bài thực hành phương pháp phân tích môi trường

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG










BÀI THỰC HÀNH
PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MÔI TRƯỜNG
Giảng viên: ThS. Trần Nguyễn Vân Nhi

NHA TRANG 6/2013


Trang 1


BÀI 1: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TỔNG NITƠ TRONG ĐẤT
BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL
1. Mục đích
Nitơ là một trong những nguyên tố dinh dưỡng quan trọng của thực vật. Hầu hết
các nitơ trong đất đều ở dạng hữu cơ (95-99%), chỉ một phần ở dạng vô cơ (1-5%). Đa
số các đất, hàm lượng nitơ trong chất mùn chiếm khoảng 5% chất mùn. Cây trồng chỉ sử
dụng nitơ trong đất khi đã chuyển hoá thành dạng vô. Mức độ phân giải phụ thuộc vào
bản chất của dạng nitơ hữu cơ (nếu C/N càng cao, nitơ hữu cơ càng khó phân giải), vào
nhiệt độ, độ ẩm, pH…. của đất.
Nitơ tổng là một chỉ tiêu thường được phân tích để đánh giá độ phì nhiêu tiềm tàng
của đất. Để phân tích người ta thường phân huỷ chất hữu cơ chuyển nitơ thành dạng
amoni. Quá trình phân huỷ này có rất nhiều phương pháp khác nhau:
 Dùng H
2
SO
4
đặc kết hợp với chất xúc tác: phương pháp Kjeldahl
(Kjendahl,1883) dùng H
2
SO
4
đặc đun sôi với chất xúc tác là Selen hoặc
CuSO
4

.
 Dùng H
2
SO
4
đặc kết hợp với chất oxi hoá mạnh: Chiurin(1933) dùng
H
2
SO
4
đặc đun sôi với K
2
Cr
2
O
7
hay CrO
3
. Hay có thể kết hợp với KClO
4

và đun sôi (Ghinbuoc, Meseriacov, 1963).
Sau khi chuyển nitơ sang dạng amoni người ta dùng phương pháp chuẩn độ hoặc
so màu để xác định lượng nitơ tổng số trong đất.
2. Nguyên tắc
Khi cho chất hữu cơ tác dụng với acid sunfuric đậm đặc (H
2
SO
4 đđ
)

đun sôi với sự
có mặt của chất xúc tác (CuSO
4
.5H
2
O và K
2
SO
4
), cacbon và hidro của chất hữu cơ được
oxi hoá đến CO
2
và H
2
O, nitơ còn lại ở dạng khử và chuyển sang dạng amonium sunfat.
2CH
3
CHNH
2
COOH + 13H
2
SO
4
(NH
4
)
2
SO
4

+ 6CO
2
+ 16H
2
O + 12SO
2
Sau đó kiềm hóa sản phẩm phản ứng:
(NH
4
)
2
SO
4
+ 2NaOH 2NH
3
+ Na
2
SO
4
+ 2H
2
O
Rồi đem chưng cất và chuẩn độ lượng amoniac giải phóng ra:


Trang 2


NH
3

+ H
3
BO
3
NH
4
+
H
2
BO
3
-

2NH
4
+
H
2
BO
3
-
+ H
2
SO
4
(NH
4
)
2
SO

4
+ 2H
3
BO
3

3. Hóa chất, dụng cụ, thiết bị
3.1 Hóa chất:
Hoá chất:
- Nước cất 01 lần
- Acid Sunfuric đậm đặc (H
2
SO
4
đđ)
- Hỗn hợp xúc tác (CuSO
4
.5H
2
O và K
2
SO
4
); NaOH; H
3
BO
3
.
- Methyl đỏ và methyl xanh
- Ethanol 95%

- Acid sunfuric 0,05mol/L (H
2
SO
4
0,1N)
Pha hoá chất:
- Xúc tác gồm hỗn hợp CuSO
4
.5H
2
O và K
2
SO
4
được cân theo tỷ lệ 1: 5 trộn đều.
- NaOH 40%: hòa tan 400g NaOH trong nước và định mức thành 1L.
- H
3
BO
3
4%: hòa tan 40g H
3
BO
3
trong nước và định mức thành 1L.
- Chỉ thị Tashiro: hòa tan 2g methyl đỏ và 1g methyl xanh trong ethanol và định
mức thành 1000mL.
- Ethanol 95%: pha 950mL ethanol trong nước và định mức thành 1000mL.
- Acid sunfuric 0,05mol/L (H
2

SO
4
0,1N): pha ống chuẩn (H
2
SO
4
0,1N) và định
mức thành 1L.
3.2 Dụng cụ:
- Buret 25mL
- Ống đong 1000mL
- Bình định mức 25mL, 1000mL
- Bình tam giác 100mL.


Trang 3


3.3 Thiết bị:
- Hệ thống phá mẫu và chưng cất đạm bán tự động (Kjeldahl).
4. Cách tiến hành
4.1 Vô cơ hoá mẫu:
- Cân khoảng 0,5g đến 2,0g mẫu cho vào ống Kjeldahl có dung tích phù hợp
(thường 250 mL).
- Thêm một lượng chất xúc tác (CuSO
4
.5H
2
O và K
2

SO
4
) phù hợp khoảng 0,9g
đến 1,2g.
- Thêm 25 mL H
2
SO
4
đđ đối với gam chất khô đầu tiên của mẫu và thêm 6-12mL
cho mỗi gam chất khô tiếp theo. Trộn đều, đảm bảo đã làm ướt toàn bộ phần mẫu thử.
Đặt bộ ống Kjeldahl vào bộ phá mẫu.
- Cài đặt nhiệt độ và thời gian cho máy với tổng thời gian vô cơ hóa từ 3 – 4 giờ.
- Sau khi phá mẫu hoàn tất, chất lỏng trong bình trong và có màu xanh da trời nhạt.
Để nguội. Nếu thấy quá trình vô cơ hóa xuất hiện cặn rắn thì cho một ít nước cất vào rồi
lắc đều.
4.2 Chưng cất amoniac
- Đem mẫu đi chưng cất. Cài đặt thông số cho máy (dựa theo catalogue) như sau:
H
2
O : 2S
H
3
BO
3
: 3S
NaOH : 5S
- Thời gian chưng cất: 5 phút
- Nhỏ 3 giọt chỉ thị Tashiro vào bình hấp thu và tiến hành chưng cất mẫu.
4.3 Chuẩn độ
Chuẩn độ bằng H

2
SO
4
0,1N, ghi nhận điểm cuối khi chuyển từ màu xanh dương
sang mận chín. Đọc thể tích acid sunfuric tiêu tốn trên buret.
5. Kết quả
Hàm lượng nitơ của mẫu thử được xác định theo công thức sau:


Trang 4


W
N
= (V
1
– V
0
) * C *14 /m
Trong đó:
W
N
: Hàm lượng nitơ của mẫu (g/kg)
V
1
: Thể tích dung dịch H
2
SO
4
0,1N dùng để chuẩn độ mẫu thử (mL)

V
0
: Thể tích dung dịch H
2
SO
4
0,1N dùng để chuẩn độ mẫu trắng (mL)
C : Nồng độ của dung dịch H
2
SO
4
0,1N (mol/L)
14 : Khối lượng phân tử gam của nitơ (M = 14 g/mol)
m : Khối lượng của mẫu thử (g)
6. Câu hỏi
6.1 Giá trị chỉ thị của hàm lượng nitơ (%N) trong 6 nhóm đất chính của Việt
Nam được quy định như thế nào?
6.2 Cho biết công thức hóa học của phức chất màu xanh dương và màu mận
chín trong quá trình chuẩn độ?

Trang 5




BÀI 2: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CHẤT HỮU CƠ TRONG ĐẤT
THEO PHƯƠNG PHÁP CHIURIN
1. Mục đích
Sự tích lũy chất hữu cơ ở dạng mùn trong đất là do hoạt động vi sinh vật, thực vật
cũng như bón phân hữu cơ. Xác định chất hữu cơ trong đất là xác định hàm lượng,
thành phần mùn quyết định hình thái và tính chất lí, hoá học và độ phì của đất.
Trong tầng mùn chứa gần 90% nitơ ở dạng dự trữ và phần lớn các nguyên tố dinh
dưỡng như P, S, nguyên tố vi lượng, là kho dự trữ chất dinh dưỡng cho cây trồng.
Hiện có nhiều phương pháp xác định chất hữu cơ của đất: phương pháp đốt khô,
phương pháp đốt ướt (Chiurin, Walkley - Black), phương pháp đốt mùn trong tủ sấy
150
o
C, thời gian 20 phút (Nikitin) và phương pháp oxi hóa mùn 24 giờ ở nhiệt độ 20
o
C
(P.Antanova)
2. Nguyên tắc
Chất hữu cơ của đất, dưới tác dụng của nhiệt độ, bị dung dịch K
2
Cr
2
O

7
+ H
2
SO
4

(1: 1) oxi hoá:
3C + 2K
2
Cr
2
O
7
+ 8H
2
SO
4
3CO
2
+ 2K
2
SO
4
+ 2Cr
2
(SO
4
)
3
+ 8H

2
O
Lượng K
2
Cr
2
O
7
còn dư được dung dịch muối FeSO
4
hay muối Morh
(FeSO
4
.(NH
4
)
2
SO
4
.6H
2
O) để khử:
K
2
Cr
2
O
7
+

6FeSO
4
+7H
2
SO
4
Cr
2
(SO
4
)
3
+ 3Fe
2
(SO
4
)
3
+

K
2
SO
4
+ 7H
2
O
Chất chỉ thị cho quá trình chuẩn độ này thường dùng là acid phenylanthranilic
(C
13

H
11
O
2
N), màu chuyển từ đỏ mận sang xanh lá cây hoặc diphenylamin (C
12
H
11
N),
màu sẽ chuyển từ màu lam tím sang xanh lá cây.
Trong quá trình chuẩn độ, Fe
3+
tạo thành có thể ảnh hưởng đến quá trình chuyển
hoá màu cũa chất chỉ thị, vì vậy trước khi chuẩn độ có thể cho thêm một lượng nhỏ
H
3
PO
4
hoặc muối chứa ion F
-
để tạo phức không màu với Fe
3+
.
3. Hóa chất, dụng cụ, thiết bị


Trang 6


3.1 Hóa chất:

- K
2
Cr
2
O
7
0,4N trong H
2
SO
4
(1:1): cân 20g tinh khiết K
2
Cr
2
O
7
nghiền bằng chày
trong cối sứ, hoà tan trong 250 mL nước cho vào bình định mức 1L. Cần phải để bình
trong chậu nước đá lạnh rồi mới cho từ từ H
2
SO
4
đậm đặc (d = 1,84) vào cho đến thể
tích 1L. Nồng độ của dung dịch này được kiểm tra bằng dung dịch FeSO
4
(hoặc muối
Morh) 0,2N.
- Có trường hợp sau khi pha xong để một vài hôm có vài tinh thể màu đỏ hình
kim xuất hiện, trong trường hợp này chỉ cần thêm ít nước, lắc đều tinh thể sẽ mất.
- Dung dịch muối Morh 0,5N: cân 200g (NH

4
)
2
SO
4
.FeSO
4
.6H
2
O hoà tan trong
nước, thêm 20mL H
2
SO
4
đặc và định mức đến 1L.
- Chỉ thị Ferroin: pha 0,695g FeSO
4
.7H
2
O; 1,485g orthophenaltrolinamonohydrat
trong 100mL H
2
O cất
3.2 Dụng cụ:
- Cối, chày sứ
- Cốc thủy tinh
- Bình định mức 1L
- Pipet
- Bình tam giác (Erlen) 250mL
- Buret

- Rây
3.3 Thiết bị:
- Cân phân tích
- Tủ sấy
4. Cách tiến hành
- Đất để phân tích mùn được chuẩn bị cẩn thận: dùng cân phân tích cân lấy
khoảng 0,8g đã rây qua rây 1mm (Tùy theo dạng đất mà lượng đất lấy khác nhau: Đất
trắng có ít mùn nên khối lượng đất > 1g, và ngược lại đất đen < 1g ), trộn đều bỏ vào
trong erlen. Hút 10mL dung dịch H
2
SO
4
: K
2
Cr
2
O
7
(1:1) bằng pipet chính xác vào trong
erlen 100mL. Lắc nhẹ bình, tránh để đất bám lên thành bình.
- Cách quan sát mẫu: nếu khi cho đất vào dung dịch chuyển sang màu xanh ngọc
 hàm lượng mùn tương đối cao.
- Sấy ở nhiệt độ 150
0
C trong vòng 20 phút.


Trang 7

- Sau 20 phút lấy mẫu ra ngoài để nguội tự nhiên 1 thời gian.
- Cho vào dung dịch mẫu khoảng 7µl chất chỉ thị Ferroin.
- Chuẩn chỉ thị với dung dịch Morh 0,5N. Dung dịch có màu xanh tím đậm 
xanh ngọc  đỏ. Đồng thời mẫu luôn được tiến hành song song với 1 mẫu trắng đối
chứng. Thí nghiệm với 3 lần lặp lại.
5. Tính kết quả
Chất hữu cơ = (V
0
-V) x N x 0,003 x 1,724 x 100 x K
a
V
0
: muối Morh dùng chuẩn độ thí nghiệm trắng (mL)
V: thể tích muối Morh dùng chuẩn độ mẫu (mL)
N: nồng độ đương lượng của dung dịch muối Morh (mgđl/L)
a: lượng mẫu đất lấy phân tích (g)
K: hệ số chuyển đổi từ mẫu khô không khí sang mẫu khô tuyệt đối.
1,724: hệ số chuyển đổi thành tổng hàm lượng chất hữu cơ.
Chú ý: đất chứa nhiều clorua cũng ảnh hưởng đến kết quả phân tích vì có một
phần Cr
2
O
7
2-
tiêu tốn cho sự oxi hoá Cl
-
.
Cr
2
O

7
2-
+6 Cl
-
+ 14H
+
2Cr
3+
+ 3 Cl
2
+ 7 H
2
O
6. Câu hỏi
6.1 Thành phần mùn đất và đặc điểm của chúng?
6.2 Công thức hóa học của tinh thể màu đỏ hình kim xuất hiện sau khi pha
dung dịch K
2
Cr
2
O
7
trong H
2
SO
4
?

Trang 8




BÀI 3: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TỔNG PHỐTPHO
TRONG ĐẤT
1. Mục đích
Phốtpho có tác dụng rất quan trọng trong dinh dưỡng của thực vật, đặc biệt là đối
với sự phát triển của rễ và hạt. Hàm lượng photpho trong đất giao động trong khoảng
0,1 – 0,19 % (P
2
O
5
). Trong tất cả các loại đất, hàm lượng photpho ở các tầng dưới nhỏ
hơn đáng kể so với tầng trên.
2. Nguyên tắc
Trong môi trường acid các dạng photphat sẽ được chuyển về dạng orthophotphat
và sẽ phản ứng tạo phức amoniummolybdate có màu xanh và được đo ở bức sóng
882nm hoặc 670nm.
Phương trình phản ứng
PO
4
3-
+ 12(NH

4
)
2
M
0
O
4
+ 24H
+
(NH
4
)
3
PO
4
.12M
0
O
3
+ 21 NH
4
+
+ 12 H
2
O
(NH
4
)
3
PO

4
.12M
0
O
3
+ ne
+
= Molybdenum (xanh dương)
3. Hóa chất, dụng cụ, thiết bị
3.1 Hoá chất
- Acid H
2
SO
4
2,5M: cho từ từ 138mL acid H
2
SO
4
đậm đặc vào trong 500mL
nước cất rồi định mức thành 1L (a).
- Dung dịch acid ascorbic 0,1M: cân 1,76g acid ascorbic hoà tan trong 100mL
nước cất (b).
- Dung dịch amoniummolybdate 4%: hoà tan 40g trong 1L nước cất (c).
- Dung dịch potassiumantimoniumtartrate KSbOC
4
H
4
O
4
.1/2H

2
O cân 0,2728g hòa
tan trong 100mL nước cất (d).
- Dung dịch thuốc thử trộn theo tỉ lệ: (a):(b):(c):(d) = 50:30:15:5 thành 100mL.
- Dung dịch NaOH 1N: Pha 40g NaOH bằng nước cất rồi định mức tới 1L.
- Dung dịch photphat chuẩn gốc: hòa tan 439mg KH
2
PO
4
khan (đã sấy ở 105
0
C
trong một giờ) trong 1L nước cất. Dung dịch chuẩn có nồng độ 100ppm.


Trang 9


- Dung dịch làm việc: pha trước lúc dùng. Lấy 5 mL dung dịch chuẩn gốc pha
loãng bằng nước cất tới 50 mL, dung dịch có nồng độ 10 ppm.
3.2 Dụng cụ
- Cốc thủy tinh
- Ống đong
- Pipet
- Bình định mức 50mL, 100mL.
3.3 Thiết bị
- Spectrophotometer
- Bếp điện
- Tủ hút
4. Cách tiến hành

- Phá huỷ mẫu bằng hỗn hợp H
2
SO
4
và HClO
4
: Cân 1g đất đã ray chuẩn bị vào
trong bình Kjeldahl dung tích 50mL. Thêm vào bình 8mL dung dịch H
2
SO
4
đậm đặc, để
yên khoảng 15 phút để mẫu thấm hóa chất.
- Đun khoảng 15-20 phút thấy xuất hiện khói trắng. Chuyển ra ngoài để nguội rồi
cho 2-3 giọt HClO
4
70% (cần chú ý phải thực hiện trong tủ hút). Đốt tiếp dung dịch cho
tới khi mẫu xuất hiện màu trắng thì đem ra để nguội. Dùng nước cất rửa và chuyển dung
dịch vào bình định mức 100mL, định mức đến 100mL.
- Sau đó dùng phương pháp so màu: Cho 2mL mẫu vào các bình định mức 50mL,
cho thêm 2-3 giọt phenolphthalein. Chuẩn độ pH bằng cách dùng NaOH 1N cho vào
bình định mức, hỗn hợp có màu hồng nhạt. Tiếp tục cho H
2
SO
4
0,1N vào chuẩn lại cho
dung dịch mất màu hồng nhạt. (Các bình định mức dựng đường chuẩn cũng chuẩn pH
tương tự như vậy). Tất cả các bình cho vào 4 mL dung dịch thuốc thử, định mức bằng
nước cất đến 50 mL. Trộn đều hỗn hợp, để yên 10 phút để màu được lên hoàn toàn.
Đem đi so màu trên máy spectrophotometer tại bức sóng 882nm.

STT 0 1 2 3 4 5 6
VPO
4
3-
chuẩn (ml) 0 2 4 6 8 10 0
V thuốc thử (ml) 4 4 4 4 4 4 4


Trang 10


Vmẫu (ml) 0 0 0 0 0 0 2
Nước cất Định mức 50 ml
5. Tính kết quả
Sau khi đo độ hấp thu loạt chuẩn. Vẽ đồ thị A = f(x). Sử dụng phương pháp bình
phương cực tiểu để lập phương trình tuyến tính y = ax + b. Dựa vào đường chuẩn để
tính toán kết quả.
P
2
O
5
(%)
Đất nghèo P <0,06
Trung bình 0,06-0,1
Giàu P 0,1
6. Câu hỏi
6.1 Giới hạn chỉ thị của hàm lượng phốtpho tổng số trong 6 nhóm đất chính
của Việt Nam
6.2 Ngoài phương pháp phá huỷ mẫu bằng cách sử dụng hỗn hợp axit và chất
oxi hoá mạnh thì dùng phương pháp nung chảy kiềm với hỗn hợp Na

2
CO
3

và K
2
CO
3
có được hay không? Giải thích?











Trang 11




BÀI 4: XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ NO
2
TRONG KHÔNG KHÍ THEO
PHƯƠNG PHÁP GRIESS-SALTZMAN
1. Mục đích

Xác định hàm lượng NO
2
trong không khí xung quanh tại vị trí thu mẫu. Phương
pháp này dùng để xác định nồng độ khối lượng của nitơ dioxit trong không khí xung
quanh trong khoảng từ 0,010 đến 20 mg/m
3
. Thời gian lấy mẫu từ 10 phút đến 2 giờ.
Do độ bền theo thời gian của dung dịch mẫu bị hạn chế, khoảng thời gian từ lúc kết
thúc lấy mẫu đến lúc đo không được vượt quá 8 giờ.
Phương pháp này không phù hợp đối với việc lấy mẫu ở vùng thở của người.
2. Nguyên tắc
Khí NO
2
được hấp thu vào dung dịch NaOH tạo NaNO
2
, cho phản ứng với
CH
3
COOH tạo thành HNO
2
. Acid HNO
2
tác dụng với axit sulfanilic và α-naphtylamin
cho ra hợp chất Azoic trong khoảng thời gian xác định, kết quả tạo thành màu hồng
trong vòng 15 phút.
Phản ứng diễn ra như sau:
2NO
2
+ 2NaOH → NaNO
2

+ NaNO
3
+ H
2
O
NaNO
2
+ CH
3
COOH → HNO
2
+ CH
3
COONa



Trang 12


Đo độ hấp thụ của dung dịch màu ở bước sóng giữa 540 nm và 550 nm bằng phổ
quang kế phù hợp (hoặc máy so màu) và xác định nồng độ khối lượng của nitơ dioxit
bằng đường chuẩn xây dựng với hỗn hợp khí hiệu chuẩn thu được.
3. Hóa chất, dụng cụ, thiết bị
3.1 Chuẩn bị thiết bị và dụng cụ đi thu mẫu hiện trường
- Máy hút không khí
- Lưu lượng kế
- Bình hấp thu
- Dung dịch hấp thu NO
2

- Lọ thủy tinh nâu đựng mẫu
3.2 Kỹ thuật lấy mẫu
- Lắp đặt hệ thống theo đúng quy trình lấy mẫu
- Mẫu không khí được hút qua 2 bình hấp thu nối tiếp nhau, chứa 40 mL dung
dịch hấp thu, với lưu lượng 0,5 L/phút lấy mẫu trong khoảng thời gian 1 giờ. Xong, gom
toàn bộ dung dịch đã hấp thu lại cho vào lọ đựng mẫu và bảo quản mẫu cẩn thận.
3.3 Chuẩn bị hóa chất phòng thí nghiệm
- Dung dịch hấp thu NaOH
 Dung dịch 0,1N: cân 4g NaOH, hòa tan trong 0,5mL butanol rồi dùng nước
cất hai lần định mức đến 1L.
 Dung dịch 0,5N: hòa tan 20g NaOH trong nước cất hai lần rồi định mức
đến 1L.
- Thuốc thử Griess A: hòa tan 0,5g acid sulfanilic trong acid acetic 10% rồi định
mức đến 150mL. Đun nhỏ lửa cho tan.
- Thuốc thử Griess B: hòa tan 0,1g N(1-naphtyl)-ethylenediamine2HCl trong
20mL nước cất và đun cách thủy 15 phút. Sau đó, thêm acid acetic 10% rồi định mức
đến 150mL.
Lưu ý: chỉ trộn dung dịch Griess A và dung dịch Griess B (tỉ lệ A:B = 1:1) với
nhau khi tiến hành phân tích.
- Dung dịch chuẩn NaNO
2

 Dung dịch chuẩn gốc (0,1mg NO
2
/mL): hòa tan 0,15g NaNO
2
trong nước
cất hai lần rồi định mức đến 1L.

Trang 13


 Dung dịch chuẩn sử dụng (5µg NO
2
/mL): pha 5mL dung dịch chuẩn gốc
trong dung dịch KI 1% thành 100 mL
- Dung dịch CH
3
COOH
 Dung dịch loãng 10%: pha 50mL CH
3
COOH đậm đặc 99,5% trong nước
cất 2 lần rồi định mức thành 500mL.
 Dung dịch 5N: pha 150mL CH
3
COOH đậm đặc 99,5% trong nước cất 2 lần
rồi định mức thành 500mL.
4. Cách tiến hành
- Lấy 7 ống nghiệm Φ16 đánh số từ 0 đến 6.
- Cho dung dịch chuẩn NO
2
nồng độ 5µg/mL vào các ống nghiệm từ số 0 đến 5
với các thể tích tương ứng nêu trong bảng. Sau đó thêm dung dịch hấp thu vào các ống
nghiệm cho đủ 10mL. Ống nghiệm số 6, cho 10 mL dung dịch mẫu vừa thu xong. Thêm
vào các ống nghiệm mỗi ống 1 mL dung dịch CH
3
COOH 5N.
- Trộn dung dịch Griess A và dung dịch Griess B (tỉ lệ A:B = 1:1), cho vào 7 ống,

mỗi ống 2mL hỗn hợp. Lắc đều, sau 10 phút đo trên máy so màu tại bước sóng 543nm
để xác định mật độ quang theo sự thay đổi lượng NO
2
.
STT 0 1 2 3 4 5 6
Dung dịch chuẩn 5µg/ml (ml) 0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 0
Mẫu thu tại hiện trường (ml) 0 0 0 0 0 0 10
Dung dịch hấp thu (ml) 10 9,6 9,2 8,8 8,4 8,0 0
Dung dịch axit acetic 5N (ml) 1 1 1 1 1 1 1
Dung dịch Griess A và B (ml) 2 2 2 2 2 2 2
5. Tính kết quả
Lập đường chuẩn tương quan giữa mật độ quang và lượng NO
2
từ kết quả đo của
các mẫu ở ống nghiệm số 0 đến 5.
Từ mật độ quang của mẫu phân tích trong ống nghiệm số 6, xác định lượng NO
2

có trong ống dựa theo đường chuẩn.
Lập công thức tính hàm lượng NO
2
trong mẫu khí thu được (mg/m
3
)
Trong đó:
C
NO2
: Nồng độ NO
2
trong mẫu khí đã thu, mg/m

3



Trang 14


a: Lượng NO
2
tương ứng trong thang mẫu, µg.
V
1
: Tổng thể tích dung dịch hấp thụ mẫu, mL.
V
2
: Thể tích dung dịch mẫu đã hấp thụ lấy ra phân tích, mL.
V
k
: Thể tích không khí được lấy quy về điều kiện tiêu chuẩn.
6. Câu hỏi
6.1 Ảnh hưởng của NO
2
đến môi trường như thế nào?
6.2 Các yếu tố nào ảnh hưởng đến độ chính xác của phương pháp phân tích?
6.3 Nhận xét kết quả so với QCVN qui định về hàm lượng NO
2
trong không
khí xung quanh?

Trang 15


BÀI 5: SẮC KÝ BẢN MỎNG
1. Mục đích
Sắc ký bản mỏng (thin layer chromatography - TLC) là một kĩ thuật sắc ký để tách
các chất trong hỗn hợp được sử dụng rộng rãi và phổ biến. Phương pháp sắc ký bản
mỏng bao gồm pha tĩnh là một lớp mỏng các chất hấp phụ, thường là silica gel,
aluminium oxide, hoặc cellulose được phủ trên một mặt phẳng chất trơ. Pha động bao
gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong một dung môi thích hợp và được hút
lên bản sắc ký bởi mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của các
thành phần trong dung dịch.
Sắc kí lớp mỏng được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực:
- Xét nghiệm độ tinh khiết của các hóa chất phóng xạ trong dược khoa
- Xác định các sắc tố trong tế bào thực vật

- Phát hiện thuốc trừ sâu, thuốc diệt côn trùng trong thức ăn, hoặc nhận biết
những hóa chất trong một chất cho sẵn.
- Giám sát các phản ứng hữu cơ
2. Nguyên tắc
Quá trình tách hỗn hợp các chất bằng sắc ký bản mỏng xảy ra khi cho pha động di
chuyển qua pha tĩnh. Chấm một giọt dung dịch chứa hỗn hợp các chất cần phân tích lên
gần đầu mép bản mỏng (điểm xuất phát), khoảng 1 cm từ dưới lên. Sau đó nhúng bản
mỏng vào pha động (dung môi). Dung môi di chuyển lên bản sắc ký bởi mao dẫn, gặp
phải dung dịch phân tích và dịch chuyển dung dịch này lên bản sắc ký. Do hệ số phân
bố khác nhau, các cấu tử được dịch chuyển lên bản mỏng theo hướng pha động với các
tốc độ khác nhau. Kết quả là mỗi chất trong hỗn hợp được phân chia thành một vùng
riêng.
Quá trình sắc kí bản mỏng: một hỗn hợp của một hợp chất đỏ và một hợp chất lam
được tách biệt trong quá trình sắc ký (dung môi màu xanh nhạt di chuyển lên trên bản
sắc ký.



Trang 16


Dung môi thích hợp dùng trong sắc ký bản mỏng sẽ là một dung môi có tính phân
cực khác với pha tĩnh. Nếu một dung môi phân cực được dùng để hòa tan mẫu thử trên
một pha tĩnh phân cực, vệt nhỏ mẫu thử sẽ lan tròn do mao dẫn, và các vệt khác nhau có
thể trộn lẫn vào nhau. Do đó, để hạn chế sự lan tròn của các vệt mẫu, dung môi được sử
dụng để hòa tan mẫu thử phải không phân cực, hoặc phân cực một phần, nếu pha tĩnh
phân cực, và ngược lại
3. Hóa chất, dụng cụ, thiết bị
3.1 Hoá chất
- Aceton

- Diethylether
- Pha hỗn hợp 2 dung môi theo tỷ lệ thể tích Aceton:Diethyether = 5:5
3.2 Dụng cụ
- Bình thủy tinh có nắp đậy
- Cốc thủy tinh
- Ống đong
- Pipet
- Đĩa petri (dùng làm nắp đậy nếu dùng cốc thủy tinh được dùng làm buồng sắc
ký )
- Viết chì, thước
3.3 Thiết bị
- Tủ hút
4. Cách tiến hành
Bình khai triển là bình thủy tinh hình trụ cao 25 cm đường kính miệng 10 cm, có
nắp đậy kín. Bão hòa hơi dung môi trong bình bằng cách lót giấy lọc xung quanh thành
trong của bình, rồi rót một lượng vừa đủ dung môi vào bình, lắc rồi để giấy lọc thấm
đều dung môi. Lượng dung môi sử dụng sao cho sau khi thấm đều giấy lọc còn lại một
lớp dày khoảng 5 mm đến 10 mm ở đáy bình. Ðậy kín nắp bình và để yên 10 phút ở
nhiệt độ phòng.
Bản mỏng TLC silicagel được cắt bằng kéo thành bản hình chữ nhật có kích thước
3,5cm x 12 cm. Sử dụng ống thuỷ tinh mao quản hoặc micropipet để đưa mẫu lên bản
mỏng. Thể tích dung dịch từ 0,001ml đến 0,005 ml đối với trường hợp đưa mẫu lên bản


Trang 17


mỏng dưới dạng điểm và từ 0,l - 0,2 ml khi đưa mẫu lên bản mỏng dưới dạng vạch.
Ðường xuất phát phải cách mép dưới của bản mỏng 1,5cm - 2cm và cách bề mặt dung
môi từ 0,8 - 1 cm. Các vết chấm phải nhỏ, có đường kính 2 - 6mm và cách nhau 15mm.

Các vết ở bìa phải cách bờ bên của bản mỏng ít nhất 1cm để tránh hiệu ứng bờ. Ðặt bản
mỏng gần như thẳng đứng với bình triển khai, các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp
dung môi khai triển. Ðậy kín bình và để yên ở nhiệt độ không đổi. Khi dung môi đã
triển khai trên bản mỏng được một đoạn, lấy bản mỏng ra khỏi bình, đánh dấu mức
dung môi, làm bay hơi dung môi còn đọng lại trên bản mỏng rồi chụp ảnh, đo khoảng di
chuyển của dung môi và các chất cần tách.
Mẫu là chất màu ở lá xanh, với hỗn hợp dung môi Aceton:Diethyether = 5:5, được
tiến hành sắc ký bản mỏng trong 10 phút.
5. Tính kết quả
5.1 Định tính các chất dựa vào việc xác định hệ số di chuyển R
f



Trong đó:
l: đoạn đường dung môi đi được, khoảng
cách từ tuyến xuất phát tới tuyến dung môi
l
o
: đoạn đường chất tan đi được, khoảng
cách từ tuyến xuất phát tới tâm vệt sắc ký
Giá trị R
f
bị ảnh hưởng bởi kích thước và
loại buồng sắc ký, bản chất và kích thước của
bản mỏng, hướng di chuyển của pha động, thể tích và thành phần của pha động, các
điều kiện cân bằng, ảnh hưởng của độ ẩm, phương pháp chuẩn bị mẫu trước khi phát
triển sắc đồ.
5.2 Độ hiệu nghiệm của bản mỏng:
Số đĩa lý thuyết N được dùng để đánh giá khả năng phân tích của bản mỏng

Trang 18



Trong đó: W
b
: đường kính vệt sắc ký
Z
f
: đoạn đường dung môi di chuyển
Đối với những bản mỏng tốt, N có thể lên đến 2000.
Chiều cao của một đĩa lý thuyết trong sắc ký bản mỏng:

5.3 Khả năng tách
Để đánh giá khả năng tách các vệt trên sắc đồ, người ta thường dùng 2 đại lượng
sau:
5.3.1
: là hiệu giá trị Rf giữa hai cấu tử lân cận. càng lớn, độ chọn lọc của bản
mỏng càng tốt. Tuy nhiên đại lượng này nhiều khi không phản ánh đúng khả năng tách
thực tế vì cùng một giá trị nhưng nếu vết bị giãn rộng thì mức độ chồng chấp 2 vệt
lớn hơn.
5.3.2 Độ chọn lọc α

Trong đó:
R
f,1
và R
f,2

là giá trị R
f
của hai cấu tử 1 và 2 thường là hai cấu tử có các vệt lân
cận.
6. Câu hỏi
6.1 Ứng dụng của sắc ký bản mỏng đến việc phân tích môi trường như thế
nào?


Trang 19


6.2 Các yếu tố nào ảnh hưởng đến độ chính xác của phương pháp phân tích?
6.3 Những điều kiện yêu cầu về khả năng phân cực của pha động, pha tĩnh và
hỗn hợp mẫu như thế nào trong kỹ thuật phân tích bằng sắc ký bản mỏng?