tích và so sánh với các chủng của châu Âu và châu Á, hỗ trợ cho nghiên
cứu dịch tễ học bệnh dịch tả heo.

1.3. TÓM TẮT TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC CÓ LIÊN QUAN

-2-


Việt Nam là nước nông nghiệp phát triển, được xem là một trong 10 nước sản xuất
thịt heo nhiều nhất thế giới. Vì vậy, việc bảo vệ và kiểm soát dịch bệnh trong chăn nuôi
có ý nghóa quan trọng trong việc nâng cao hiệu quả sản xuất và xuất khẩu các sản phẩm
từ thịt.
Trong thời gian qua, bệnh dịch tả heo được chẩn đoán dựa trên triệu chứng và bệnh
tích, nhưng phương pháp này không đáng tin cậy và triệu chứng của bệnh thường xuyên
biến đổi rất đa dạng và phức tạp. Một số phương pháp chẩn đoán truyền thống được sử
dụng như tiêm truyền qua heo, trung hòa trên thỏ, phương pháp phân lập vi rút dịch tả
heo trên nuôi cấy tế bào PK-15 cho kết quả chậm, tốn kém, chỉ phát hiện được bệnh khi
đã có xuất hiện các triệu chứng lâm sàng. Khi đó bệnh đã có nguy cơ lây lan cao do đó
không đáp ứng yêu cầu kiểm soát dịch bệnh. Vì vậy nhu cầu có một phương pháp chẩn
đoán, phát hiện bệnh gây ra bởi CSFV một cách nhanh chóng, chính xác, độ tin cậy cao
là cấp bách và cần thiết. Áp dụng thành tựu của di truyền học phân tử và các kỹ thuật
miễn dịch mới đã cho ra đời nhiều phương pháp chẩn đoán nhanh, nhạy, chính xác hơn.
Trong đó, phương pháp ELISA được sử dụng phổ biến. Tuy nhiên, thông thường phương
pháp này cũng phải kết hợp với chẩn đoán lâm sàng. Một kỹ thuật có nhiều ưu điểm hơn
là sử dụng phản ứng tổng hợp dây chuyền polymerase (PCR) nhằm phát hiện gen đặc
trưng, chuyên biệt đối với vi rút CSFV. Phương pháp này dễ thực hiện, độ nhạy cao, và
đặc biệt khác phục được nhược điểm của phương pháp phân lập virút, được xem là tiêu
chuẩn vàng trong chẩn đoán, là nguồn mẫu không cần phải sạch. Tuy nhiên, hiện vẫn

chưa có công trình nghiên cứu phát hiện CSFV bằng RT-PCR được công bố tại Việt
Nam. Vì vậy, mục tiêu đề ra của chúng tôi là xác định trình tự 5’UTR của chủng CSFV
phân lập tại Việt Nam nhằm phục vụ cho nghiên cứu phân loại và hỗ trợ cho phương
pháp phát hiện CSFV bằng RT-PCR.

1.4. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
Mục tiêu đề ra của chúng tôi là dòng hóa và giải trình tự đoạn 5’UTR của CSFV
phân lập tại các tỉnh thành phía Nam Việt Nam và xây dựng quy trình phát hiện sớm
CSFV bằng kỹ thuật RT-PCR, tạo một công cụ chẩn đoán chuyên biệt cho CSFV tại Việt
Nam, góp phần bảo vệ và kiểm soát bệnh dịch tả heo trong ngành chăn nuôi heo, đồng
thời phục vụ cho các nghiên cứu phân loại, dịch tễ học của bệnh này.

1.5. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Để thực hiện các mục tiêu này, chúng tôi tiến hành các nội dung nghiên cứu bao
gồm:
- Thu nhận đoạn gen 5'UTR từ virus CSFV.
- Tạo dòng gen 5'UTR trong E. coli.
- Giải trình tự gen 5'UTR, so sánh với các trình tự đã công bố trên thế giới.
- Thiết kế mồi để phát hiện CSFV bằng RT-PCR.
- Xây dựng quy trình chẩn đoán sớm, nhanh, nhạy CSFV bằng RT-PCR.

-3-


PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. TÌNH HÌNH BỆNH DỊCH TẢ HEO
Bệnh dịch tả heo, Classical swine fever - CSF hay Hog cholera là một bệnh dịch do
một loại virus có tên Classical swine fever virus (CSFV) hay Hog cholera virus (HCV)
gây ra trên heo. Đây là một bệnh truyền nhiễm có khả năng lây lan lớn, tỉ lệ gây tử vong
cao (từ 60% - 90%).

2.1.1. Tình hình bệnh Dịch tả heo trên thế giới [2, 7, 8, 17, 20, 26, 27, 28]
Bệnh dịch tả heo được phát hiện đầu tiên vào năm 1810 ở Mỹ và đến 1855 bệnh
lan tràn khắp nước Mỹ, toàn châu ÂÂu đến khắp các châu lục. Hiện nay bệnh đã được
thanh toán ở Canada, Mỹ, Úc, Niudilan và Nam Phi. Ở Pháp, sau 15 năm thực hiện chặt
chẽ chương trình thanh toán bệnh, năm 1983 bắt đầu ngừng tiêm phòng, thực hiện các
biện pháp vệ sinh phòng dịch nghiêm ngặt, đến nay đàn heo nuôi nước Pháp không bị
một tổn thất nào do dịch tả heo gây ra, được coi là không có bệnh dịch tả heo trừ một vài
ổ dịch ở heo rừng phía Bắc của Vosges là nguy cơ gây nhiễm cho heo nuôi ở vùng lân
cận như ổ dịch tháng 9 năm 1993.
Ở Đức, 1993 có 103 ổ dịch, 1994: 117, 1995: 54 ổ dịch, năm 1996 chỉ có 4 ổ dịch
nhưng đầu năm 1997 xuất hiện 2 ổ dịch do dùng thức ăn thừa của nhà bếp trại lính Mỹ.
Dịch đã tiếp tục từ đó lưu hành trong vùng tiếp giới Đức, Hà Lan. Kết quả phân tích sinh
học phân tử về các chủng virus dịch tả heo ở Đức và Hà Lan cho thấy mối liên quan
chặt chẽ với nhau.
Năm 1997-1998, dịch bệnh dịch tả heo nổ ra mạnh mẽ ở 6 nước: Đức, Ý, Hà Lan,
Tây Ban Nha, Bỉ và Úc, tiêu diệt hơn 12,4 triệu con, thiệt hại khoảng 2,3 tỉ USD. Ở Hà
Lan, năm 1997, tổng số đã có tới 424 ổ dịch nổ ra, tính bình quân 15 ổ dịch mỗi tuần.
Tháng 2/1997, hai ổ dịch ở Ýù được xác nhận là có liên quan tới heo mua từ Hà Lan về,
và cũng như vậy, tháng 4/1997 nổ ra ổ dịch đầu tiên và cả năm có tới 78 ổ dịch. Việc
nhập heo từ Hà Lan về cũng được xác minh là nguyên nhân của ổ dịch này. Tháng 6
năm 1997, ổ dịch đầu tiên ở Bỉ cũng được công bố có liên quan tới một trại heo ở Hà
Lan (A.Mesplede và cộng sự, 1997). Các vụ dịch ở Đức, Pháp còn được ghi nhận lây lan
từ đàn heo rừng.
Hiện nay bệnh dịch tả heo được ghi nhận khắp thế giới: Châu Âu, Trung Phi,
Mexico, các nước Trung Mỹ, hầu hết các nước Nam Mỹ, Ấn Độ, Trung Quốc, Đông Á
và Đông Nam Á (Hàn Quốc, Indonesia, Philippine, Thái Lan, Việt Nam).
Năm 2000, dịch bệnh xảy ra ở Anh. Năm 2001, dịch bệnh nổ ra ở Đức, Slovakia,
Tây Ban Nha. Vào cuối năm 2003 dịch bệnh tả heo xuất hiện tại Nhật, Albania và
Slovakia.
Nhiều quốc gia đã xây dựng chương trình thanh toán bệnh. Ở Mỹ, chương trình tiêu

diệt bệnh dịch tả heo được triển khai năm 1962 nhưng đến năm 1976 mới thành công,
tiêu tốn hết 140 tỉ USD. Hiện nay bệnh đã được thanh toán ở Canada, Mỹ, Úc, New
Zealand, Nhật và Nam Phi.
-4-


Hiện nay, bệnh dịch tả heo có ở hầu hết các nước có chăn nuôi heo. Bệnh này vẫn
còn lây lan nhiều ở các nước như Pháp, Hà Lan, các nước Châu Phi và cả các nước ở
Châu Á như Nhật Bản, Việt Nam…
2.1.2. Tình hình bệnh Dịch tả heo ở Việt Nam [7, 14, 18]
Bệnh dịch tả heo ở Việt Nam được Houdemer phát hiện đầu tiên vào năm 19231924. Từ đóù đến nay bệnh đã lan truyền và được phát hiện ở nhiều nơi.
Năm 1949-1950, một vụ dịch lớn xảy ra ở Việt Bắc rồi lan sang các tỉnh Phú Thọ,
Yên Bái, Thái Nguyên, Hà Nội và Hải Phòng. Năm 1960-1961, dịch lan từ Hoà Bình
sang Yên Bái, Phú Thọ, Lào Cai. Năm 1961, dịch xảy ra ở Nghệ An, lan sang Sơn Tây,
Hà Đông và Hà Nội. Năm 1968-1969, dịch phát ra ở hơn 20 tỉnh miền Bắc. Năm 1974,
dịch đã nổ ra ở 17 tỉnh phía Bắc, đặc biệt là từ Thanh Hóa dọc theo quốc lộ 1 đến Quảng
Trị, gây thiệt hại trên 400.000 con. Theo báo cáo của Cục thú y (1986), ở các tỉnh Nam
Bộ, bệnh dịch tả heo thường bị hội nhiễm với bệnh phó thương hàn (An Giang, Long An
năm 1984, Tiền Giang và Hậu Giang năm 1985). Bệnh dịch tả heo hội nhiễm với bệnh
tụ huyết trùng xảy ra ở Đồng Nai và TP. Hồ Chí Minh năm 1985 (Trần Thanh Phong,
1996).
Trong những năm gần đây, các ổ dịch lớn không còn xảy ra, song các ổ dịch địa
phương vẫn tồn tại và liên tục có các ổ dịch mới xuất hiện. Theo báo cáo của Cục Thú y
năm 1998, trong năm 1995 cả nước có 13 tỉnh xảy ra dịch bệnh tả heo, và số tỉnh có dịch
tăng lên là 23 tỉnh trong năm 1996, 32 tỉnh trong năm 1997 và 50 tỉnh trong năm 1998.
Theo thống kê của tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y tập VII, số 1–2000, tỉ lệ heo nhiễm
virus dịch tả heo mãn tính tại các tỉnh duyên hải miền Trung là 46,87%.
Bệnh dịch tả heo mãn tính và bẩm sinh xuất hiện vào thập niên 90 của thế kỷ 20
(Nguyễn Tiến Dũng và cộng sự, 2002). Hiện nay dịch tả heo phá t muộn đã được ghi
nhận trong tất cả các khu vực trong cả nước. Các dạng bệnh không điển hình này gây

nhiều trở ngại cho việc chẩn đoán.
Trong năm 2000, theo thống kê của OIE, cả nước có 63 trận dịch xảy ra ở các tỉnh
Ninh Bình, Lai Châu, Cao Bằng, Yên Bái, Thanh Hóa, Bình Thuận, Phú Yên, Quảng Trị,
Huế… Năm 2001 và 2002, nhiều trận dịch xảy ra ở các tỉnh trên và liên tục có các trận
dịch địa phương mới xuất hiện như ở Bình Định, Vónh Phúc, Kiên Giang…. Năm 2003,
tổng cộng có 58 trận dịch bệnh tả heo xảy ra ở nhiều tỉnh trong cả nước.

2.2. SỰ LÂY NHIỄM [8, 27]
Bệnh dễ lây lan do tiếp xúc trực tiếp giữa heo bệnh và heo mẫn cảm. Heo nhiễm
virus bài thải một lượng lớn virus trong dịch mũi, nước bọt, nước tiểu và phân ngay cả
trước khi biểu hiện triệu chứng bệnh và có thể bài thải virus đến khi chết. Trong một số
trường hợp khi khỏi bệnh, heo vẫn tiếp tục bài virus trong một thời gian dài sau đó. Heo
bệnh nhiễm virus có độc lực thấp liên tục bài thải virus hàng tháng mà không biểu hiện
triệu chứng (Van Oirschot và Terpstra, 1977).
Dịch bệnh có thể truyền lây theo các cách:
- Tiếp xúc trực tiếp giữa các động vật bị nhiễm virus (heo bệnh từ nơi khác về,
heo rừng tiếp xúc với heo nhà).
-5-


- Cho heo ăn bằng thức ăn thừa, đặc biệt là thức ăn thừa có chứa thịt heo bệnh.
- Truyền qua nhau từ heo nái có thai sang phôi.
- Sự thụ tinh heo nhân tạo với tinh trùng đã bị nhiễm bệnh.
- Các yếu tố khác như người, xe cộ, đồ dùng trong chăn nuôi có dính virus đều có
thể lây lan và phát tán virus khắp nơi.
- Ởû một số nước châu Á, heo được thả rong, dầm mình trong ao hồ, do đó bệnh có
thể lây qua ao hồ, kênh tưới tiêu, sông suối và các tuyến đường thủy nhiễm bẩn.
Các ổ dịch bệnh dịch tả heo nổ ra trong điều kiện tự nhiên không phụ thuộc vào
mùa vụ và điều kiện khí hậu. Tất cả các giống heo ở các lứa tuổi đều mắc bệnh, nhưng
đặc biệt mẫn cảm là các giống heo cao sản và heo con.

Điều kiện thức ăn và chăm sóc có thể ảnh hưởng đến đặc điểm lây lan của bệnh.
Việc sử dụng thức ăn kém phẩm chất, thiếu vitamin và các nguyên tố vi lượng gây nên
sự rối loạn trao đổi chất là điều kiện cho bệnh dịch tả heo phát ra dữ dội, thường ở dạng
cấp tính.

2.3. TRIỆU CHỨNG LÂM SÀNG [2, 3]
Tuỳ theo độc lực của virus, số lượng virus và phản ứng của cơ thể, bệnh dịch tả heo
được chia thành các thể lâm sàng: quá cấp tính, cấp tính, bán cấp tính, mãn tính và thể
tiềm ẩn. Thời gian ủ bệnh từ 2-14 ngày.
Thể quá cấp tính
Dạng bệnh này hiếm thấy. Quá trình diễn biến bệnh rất nhanh, thân nhiệt tăng cao
(41-42oC), heo mệt mỏi, bỏ ăn và nôn. Hoạt động của hệ tim mạch rối loạn rất nặng.
Phần da mỏng ửng đỏ chưa kịp xuất huyết trên da nên còn gọi là “dịch tả trắng”. Heo
chết nhanh sau 1-3 ngày. Tỉ lệ chết có thể lên đến 100%.
Thể cấp tính
Heo có biểu hiện lờ đờ, kém ăn, nhiệt độ trực tràng 40-41oC hoặc cao hơn. Viêm
kết mạc, sưng mắt là dấu hiệu lâm sàng sớm nhận thấy trên heo. Da heo có màu hơi đỏ.
Giai đoạn đầu của bệnh thường có các dấu hiệu thần kinh như quay vòng, không phối
hợp và mất điều hoà vận động. Heo bệnh lạnh và run do đó chúng thường nằm túm tụm
trên nền chuồng hay nằm chồng lên nhau. Lượng bạch cầu hạ thấp, chỉ còn khoảng 3000
tế bào trong 1 mm3 máu (ở heo bình thường thì tỉ lệ bạch cầu là 9000/ mm3 máu)
Một số heo chết trong vòng 24-48 giờ sau khi biểu hiện bệnh nhưng trong hầu hết
các ca bệnh, giai đoạn lâm sàng từ lúc bỏ ăn đến khi chết là 10-20 ngày.
Trong trường hợp cấp tính, heo nái có thể sảy thai nếu không được tiêm phòng hay
đẻ ra heo con yếu ớt, run rẩy. Tuy nhiên, nếu heo nái được tiêm vaccine ít nhất một lần
thì không xảy ra bệnh nghiêm trọng.
Thể bán cấp tính
Bệnh dịch tả heo bán cấp tính có dấu hiệu lâm sàng ít nghiêm trọng hơn và thời kỳ
bệnh kéo dài đến khoảng 30 ngày. Những đặc điểm thường thấy ở heo bị nhiễm bệnh
thể bán cấp tính là chán ăn, buồn bã, gầy rạc dần, dáng đi yếu và lảo đảo, trong một số

trường hợp da trở nên tím bầm trước khi chết.
-6-


Heo nhiễm bệnh ở thể bán cấp tính thường có hiện tượng hội nhiễm của vi khuẩn
như Salmonella và Pasteurella.
Thể mãn tính
Thể mãn tính của bệnh dịch tả heo đặc trưng bằng diễn biến bệnh kéo dài vài tuần
hoặc thậm chí vài tháng. Ban đầu heo bệnh yếu, chán ăn và buồn bã, sau đó biểu hiện
dấu hiệu lạnh và nằm túm tụm với nhau. Sau vài tuần, heo hồi phục rõ rệt và thèm ăn
trở lại. Trong giai đoạn thứ 3, heo lại có biểu hiện chán ăn và buồn bã. Tỉ lệ tăng trưởng
bị ảnh hưởng nghiêm trọng.
Phần lớn heo bị hội nhiễm vi khuẩn (Salmonella, Pasteurella…) nên phát ra các triệu
chứng toàn thân như rối loạn hô hấp, rối loạn tiêu hoá, tỉ lệ chết cũng khá cao. Con vật
gầy mòn và chết trong vòng 30-95 ngày sau khi bắt đầu bệnh. Những con không chết sẽ
còi cọc chậm phát triển và bài virus khoảng 3 tháng.
Thể tiềm ẩn
Bệnh dịch tả heo có thể có dạng tiềm ẩn do nhiễm virus bẩm sinh. Ở thể bệnh này
thời kỳ không xuất hiện triệu chứng lâm sàng khá dài. Triệu chứng đầu tiên xuất hiện
sau một vài tháng nhiễm bệnh. Các triệu chứng thường thấy là heo bỏ ăn, ủ rũ, viêm kết
mạc, tiêu chảy và bị liệt. Những cảm nhiễm dai dẳng như vậy rất khó phát hiện, chỉ có
xét nghiệm máu mới chẩn đoán được thể bệnh này. Dấu hiệu có ý nghóa chẩn đoán tốt
nhất là hiện tượng giảm bạch cầu, thấy ngay sau 48 giờ nhiễm bệnh và vào ngày thứ 5-8
lượng bạch cầu giảm rõ rệt.
Cảm nhiễm virus dịch tả heo bẩm sinh có thể gây ra rối loạn sinh sản như sẩy thai,
thai gỗ, thai dị dạng và đẻ ra heo con yếu ớt.

2.4. BỆNH TÍCH [2, 3]
Các tổn thương bệnh lý của bệnh dịch tả heo chủ yếu do virus phá huỷ tế bào mô,
mạch quản và do suy tủy làm giảm bạch cầu và tiểu cầu. Quá trình bệnh lý này liên

quan chặt chẽ với hiện tượng xuất huyết và xung huyết tràn lan khắp cơ thể.
Các biểu hiện bệnh tích ở các cơ quan của heo bị bệnh như sau:
Da
Trong bệnh dịch tả heo cấp tính, xuất huyết mảng và xuất huyết điểm với nhiều
kích thước khác nhau thường hiện diện trên khắp cơ thể heo, đặc biệt ở tai, mũi, chân và
vùng bụng.
Hạch bạch huyết
Trong bệnh dịch tả heo thể cấp tính, các hạch bạch huyết thường sưng lớn và bị
xuất huyết. Lát cắt ngang của hạch bạch huyết thường cho thấy dạng có vân giống đá
hoa vân do hạch bị xuất huyết ở vùng ngoại vi.
Hạch hạnh nhân
Ở heo bình thường, màu của hạch hạnh nhân gần như cùng màu với mô xung
quanh. Trên heo bị bệnh dịch tả cấp tính, các hạch hạnh nhân thường có màu đậm cho
đến đỏ đậm, đôi khi có thể thấy các vết xuất huyết.
Thận
-7-


Xuất huyết điểm và xuất huyết mảng vùng vỏ thận là đặc trưng của bệnh dịch tả
heo cấp tính (hình 1). Đây là một bệnh tích tương đối ổn định. Hiện tượng xuất huyết còn
thấy ở phần tuỷ thận.

Hình 1: Thận heo nhiễm bệnh dịch tả heo với các điểm xuất huyết trên vỏ thận.
Lách
Hiện tượng nhồi huyết ở lách xảy ra trong khoảng 25% đến 65% các trường hợp
heo nhiễm bệnh. Hiện tượng này được coi là một bệnh tích chỉ định cho bệnh dịch tả heo
(Van Oirschot, 1982). Thông thường bệnh tích nhồi huyết xảy ra dưới dạng những nốt với
nhiều kích cỡ, hơi nhô lên bề mặt và thường tập trung lại thành một đường viền chạy
liên tục dọc theo bìa của lách.
Não

Trên heo bệnh, màng của não thường bị tụ huyết và xuất huyết trầm trọng (hình 2).
Ở thể bán cấp tính, tụ huyết trong các mạch máu màng não tũy thường xuất hiện rất rõ.

Hình 2: Tụ huyết và xuất huyết màng não tủy ở heo bệnh.
Ngoài ra, những bệnh tích đại thể khác có thể bao gồm xuất huyết mảng hay xuất
huyết điểm ở nhiều cơ quan như bàng quang, túi mật, niêm mạc của dạ dày và ruột. Các
nốt loét hình cúc áo của ruột, đặc biệt của kết tràng và đôi khi manh tràng là do tổn
thương mạch quản và viêm hoại tử.

2.5. ĐẶC ĐIỂM CỦA VIRUS DỊCH TẢ HEO, CLASSICAL SWINE FEVER
VIRUS – CSFV
2.5.1. Đặc điểm phân loại [23]
Virus dịch tả heo, Classical swine fever virus – CSFV, trước đây được xếp vào họ
Togaviridae thuộc chi Pestivirus. Theo Collett (1989) và Hozinek (1990), những nghiên
cứu gần đây cho thấy cấu trúc bộ gen của chi Pestivirus tương ứng với các virus thuộc họ
Flaviviridae hơn là Togaviridae. Chính vì vậy, hiện nay CSFV được xếp vào họ
Flaviviridae.
-8-


Pestivirus là tác nhân gây bệnh nổi trội ở động vật nhai lại. Trong nhóm này, ngoài
CSFV còn có 2 thành viên khác là: virus gây bệnh tiêu chảy ở bò (Bovine viraldiarrhoea
virus, BVDV) và Border Discase virus (BDV). Cấu trúc kháng nguyên và cấu trúc bộ
gen của CSFV rất giống với BVDV và BDV, do vậy cần phải phân biệt các virus này với
nhau khi chẩn đoán bệnh.
Không có sự khác nhau cơ bản nào về tính kháng nguyên để sắp xếp các chủng
virus gây bệnh dịch tả heo vào nhiều type virus khác nhau (Gieger, 1939). Trần Đình Từ
(1990) lại cho rằng hiện tượng biến chủng của virus CSFV làm độc lực của virus biến
chủng thường thấp hơn độc lực của virus ban đầu. Những nghiên cứu định lượng bằng
phản ứng trung hòa huyết thanh cho phép phân biệt 2 nhóm phụ về huyết thanh:

- Nhóm phụ A: gồm những chủng cường độc (như chủng Alfort), chủng độc lực
thấp, chủng biến đổi (chủng Chinois, chủng Thiverval …)
- Nhóm phụ B: chủng độc lực thấp gây xáo trộn sinh sản (như chủng 331).
Những chủng thuộc nhóm B có khả năng gây bệnh yếu, khả năng kích thích tạo ra
kháng thể trên heo nhiễm virus thấp. Ngược lại, thú cảm nhiễm bởi những chủng thuộc
nhóm A cho nhiều kháng thể hơn và kháng thể này phản ứng với cả hai nhóm A và B.
Như vậy, khi theo dõi những thể cận lâm sàng (sub – clinique) cần phải nghiên cứu kỹ
huyết thanh học.
Bệnh dịch tả heo do những chủng có độc lực trung bình phần nào chịu ảnh hưởng
bởi những yếu tố thuộc vật chủ như: giống, tuổi, sự cạnh tranh miễn dịch, điều kiện dinh
dưỡng. Trái lại, đối với những chủng có độc lực cao yếu tố trên giữ vai trò rất nhỏ.
Như vậy, những chủng có độc lực cao thường gây bệnh cấp tính và tỉ lệ chết cao,
trái lại những chủng có độc lực trung bình gây bệnh ở thể á cấp tính hay mãn tính. Các
chủng có độc lực thấp thường gây tỉ lệ chết trong bào thai và heo sơ sinh cao.
Năm 1975, Dunne cho rằng tính độc của virus không bền, tính độc sẽ thay đổi sau
một hay nhiều lần tiêm truyền qua heo. Dựa vào đặc tính này mà người ta sản xuất vắc xin phòng bệnh dịch tả heo – đó là phương pháp làm giảm độc lực của virus và thu được
một số chủng nhược độc sử dụng làm vắc-xin như CSFV chủng C, chủng IFFA …
2.5.2. Bộ gen virus [13, 16, 18, 19, 20, 22, 24, 25]
Classical swine fever virus (CSFV) có dạng hình cầu, cấu trúc nucleocapside là một
khối đối xứng 20 mặt, được bao bọc bởi màng ngoài (envelope). Virion có đường kính 40
– 50 nm, nucleocapsid khoảng 29nm.
CSFV có cấu tạo gồm 2 phần:
- Phần vỏ có chứa glycoprotein và nucleocapside.
- Phần lõi là RNA, mạch dương (+) chứa đầy đủ những thông tin di truyền về cấu
trúc và những đặc điểm cần thiết cho mọi hoạt động sống của virus như: xâm nhiễm,
sinh sản và gây bệnh.
RNA, vật liệu di truyền chính của CSFV cũng như của nhóm Pestivirus, mang đặc
điểm RNA của họ Flaviviridae, tức là RNA virus được gắn mũ chụp (cap) ở đầu
5’methyl, RNA bộ gen thiếu chuỗi poly A ở đầu 3’. Bộ gen có kích thước khoảng 12,5 kb
(Moormann và Hulst, 1988), chứa vùng 5’không mã hóa (5’unstranslated region,

-9-


5’UTR), điểm gắn vào ribosome tế bào chủ (internal ribosomal entry site, IRES), 1
khung đọc mở (open reading frame, ORF) mã hóa cho 1 polyprotein lớn chứa khoảng
4000 amino acid và vùng 3’ không mã hóa (3’unstranslated region, 3’UTR).
Khung đọc mở (ORF) của CSFV mã hoá cho 2 nhóm protein quan trọng là protein
cấu trúc và protein không cấu trúc. RNA bộ gen có chức năng như mRNA, được dịch mã
sau khi virus nhiễm vào tế bào chủ để tạo ra polyprotein, sau đó các polyprotein này
được scắt bỏ để tạo thành các protein trưởng thành.

Hình 3: Cấu tạo bộ gen RNA của Pestivirus
 Cấu trúc protein của CSFV: bao gồm protein C, E1, E2; trong đó protein C
tham gia tạo nucleocapside, còn protein E1 và E2 tham gia tạo vỏ. Ba loại protein này
mã hóa từ nucleotide 1100 đến 3600. E0 và E2 có vai trò quan trọng trong việc kích thích
tạo đáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ (heo) bị nhiễm bệnh.
- E0-glycoprotein tạo homodimer bằng một nối di-sulfide có khối lượng phân tử
97kDa. Các monomer tương tự có sự khác biệt nhỏ trong khối lượng phân tử (44 và
48kDa) có lẽ là do những biến đổi trong quá trình glycosyl hóa. Mỗi monomer chứa
khoảng 227 amino acid và tương ứng từ gốc 268-494 trên polyprotein của CSFV. 50%
khối lượng phân tử E0-glycoprotein trưởng thành được tạo ra từ carbohydrate.
E0 nối với màng qua vòng xoắn xuyên màng và những phần quan trọng của protein
được thải ra từ những tế bào bị nhiễm. Cơ chế liên kết E0 với bề mặt virion chưa được
làm rõ. Gần đây, chức năng RNase của E0 mới được phát hiện. Đồng thời E0glycoprotein cũng là mục tiêu đầy hứa hẹn cho việc phát triển các loại thuốc chống virus
và làm vắc-xin phòng bệnh CSF.
- E2 là glycoprotein màng chính ở bề mặt ngoài của virion. Nó cảm ứng tạo kháng
thể trung hoà bảo vệ hệ miễn dịch ở heo rất mạnh.
Thuộc tính kháng nguyên của E2 được làm rõ qua thí nghiệm dùng một số kháng
thể đơn dòng (Monoclonal antibody, Mabs). Đoạn gen mã hóa cho E2 đã được tạo dòng
để làm vắc-xin tái tổ hợp phòng bệnh dịch tả heo.

 Protein không cấu trúc: nằm tiếp theo sau phần protein cấu trúc, gồm các
protein sau: NS2, NS3, NS4, NS5. Trong đó mỗi protein có chức năng riêng.
Kháng thể trong huyết thanh hình thành từ sự cảm ứng trong quá trình nhiễm virus
sẽ kháng trực tiếp với protein tham gia tạo cấu trúc virion như E0, E2 và cả protein
không cấu trúc NS3. Kháng thể đơn dòng kháng protein cấu trúc virion hầu hết cho phép
phân biệt được CSFV và các Pestivirus khác, kháng thể đơn dòng kháng NS3 lại có tính
nhận biết cao đối với các epitope bảo tồn trong nhóm Pestivirus.


Cấu trúc vùng 5’UTR

- 10 -


Vùng gen ở đầu 5’(5’UTR) và 3’(3’UTR) là vùng không dịch mã nhưng đóng vai
trò quan trọng. Vùng 5’ có khả năng điều hòa dịch mã. Mặt khác người ta còn sử dụng
trình tự này để tạo mẫu dò (do vùng này có mức độ bảo tồn cao) và tổng hợp primer
trong kó thuật PCR dùng trong chẩn đoán.
Vùng 5’UTR của Pestivirus chứa nhiều mã AUG nằm ở vùng thượng nguồn của
điểm bắt đầu cho sự tổng hợp polyprotein. Trong vùng 5’UTR chứa những trình tự
nucleotide có tính bảo tồn cao.
Qua việc so sánh phân tích trình tự và mô hình nhiệt động học của vùng 5’UTR
của nhiều chủng BVDV và CSFV, người ta đã xây dựng mô hình cấu trúc bậc hai của
RNA bộ gen virus. Bộ gen của picorna viruses cũng có cấu trúc RNA nhiều mã bộ ba
AUG định vị tại đầu 5’UTR.

2.6. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BỆNH DỊCH TẢ HEO
Trước đây, bệnh dịch tả heo được chuẩn đoán dựa trên triệu chứng và bệnh tích,
nhưng phương pháp này không đáng tin cậy và triệu chứng của bệnh thường xuyên biến
đổi rất đa dạng và phức tạp. Ngày nay, áp dụng thành tựu của di truyền học phân tử và

các kỹ thuật miễn dịch mới, các phương pháp chẩn đoán nhạy, chính xác hơn được ra đời
nhằm phát hiện các tác nhân gây bệnh trền nhiễm.
2.6.1. Chẩn đoán virus học
2.6.1.1. Phương pháp tiêm truyền qua heo [12]
Lấy bệnh phẩm máu, lách của heo trong trường hợp nghi ngờ, triệu chứng, bệnh
tích không rõ ràng để tiêm cho heo con. Heo con được dùng làm thí nghiệm khoảng 3-4
tháng tuổi, khoẻ mạnh, không ở ổ bệnh dịch tả heo. Ba ngày sau heo sẽ biểu hiện các
triệu chứng bệnh. Sau một tuần con vật mệt lả và chết. Các bệnh tích đặc trưng thường
thấy trong lúc mổ khám là ở ngoài da, nhất là ở vùng đùi, bụng có nốt đỏ xuất huyết, dạ
dày và ruột loét, thận xuất huyết từng chấm đỏ mặt ngoài, lá lách xuất huyết, tụ huyết
quanh rìa. Đây là phương pháp cần nhiều thời gian, tốn kém và phải hết sức cẩn thận
tránh lây nhiễm nhưng có độ chính xác cao hơn phương pháp nuôi cấy tế bào 10 lần.
2.6.1.2. Phương pháp trung hòa trên thỏ [12]
Phương pháp này đã được ứng dụng trong chẩn đoán một số ổ dịch nghi bệnh dịch
tả heo ở miền Trung (Nguyễn Thị Phương Duyên, 1988). Phương pháp chẩn đoán qua
thỏ được thực hiện như sau: lách heo bệnh nghiền nhuyễn pha thành huyễn dịch tiêm
dưới da thỏ (có thể thay bằng máu heo bệnh) để gây miễn dịch. Sau 5-10 ngày, tiêm tónh
mạch tai thỏ vắc-xin dịch tả heo nhược độc đồng thời cũng tiêm vắc -xin vào tónh mạch
một tai thỏ khác để làm đối chứng, khoảng 3 ngày sau nếu thỏ tiêm bệnh phẩm không
sốt, trong khi thỏ đối chứng sốt rõ rệt, chứng tỏ bệnh phẩm chứa virus dịch tả heo (Theo
dẫn liệu của Trần Thanh phong, 1996)
Phương pháp chẩn đoán trên này dựa trên nguyên tắc virus dịch tả heo cường độc
và virus dịch tả heo thông qua thỏ (nhược độc) có sức gây bệnh khác nhau nhưng có tính
kháng nguyên giống nhau, có thể sử dụng virus dịch tả heo cường độc để gây miễn dịch
cho thỏ, dùng thỏ hay heo để chẩn đoán virus.

- 11 -


* Phản ứng trung hòa trên thỏ, cũng như việc tiêm truyền lợn thí nghiệm là các

phương pháp chẩn đoán truyền thống, tuy nhiên cho kết quả chậm, tốn kém. Trước mắt
một số nơi chưa có điều kiện vẫn phải sử dụng, về lâu dài có thể dùng như là phản ứng
đối chứng.
2.6.1.3. Phản ứng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp [26]
Phương pháp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp được thực hiện trên những mẫu mô
đông lạnh nhằm phát hiện sự hiện diện của virus trong mẫu bệnh phẩm. Kháng thể dịch
tả heo được đánh dấu huỳnh quang sẽ bắt cặp đặc hiệu với kháng nguyên tương ứng, tức
là virus, có trong bệnh phẩm tạo phức hợp kháng nguyên và kháng thể phát sáng khi soi
dưới kính hiển vi huỳnh quang.
Ưu điểm của phương pháp là giá thành rẻ, đơn giản (kể cả việc lấy bệnh phẩm),
phát hiện nhanh (có thể hoàn thành trong 2 giờ) và khá tin cậy, vì vậy đã trở thành một
trong những phương pháp chẩn đoán phổ biến trong nhiều chương trình diệt trừ virus dịch
tả heo.
Tuy nhiên, phương pháp này không cho phép phân biệt giữa kháng nguyên dịch tả
heo và tiêu chảy ở bò vì virus dịch tả heo có cùng kháng nguyên với virus gây tiêu chảy
ở bò, do đó chẩn đoán có thể cho kết quả âm tính giả.
2.6.1.4. Phương pháp phân lập virus dịch tả heo trên nuôi cấy tế bào PK-15 [12]
Phủ tạng heo nghi nhiễm virus dịch tả heo được nghiền nát, chất nghiền được trực
tiếp nuôi cấy vào môi trường tế bào PK-15. Sau đó phát hiện virus trong các tế bào bằng
kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang. Phương pháp này còn được dùng để chẩn đoán lại
những trường hợp mà xét nghiệm ELISA cho kết quả còn nghi ngờ. Kết quả có được sau
3-5 ngày gây nhiễm virus trên tế bào PK-15. Phương pháp phân lập virus thì nhạy hơn
phương pháp miễn dịch huỳnh quang trên phẫu thức đông lạnh, tuy nhiên nhược điểm
của phương pháp là tốn nhiều thời gian.
2.6.1.5. Phương pháp nhuộm hoá mô miễn dịch (IHC: Immunohistochemical
staining) [26]
Để phát hiện kháng nguyên virus dịch tả heo trong những bệnh phẩm, phương pháp
miễn dịch huỳnh quang đòi hỏi mẫu mô phải được đông lạnh, ngược lại trong phương
pháp IHC có thể sử dụng mẫu mô cố định bằng formol 10% và đóng khối bằng parafin.
Sau đó phát hiện kháng nguyên bằng phương pháp miễn dịch với sự hiện diện của Biotin

và Avidin peroxidase (The Avidin-Biotin Complex Immunoperoxidase Method). Phương
pháp này tiện lợi hơn phương pháp miễn dịch huỳnh quang là mẫu bệnh phẩm được cố
định ngay tại thực địa (thuận lợi cho vận chuyển trong việc bảo quản mẫu bệnh phẩm)
và phẫu thức nhuộm được quan sát bằng kính hiển vi bình thường.
2.6.2. Chẩn đoán huyết thanh học
2.6.2.1. Thử nghiệm hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme ELISA (enzyme-linked
immuno sorbent assay) [5]
Nguyên tắc của kỹ thuật ELISA là sử dụng kháng thể đơn dòng được cố định trên
các giếng với mục đích thu giữ kháng nguyên đặc hiệu mục tiêu. Những kháng nguyên
này lại được phát hiện bằng cách sử dụng kháng thể thứ cấp được gắn kết với enzyme có
khả năng tạo màu khi bổ sung cơ chất chuyên biệt.
- 12 -


Phương pháp ELISA sử dụng kháng thể đơn dòng nhận biết được một biểu mô khác
trên protein E2 của virus dịch tả heo, vì vậy cho phép phân biệt virus này và các
Pestivirus khác. Phương pháp này đơn giản, cho kết quả nhanh trong vòng 36 giờ và có
thể thực hiện trên số lượng mẫu lớn, cho kết quả tin cậy đối với những mẫu bệnh phẩm
từ heo có dấu hiệu lâm sàng như: sốt, tiêu chảy… Do đó sử dụng phương pháp ELISA
phải kết hợp với chẩn đoán lâm sàng trên thú bệnh.
Tuy nhiên, sử dụng trong chẩn đoán đại trà sẽ gặp khó khăn vì giá thành cao.
Phương pháp này được khuyến cáo sử dụng để đánh giá phát hiện virus dịch tả heo tại
các trại giống, kiểm tra lại kết quả của các phản ứng khác. Từ 1998-1999 một số tỉnh
phía Nam đã áp dụng phương pháp này để phát hiện, xử lý heo nái ở thể mang trùng
mang lại kết quả tốt cho chăn nuôi.
2.6.2.2. Chẩn đoán bằng phản ứng trung hòa trên môi trường tế bào [5]
Phản ứng trung hòa hay thử nghiệm trung hòa dựa trên cơ sở của sự tác động của
virus đối với kháng thể đặc hiệu nhờ đó có thể trung hòa hoạt tính của virus. Thí nghiệ m
bao gồm trộn virus với kháng huyết thanh và đưa hỗn hợp này vào hệ thống sinh học
động vật thí nghiệm, trứng có phôi hay nuôi cấy tế bào mẫn cảm đối với virus. Nếu virus

bị trung hòa thì hệ thống chỉ định sẽ không biểu hiện bệnh tích.
Thử nghiệm trung hòa được sử dụng để giám định virus, hiệu giá của virus, phát
hiện được sự hiện diện của kháng thể đặc hiệu và hàm lượng của kháng thể. Phương
pháp trung hòa virus được hội nghị khoa học thú y của cộng đồng trung Châu Âu nghiên
cứu để phát hiện kháng thể trung hòa trong chẩn đoán bệnh dịch tả heo. Đây là một
trong những kỹ thuật được áp dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm quốc gia Pháp
(Y. Leforban và cộng sự, 1987). Phản ứng trung hòa được xem là phản ứng có độ nhạy
và độ chuyên biệt cao, được dùng để kiểm tra lại những mẫu mà phản ứng ELISA cho
kết quả âm tính (Nguyễn Tiến Hà, 2001).
2.6.3. Chẩn đoán bệnh dịch tả heo bằng kỹ thuật RT-PCR (reverse
transcription - polymerase chain reaction ) [12, 17, 21]
Một kỹ thuật khác có nhiều ưu điểm hơn là sử dụng phản ứng tổng hợp dây chuyền
polymerase (polymerase chain reaction - PCR) nhằm phát hiện gen đặc trưng. Do vật
liệu di truyền của virus dịch tả heo là RNA nên kó thuật phối hợp RT-PCR được sử dụng
cho phát hiện virus dịch tả heo có trong mẫu. Trước hết, RNA được chuyển thành cDNA
nhờ enzyme phiên mã ngược. Sau đó, cDNA được khuếch đại nhờ Taq polymerase. Kó
thuật RT-PCR cho phép nghiên cứu các mRNA tồn tại với hàm lượng rất thấp, không thể
phát hiện bằng các phương pháp cổ điển như Northern blot. Nhờ vậy việc phát hiện virus
được nhanh chóng và có tính đặc hiệu cao.
Một kỹ thuật mới phát triển-kó thuật in situ RT-PCR cho phép khuếch đại các RNA
ngay trên mô và tế bào. Kó thuật này có nguyên tắc như trên, được tiến hành trên lát cắt
mô, tế bào cố định trên lame, trong thiết bị PCR có bộ phận tạo nhiệt chuyên cho lame.
2.6.4. Các phương pháp chẩn đoán khác
2.6.4.1. Kính hiển vi điện tử [10]
CSFV nằm ngoài giới hạn thấy được của kính hiển vi quang học. Những số liệu về
hình thái của virus này được biết đến qua kính hiển vi điện tử. Muốn thấy được vật liệu
- 13 -


sinh học dưới tác động của chùm điện tử cần phải nhuộm bằng thuốc nhuộm chứa kim

loại nặng. Lát cắt cực mỏng của tế bào nhiễm virus có thể được nhuộm dương bản với
chì hay muối uranium, huyền dịch của virion có thể được nhuộm âm bản với acid
phosphotungstic.
2.6.4.2. Dùng phương pháp tủy đồ [5]
Phương pháp tủy đồ được sử dụng để chẩn đoán bệnh dịch tả heo dựa trên đặc tính
biến đổi của tủy xương tạo máu, trong đó chú ý dến các dạng tế bào gây bệnh như
paralymphoblast tăng lên. Người ta đã xác định là trong tủy xương của heo nhiễm virus
dịch tả heo cường độc có xuất hiện những paralymphoblast khi heo bệnh thể cấp tính có
triệu chứng lâm sàng. Sự biến đổi này không thấy ở bệnh mãn tính. Tuy nhiên phương
pháp này không phổ biến trong đại trà bệnh dịch tả heo (J. bull, 1985).
2.6.4.3. Chẩn đoán phân biệt [5]
Với biểu hiện “đỏ” trên da cần phân biệt với các bệnh do Salmonella, bệnh đóng
dấu son, bệnh do Parvovirus, bệnh tụ huyết trùng và bệnh dịch tả Châu Phi. Tuy nhiên
cần lưu ý các đặc điểm sau: bệnh dịch tả heo lây lan nhanh, mạnh từ một nơi có thể lan
ra vùng khác, gây chết heo hầu hết các lứa tuổi, heo 5-35kg thường chết ở thể cấp tính.
Giai đoạn đầu nhiễm bệnh heo thường sốt cao kéo dài trong nhiều ngày, sau đó giảm
sốt, kèm theo triệu chứng tiêu chảy dữ dội. Xuất huyết đốm ở nhiều cơ quan. Nhồi huyết
ở rìa lách. Ruột khoét hình cúc áo. Số lượng bạch cầu giảm < 10000/mm3. Cần mổ nhiều
heo bệnh, sự vắng mặt những bệnh tích chuyên biệt không cho phép loại thải giá trị chết
về bệnh (theo dẫn liệu của Trần Thanh Phong, 1996).

2.7. PHƯƠNG PHÁP RT-PCR [1, 19, 32]
Phản ứng dây chuyền polymerase (polymerase chain reaction - PCR) là một công
cụ quan trọng trong sinh học phân tử được khám phá bởi Kary Mullis và cộng sự vào
năm 1983. Phản ứng PCR khuếch đại đoạn DNA xác định từ một nguồn mẫu ban đầu
phức tạp như DNA bộ gen.
Đối với RNA, có thể khuếch đại một trình tự chuyên biệt từ mẫu RNA bằng kỹ
thuật RT-PCR (reverse transcriptase PCR). Kỹ thuật RT-PCR không chỉ là một phương
pháp giúp phân tích sự biểu hiện của gen mục tiêu một cách nhanh, nhạy mà còn có thể
cung cấp một số thông tin bán định lượng về mức độ biểu hiện.

2.7.1. NGUYÊN TẮC CHUNG
Trong phản ứng RT-PCR, trước hết RNA được chuyển thành DNA nhờ phản ứng
phiên mã ngược giống như cách biến đổi RNA bộ gen của những virus RNA thành DNA
trong tế bào chủ, sau đó thực hiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn DNA bổ sung
(complementary DNA – cDNA). Phản ứng RT và phản ứng PCR có thể thực hiện trong 2
tube phản ứng khác nhau (RT-PCR hai bước) hay trong cùng một tube (RT-PCR một
bước). Sơ đồ mô hình một quy trình phản ứng RT-PCR được trình bày trong hình 4.
Giai đoạn RT
Phản ứng phiên mã ngược có thể được thực hiện trên RNA tổng số hay mRNA.
Enzyme phiên mã ngược dùng trong phản ứng RT là một DNA polymerase phụ thuoäc
- 14 -


RNA (RNA-dependent DNA polymerase) sử dụng mRNA làm mạch khuôn để tổng hợp
ra một mạch DNA bổ sung.
Mồi sử dụng trong giai đoạn này có thể là mồi ngược của phản ứng PCR (mồi
chuyên biệt gen), mồi oligo(dT) hay mồi trình tự 6 nuleotide bắt cặp ngẫu nhiên.
Giai đoạn PCR
PCR được thực hiện trên cơ sở phản ứng sinh tổng hợp DNA theo 3 bước sau:
- Biến tính DNA thành DNA mạch đơn.
- Phản ứng của mồi bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn.
- Kéo dài đoạn DNA mới nhờ DNA polymerase chịu nhiệt.
Những phản ứng này được thực hiện nhờ enzyme polymerase có tính ổn định rất
cao đối với nhiệt độ, và sự thay đổi chu kỳ nhiệt độ một cách hợp lý, đặc biệt là nhiệt độ
cho sự biến tính và bắt cặp. Ba bước này được xảy ra theo chu kỳ rất nhanh và lặp lại
nhiều lần để khuếch đại DNA. Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân, mỗi lần lặp lại sẽ
gấp đôi lượng mẫu của lần trước. Theo tính toán, sau khoảng 30 chu kỳ thì đoạn DNA
mục tiêu sẽ được khuếch đại gấp 106 so với lượng mẫu ban đầu.
Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch
khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Khi cung cấp hai mồi chuyên

biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ
được tổng hợp. Điều này có nghóa là để khuếch đại một trình tự DNA, cần phải có thông
tin tối thiểu về trình tự đó đủ để tạo các mồi bổ sung chuyên biệt. Các mồi này gồm một
mồi xuôi (tác động lên mạch 5’-3’, forward primer) và mồi ngược (tác động lên mạch 3’5’, reverse primer). Ba giai đoạn của phản ứng PCR xảy ra trong điều kiện nhiệt độ khác
nhau, nên máy luân nhiệt phải có tính chất tự động hoá một cách chính xác với sự trợ
mRNA hay RNA tổng số
Mồi ngược

+ Reverse Transciptase

Chu kỳ PCR 1

cDNA
Mồi xuôi
+ Taq DNA polymerase

Chu kỳ PCR 2

Hình 4 Sơ đồ tổng quát một quy trình RT-PCR
- 15 -


giúp của enzyme chịu nhiệt Taq DNA polymerase. Đây là nguyên tắc cơ bản quyết định
sự thành công của PCR.
2.7.2. TỐI ƯU HOÁ CÁC ĐIỀU KIỆN CHO PHẢN ỨNG RT-PCR
Có nhiều yếu tố cần được xem xét trong phản ứng RT-PCR như nhiệt độ tối ưu của
enzyme phiên mã ngược, mức độ nhạy của phản ứng, ứng dụng của sản phẩm PCR và sự
dễ dàng trong quá trình thực hiện. Để đạt được hiệu quả tốt trong phản ứng RT-PCR, các
yếu tố trong phản ứng cần được tối ưu.
2.7.2.1. Phản ứng phiên mã ngược (Reverse Transriptase - RT)

a) Trình tự và nồng độ mồi
Việc lựa chọn mồi phù hợp cho phản ứng phiên mã ngược phụ thuộc vào kích thước
và cấu trúc thứ cấp của mRNA mục tiêu. Nồng độ tối ưu của mồi được xác định trong
thực nghiệm đối với từng phản ứng cụ thể.
Đối với mồi oligo(dT), phản ứng phiên mã ngược dựa vào đuôi polyA ở đầu 3’
mRNA của eukaryote để tổng hợp trực tiếp mạch cDNA. Nồng độ mồi oligo(dT) được đề
nghị là 0,5 g trong 20 l phản ứng.
Mồi chuyên biệt trình tự gen có thể bắt cặp chuyên biệt với RNA mục tiêu tại vùng
3’. Đây cũng là mồi ngược của giai đoạn PCR. Để có thể phân biệt đoạn cDNA được
khuếch đại với các trình tự khuếch đại của DNA bộ gen, mồi được thiết kế gắn chuyên
biệt với trình tự exon. Khi đó, sản phẩm khuếch đại từ bộ gen sẽ được phân biệt do có
kích thước lớn hơn sản phẩm được khuếch đại từ cDNA mục tiêu. Trong quy trình RTPCR một bước, mồi chuyên biệt gen được sử dụng giúp tránh sự canh tranh giữa mồi của
phản ứng RT và PCR. Nồng độ mồi chuyên biệt được đề nghị là 0,5 g trong 20 l phản
ứng.
Để khuếch đại những đoạn mRNA dài hay những phân tử có cấu trúc thứ cấp, mồi
chuyên biệt trình tự và mồi oligo(dT) gặp phải trở ngại là enzyme phiên mã ngược phải
kéo dài một trình tự quá dài hay đi qua một trình tự có cấu trúc thứ cấp. Trong trường
hợp này, mồi 6 nucleotide ngẫu nhiên được sử dụng. Tuy nhiên mồi 6 nucleotide ngẫu
nhiên lại có tính chuyên biệt thấp do sự bắt cặp là ngẫu nhiên trên RNA.
b) Enzyme phiên mã ngược
Hai enzyme xúc tác phản ứng phiên mã ngược thường được sử dụng là enzyme
phiên mã ngược từ virus: Monoley murine leukemia virus (MMLV-RTase) vaø Avian
myeloblastosis virus (AMV-RTase). Enzyme AMV có hoạt tính 5’-3’ polymerase phụ
thuộc mồi (5’-3’ primer-dependent polymerase) sử dụng khuôn mẫu là RNA hoặc DNA
và có hoạt tính 3’-5’ RNAse H. MMLV chỉ sử dụng khuôn mẫu là RNA.
Để phiên mã RNA thành cDNA, các cấu trúc thứ cấp của RNA phải được biến tính.
Do enzyme AMV và MMLV bị bất hoạt ở nhiệt độ cao nên các phản ứng tổng hợp mạch
cDNA phải được thực hiện ở 37-48oC. Nhiệt độ phản ứng tối đa của enzyme MMLV là
42oC, trong khi AMV có thể hoạt động tại 48oC ở điều kiện dung dịch đệm phù hợp. Vì
vậy việc sử dụng enzyme AMV RT có thể giúp loại trừ những vấn đề liên quan đến cấu

trúc thứ cấp cuûa RNA.

- 16 -


Một enzyme khác có thể sử dụng trong phản ứng RT là enzyme Tth DNA
polymerase có hoạt tính phiên mã ngược khi có mặt ion Mn2+. Enzyme này có thể hoạt
động ở nhiệt độ cao (60-70oC) nên có nhiều thuận lợi trong trường hợp cần loại trừ các
cấu trúc thứ cấp của RNA. Tuy nhiên, khi tổng hợp mạch cDNA bằng mồi 6 nucleotide
ngẫu nhiên, việc giảm nhiệt độ sẽ gây trở ngại cho hoạt tính của enzyme chịu nhiệt.
Trong trường hợp này, enzyme AMV hay MMLV sẽ được sử dụng.
Mặt khác, các nghiên cứu cho thấy enzyme phiên mã ngược từ virus nhạy hơn DNA
polymerase chịu nhiệt. Do đó trong các trường hợp yêu cầu sự chính xác cao như khuếch
đại DNA để tạo dòng thì AMV và MMLV thường được sử dụng.
c) Các thông số trong chu kỳ
Sự tổng hợp mạch cDNA sử dụng enzyme AMV có thể được thực hiện trong 20-60
phút tại 37-48 oC.
Trước phản ứng phiên mã ngược, bước biến tính có thể được thực hiện độc lập hay
phối hợp bằng cách ủ mồi và khuôn RNA ở 94oC trong 2 phút. Sau đó, hỗn hợp khuôn
RNA/mồi được làm lạnh đến nhiệt độ phù hợp cho phản ứng phiên mã ngược (37-48oC)
và thêm các hỗn hợp phản ứng.
Sau phản ứng phiên mã ngược, nhiệt độ lại được tăng lên 94oC nhằm biến tính sợi
đôi RNA/cDNA và ức chế hoạt tính enzyme phiên mã ngược. Các báo cáo từ kết quả
thực nghiệm cho thấy việc ức chế hoạt tính enzyme phiên mã ngược giúp thu được hiệu
quả khuếch đại DNA ở bước PCR tốt hơn.
2.7.2.2. Phản ứng PCR
a) Thể tích phản ứng và tube phản ứng
Hầu hết các quy trình PCR được thực hiện với thể tích từ 25-100 l trong các tube
0,2ml hay 0,5ml. Trong trường hợp tiến hành với thể tích lớn hơn 100 l thì thời gian ủ
cần lâu hơn để có sự cân bằng nhiệt độ trong hỗn hợp phản ứng. Thể tích được lựa chọn

sao cho sự điều khiển nhiệt độ trong hỗn hợp phản ứng được chính xác.
Các loại tube cần được thiết kế phù hợp với máy luân nhiệt và phù hợp với sự thay
đổi nhiệt độ trong khoảng thời gian nhanh nhất.
b) Trình tự và nồng độ mồi
Trình tự mồi
Trình tự của mồi quyết định tính chuyên biệt của phản ứng PCR. Việc lựa chọn
trình tự mồi chuyên biệt và nồng độ mồi tối ưu cho phản ứng có vai trò quan trọng đối
với hiệu quả của phản ứng. Thông thường, độ dài của mồi sử dụng trong phản ứng PCR
dao động trong khoảng 18-30 bp.
Khi chọn lựa hai mồi cho phản ứng PCR, cần lưu ý rằng mồi không được chứa các
trình tự tự bổ sung và không bắt cặp bổ sung giữa mồi xuôi và mồi ngược.
Thành phần G/C thông thường trong khoảng 15-55%, tỉ lệ G+C khoảng 40-60%
giúp gia tăng độ bền của mồi và tránh các cấu trúc bậc hai.
Mồi cho phản ứng PCR không nên thiết kế bắt cặp với vùng chứa cấu trúc bậc hai
trên DNA mục tiêu.

- 17 -


Việc lựa chọn trình tự và tính toán nhiệt độ bắt cặp có thể thực hiện bằng máy tính
với các phần mềm chuyên dụng.
Nồng độ mồi
Trong hầu hết các ứng dụng, mồi xuôi và mồi ngược đều phải có nồng độ bằng
nhau. Theo thực nghiệm, 95% các phân tử đầu tiên của mồi vẫn còn duy trì sau 30 chu
kỳ PCR. Vì vây, nồng độ mồi tối ưu sử dụng nên dao động trong khoảng 0,1 M đến 1
M trong 25 l dung dịch phản ứng. Sử dụng nồng độ mồi cao hơn không những không
cần thiết mà còn có thể dẫn đến sự hình thành dimer giữa các mồi và hiện tượng bắt cặp
nhầm.
c) Nồng độ Mg2+
Một trong những yếu tố ảnh hưởng có tính chất quyết định là nồng độ Mg 2+, kể cả

về tác dụng chuyên biệt và kết quả PCR. Nồng độ cao của Mg2+ sẽ làm cho phân tử
DNA mạch đôi ổn định hơn, ngăn cản sự biến tính tạo thành sợi đơn làm giảm sản phẩm
PCR. Lượng thừa Mg2+ còn gây ra sự bắt cặp không chính xác làm giảm sự chuyên biệt
của phản ứng.
Ngược lại, khi nồng độ Mg2+ thấp (< 0,5 M) sẽ ảnh hưởng đến quá trình kéo dài do
Mg2+ đóng vai trò co-factor của enzyme polymerase.
Ion Mg2+ tự do có thể liên kết với dNTP, mồi và DNA bản mẫu nên lượng ion Mg 2+
cần cho hoạt động của enzyme sẽ bị giảm. Do đó, cần phải xác định nồng độ tối ưu của
Mg2+ để đảm bảo sự chuyên biệt của sản phẩm PCR và hiệu suất tổng hợp. Nồng độ
Mg2+ tự do cần cao hơn nồng độ dNTP 0,5-2,5 mM.
d) Dung dịch đệm (buffer)
pH của dung dịch đệm cần được xem xét trong phản ứng PCR. Hầu hết các phản
ứng được đệm trong môi trường 10-50 mM Tris-HCl ở pH 8,3 nhiệt độ 20oC. Tuy nhiên
pH giảm khi nhiệt độ tăng, do đó theo chu kỳ nhiệt của PCR, pH sẽ thay đổi từ 7,8 đến
6,8. Với sự dao động như vậy, pH được xem như tạm chấp nhận.
Môi trường đệm KCl thường được sử dụng. Nồng độ KCl hay NaCl cao có thể ức
chế hoạt tính của enzyme Taq polymerase, tuy nhiên các thành phần này lại cần để thúc
đẩy sự bắt cặp giữa mồi và khuôn mẫu.
Ammonium sulphate cũng được sử dụng làm dung dịch đệm để phát hiện các sản
phẩm khuếch đại có trọng lượng phân tử thấp trên gel acrylamide.
Gelatine hoặc Triton X-100 được dùng để bảo quản enzyme. Nhằm bảo quản và ổn
định enzyme trong quá trình xử lý nhiệt của phản ứng PCR, dung dịch đệm trong phản
ứng thường chứa gelatine ở nồng độ 0,01% và Triton X-100 ở nồng độ 0,1% (v/v).
e) Enzyme
Nhiều loại enzyme chịu nhiệt có thể được sử dụng trong phản ứng PCR như Taq
polymerase, Tth polymerase…. Nồng độ của enzyme polymerase là một nhân tố quan
trọng quyết định sự chính xác của phản ứng PCR. Nếu nồng độ enzyme cao và dư thừa
sẽ làm giảm sự chuyên biệt và gia tăng giá thành không cần thiết. Nồng độ Taq
polymerase nên sử dụng được khuyến cáo trong hầu hết các protocol là 0,5 U/ 25 l
phản ứng và không nên sử dụng nồng độ cao hơn 1,25 U/ 25 l phản ứng.

- 18 -