nghiên cứu công nghệ sản xuất vắcxin chống dị ứng từ mạt bụi nhà acarien d pteronyssinus (DP) và ứng dụng trong chẩn đoán, điều trị một số bệnh dị ứng hen phế quản, viêm mũi dị ứng, viêm kết mạc nghiên cứu quy trình tác

Bộ khoa học và công nghệ
Công ty Vaccin pasteur Đà lạt



Báo cáo kết quả đề tài nhánh
KC 10-10/ 06-10/04




Nghiên cứu quy trình tách chiết và điều chế dị nguyên
mạt bụi nhà Acarien D.pteronyssinus Tại Việt NAm



Chủ nhiệm đề tài nhánh: PGS.TS.Nguyễn Hoài An
TS Nguyễn Thị Ngọc Dung
Thời gian thực hiện: 01/07/2007 - 30/03/2009







7598-4
20/01/2010

Hà nội, 05 2009


Bộ khoa học và công nghệ
Công ty Vaccin pasteur Đà lạt



Báo cáo kết quả đề tài nhánh
KC 10-10/ 06-10/04




Nghiên cứu quy trình tách chiết và điều chế dị nguyên
mạt bụi nhà Acarien D.pteronyssinus Tại Việt NAm





Chủ nhiệm đề tài nhánh: PGS.TS.Nguyễn Hoài An
TS Nguyễn Thị Ngọc Dung
Cỏn b tham gia :
Ths. Hunh Quang Thun
GS.TSKH. V Minh Thc.
PGS.TS.Nguyn Tn Phong
BSCKII. Phm Th Ngc.
Ks.inh Vn Minh

Hà nội, 05 - 2009
1

T VN

Trong mấy chục năm qua, số ngời mắc bệnh dị ứng có xu hớng tăng
nhanh, ở nhiều nớc tỷ lệ mắc bệnh dị ứng ở vị trí thứ ba, sau các bệnh tim
mạch và ung th, ở một vài nớc nó còn chiếm vị trí hàng đầu, phổ biến nhất
là dị ứng do phấn hoa, bụi nhà, bụi bông và lông vũ. Theo thống kê của Tổ
chức Y tế thế giới (WHO) tại các nớc công nghiệp phát triển, chỉ riêng các
thể hen phế quản dị ứng có tới 4-5% viêm mũi dị ứng 15-20% và tổng tần số
các trờng hợp dị ứng đạt tới 10-15% dân số thế giới.
Ngày nay không còn ai nghi ngờ rằng nhiều bệnh dị ứng ( nh Hen phế
quản atopy, Viêm mũi dị ứng, mày đay, eczema atopy, và nhiều bệnh khác) do
tác động của bụi nhà là một trong những nguyên nhân thông thờng nhất
(Helk et al, 1986; Berardino et al,1987; Plátt-Mills et al, 1987; Bousquet et al,
1988; Saint-Remy et al, 1988).
Để chẩn đoán một bệnh dị ứng, trớc hết cần phải xác định nguyên nhân
gây dị ứng (một hoặc nhiều DN đặc hiệu). Vì vậy tiến hành test mẫn cảm
(sensitivity testing) với các DN điều chế đợc vẫn là phơng pháp chủ yếu để
tìm nguyên nhân của bệnh. Mặt khác, phơng pháp điều trị bằng DN còn gọi
là phơng pháp giảm mẫn cảm đặc hiệu hoặc liệu pháp miễn dịch là
phơng pháp điều trị hiệu quả, nhất là khi ngời bệnh phải thờng xuyên tiếp
xúc với DN. Phơng pháp này chính là đa DN vào cơ thể đã mẫn cảm với nó
nhằm làm cho cơ thể thay đổi cách đáp ứng miễn dịch : thay đổi cân bằng
giữa các quần thể lympho bào T : Th

1/Th2 nghiêng về Th1, làm giảm dòng
Th
2/Tho đặc hiệu dị nguyên, dẫn tới sự giảm mẫn cảm các tế bào đích (tế bào
dị ứng) mastocyte, basophille làm giảm sự giải phóng các chất trung gian và
do đó hạn chế đợc các triệu chứng dị ứng. Đó cũng là cơ sở của biện pháp
tiêm chủng vaccin chống dị ứng.
2

Hiện nay, việc điều chế cũng nh ứng dụng DN nói chung và DN
D.pteronyssinus nói riêng đã đợc tiến hành ở nhiều trung tâm dị ứng của
nhiều nớc trên thế giới với nhiều loại DN sản xuất ra mỗi năm, cung cấp cho
nhiều nớc nh allergam, allergen, allerglobulin. ở Việt Nam, trong nhiều
năm gần đây việc điều chế và đa vào ứng dụng các dị nguyên bụi nhà, bụi
bông, lông vũ đã đợc các tác giả Nguyễn Năng An, Nguyễn Văn Hớng,
Nguyễn Văn Sửu, Vũ Minh Thục, Phan Quang Đoàn, v.v thực hiện thành
công. Các tác giả đã đi sâu nghiên cứu các đặc tính sinh học, hóa sinh, miễn
dịch của các dị nguyên nói trên, sử dụng các dị nguyên này trong chẩn đoán
và điều trị các bệnh dị ứng đã mang lại hiệu quả tích cực. Song các tác giả
cha đi sâu nghiên cứu thành phần chính có khả năng tạo nên hoạt tính của dị
nguyên bụi nhà, đó là các loài mạt có trong bụi nhà và các sản phẩm thải của
chúng. Bụi nhà chỉ là môi trờng sống của mạt. Mặt khác, một số kết quả
nghiên cứu gần đây cho thấy sử dụng dị nguyên bụi nhà để điều trị cho bệnh
nhân hen phế quản và viêm mũi dị ứng cho kết quả thấp hơn so với dùng dị
nguyên mạt bụi nhà để điều trị.
Việt Nam là nớc có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nắng, nóng, có độ ẩm cao.
Đây là điều kiện thuận lợi cho mạt bụi nhà phát triển, đặc biệt đối với loài phổ
biến nh D. pteronyssinus.
Do đó việc nghiên cứu tách chiết d nguyên mạt bụi nhà D.
pteronyssinus để có thể ứng dụng vào thực tế y học nớc ta là một yêu cầu cấp
thiết và có ý nghĩa khoa học.

Chúng tôi tiến hành đề tài :
Nghiờn cu quy trỡnh tỏch chit v iu ch D nguyờn mt bi nh
Acarien D.pteronyssinus ti Vit nam
.
Với mục tiêu:
- So sánh các phơng pháp điều chế dị nguyên tại Việt nam.
- Xây dựng một quy trình điều chế dị nguyên có hiệu quả cao.
3

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. TÌNH HÌNH CÁC BỆNH DỊ ỨNG VÀ VAI TRÒ CỦA CÁC DỊ
NGUYÊN
Ngày nay, dị ứng học đã trở thành một lĩnh vực quan trọng của y học
không chỉ bởi người ta ngày càng tìm ra nhiều bệnh có cơ chế dị ứng: hen phế
quản, viêm mũi dị ứng, mày đay, phù Quinke, dị ứng thuốc, xơ cứng bì mà
còn do tỷ lệ người mắc bệnh dị ứng ngày càng gia tăng [1], [8].
Các thống kê dịch tễ
học gần đây ở trong và ngoài nước cho thấy, các
bệnh dị ứng đường hô hấp trên - chủ yếu là VMDƯ và hen phế quản (HPQ)
chiếm tỷ lệ từ 10-15% dân số, tương ứng với 2,5% - 3,5% tổng số người bệnh
đến khám bệnh ở mọi chuyên khoa và chiếm một phần đáng kể trong kinh phí
dành cho y tế .
- Thụy Điển: 25,87% VMDƯ; 8,1% HPQ.
- Na Uy: 24,95% VMDƯ; 8,51% HPQ.
- Việt nam : 15 - 20% VMDƯ; 5 - 7 % HPQ.
- Một số
nước Đông Nam Á: VMDƯ ở Thái Lan: 38,63%; Singapore:
39,58%; Indonexia: 41,45% [9], [11], [14], [28], [32], [41], [44].

Giống như phần lớn các môn hóa sinh, lịch sử thuật ngữ dị nguyên quay
trở về thời gian khi các dị nguyên phân lập được bằng cách sử dụng một số kỹ
thuật tách sinh hóa "kinh điển", và phần hoạt tính (phần lớn có tính dị nguyên)
thường được đặt tên theo ý nghĩ chợt nảy ra của nhà nghiên cứu. Đã có những
cố gắng sớm để
tinh lọc dị nguyên phấn hoa và dị nguyên mạt bụi nhà, sử
dụng chiết phenol, kết tủa muối và các kỹ thuật điện di trong những năm
1940-1950. Trong những năm 1960, sự trao đổi ion và môi trường lọc trong
gel đã được đưa vào sử dụng, và dị nguyên đầu tiên được tinh lọc là "kháng
4

nguyên E" của cỏ phấn hương. Dị nguyên này được King và Norman đặt tên
vì nó ở một trong năm phân đoạn kết tủa (đánh dấu từ A đến E).
Đỉnh cao phát triển đầu những năm 1970 là những nghiên cứu về các kháng
nguyên của Marsh, mô tả các tính chất phân tử của các dị nguyên, các yếu tố
ảnh hưởng đến tính dị nguyên, đáp ứng miễn dịch với dị nguyên, và các
nghiên cứu miễn dịch di truy
ền của đáp ứng IgE với các dị nguyên phấn hoa
tinh lọc. Những nghiên cứu đầu tiên của Marsh định nghĩa rõ ràng về một dị
nguyên "chính" là một dị nguyên tinh khiết cao gây đáp ứng test da tức thì ở
> 90% bệnh nhân có đáp ứng test da. Hiện nay, nói chung một dị nguyên
chính là dị nguyên mà hơn 50% bệnh nhân dị ứng phản ứng với nó.
Một dị nguyên chính thường có các tiêu chuẩn sau:
1. Tỷ lệ mẫn cảm > 80% (>2 ng IgE đặ
c hiệu dị nguyên/mL) ở một quần
thể lớn bệnh nhân dị ứng.
2. Một tỷ lệ đáng kể IgE toàn phần (>10%) có thể là đặc hiệu dị nguyên.
3. Sự hấp thu dị nguyên từ nguyên liệu nguồn làm giảm đáng kể hiệu
năng chiết xuất.
4. Sự hấp thu huyết thanh bằng dị nguyên tinh khiết làm giảm đáng kể

IgE đặc hiệu với chiết xuất d
ị nguyên.
5. Dị nguyên chiếm một tỷ lệ đáng kể protein có thể chiết xuất được
trong chất liệu nguồn.
6. Có thể sử dụng dị nguyên làm một dấu hiệu đánh giá tiếp xúc môi
trường.
7. Có thể đo được cả đáp ứng kháng thể và đáp ứng tế bào với dị nguyên
trong một tỷ lệ cao bệnh nhân dị ứng.
8. Dị nguyên đã chứng tỏ hi
ệu quả như một phần của một vacxin dị ứng.
Tài liệu trên thế giới thường xuyên được bổ sung bởi các sách hướng dẫn
xem xét toàn diện các vấn đề về dị ứng học. Người ta đang thảo luận các điều
kiện hình thành các loại tăng độ mẫn cảm khác nhau, các cách chẩn đoán,
5

điều trị và phòng các trạng thái dị ứng. Việc giải quyết những nhiệm vụ này
phụ thuộc đáng kể vào danh mục và chất lượng của các DN. Số lượng các tập
chuyên khảo nói về DN như một loại sinh phẩm không nhiều. Tuy nhiên,
những tiến bộ của dị ứng học ứng dụng, hóa miễn dịch và công nghệ sinh học
thường xuyên mở ra những triển vọ
ng mới đối với việc tạo nên các chế phẩm
DN. Việc nghiên cứu sâu các thành phần DN phối hợp với những kết quả
nghiên cứu lâm sàng cho phép tách các thành phần ít hoạt tính và để lại các
phân đoạn chính của DN [23], [25], [32], [41].
Thực tiễn y học đã sử dụng rộng rãi các chế phẩm DN được chiết xuất
bởi nước - muối để chẩn đoán xác định tác nhân gây bệnh dị ứng và đặc trị

bằng MDĐH. Việc mở rộng danh mục các DN đã dẫn tới sự cần thiết phải
tiến hành một số lượng lớn các mẫu thử nghiệm chẩn đoán trên da, kết hợp
với việc tăng số lượng bệnh nhân đã làm phức tạp công việc của ngành dị ứng

học. Ngoài ra đi đôi với việc dùng các chiết xuất nước - muối để ch
ữa bệnh
đôi khi gây nên các phản ứng quá mẫn tại chỗ, từng vùng và từng hệ thống ở
những người mẫn cảm cao, đặc biệt là khi sử dụng các mũi tiêm DN có nồng
độ lớn. Thời gian của đợt điều trị cũng là một vấn đề rất quan trọng đối với
bệnh nhân, đòi hỏi các bác sĩ lâm sàng phải mất nhiều thời gian chăm sóc.
Chính vì vậy mà trong th
ời gian vừa qua đã có nhiều đề xuất về cấu trúc các
dạng DN mới. Ví dụ, với mục đích chẩn đoán, người ta đã áp dụng các hệ
thống hấp thu DN bằng phóng xạ RAST (Radio Allergosorbent Test) và
ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay). Trong nghiên cứu các thể
DN điều trị, một trong những xu hướng được chú ý là biến đổi những KN làm
mất đi khả năng phản ứng với những kháng thể đặc hiệu loạ
i IgE mà vẫn duy
trì hoạt tính miễn dịch (hình thành trong cơ thể các kháng thể bao vây loại
IgG). Đã có dự tính sử dụng các kháng nguyên với nồng độ nhỏ nhất để chữa
bệnh bằng cách nối chúng với các chất kích thích miễn dịch không đặc hiệu
[48], [53], [54], [55], [63], [64], [65].
6

Việc sử dụng an toàn và có hiệu quả các seri DN khác nhau ở một mức
độ đáng kể tùy thuộc vào việc tiêu chuẩn hóa chúng và phương pháp kiểm tra
chất lượng. Trong các công trình điều chế và tiêu chuẩn hóa DN của Việt
Nam, chúng tôi sử dụng phương pháp điều chế DN theo dạng nước - muối.
Chúng tôi cố gắng phản ánh đầy đủ tình hình hiện nay trong lĩnh vực nghiên
cứu và điều chế DN nói chung, đặc biệt là DN
D.pteronyssinus, phát hiện các
đặc điểm lý-hóa, miễn dịch và ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị GMCĐH
[9], [11], [15], [39], [40], [63], [83], [93].
1.2. MẠT BỤI NHÀ DERMATOPHAGOIDES PTERONYSSINUS

1.2.1. DỊ NGUYÊN MẠT BỤI NHÀ D.PTERONYSSINUS
Mạt bụi nhà (tiếng Anh - house dust mites, tiếng Pháp - les acariens)
được nhà da liễu Scheremetevsky (Nga) phát hiện năm 1876, Bogdanov (Nga
1894) mô tả dưới tên Dermatophagoides scheremetewskji. Sau đó, các nhà
nghiên cứu ở châu Âu thấy Dermatophagoides pteronyssinus mà đôi khi gọi
chúng là những con mạt nhỏ (Microacariens) ở trên giường, mặc dù chúng
sống cả ở trong vải bọc gỗ mềm, tấm thảm và các đồ đạc có vải bọc khác [9],
[22], [25], [43], [47], [68].
Tình hình nghiên cứu nước ngoài
Kern (1921), Cooke, Storm van Leeuven (1922) phát hiện phản ứng da
dương tính với dịch chiế
t bụi nhà có mạt trong đó ở các bệnh nhân dị ứng.
Năm 1925, Varekamp đã thu nhận được chế phẩm từ dịch chiết mạt và
thử nghiệm trong lâm sàng dị ứng. Tác giả đã chỉ ra vai trò của MBN trong
việc gây bệnh dị ứng nhưng chưa khẳng định được tính KN chủ yếu của
chúng trong thành phần của bụi nhà. Tuy nhiên, mối quan tâm rộng rãi tới
nguồn DN gây cảm ứng bệnh chỉ
được thể hiện trong nửa sau của thế kỷ XX.
Năm 1964, Voorhorst và cộng sự nhận thấy rằng mạt Dermatophagoides
(Bogdanov, 1894) có mặt trong bụi nhà là nguyên nhân gây HPQ; Voorhorst
và cộng sự (1969) kết luận rằng Dermatophagoides pteronyssinus
7

(Trouessart, 1897) l ngun DN ch yu gõy bnh c a d ng do bi nh.
Cỏc tỏc gi ó chng minh s ph thuc trc tip ca tn s phn ng vi ch
phm bi nh cỏc bnh nhõn vo bóo hũa mt trong bi nh. Trong
nghiờn cu ny, ngi ta ó x lý c bit mt trong cỏc phn bi c thu
thp vựng nỳi cao Thy S vi s l
ng mt khụng ỏng k, sau ú lm cho

tt c mt u cht. Tip theo chia nguyờn liu lm 2 phn, ri a mt lng
nh mt sng vo 1 trong 2 phn ú. C 2 phn nguyờn liu gi trong iu
kin ti u cho mt sinh sn trong 3 thỏng. Sau ú tỏch chit DN theo cựng
mt k thut. Kt qu cho thy ch phm tỏch chit t phn cú mt bi nh
s
ng cú hot tớnh KN mnh gp 100 ln. Nghiờn cu ny ó khng nh c s
tỏc dng gõy d ng ca bi nh l D. pteronyssinus. T ú cỏc nh nghiờn
cu hng vn d ng vo MBN [9], [10], [11], [16], [18], [25], [47].
Hng lot cỏc cụng trỡnh nghiờn cu ca cỏc tỏc gi khỏc trờn th gii ó
chng minh chớnh MBN, c bit l loi D. pteronyssinus - thnh phn quan
trng nht ca bi nh quyt nh hot tớnh KN ca nú v cho rng DNBN ch
mang tớnh KN khi cú m
t trong bi [9], [11], [25], [43], [79].


Hỡnh 1.1. Mt D. pteronyssinus
Tỡnh hỡnh nghiờn cu trong nc
Nhận thức đợc vai trò quan trọng của dị nguyên trong chẩn đoán và điều
trị, ở Việt nam ngay từ những năm 1982 các nghiên cứu của Nguyễn Năng
An, Nguyễn Văn Hớng và Vũ Minh Thục về việc điều chế dị nguyên là mục
8

tiêu quan trọng hàng đầu giúp cho việc chẩn đoán và điều trị miễn dịch đặc
hiệu bằng dị nguyên nhằm giảm thiểu sự gia tăng các bệnh dị ứng: HPQ,
VMDƯ, Viêm kết mạc Trong nớc, các nghiên cứu từ năm 1980 đến năm
2003 của nhiều nhóm tác giả [2, 6, 8] mới chỉ dừng lại ở dị nguyên bụi nhà
toàn phần, dị nguyên lông vũ, dị nguyên bụi bông. Sự khẳng định của các
công trình khoa học trên thế giới: thủ phạm chính gây nên HPQ, VMDƯ,
Viêm kết mạc do bụi nhà chính là Acarien D. pteronyssinus, hoạt tính kháng
nguyên của dị nguyên bụi nhà phụ thuộc chặt chẽ vào số lợng Acarien D.

pteronyssinus có trong bụi nhà. Bởi vậy, ngay từ những năm 90 các nhóm
nghiên cứu trong nớc đã hớng tới việc phân lập, nuôi cấy mạt bụi nhà D.
pteronyssinus nhng cha thành công do cha nghiên cứu đợc các môi
trờng nghiên cứu cho mạt bụi nhà D. pteronyssinus tồn tại và phát triển. Đến
năm 2003, nhóm nghiên cứu của Labo Miễn dịch dị nguyên thuộc Bệnh viện
Tai Mũi Họng TW bớc đầu đã nghiên cứu thành công một số môi trờng
nuôi cấy đã điều chế dị nguyên D. pteronyssinus từ các môi trờng này và
bớc đầu thử nghiệm trong chẩn đoán và điều trị miễn dịch đặc hiệu trong
VMDƯ đã cho kết quả hết sức khả quan từ 75-85%. Trên cơ sở những kết quả
nghiên cứu ban đầu rất đáng khích lệ này, nhóm nghiên cứu chúng tôi hy vọng
rằng đợc thực hiện đề tài này nhằm xây dựng và hoàn thiện quy trình công
nghệ sản xuất vắc xin dị nguyên D. pteronyssinus để phục vụ công tác dự
phòng chẩn đoán và điều trị bệnh dị ứng: HPQ,VMDƯ, Viêm kết mạc do dị
nguyên D. pteronyssinus tại Việt Nam.
1982 : Nguyễn Năng An, Nguyễn Văn Hớng, Vũ Minh Thục v.v nghiên
cứu về bụi nhà toàn phần.
1987 : Vũ Minh Thục, Nguyễn Năng An, Nguyễn Chí Phi : Nghiên cứu
về thành phần hóa sinh miễn dịch của dị nguyên bụi nhà.
1990 : Vũ Minh Thục : Nghiên cứu về vai trò của mạt bụi nhà trong bệnh dị
ứng (Luận văn PTS).
1993 : Nguyễn Văn Hớng và CS nghiên cứu về : Điều chế, tiêu chuẩn
hóa và ứng dụng trong lâm sàng của dị nguyên bụi nhà toàn phần.
1996 : Nguyễn Năng An, Vũ Minh Thục, Phan Quang Đoàn, Lê Văn
Khang, nghiên cứu độ mẫn cảm của dị nguyên bụi nhà và hiệu quả điều trị của
chúng.
9

2001 : Vũ Minh Thục, Phạm Quang Chinh, Lu Tham Mu nghiên cứu
điều tra 2 loài mạt bụi nhà gây bệnh dị ứng: D.pteronyssinus và G. domesticus
ở Hà Nội và các vùng phụ cận.

2002 : Vũ Minh Thục, Phạm Quang Chinh, Đái Duy Ban : Nuôi cấy mạt
bụi nhà D.pteronyssinus tạo nguồn dị nguyên góp phần chẩn đoán và điều trị
bệnh dị ứng do mạt bụi nhà.
ở nớc ta, theo công trình nghiên cứu của Vũ Minh Thục (1990) thấy rằng
Glycyphacus domesticus và Dermatophagoides pteronyssinus là 2 loài D.
pteronyssinus phổ biến nhất ở Hà Nội. Tần số phát hiện chúng trong các mẫu
bụi tơng ứng là 89,09% và 43,64%, tỷ lệ trên tổng số D.pteronyssinus tơng
ứng là 42,3% và 49,0%. Số lợng của chúng trong 1g bụi trung bình là
332,76163,1 và 385,24220,38 con [4].
Tầm quan trọng của việc nuôi cấy D. pteronyssinus là để chủ động tạo
nguồn dị nguyên phục vụ cho việc điều chế, tạo các chế phẩm thơng mại - chế
phẩm vacxin chống dị ứng (sản phẩm công nghệ sinh học) để ứng dụng trong
chẩn đoán và điều trị cho bệnh nhân dị ứng do mạt bụi nhà D.pteronyssinusở
Việt nam.
Việc sử dụng an toàn và có hiệu quả các seri dị nguyên khác nhau ở một
mức độ đáng kể tùy thuộc vào việc tiêu chuẩn hóa chúng và phơng pháp
kiểm tra chất lợng. Trong các công trình điều chế và tiêu chuẩn hóa dị
nguyên của Việt Nam, chúng tôi sử dụng phơng pháp điều chế dị nguyên
theo dạng muối nớc. Chúng tôi cố gắng phản ánh đầy đủ tình hình hiện nay
trong lĩnh vực nghiên cứu và điều chế các dị nguyên nói chung, đặc biệt là dị
nguyên D. pteronyssinus phát hiện các đặc điểm lý-hóa, miễn dịch của chúng
để ứng dụng chúng trong chẩn đoán và điều trị miễn dịch đặc hiệu bằng dị
nguyên.

1.2.2. VAI TRề CA MT BI NH TRONG BNH D NG
Khi bn hỳt bi, quột, lm sch bi nh v sinh nh ca (hoc cú mt
trong lỳc ú) m bn b chy nc mi, nga mi v ht hi tng hi, thỡ cú
th l bn ó d ng vi mt cht no ú trong bi nh. Thnh phn chớnh
10

xác nào gây ra dị ứng cho bạn có thể được khẳng định bằng phản ứng thử dị
ứng tiến hành trên da, hoặc bằng phản ứng huyết thanh của bạn [9], [10], [25].
Nếu bạn bị dị ứng với bụi nhà thì những triệu chứng của bạn thường
xuất hiện cả trong hoặc ngoài nhà, ở trong nhà thường tệ hơn ngoài trời, và
càng ở lâu trong nhà thì lại càng bị nặng hơ
n. Thường thì các triệu chứng dị
ứng với bụi thể hiện một cách xấu nhất vào lúc sáng, khi ngủ dậy. Ngủ trên
một cái giường bẩn hoặc một cái đệm bẩn thì có thể góp phần làm xuất hiện
các triệu chứng, cũng như nằm ngủ dưới quạt trần hay quạt quay đi quay lại
một cách giao động khiến cho bụi trong nha bay quanh quẩn trong không khí
khi bạn đi ngủ. Những triệu ch
ứng do một chất nào đó trong bụi nhà gây ra sẽ
giảm đi hoặc sẽ mất đi khi bạn đi nghỉ, và sẽ trở nên tồi tệ khi bạn hết kỳ
nghỉ trở về nhà [1, 4, 5, 15].
1.2.2.1. Mạt bụi nhà với bệnh dị ứng đường hô hấp
MBN là nguồn DN quan trọng và rất phổ biến trên thế giới. Mẫn cảm dị
ứng với MBN chiếm 10 – 20% dân số, nhưng biên độ
dao động rất lớn, từ 8 –
40%. Theo Dutau, MBN chiếm 60 – 70% nguyên nhân gây dị ứng đường hô
hấp và tỉ lệ mẫn cảm tăng lên theo tuổi: 11,4% dưới 2 tuổi; 25% từ 2 đến 6
tuổi; 59,1% trên 6 tuổi; 70% trên 16 tuổi. Loại mạt thường gặp trong các mẫu
bụi là D. pteronyssinus và D. farinae, bản chất dị nguyên của chúng là enzym
proteaza [1], [8], [9], [10], [20], [25], [28].
Mức độ mẫn cảm với MBN thường cao, do đó các dịch chiết mạt thậm
chí ở n
ồng độ thăm dò 10
-7
có thể gây phản ứng tại chỗ lẫn các phản ứng toàn
thân và phản ứng ổ có biểu hiện. Tuy nhiên, cần phải nhận thấy rằng bụi nhà
khác nhau có thể khác nhau về độ bão hòa mạt. Khi phân tích gần 300 mẫu

bụi từ các căn hộ bệnh nhân HPQ, mạt được phát hiện ở 30,6% số mẫu bụi.
Mạt xâm nhập cơ thể bằng con đường hít. Người ta phát hiện chúng ở da, đôi
khi ở
trong nước tiểu và chỗ ẩm ướt [41], [43], [44], [52], [54].
11

Đối với bụi nhà, MBN chiếm hơn 70% tính dị ứng nguyên. Vì vậy người
ta đặt vấn đề xem xét lại thuật ngữ “dị ứng với bụi nhà”.
Theo Pepys và cộng sự, tần số phát hiện D. pteronyssinus trong các mẫu
bụi nhà là hơn 80%.
Nhiều nhà nghiên cứu đã phát hiện thành phần khu hệ mạt nhà ở và tỉ lệ
dị ứng do MBN ở các khu vực khác nhau và nhận thấy rằng D. pteronyssinus
là loài mạ
t có hoạt tính gây dị ứng cao phổ biến nhất, chiếm từ 70 – 98% tổng
số mạt phát hiện được. Thành phần hệ MBN phụ thuộc nhiều yếu tố khác
nhau, chẳng hạn như mùa, vị trí địa lý, đặc điểm khí hậu, điều kiện xã hội và
sinh hoạt [1, 19, 56, 57, 59, 73, 74].
Một số nghiên cứu nhận thấy rằng, phụ thuộc vào điều kiện sống của
bệ
nh nhân hoặc các đặc điểm nghề nghiệp của họ mà có những phản ứng dị
ứng khác nhau với các loài mạt khác nhau.
MBN là nguyên nhân gây các bệnh HPQ, viêm mũi, viêm kết mạc dị
ứng. Ngoài ra, chúng còn là căn nguyên của bệnh mày đay mạn tính, viêm da
dị ứng. Nhiều nhà nghiên cứu đã xác nhận mối liên hệ của các bệnh dị ứng kể
trên với mạt D. pteronyssinus.
Tỉ lệ mạt trong bụi nhà là yếu tố
bệnh căn của HPQ và các bệnh khác,
dao động lớn và phụ thuộc vào điều kiện địa lý-khí hậu. Ở nước có khí hậu
duyên hải ẩm, sự mẫn cảm với DN D. pteronyssinus chiếm 70 – 100% số
trường hợp bệnh nhân HPQ dị ứng. Ở nước có khí hậu lục địa khô, tỉ lệ này

thấp hơn và dao động từ 14,1 đến 43,2% [1], [9], [10], [11], [20], [22], [25].
Tovey và cộng sự đã chứng minh các mẫu phân mạ
t cũng là một nguồn
DNBN quan trọng. Kanchurin và cộng sự nhận thấy về hoạt tính, phân mạt
không khác so với các chế phẩm từ cơ thể mạt. Việc sử dụng ức chế RAST
của Stewart và cộng sự đã cho thấy hoạt tính tiềm tàng của dịch chiết mạt
nguyên vẹn cao hơn 3 lần so với dịch chiết từ vỏ cuticul của chúng hoặc từ
môi trường nuôi cấy chúng [1], [32], [43], [46], [65].
12

Ở các nước khác nhau, có 14 - 100% số bệnh nhân dị ứng cho thử
nghiệm da dương tính với DN mạt Dermatophagoides sp. do đó ở các nước
trên thế giới, đang tiến hành nghiên cứu vấn đề dị ứng với MBN.
Sự mẫn cảm với DN mạt xảy ra chủ yếu bằng đường mũi. Khi giũ đồ trải
giường, quét dọn phòng, các DN mạt lọt vào đường hô hấp. Lúc này những
thành phần m
ạt khô và bị hủy hoại bay lên và được hít vào cùng với không
khí. Hoạt tính của DN mạt tỉ lệ thuận với thành phần mạt trong nó. Khi giảm
hoặc loại trừ được MBN khỏi môi trường chung quanh bệnh nhân, tính phản
ứng của phế quản giảm, mức KT đặc hiệu IgE giảm, IgG tăng, tình trạng của
bệnh nhân được cải thiện [1], [80], [82].
Tính đặc hiệu DN của các loại bụi khác nhau là một vấn đề rấ
t quan
trọng. Ado cho rằng bụi nhà có tính chất DN đặc hiệu.
Có tác giả cho rằng có thể sử dụng các DNBN nguồn gốc khác nhau để
chẩn đoán dị ứng với bụi nhà. Tác giả đã dùng DN từ bụi phân lập ở nước họ
(Mỹ) để nghiên cứu dị ứng đối với bụi ở bệnh nhân của nước khác (Đức). Kết
quả cho thấy 69,1% số trường hợp có kế
t quả thử nghiệm da dương tính với
các DN này. Tuy nhiên, cho đến nay chưa có ý kiến thống nhất về khả năng

sử dụng DNBN chuẩn để phát hiện bệnh dị ứng ở các nước. Vấn đề này rất
quan trọng đối với dị ứng học thực hành, đặc biệt, nếu chú ý đến ý kiến của
Ado cho rằng bụi có tính đặc hiệu đối với từng bệnh nhân. Khi nghiên cứu
tính chất DN của bụi có nguồn gốc khác nhau, Ado và cộng sự nhận thấy ý
nghĩa của “bụi cá nhân” trong bệnh sinh HPQ.
Nhiều tác giả cho rằng ngoài con đường hít còn có thể có con đường tổn
thương do tiếp xúc với mạt D. pteronyssinus. Chẳng hạn, các nhà nghiên cứu
Nhật Bản chỉ ra rằng giống mạt Dermatophagoides có thể đóng vai trò bệnh
sinh của mày đay. Các tác giả đã tiến hành thử nghiệm dưới da với DN D.
pteronyssinus và D. farinae ở 138 bệnh nhân mày đay mạn tính. Đã phát hiện
phản ứng dương tính với D. pteronyssinus ở 37 bệnh nhân (26,8%), còn với
13

D. farinae – ở 68 bệnh nhân (40,3%). Titova và cộng sự, Kanchurin,
Vaitsekauskaite đã chỉ ra vai trò của mạt trong bệnh căn mày đay, chứng
minh sự mẫn cảm với D. pteronyssinus ở những bệnh nhân mày đay bằng các
thử nghiệm da và phản ứng phân hủy tế bào mast gián tiếp.
Đã có những tài liệu nói về vai trò bệnh căn của MBN trong các bệnh da
dị ứng của người như viêm da dị ứng và viêm da thần kinh.
Kể từ
khi Voorhorst R (1964) chỉ ra vai trò của MBN trong việc phát
sinh HPQ dị ứng, đến nay nhờ tạo ra được các KT đơn dòng người ta đã đo
được số lượng DN trong môi trường sống, mức độ DN có thể gây mẫn cảm
cũng như mức độ DN dẫn đến xuất hiện triệu chứng bệnh lý.
Các hạt phân của mạt chứa phần lớn DN Der p I, có kích thước trung
bình 20 µm, trong đó 4% Der p I có kích thước dưới 5 µm có th
ể được hít
thẳng vào phổi. DN MBN có hoạt tính enzym, do đó làm tăng tính thấm của
hàng rào biểu mô đường hô hấp. Các phần tử DN này có nhiều trong bụi của
vải bọc nệm giường, chăn, gối, thảm Khi quét dọn hoặc giũ các đồ đạc trên,

chúng lơ lửng trong không khí khoảng 20 – 30 phút. Đối với DN có kích cỡ
lớn sẽ bị giữ lại ở niêm mạc mũi, còn DN có kích cỡ nhỏ đi thẳng vào phổi.
Tại các nơi đó, DN sẽ gây nên bệnh cảnh lâm sàng.
Phần lớn các báo cáo đều cho thấy mức độ DNBN gây mẫn cảm là 2
µg/g bụi mịn (tương đương số mạt hơn 100 con/g) và mức độ gây xuất hiện
triệu chứng bệnh lý là 10 µg/g bụi mịn (tương đương hơn 500 con/g).
Theo Platts-Mills và cộng sự, liều 2 µg/g bụi mịn của Der p I gây mẫn
cảm, còn Dreborg chỉ ra liều 10 µg/g b
ụi mịn gây cơn hen cấp ở người mẫn
cảm. Nghiên cứu của Sporile và cộng sự ở Anh cho thấy nồng độ DN mạt
trong bụi nhà của những đứa trẻ bị hen cao hơn nồng độ DN ở nhà những đứa
trẻ khỏe mạnh. Trẻ sơ sinh nếu sớm tiếp xúc với môi trường có nồng độ hơn
10 µg Der p I /g bụi sẽ xuất hiện bệ
nh hen trong 10 năm đầu.
14

Mức độ biểu hiện bệnh cảnh lâm sàng của cá nhân có cơ địa mẫn cảm
(atopy) tiếp xúc với môi trường có DN phụ thuộc vào các yếu tố:
+ Độ mẫn cảm của từng cá nhân. Liều lượng chung gây mẫn cảm và
biểu hiện dị ứng là 2 - 10 µg/g, một vài nghiên cứu cho thấy với liều DN mạt
từ 1 – 2 µg/g đã gây mẫn cảm ở một số trẻ
nhỏ. Ở môi trường có nồng độ DN
thấp chỉ có cơ địa rất mẫn cảm mới thể hiện, môi trường có mức độ DN cao
thì ngay cả người có cơ địa mẫn cảm yếu có thể bộc lộ triệu chứng của bệnh.
+ Thời gian tiếp xúc. Với liều DN thấp nhưng nếu tiếp xúc hàng ngày,
thường xuyên cũng làm xuất hiện triệu chứng ở
người mẫn cảm. Nghiên cứu
của Ihre và cộng sự cho thấy nếu hít hàng ngày trong 1 tuần với liều DN rất
thấp (dưới 1 mg/ngày hoặc dưới 1 pg/phút) sẽ tăng phản ứng phế quản.
Mức độ DN mạt trong không khí thay đổi theo mùa và ảnh hưởng bởi sự

thông khí, nhiệt độ, độ ẩm nên mức độ mẫn cảm và triệu chứng của bệnh
cũng thay đổi theo.
Ở nước ta, theo Nguyễ
n Năng An , Nguyễn Văn Hướng, Vũ Minh Thục,
dị nguyên mạt bụi nhà chiếm vị trí lớn trong bệnh căn HPQ, Viêm mũi dị ứng
và nhiều bệnh dị ứng khác. Các nghiên cứu trong nước đã chú ý tới vai trò
mạt thuộc họ Pyroglyphidae, trong đó D. pteronyssinus – một loài MBN
thường gặp ở nước ta có ý nghĩa to lớn. Có thể là do độ ẩm không khí cao gần
như quanh năm, số ngày sương mù nhiều, nhiệt độ
trung bình hàng năm
tương đối cao đã tạo điều kiện thuận lợi cho mạt phát triển ở nước ta và làm
cho vấn đề dị ứng với MBN ngày càng trở nên quan trọng. Tuy nhiên, các
công trình nói trên mới chỉ đánh dấu bước khởi đầu trên con đường nhận thức
vai trò của MBN trong bệnh căn và bệnh sinh của các bệnh dị ứng ở nước ta.
1.2.2.2.Vai trò của dị nguyên mạt trong cơ chế bệnh lý (quá mẫ
n typI)
a. Cái gì trong bụi nhà đã gây ra dị ứng:
Một cuộc tranh cãi đã nổ ra trong nhiều năm tại nhiều phòng thí nghiệm
trên thế giới là chỉ một chất kháng nguyên đặc biệt duy nhất có trong bụi nhà
15

gây ra dị ứng, hoặc triệu chứng do dị ứng gây ra có thể quy cho một trong
những chất đã được thừa nhận là có trong bụi đáng nghi ngờ nhất, đó là
những con mạt trong bụi nhà. Tuy nhiên, mọi thành phần trong bụi nhà đều có
thể là nguyên nhân của những triệu chứng, các loại côn trùng khác và phân
của chúng, nhất là con gián, cũng như những mảnh vụn ở lông, da của các con
vật nuôi trong nhà (chó và mèo). Thật là không may vì nhiều người có cơ
địa
dị ứng lại thường dễ bị cảm ứng với nhiều thành phần trong bụi nhà của họ.
Họ có thể phản ứng với mạt bụi nhà, bào tử nấm, phấn hoa và nước tiểu của

mèo [9], [11], [77], [78], [79], [80].
b. Thành phần nào của mạt bụi nhà gây ra dị ứng:
Người bị dị ứng với hạt tròn phân mạt. Một con mạt sản ra một lượng
khoả
ng 200 lần trọng lượng cơ thể nó, hạt tròn phân mạt chứa tiềm năng gây
dị ứng cao chỉ có trong thời gian ngắn ngủi của cuộc đời nó. Khi thải ra
ngoài, được không khí mang đi khi các vật dùng như thảm đệm, các đồ
đạc.v.v bị xáo lộn. Với kích thước siêu nhỏ (phải nhìn qua kính hiển vi mới
thấy) những tiểu thể trên rất dễ hít vào mũi và phổi, ở đó nó làm khởi phát
triệu ch
ứng dị ứng, mật độ quần thể bọ sống trong nhà quyết định mức độ
vấn đề mà bạn phải đương đầu với những tiểu thể phân chúng. Mặc dù xác
những con bọ chết có thể được khống khí mang đi, nhưng chúng không góp gì
đáng kể cho việc bị dị ứng với MBN [77], [78], [79], [80], [82].
c. Cơ chế bệnh lý
+ Giai đoạn mẫn cảm: DN lầ
n đầu tiên xâm nhập vào cơ thể mẫn cảm
tạo ra các kháng thể IgE đặc hiệu với DN (chưa có biểu hiện lâm sàng).
+ Giai đoạn tức thì: xảy ra trong 10 – 15 phút khi cơ thể tiếp xúc lại với
DN đã gây mẫn cảm. Các triệu chứng như hen, ngạt mũi là do kết quả gắn
kết giữa IgE và DN làm hoạt hóa tế bào mast ở niêm mạc mũi. Các chất trung
gian hóa học giải phóng ra từ các hạt trong t
ế bào như histamin, tryptaza. Các
chất trung gian mới hình thành có nguồn gốc từ màng tế bào như leucotrien,
16

prostaglandin. Các chất trung gian có nguồn gốc lipit như yếu tố hoạt hóa tiểu
cầu cũng xuất hiện. Các chất này gây giãn mạch, tăng tính thấm thành mạch
dẫn đến phù nề, ngạt mũi. Các tuyến nhầy mũi tăng tiết. Các dây thần kinh
hướng tâm bị kích thích làm ngứa mũi, hắt hơi. Các chất trung gian, đặc biệt

là histamin, kích thích sợi thần kinh hướng tâm và sợi trục giải phóng các
nơropeptit tại chỗ (chấ
t P và tachykinin). Những chất này lại kích thích tế bào
mast thoát hạt. Ngoài ra, DN làm lympho bào T (CD4+Th0) hoạt hóa thành
lympho T (CD4+Th2).
+ Giai đoạn muộn: xảy ra từ 2 – 48 giờ. Đáp ứng tế bào chiếm ưu thế do
sự tương tác giữa các tế bào dưới ảnh hưởng của các cytokin. Tính chất đặc
trưng của HPQ, VMDƯ là sự tích tụ tại chỗ các tế bào viêm như lympho
TCD4, eosinophil, basophil, nơrophil. Trong đó, eosinophil giải phóng ra một
lượng rất lớn các protein cơ b
ản gây độc tế bào biểu mô đường hô hấp và sự
có mặt của các ion kích thích tế bào mast thoát hạt.
Các biểu hiện trên đều do các cytokin điều biến. Ngoài các tế bào
lympho T, cytokin còn tiết ra từ các tế bào mast, basophil, đại thực bào và tế
bào biểu mô. IL-4 kích thích lympho B tăng sản xuất IgE, tăng bộc lộ các
phân tử kết dính (ICAM) ở thành mạch để thu hút eosinophil đến mô tổ chức,
chuyển lympho Th0 thành lympho Th2, bộc lộ các thụ thể IgE có ái lực thấp
(CD23), ức ch
ế tạo thành IFNγ, kích thích tế bào mono biệt hóa thành tế bào
trình diện kháng nguyên. IL-13 kích thích lympho B sản xuất IgE, bộc lộ thụ
thể IgE có ái lực thấp (CD23), hoạt hóa tế bào nội mô bộc lộ phân tử kết dính
để thu hút các tế bào viêm tới tổ chức. IL-5 có đặc tính chọn lọc đối với
eosinophil, gồm kích thích biệt hóa và trưởng thành của các eosinophil từ tủy
xương, hoạt hóa các eosinophil và làm tăng thời gian sống của nó ở tổ chức.
17


Hỡnh 1.2. Vai trũ ca d nguyờn MBN trong c ch bnh lý
1.3. QUY TRèNH IU CH D NGUYấN
Nhận thức đợc vai trò quan trọng của các loại dị nguyên đối với bệnh dị ứng,

nhiều tác giả đã tiến hành nghiên cứu và công bố các kết quả trong việc điều chế dị
nguyên.
1.3.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu cho chiết xuất DN mạt có thể là cơ thể mạt thuần khiết hoặc
hỗn hợp nuôi cấy. Lần đầu tiên, Chapman đã tinh chế dị nguyên từ mạt D.
pteronyssinus nuôi cấy. Lind đã tinh chế và mô tả đặc điểm của hai dị nguyên
chính từ phân mạt D. pteronyssinus và từ hỗn hợp nuôi cấy chúng. Các tác giả
khác cũng tách chiết dị nguyên từ hỗn hợp mạt nuôi cấy [29]. Theo Ipsen và
cộng sự, lợi thế của dịch chiết hỗn hợp nuôi cấy là chứa tất cả những nguyên
liệu mà bệnh nhân dị ứng với mạt gặp phải trong môi trờng tự nhiên, trong
khi lợi thế của dịch chiết mạt thuần khiết (mạt đợc tách riêng) là tránh đợc
nhiễm các thành phần của môi trờng nuôi cấy. Dịch chiết hỗn hợp nuôi cấy
bao gồm các chất từ cơ thể mạt, trứng, ấu trùng, các hạt phân, các chất phân
hủy của mạt và cả các chất ô nhiễm của môi trờng nuôi cấy. Dịch chiết mạt
thuần khiết chỉ chứa các chất chiết xuất từ cơ thể mạt. Nồng độ tơng đối của
18

các DN nhóm 1 và 2 gắn liền với nguồn nguyên liệu. Theo Platts-Mills, dịch
chiết từ hỗn hợp nuôi cấy mạt chứa DN nhóm 1 nhiều hơn DN nhóm 2 (hơn
10 lần). Tuy nhiên, các thử nghiệm lâm sàng so sánh các dịch chiết dựa trên
hỗn hợp nuôi cấy và mạt thuần khiết cho thấy cả 2 kiểu dịch chiết có tác dụng
tơng tự trên hệ MD trong quá trình LPMD [25].
1.3.2. Tách chiết dị nguyên
Khi tách chiết dịch chiết DN phải chú ý dịch chiết không phải là một dung
dịch, trong đó có một lợng chất hoạt động nhất định hòa tan mới đánh giá
đợc những khó khăn về sau của chuẩn hóa. Quá trình này không đợc làm
biến tính protein DN, cũng không đợc làm thay đổi tỉ lệ giữa các thành phần
riêng. Sự chiết xuất cần phải thực hiện trong điều kiện (pH, lực ion) tơng tự
với trạng thái sinh lý và ngăn chặn sự thủy phân, sự phát triển của vi sinh vật.
Do đó, chiết xuất phải đợc thực hiện ở nhiệt độ thấp (cản trở sự thủy phân) và

có thể có các chất diệt khuẩn và diệt nấm [38, 40].
Khái niệm dịch chiết dị nguyên
Hơn 90 năm làm chúng ta xa dần các công trình cổ điển của Noon L (1911)
và Freeman I (1911) về thu nhận các dị nguyên từ phấn hoa thực vật để chẩn
đoán và điều trị bệnh nhân bị sốt cỏ khô. Đây là thời kỳ khi mà cha một nhà lý
thuyết và lâm sàng nào biết bản chất cơ sở hoạt tính của những chế phẩm họ sử
dụng. Các nghiên cứu của Coca A (1925) đã góp phần vào việc vạch ra phơng
pháp thu nhận dị nguyên. Trong những thông báo của ông có những dữ liệu còn
giữ nguyên giá trị cho đến ngày nay. Chẳng hạn, ông chỉ ra rằng nếu bản chất
của cơ chất gây dị ứng cha biết mà sử dụng phơng pháp xử lý thô nguyên liệu
là không hợp lý, nên hạn chế bởi chiết xuất đơn giản bằng dung dịch đệm hoặc
nớc. Để làm giàu các hợp phần có hoạt tính của dịch chiết, ông đa ra giai
đoạn cô đặc nguyên liệu trong thiết bị chân không ở nhiệt độ thấp. Coca A.
nhận thấy dịch chiết bình thờng chứa cả các sản phẩm không cần thiết để chẩn
đoán, do đó đề nghị tiến hành thẩm tách, bởi vì các hợp phần có hoạt tính gây
dị ứng lúc này không bị thẩm tách [58, 59].
Hai thuốc thử để thu nhận dị nguyên do Coca nghiên cứu ngày nay
vẫn đợc sử dụng:
Thứ nhất: là hỗn hợp muối đợc hòa tan trong 1 lít nớc cất, đáp ứng
19

đòi hỏi của dợc điển nh:
NaCl 500g
KH
2
PO
4
363g
Na
2

HPO
4
.12H
2
O 14,31g
Nớc cất (đun sôi trớc khi dùng để loại bỏ CO
2
) đến 1 lít.
Thứ hai: dung dịch nớc phenol 4%. Trong nghiên cứu của Coca, chúng
ta thấy cả phơng án bổ sung glycerol vào dịch chiết chính để ổn định hoạt
tính của chế phẩm. Theo các tài liệu, các dị nguyên trong hỗn hợp với glycerin
đựng trong lọ thủy tinh tối màu giữ đợc hoạt tính đến 7 năm. Ngày nay ngời
ta ít dùng dạng hỗn hợp với glycerin.
Công nghệ hiện đại thu nhận dị nguyên theo phơng pháp Coca gồm
7 giai đoạn chính:
1. Thu nhận nguyên liệu và chuẩn bị tách chiết. Đối với các dị nguyên
khác nhau giai đoạn chuẩn bị không giống nhau. Trong trờng hợp này,
nguyên liệu (bụi nhà) thu gom những thành phần có hoạt tính (mạt), trờng
hợp khác loại bỏ dầu mỡ.
2. Chiết xuất và lọc. Tiến hành chiết xuất trong điều kiện lắc. Đối với
phấn hoa thực vật hoàn thành quá trình này trong thời hạn ngắn hơn (2 ngày
đêm). Chiết xuất bụi nhà và biểu bì động vật có thể kéo dài đến 3 - 4 ngày
đêm. Tiến hành chiết ở nhiệt độ < nhiệt độ phòng để ngăn ngừa vi khuẩn phát
triển. Khử dầu mỡ nguyên liệu cũng làm giảm mức độ nhiễm khuẩn. Nếu kỹ
thuật dự tính khử dầu mỡ dịch chiết thì cho vào đệm chiết ete dietylic 1%, nó
sẽ bị loại bỏ trong quá trình làm đông khô. Khoảng thời gian giữa chiết xuất
và lọc cần phải tối thiểu. Dịch chiết đợc lọc hoặc quay ly tâm, phải có giá trị
pH 6,9 0,3.
Trên cơ sở thực tế phổ biến, các kết quả nghiên cứu của Kauffman H và CS
(1985) thật thú vị. Sau khi đánh giá điều kiện chiết xuất mạt bụi nhà trong

dung dịch đệm nhẹ, các tác giả đi đến kết luận liệu pháp chiết phải nhanh
chóng, không quá 1 giờ, bởi vì trong thời gian tiếp theo, mặc dù lợng sản
phẩm phong bế IgE tăng nhng hoạt tính của chúng giảm và lúc đó các chất
vô ích sẽ tích lũy.
3. Thẩm tách dịch chiết. Giai đoạn này loại bỏ các thành phần phân tử
20

lợng thấp, các sắc tố, sự có mặt của chúng là không mong muốn (có thể là những
phản ứng da không đặc hiệu và làm chậm sự hình thành phản ứng đặc hiệu). Khi
cần thiết nhờ thẩm tách mà làm tăng nồng độ protein trong dịch chiết DN.
4. Khử trùng dịch lọc. Dùng bộ lọc Zeits, nến gốm hoặc màng lọc. Lựa
chọn đúng điều kiện tiệt trùng có ý nghĩa lớn để đảm bảo protein toàn phần
mất mát ít nhất và giữ đợc tính đặc hiệu cơ chất.
5. ổn định dịch lọc. ở 42
0
C có thể bảo quản dịch lọc lâu dài (3-6 tháng)
với mục đích ổn định hoàn toàn tính chất vật lý của chúng.
6. Thu nhận chế phẩm. Hòa tan dịch lọc đến nồng độ yêu cầu và rót vào
lọ vô trùng. Đóng nút và ghi nhãn.
7. Kiểm tra độ vô trùng, độ độc, hoạt tính đặc hiệu và các tính chất lý
hóa sinh của chế phẩm
Năm 1942, Sutherland đã sử dụng phơng pháp hấp phụ DN trong axit
benzoic để điều chế DNBN. Bụi nhà sau khi sơ chế sẽ đợc chiết xuất trong
đệm photphat pH 6,9 rồi đợc tủa lại bằng axit benzoic. Ngời ta thêm axeton
vào cặn thu đợc sau khi lọc để hòa tan axit benzoic và đồng thời làm lắng
đọng DN. Để loại bỏ axit benzoic, sau khi ly tâm, DN đợc rửa bằng axeton,
etanol, ete. Chế phẩm đợc sấy khô trong chân không ở nhiệt độ phòng, rồi
hòa tan trong nớc và kết tủa lại bằng axeton 25 - 75%. Sau đó tiến hành thủy
phân với axit citric 2%. Quá trình này cũng đợc hoàn tất bằng cách kết tủa
DN bằng axeton [8, 59].

Trong kết quả nghiên cứu của mình đợc công bố vào năm 1957, Scoville
đã đa ra một quy trình chung để tách chiết các loại DN. Theo tác giả, nguyên
liệu để tách chiết DN đợc làm nhỏ và loại chất béo trớc giai đoạn chiết để
nâng cao hiệu quả chiết xuất. Để loại chất béo tác giả đã sử dụng một số dung
môi hữu cơ nh: ete, toluen, xylen Tác giả đã sử dụng các dung dịch đệm có
pH 8 để làm dung môi chiết. Sau khi đợc tinh chế, điều chỉnh tới nồng độ
thích hợp, dịch chiết đợc diệt khuẩn.
Richard Shough cũng đa ra một quy trình chiết xuất DN tơng tự Scoville
nhng có cải tiến đôi chút. Trong giai đoạn loại chất béo, tác giả đã sử dụng
hai loại đệm: đệm salin và đệm Coca mà thành phần chính là hệ đệm
photphat.
21

Nh vậy, các tác giả tuy đa ra phơng pháp khác nhau để tách chiết DN
nhng tất cả các phơng pháp này đều trải qua các giai đoạn chính, đó là: loại
chất béo, chiết xuất và tinh chế.
Thời gian cần thiết để thu nhận dịch chiết thờng khoảng giữa biến tính
của chế phẩm và sản lợng mong muốn. Khi nghiên cứu ảnh hởng của thời
gian chiết xuất đến việc tách các DN, Geissler và cộng sự nhận thấy các
protein, gluxit và các chất DN tách ra ngay nhng có động học không giống
nhau. Trong thời gian 48 giờ, các DN chính đợc tách ra không ngừng. Hoạt
tính gây dị ứng chung của dịch chiết đạt điểm cao sau 4 5 giờ chiết rút [57,
58].
Theo Ipsen và cộng sự, điều quan trọng là giảm thiểu các chất phi KN có
KLPT thấp 3000 đến 5000 Da khỏi dịch chiết cuối cùng. Có thể thực hiện
nhiệm vụ này bằng thẩm tách, siêu lọc hoặc sắc ký loại bỏ theo kích thớc.
Dịch chiết cuối cùng cần đợc bảo quản ở nhiệt độ duy trì hoặc giảm thiểu h
hỏng hoạt tính DN bằng cách làm đông khô dịch chiết hoặc cất giữ ở nhiệt độ
thấp (- 20
0

C đến 80
0
C), có thể có các chất làm ổn định (glyxerin, albumin
huyết thanh ngời). Môi trờng chiết xuất đợc sử dụng rộng rãi là hệ đệm
(pH 6 đến 9, lực ion 0,05 đến 0,2). Nói chung, dung môi khô nên hạn chế
dùng vì nguy cơ làm biến tính protein.
Mặc dù có nhiều phơng pháp thu nhận DN đợc đề xuất, nhng nhiều chi
tiết về tách chiết DN từ mạt không đợc mô tả, chẳng hạn, vấn đề tách KN
chủ yếu khỏi hỗn hợp môi trờng dinh dỡng, nhất là khi ngời ta dùng những
chất có hoạt tính KN (ví dụ móng ngựa) để nuôi mạt.
Từ những nguyên liệu dị nguyên gốc dịch chiết dị nguyên đợc điều
chế dới dạng dung dịch mẹ, từ đó chế ra dung dịch nớc để phục vụ cho chẩn
đoán và điều trị thể hiện bằng sơ đồ sau:
22


+ Có 2 “sơ đồ” sản xuất dù sử dụng một hoặc vài nguyên liệu DN:
- Hoặc sản xuất các dung dịch mẹ đông khô → từ đó chế ra dung dịch
nước và dung dịch tác dụng chậm được hấp phụ trên photphat canxi.
- Hoặc sản xuất các dung dịch mẹ tác dụng chậm được hấp phụ trên
hydroxit nhôm.
Phần lớn các dịch chiết DN thu được bằng chiết xuất nguyên liệu sinh
họ
c với dung dịch. Ví dụ NH
4
HCO
3
, NH
4
OH, các dung dịch muối photphat.

23

1.3.3. SƠ ĐỒ SẢN XUẤT (SƠ ĐỒ TỔNG QUÁT)
























Sơ đồ 1.1: Sơ đồ sản xuất

Cân nguyên liệu
Chiết xuất
Lọc trong
Lọc tiệt trùng
Kết tủa trên gel Al(OH)
3
Rửa gel
Ổn định gel
Phân chia
Đóng lọ, bọc nút
Dán nhãn
Dự trữ
Dung dịch mẹ đông khô Dung dịch mẹ (10.000 PNU/ml)
Đông khô
Đông khô