Báo cáo khoa học : Phân lập các hợp chất có khả năng gây độc tố tế bào ung thư tuyến tuỵ panc - i và psn- 1 từ keo ong dú (trigona minor) ở Bến Tre, Việt Nam

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM
SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆTHÀNH ĐOÀN TP. HỒ CHÍ MINH





BÁO CÁO NGHIỆM THU



- -1

ThS. NGUYỄN XUÂN HẢI






CƠ QUAN CHỦ TRÌ: TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN
KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
THÁNG 09/2014



SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH ĐOÀN
TP. HỒ CHÍ MINH TP. HỒ CHÍ MINH


CHƢƠNG TRÌNH VƢỜN ƢƠM
SÁNG TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ

 * 









BÁO CÁO NGHIỆM THU
(Đã được chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu ngày 27/09/2014)


PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT CÓ KHẢ NĂNG GÂY ĐỘC TẾ
- -1 TỪ KEO ONG DÚ
(TRIGONA MINOR


Thủ trƣởng
Cơ quan chủ trì đề tài
(Họ tên, chữ ký, đóng dấu)
Chủ nhiệm đề tài
(Họ tên và chữ ký)

Giám đốc Sở Khoa học và Công nghệ

Chủ tịch Hội đồng nghiệm thu














Phân lập 10 hợp chất tinh khiết từ keo
ong Trigona minor .
Phân lập 10 hợp chất tinh khiế
.
2-5 Hợp chất có khả
tế bào ung thư -
PSN-1
50

< 100 µM.
6 Hợp chất có khả
tế bào ung thư -1
50
< 100 µM.
.
.
1 B
.
1 B
, ĐHQG-HCM.

i

MỤC LỤC

MỤC LỤC i
iv
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vi

TỔNG QUAN
1. TỔNG QUAN VỀ LOÀI ONG KHÔNG NGÕI ĐỐT 1
1.1. Giới thiệu về loài ong mật 1
1.2. Các chi chính của loài ong không ngòi đốt 1
1.2.1. Chi Trigona 1
1.2.2. Chi Melipona 2
1.3. Sản phẩm của loài ong không ngòi đốt 2
1.4. Thành phần hóa học của keo ong một số loài ong không ngòi đốt 3
1.4.1. Thành phần hóa học của keo ong loài Trigona spinipes ở Brazil 3
1.4.2. Thành phần hóa học của keo ong loài Tetragonula carbonaria ở Öc 4

1.4.3. Thành phần hóa học của keo ong loài Melipona subnitida ở Brazil 6
1.4.4. Thành phần hóa học của keo ong loài Melipona interrupta ở Brazil 6
1.4.5. Thành phần hóa học của keo ong loài Melipona beecheii ở Mexico 7
1.5. Hoạt tính sinh học của keo ong của một số loài ong không ngòi đốt 7
1.5.1. Hoạt tính kháng ung thư của keo ong loài Trigona laeviceps ở Thái Lan 7
1.5.2. Hoạt tính kháng khuẩn của keo ong của loài Trigona sp. ở Ấn Độ 8
1.5.3. Hoạt tính kháng khuẩn của keo ong của một số loài thuộc chi Melipona 8
1.5.4. Hoạt tính kháng tăng trưởng các dòng tế bào ung thư của keo ong không ngòi
đốt loài Melipona scutellaris ở Brazil 9
1.5.5. Một số hoạt tính sinh học của keo ong loài Melipona orbignyi ở Brazil 9
2. TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ TUYẾN TỤY 9
2.1. Giới thiệu về ung thư tuyến tụy 9
2.1.1. Tụy và ung thư tuyến tụy 9
2.1.2. Phân loại ung thư tuyến tụy 10
2.1.3. Các phương pháp điều trị ung thư tuyến tụy 11
2.1.3.1. Hóa trị 11
ii

2.1.3.2. Xạ trị 11
2.1.3.3. Phẫu thuật 11
2.1.3.4. Phương pháp hỗ trợ điều trị 12
2.1.4. Một số dòng tế bào ung thư tuyến tụy 12
2.2. Một số hợp chất phân lập từ tự nhiên có khả năng kháng ung thư tuyến tụy trên
dòng tế bào PANC-1 -1 13
2.2.1. 13
2.2.2. 14
2.2.3. 15
2.3. Phương pháp thử hoạt tính kháng ung thư tuyến tụy 17
2.3.1. Nguyên tắc 17
2.3.2. Đánh giá khả năng gây độc tế bào ung thư 18

2.3.2.1. Khả năng gây độc tế bào ung thư 18
2.3.2.2. Giá trị PC
50
và cách xác định giá trị PC
50
18

MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
THỰC NGHIỆM
3. HÓA CHẤT, DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ 19
3.1. Hóa chất 19
3.2. Dụng cụ 19
3.3. Thiết bị 20
4. QUY TRÌNH THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƯ TUYẾN TỤY 20
4.1. Chuẩn bị hóa chất 20
4.2. Nuôi cấy tế bào 21
4.3. Quy trình thử hoạt tính 21
5. PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÖC CÁC HOẠT CHẤT TỪ CAO
HEXANE CỦA KEO ONG LOÀI TRIGONA MINOR 21
5.1. Nguyên liệu 21
5.2. Ly trích và điều chế cao thô 21
5.3. Phân lập các hoạt chất từ phân đoạn cao hexane 22
5.3.1. Phân đoạn B 24
5.3.2. Phân đoạn D 24
iii

5.3.3. Phân đoạn H 24
5.3.4. Phân đoạn I 28
5.3.5. Phân đoạn J 30

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
6. BIỆN LUẬN CẤU TRÖC CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC 33
6.1. Cấu trúc các hợp chất phân lập được 33
6.2. Hợp chất 1 34
6.3. Hợp chất 2 36
6.4. Hợp chất 3 39
6.5. Hợp chất 4 41
6.6. Hợp chất 5 43
6.7. Hợp chất 6 47
6.8. Hợp chất 7 49
6.9. Hợp chất 8 53
6.10. Hợp chất 9 55
6.11. Hợp chất 10 59
7. KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƯ TUYẾN TỤY 61
7.1. Kết quả thử hoạt tính của các mẫu cao 61
7.2. Kết quả thử hoạt tính của các hợp chất phân lập được 62

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
8. KẾT LUẬN 63
9. KIẾN NGHỊ 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO 65
70


iv



ốt loài Trigona minor

, trong đó có ba hợp chất mớ trigonol
A (5), trigonone A (7) và trigonol B (9 , cùng với 7 hợp chấ
(1), mangiferolicacid (2), 23-hydroxymangiferonicacid(3),
23-hydroxymangiferolicacid(4), 27-hydroxymangiferonicacid(6), 27-
hydroxymangiferolicacid (8), và 27-hydroxyisomangiferolicacid (10
h . Các hợp chất này
được thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư tuyến tụy trên dòng PANC-1
3, 5, 7-10 hoạt tính mạnh, với giá trị
PC
50
lần lượt là 32.3, 52.8, 25.3, 52.1, 31.8 và 31.0 µM. 1,
2, 4 6 100µM
- -1.
Từ khóa: Trigona minor, keo ong, triterpene khung cycloartane, PANC-1, PSN-1




v

ABSTRACT

From the ethanolic extract of the propolis of Trigona minor, three new
cycloartane-type triterpenes named trigonol A (5),trigonone A (7), and trigonol B (9),
together with seven known cycloartane-type triterpenes, including mangiferonic acid
(1), mangiferolicacid (2), 23-hydroxymangiferonicacid(3), 23-
hydroxymangiferolicacid(4), 27-hydroxymangiferonicacid(6), 27-
hydroxymangiferolicacid (8), and 27-hydroxyisomangiferolicacid (10) have been
isolated. Their chemical structures were determined by extensive NMR spectroscopic
analysis. All compounds were tested for preferential cytotoxicity against PANC-1

human pancreatic cell line in the nutrient starvation condition (NDM). Among them,
compounds 3, 5, 7-10 showed potent preferentially cytotoxic candidates with PC
50

values of 32.3, 52.8, 25.3, 52.1, 31.8 and 31.0 µM, respectively. However, compounds
1, 2, 4 and 6displayed weak cytotoxicityagainst both PANC-1 and PSN-1 cells at a
concentration of 100 µM.
Keywords: Trigona minor, propolis, cycloartane-type triterpenes, PANC-1, PSN-
1




vi

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
MeOH : methanol
EtOH : ethanol
EtOAc : ethyl acetate
MeCN : acetonitrile
CDCl
3
: deuterated chloroform
DMSO-d
6
: deuterated dimetylsufoside
NMR : Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy
(phổ cộng hưởng từ hạt nhân)
1
H-NMR : phổ cộng hưởng từ hạt nhân của

1
H
13
C-NMR : phổ cộng hưởng từ hạt nhân của
13
C
DEPT : Distortionless Enhancement by Polarization Transfer
COSY : COrrelation SpectroscopY (phổ tương quan giữa
1
H-
1
H)
HSQC : Heteronuclear Single Quantum Correlation spectroscopy
(phổ tương quan giữa
1
H-
13
C qua 1 nối)
HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Correlation spectroscopy
(phổ tương quan giữa
1
H-
13
C qua 2, 3 nối)
NOESY : Nuclear Overhause Effect Spectroscopy
(phổ tương quan giữa
1
H-
1
H trong bán kính 5Å)

HR-MS : High Resolution Mass Spectroscopy
(phổ khối lượ )
δ
H
, δ
C
: độ dịch chuyển hóa học của
1
H,
13
C
s : singlet (mũi đơn)
d : doublet (mũi đôi)
dd : doublet of doublets (mũi đôi - đôi)
vii

t : triplet (mũi ba)
m : multiplet (mũi đa)
br : broad (mũi bầu)
J : hằng số ghép
Hz, MHz : hertz, megahertz
ppm : part per million
EC
50
: Effective Concentration (nồng độ ức chế 50 % vi khuẩn)
IC
50
: Inhibitory Concentration (nồng độ ức chế 50 % enzyme)
PC
50

: Preferential Cytotoxicity (nồng độ gây độc 50 % tế bào ung thư)
PC
100
: Preferential Cytotoxicity (nồng độ gây độc 100 % tế bào ung thư)
PTLC : Preparative Thin Layer Chromatography (sắc ký bản mỏng điều chế)
CCNP : Column Chromatography Normal Phase (sắc ký cột pha thường)
DNA : DeoxyriboNucleic Acid
MTT : 3-(4,5-diMethyl-2-Thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-Tetrazolium bromide
DMEM : Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (môi trường nuôi cấy tế bào có
dinh dưỡng)
NDM : Nutrient Deprived Medium (môi trường nuôi cấy thiếu dinh dưỡng)
FBS : Fetal Bovine Serum (huyết thanh bào thai bò)
PBS : Phophates Buffer Saline (đệm phosphate)
HEPES : 4-(2-HydroxyEthyl)-1-PiperazinEthanSulfonic acid
MEM : MinimumEssentialMedium (môi trường cần thiết tối thiểu)
MIC : Minimum Inhibitory Concentration (nồng độ chất ứcchế tối thiểu)
MBC : Minimum Bactericidal Concentration (nồng độ diệt khuẩntốithiểu)
MFC : Minimum Fungicidal Concentration (nồng độ diệt nấm tối thiểu)
TGI : Total Growth Inhibition(tổng nồng độ ức chế tăng trưởng)

i

TỔNG QUAN














1

1. TỔNG QUAN VỀ LOÀI ONG KHÔNG NGÒI ĐỐT
1.1. Giới thiệu về loài ong mật
Ong mật thuộc giới động vật (Animalia), ngành chân đốt (Arthropoda), phân
ngành có khí quản (Tracheata), lớp côn trùng (Insecta), phân lớp có cánh (Pterygota),
bộ cánh màng (Hymenoptera), liên họ ong (Apoidea), họ ong mật (Apidae).
Ong mật là một nhóm ong gồm hơn 1000 loài. Đây là nhóm ong được nghiên
cứu nhiều nhất trong tất cả các loài ong. Phân họ ong mật có bốn tông đáng chú ý là:
tông Apini (ong mật), tông Meliponini (ong không ngòi đốt), tông Bombini (ong nghệ)

và tông Euglossini (ong phong lan).
1

1.2. Các chi chính của loài ong không ngòi đốt
Tông Meliponini có khoảng 23 chi và 18 phân chi, bao gồm 374 loài
(2000).Trong đó có hai chi lớn là TrigonavàMelipona, ngoài ra còn có các chi và phân
chi ít phổ biến hơn như: Meliponula,Oxytrigona, Dectylurina,Lestrimelitta,
Trichotrigona, Hypotrigona, Liotrigona, Lisotrigona, Trigonisca, Austroplebeia,
Cephalotrigona, Cleptotrigona, Frieseomelitta, Nannotrigona, Nogueirapis,
Paratrigona, Tetragonula, Plebeina, Partamona, Tetragonisca, Scaptotrigona,
Paratrigonoides, Plebeia, Meliwillea, Pariotrigona,…Trong đó, ở châu Á có hai chi
phổ biến là Lisotrigona và Trigonabao gồm khoảng 43 loài (2000).
2,3

1.2.1. Chi Trigona
Chi Trigona là chi lớn nhất và phân bố rộng rãi của tông Meliponini, gồm 10
phân chi với khoảng 120 loài (2000). Trong đó, ba phân chi phổ biếnlàHeterotrigona,
Lepidotrigona vàHomotrigona phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Á. Loài
ong không ngòi đốt thuộc chi Trigonađược tìm thấy ở Ấn Độ, Indonesia, Úc và phần
lớn ở vùng nhiệt đới châu Mỹ.

Phân chi Heterotrigona gồm khoảng 36 loài (2000), là phân chi có số loài lớn
nhất và phổ biến nhất của chi Trigona, phân bố trong vùng từ Indonesia đến Thái Bình
Dương, trong đó có 6 loài ở Úc. Theo phân loại trước đây của Michener vào năm
2000, phân chi này bao gồm cả phân chi Tetragonula, tuy nhiêntheo hệ thống phân
loại sau này, Heterotrigona và Tetragonula được coi là hai phân chi riêng biệt của chi
Trigona. Ở miền Trung Việt Nam, 4 trong số 13 loài của phân chi Tetragonula được
tìm thấy là T. laeviceps, T. gressitti, T. pagdeni và T. fuscobalteata(1978).

2
Phân chi Lepidotrigona phân bố rộng rãi ở Indonesia và Úc, Ấn Độ, Thái Lan
và Đài Loan, trong đó loàiTrigona (L.) ventralis là loài phổ biến nhất, gồm 4 phân
loài: T. (L.) v. ventralis, T. (L.) v. hoozana, T. (L.) v. flavibasis và T. (L.) v. doipaensis.
Loài T. ventralis cũng được tìm thấy ở vùng núi của miền Trung Việt Nam (1975).

Phân chi Homotrigona chỉ có một loài là H.fimbriata,được tìm thấy ở Sumatra,
Borneo, Malaysia và Việt Nam (2000).

Có 4 loài mới được tìm thấy thuộc phân chi Lisotrigona, trong đó có 3 loài
được tìm thấy ở Việt Nam là L. cacciae, L. scintillans, L. carpenteri và một loài được
tìm thấy ở Thái Lan là L. furva (1975).
4

1.2.2. Chi Melipona
Chi Melipona có khoảng 40 loài, trong đó loài Melipona favosa phân bố chủ
yếu ở một số quốc gia ở Nam Mỹ như: Guyana, Tobago, Venezuela, Colombia và
Panama (1982).
Các loài thuộc chi Meliponacó kích thước lớn hơn hẳn so với các chi khác, hình
dáng gần giống với chi Apis của tông Apini và có khả năng cho mật năng suất cao nên
được thuần hóa để nuôi như: M. beecheii, M. costaricensis, M. yucatanica, M.
panamica, M. flavolineata, M. fasciculate, M. fasciata, M. subnitida,…
4,5

Mật của loài ong thuộc chi Melipona có tác dụng trị bệnh nên ở Brazil, loài ong
thuộc chi này được nuôi để lấy mật. Loài ong thuộc chi nàyở Mexico cũng được nuôi
để lấy phấn hoa và thụ phấn cho hoa nhằm tăng năng suất mùa vụ.
5
1.3. Sản phẩm của loài ong không ngòi đốt
Như các loài ong mật khác, loài ong không ngòi đốt cũng cho các sản phẩm như

mật ong, keo ong, phấn hoa, sáp ong,… Vớ , sản phẩm được quan tâm
chủ yếu là mật ong, vì nó có kích thước nhỏ, mật độ đàn thấp nên năng suất mật thấp,
do đó rất ít được thuần hóa để nuôi mà chủ yếu lấy mật từ các tổ tự nhiên. Theo kinh
nghiệm dân gian khi nuôi ong loài này, khoảng một năm mới thu hoạch mật và chia
đàn một lần, sản lượng mật rất ít chỉ khoảng 250 mL trên một đàn trong một năm.
Trong những năm gần đây, mật ong của loài ong này đang được chú ý nhất trong các
loại mật ong do sản lượng ít và có dược tính tốt, nó được sử dụng như một loại thuốc
dân gian để chữa một số bệnh như đau dạ dày, hen xuyễn, làm lành vết thương, nên
giá thành của nó rất cao, khoảng 30 - 40 lần so với giá của mật ong thường.

3
Ở nước ta, loài ong này cũng bắt đầu thuần hóa để nuôi lấy mật ở một số
như Tiền Giang, Bến Tre, Ninh Thuận, Bình Thuận,Hà Tĩnh, Hưng Yên,… Người
nuôi ong chủ yếu nuôi để kiếm thêm thu nhập và nuôi theo kiểu tự phát, chưa có quy
mô tập trung, nuôi với kinh nghiệm gia đình mà chưa có kỹ thuật nuôi nên sản lượng
mật còn rất thấp chưa được cải thiện. Bên cạnh đó, nước ta đến nay vẫn chưa có một
quy định nào về nghề nuôi ong cũng như chưa có một quy trình kiểm tra, đánh giá chất
lượng mật ong.
Trong tổ của loài ong không ngòi đốt, ngoài sản phẩm chính là mật ong được
chúng dự trữ làm thức ăn thì keo ong cũng là một thành phần quan trọng. Keo ong là
thành phần chính của tổ được tạo ra để xây dựng và bảo vệ tổ khỏi kẻ thù hay vi
khuẩn, đặc biệt với loài ong không ngòi đốt thì đây là vũ khí duy nhất để ngăn cản kẻ
thù tấn công tổ của chúng, bằng cách dùng keo ong xây lối vào để làm nhỏ miệng tổ
nên keo ong được chúng tạo ra với số lượng nhiều. Keo ong được coi là chất “kháng
sinh tự nhiên” vì vậy được con người biết đến và sử dụng trong việc ức chế vi khuẩn
và một số bệnh về dạ dày, ruột, nướu răng, các cơ quan trong cơ thể, nâng cao chức
năng miễn dịch, chống lão hóa, chống viêm,…
Những năm gần đây, keo ong của loài ong không ngòi đốt đã được một số nhà
khoa học trên thế giới tìm hiểu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chúng.
Tuy nhiên các nghiên cứu chỉ mới khảo sát sơ bộ về thành phần hoá học và hoạt tính

sinh học, kết quả cho thấy nó có thành phần hóa học rất đa dạng và phụ thuộc nhiều
vào môi trường sống, bên cạnh đó cũng có một số hoạt tính sinh học rất có giá trị. Ở
Việt Nam, loài ong không ngòi đốt phân bố rộng khắp cả nước, đa dạng về loài và
bước đầu được thuần hóa để nuôi lấy mật. Tuy nhiên, keo ong của loài ong này còn
chưa được biết đến, do sau khi thu hoạch mật ong, keo ong thường bị bỏ đi hay chỉ
dùng để hàn kín các vết nứt của vật dụng mà chưa có bất kỳ một ứng dụng nào, cũng
như chưa có nghiên cứu nào về thành phần hóa học hay hoạt tính sinh học của keo ong
loài này.
1.4. Thành phần hóa họccủa keo ong một số loài ong không ngòi đốt
1.4.1. Thành phần hóa học của keo ong loài Trigona spinipes ở Brazil
Theo nghiên cứu của M. O. Freitas cùng các cộng sự, mẫu keo ong của loài T.
spinipesđược lấy ở miền Bắc Brazil vào năm2008 đã phân lập được 7 hợp chất (hình
1). Đặc trưng là các hợp chất triterpene khung cycloartane, trong đó hai hợp chất

4
mangiferolic acid (1) và 3β-hydroxy-24-methylencyloartan-26-oic acid (2) lần đầu tiên
được tìm thấy trong trong keo ong loài này(hình 1).


Hình 1. Cấu trúc các hợp chất đƣợc phân lập từ keo ong T. spinipes
Có nhiều nghiên cứu về sự tương quan giữa thành phần hóa học của keo ong
với thành phần hóa học nguồn thức ăn của loài ong. Các nghiên cứu cho thấy rằng,
nguồn gốc thực vật của keo ong ở Nam Mỹ, Bắc Mỹ và Tây Á là dịch tiết ra từ nhựa
cây vàmậ ạch đàn(Eucalyptus citriodora)gầnnơi ong làm tổ. Theo kết
quả này cho thấy, thành phần hóa học của nhựa cây loài này có chứa các hợp chất như:
7-methoxyaromadendrin, 7-methoxykaempferol, narigenin, sakuranetin, gallic acid,
aromadendrin, Trong đó, các hợp chất 4,5 và 7 đều được tìm thấy trong keo ong và
trong câybạch đàn.
6
1.4.2. Thành phần hóa học của keo ong loài Tetragonula carbonaria ở Úc

Nghiên cứu của C. F. Massaro vào năm 2008 cho thấy mẫu keo ong lấy ở Đông
Nam Queensland, Úc có 34 hợp chất được phân tích bằng sắc ký khí ghép đầu dò khối
phổ, trong đó có 30 hợp chất đã được định danh. Các thành phần chính của mẫu keo
ong này là gallic acid, 5 hợp chất pimaric acid và 4 hợp chất abietic acid. Trong đó,
gallic acid (8), pimaric acid (9) và đồng phân của pimaric acid (10) lần đầu được tìm
thấy ở keo ong loài T. carbonaria (hình 2).


5


Hình 2. Cấu trúc các hợp chất đƣợc phân lập từ keo ong T. carbonaria năm 2008
Cao ethanol của keo ong loài T. carbonaria được thử hoạt tính ức chế enzyme
5-lipoxygenase. Kết quả cho thấy cao ethanol của keo ong này có giá trị IC
50
là 12.8
µg mL
-1
, nhưng không mạnh bằng gallic acid (8) có giá trị IC
50
là 5.6 µg mL
-1
.
7
Theo nghiên cứu của C. F. Massaro và cộng sự về keo ong của loài ong không
ngòi đốt loài T. carbonaria được lấy vào tháng 7 năm 2011 ở vùng Đông Nam nước
Úc đã phân lập được 6 hợp chất, trong đó có 4 hợp chất (2S)-cryptostrobin (11), (2S)-
stroboponin (12), (2S)-7-methoxycryptostrobin (13), (2S)-desmethoxymatteucinol (16)
là các hợp chất flavanonoid bị C-methyl hóa. Cùng với 2 hợp chất flavononoid còn lại
là: (2S)-pinostrobin (14) và (2S)-pinocembrin (15). Các hợp chất này được thử hoạt

tính kháng khuẩn trên dòng Staphylococcus aureus,kết quả cho thấy các hợp chất 12,
14, 15 có giá trị MIC< 50 µg mL
-1
, trong đó hợp chất 14 có khả năng ứng chế mạnh
nhất với giá trị MIC là 6.9 µg mL
-1
(hình 3).


Hình 3. Cấu trúc các hợp chất đƣợc phân lập từ keo ong T. carbonarianăm 2011
Ngoài ra, khi tiến hành sắc ký khí ghép đầu dò khối phổ đối với nhựa quả của
cây bạch đàn lai (Corymbia torelliana)xác định được các hợp chất 11-16 cho thấy có
sự tương quan trong thành phần hóa học của keo ong loài T. carbonaria và nhựa quả
của câybạch đàn lai. Đồng thời kết quả cũng cho thấy, keo ong loài này là sự trộn lẫn
giữa sáp ong và nhựa quả của câybạch đàn lai theo một tỉ lệ thích hợp.
8



6

1.4.3. Thành phần hóa học của keo ong loài Melipona subnitidaở Brazil

Hình 4. Cấu trúc các hợp chất đƣợc phân lập từ keo ong M. subnitida
Keo ong loài M. subnitida được nghiên cứu bởi Silvana Alves de Souza và các
cộng sự ở vùng Paraiba, Brazil vào năm 2010 đã phân lập được 9 hợp chất, đặc biệt là
hai hợp chất phenylpropanoid acid: 6-O-p-coumaroyl-D-galactopyranose (17), 6-O-
cinnamoyl-1-O-p-coumaroyl-β-D-glucopyranose (18) và các hợp chất flavonoid: 7-
methoxynaringenin (19), 7-methoxyaromadendrin (20), 7,4'-dimethoxyaromadendrin
(21), 4'-methoxykaempferol (22), 3-methoxyquercetin (23), 5-methoxyaromadendrin

(24), 5'-methoxykaempferol (25), trong đó hợp chất 17 là hợp chất mới lần đầu tiên
được công bố trên thế giới (hình 4).
9

1.4.4. Thành phần hóa học của keo ong loài Melipona interrupta ở Brazil
Mẫu keo ong được Ellen Cristina Costa da Silva và cộng sự lấy tại Manaus –
AM, Brazil vào năm 2011. Từ mẫu keo ong của loài M. interruptađãphân lập được 4
hợp chất flavonoid: 5,7,4'-trihydroxyflavone (26), 3,5,6,7,4'-pentahydroxyflavone(27),
naringenin-4'-O-β-D-glucopyranoside (28), myricetin-3-O-β-D-glucopyranoside (29)
(hình 5).

Kết quả thử hoạt tính ức chế DPPH của keo ong loài này cho thấy giá trị EC
50

thấp nhất với cao methanol là 10.0 µg mL
-1
.
10


7

Hình 5. Cấu trúc các hợp chất đƣợc phân lập từ keo ong M. interrupta
1.4.5. Thành phần hóa học của keo ong loài Melipona beecheii ở Mexico
Nghiên cứu của J. A. Pino vào năm 2003 đã xác định được thành phần các hợp
chất dễ bay hơi trong keo ong Apis mellifera và Melipona beecheii ở bang Yucatán,
phía Đông Nam Mexico. Kết quả phân tích bằng sắc ký khí ghép đầu dò khối phổ cho
thấy, trong hai mẫu keo ong có khoảng 120 hợp chất, trong đó 99 hợp chất có trong
keo ong mật và 92 hợp chất trong keo ong không ngòi đốt.

Đặc biệt, thành phần hóa học của keo ong hai loài này có các hợp chất phổ biến
như α-pinene, β-pinene, trans-verbenol, α-copaene, β-bourbonene, β-caryophyllene,
spathulenol và caryophyllene oxide. Tuy có sự giống nhau về thành phần nhưng hàm
lượng các hợp chất trong hai mẫu là khác nhau, các hợp chất chính trong keo ong của
loài ong mật là α-pinene (11.9 %), hexadecanoic acid (10.9 %) và trans-verbenol (7.0
%), trong khi ở keo ong của loài ong không ngòi đốt có thành phần chính là α-pinene
(17.6 %), β-caryophyllene (11.8 %), spathulenol (9.7 %), caryophyllene oxide (9.5 %),
β-bourbonene (9.2 %), β-pinene (6.7 %), α-copaene (4.8 %) và trans-verbenol (4.0 %).

Từ kết quả đó có thể kết luận rằng, thành phần hóa học của keo ong rất đa dạng,
nó có nguồn gốc từ các loài thực vật trong khu vực và có sự khác nhau về thành phần
hóa học tùy vào mỗi loài ong, kể cả khi chúng sinh sống trong cùng một môi trường.
11
1.5. Hoạt tính sinh họccủa keo ong của một số loài ong không ngòi đốt
1.5.1. Hoạt tính kháng ung thƣ của keo ong loài Trigona laeviceps ở Thái Lan
Trigona laeviceps là loài ong bản địa ở Thái Lan cho lượng keo ong tương đối
lớn. Keo ong của loài này đã được thử nghiệm hoạt tính kháng ung thư trên 5 dòng tế
bào ung thư là ung thư ruột kết (SW620), ung thư vú (BT474), ung thư gan (Hep-G2),
ung thư phổi (Chago), ung thư dạ dày (Kato-III) cùng 2 dòng tế bào bình thường là tế
bào gan (CH) và các nguyên bào sợi (HS-27).

1



8
Kết quả nghiên cứu cho thấy, cao ethanol của keo ong của loài T. laeviceps có
hoạt tính mạnh trên cả 7 các dòng tế bào thử nghiệm, trong đó hoạt tính mạnh nhất đối
với dòng tế bào SW620 có giá trị IC
50

là 19.9 µg mL
-1
, các dòng tế bào còn lại đều có
IC
50
< 50 µg mL
-1
. Tuy nhiên, cao hexane của keo ong loài này chỉ có hoạt tính trên
dòng tế bào SW620 với giá trị IC
50
là 16.4µg mL
-1
mà không có hoạt tính trên 2 dòng tế
bào thường.

Từ đó có thể kết luận rằng, keo ong của loài T. laeviceps của Thái Lan chứa
một số hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh, có khả năng kháng các dòng tế bào ung
thư mà không gây hại trên các dòng tế bào bình thường.
12
1.5.2. Hoạt tính kháng khuẩn của keo ong của loài Trigona sp. ở Ấn Độ
Keo ong của loài Trigona sp. được sử dụng rộng rãi trong y học dân gian Ấn Độ
để điều trị nhiều loại bệnh. Tiến hành phân lập các hợp chất của cao ethanol cho thấy
có chứa 24 hợp chất với 9 chất đã được biết và 15 chất mới chưa được công bố thuộc
họ alkane, thiophilic acid, acid thơm, acid béo, đường, ester và terpene.
Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của cao ethanol cho thấy hoạt động kháng
khuẩn mạnh đối với cả vi khuẩn gram (–) và gram (+) cũng như đối với nấm men. Giá
trị MIC trong khoảng 1.2- 9.8 g mL
-1
trong khi giá trị MBC/MFCtrong khoảng 2.4-
19.5 g mL

-1
. Thời gian để đạt được hoạt tính khoảng 90 % từ 1.1 đến 3.5 giờ với giá
trị MIC tương ứng.
13
1.5.3. Hoạt tính kháng khuẩn của keo ong của một số loài thuộc chi Melipona
Cao ethanol của keo ong của ba loài M. fasciculata, M. compressipes và M.
quadrifasciata ở Brazil cho thấy có khả năng kháng vi khuẩn gram (–) với hàm lượng
flavonoid cao cho kết quả kháng khuẩn cao. Do tác dụng kháng vi khuẩn Candida
albicans, Streptococcus mutans, Lactobacillus sp. và Glucosyl transferases nên keo
ong của các loài này đã được đề nghị như là một chất hỗ trợ để phòng ngừa các bệnh
truyền nhiễm của khoang miệng, đặc biệt là bệnh sâu răng. Ngoài ra, các nghiên cứu
của keo ong thuộc chi Melipona ở Brazil còn tìm được các hoạt chất có khả năng
kháng khuẩn trên 2 loài Streptococcus pneumoniae và Staphylococcus aureus.
14





9
1.5.4. Hoạt tính kháng tăng trƣởng các dòng tế bào ung thƣ của keo ong không
ngòi đốt loài Melipona scutellaris ở Brazil
Theo nghiên cứu của Marcos Guilherme da Cunha và các cộng sự, mẫu keo ong
được lấy ở miền Bắc Brazil vào năm 2013 được tiến hành chiết với các dung môi
ethanol, hexane, chloroform, ethyl acetate thu được các cao tương ứng. Tiến hành thử
hoạt tính kháng tăng trưởng của các cao này trên 8 dòng tế bào ung thư: u thần kinh
đệm (U251), ung thư da (UACC-62), ung thư vú (MCF-7), ung thư buồng trứng kháng
đa thuốc (NCI/ADR-RES), ung thư thận (786-0), ung thư phổi (NCI-H460), ung thư
tuyến tiền liệt (PC-3), ung thư buồng trứng (OVCAR-3), đều thu được giá trị TGI< 50
µg mL

-1
đối với cao ethanol và cao hexane. Trong đó, cao hexane có hoạt tính mạnh
nhất trên tất cả các dòng ung thư với giá trị TGI lần lượt là 7.2, 1.8, 14.1, 14.3, 8.5,
9.6, 6.0, 3.9 µgmL
-1
.

Cao ethanol của keo ong loài này cũng có khả năng kháng khuẩn với giá trị
MIC < 50 µg mL
-1
trên 3 dòng vi khuẩn gram (+) là Streptococcus mutans UA 159,
Staphylococcus aureus ATCC 25923, vi khuẩn Staphylococcus aureus ATCC 33592
kháng meticillin (MRSA) và cho khả năng ức chế yếu với dòng vi khuẩn gram (–) như
Pseudomonas aeruginosa ATCC 25619.
15
1.5.5. Một số hoạt tính sinh học của keo ong loài Melipona orbignyiở Brazil
Keo ong loài M. orbignyi được lấy ở tiểu bang Mato Grosso do Sul trong khu
vực Trung Tây của Brazil vào năm 2008. Thành phần hóa học của keo ong được xác
định chủ yếu là các hợp chất flavonoid. Kết quả thử hoạt tính cho thấy khả năng kháng
một số vi khuẩn gram (+) như Staphylococcus aureus, Candida albicans và không có
ảnh hưởng đến các vi khuẩn gram (–) như Escherichia coli. Đồng thời, keo ong loài
này còn có khả năng ức chế DPPH và gây độc dòng tế bào ung thư máu K562.
16
2. TỔNG QUAN VỀ UNG THƢ TUYẾN TỤY
2.1. Giới thiệu về ung thƣ tuyến tụy
2.1.1. Tụy và ung thƣ tuyến tụy
Tụy là một tuyến nằm phía sau dạ dày và phía trước cột sống, có chức năng sản
xuất ra dịch tiêu hoá và các hormone điều hoà lượng đường huyết trong máu (hình 6).
Tế bào của tuyến tụy ngoại tiết sản xuất ra dịch tiêu hoá thức ăn, còn tế bào của tuyến
tụy nội tiết sản xuất insulin và một số hormone khác.

10


Hình 6. Vị trí và cấu tạo của tuyến tụy
Ung thư tuyến tụy có nguồn gốc từ các mô của tuyến tụy, trong đó 75 % ung
thư tuyến tụy là xảy ra ở phần đầu tụy, 15 - 20 % ở phần thân, 5 - 10 % ở phần đuôi
tụy. Ung thư ở đầu tụy có triệu chứng xuất hiện sớm hơn ung thư ở thân và đuôi tụy
(triệu chứng do chèn ép đường mật), do đó có tỉ lệ phẫu thuật cắt bỏ cao hơn.
Ung thư tuyến tụy thường di căn nhanh và ít khi được phát hiện ở giai đoạn
đầu, đó là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trong các loại bệnh ung thư. Mặc dù
hiện nay đã có nhiều phương pháp xét nghiệm hiện đại nhưng việc phát hiện các khối
u tụy dưới 2 cm còn rất khó khăn. Thường sau khi khối u xuất hiện một thời gian mới
có biểu hiện lâm sàng, vào thời điểm chẩn đoán thì có đến 25 - 30 % bệnh nhân đã có
tế bào ung thư di căn, thường gặp nhất là di căn ra các hạch bạch huyết quanh tụy,
phúc mạc, gan và đôi khi di căn đến xương và phổi. Chính vì sự di căn lan rộng nên
khó chẩn đoán và hầu như phẫu thuật là rất khó khăn.
17,18
2.1.2. Phân loại ung thƣ tuyến tụy
Hầu hết ung thư tuyến tụy xuất phát từ phần ngoại tiết của tụy, trong đó 80 %
ung thư có nguồn gốc từ biểu mô của tuyến tụy (ung thư ngoại tiết), ngoài ra còn có
ung thư nội tiết ít phổ biến hơn.
Ung thƣ ngoại tiết (exocrine cancer): các tế bào bị ung thư là những tế bào ở
mặt trong ống tụy giúp sản xuất các dịch tiêu hóa còn được gọi là ung thư biểu mô của
tuyến tụy. Đây là một loại khối u biểu mô ác tính, loại ung thư có khả năng di căn
nhiều nhất. Vào thời điểm chẩn đoán, hầu hết các trường hợp ung thư đều đã di căn
đến các vị trí khác của cơ thể. Loại ung thư này có khả năng đề kháng đối với điều trị
nội khoa, do đó cách điều trị duy nhất có khả năng chữa khỏi là phẫu thuật.

11

Ung thƣ nội tiết (endocrine cancer): ung thư hình thành trong các tế bào sản
xuất hormone của tuyến tụy được gọi là ung thư nội tiết hay u tế bào đảo tụy. Loại ung
thư này rất ít khi gặp. Hầu hết các khối u nội tiết hoạt động theo kiểu lành tính.
Các bệnh lý ác tính khác của ung thư tụy bao gồm: ung thư nang tuyến (acinar
cell carciomas), ung thư mô liên kết của tụy (sarcomas), ung thư mô bạch huyết của
tụy (lymphomas),…
18
2.1.3. Các phƣơng pháp điều trị ung thƣ tuyến tụy
2.1.3.1. Hóa trị
Hóa trị là việc sử dụng thuốc để tiêu diệt các tế bào ung thư. Thuốc có vai trò
làm gián đoạn quá trình tổng hợp DNA của tế bào ung thư làm cho tế bào ung thư
không phân bào được và chết.Phần lớn các thuốc sử dụng để hóa trị đều gây nên
những tác dụng phụ bên cạnh khả năng ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư như:
buồn nôn, rụng tóc, mệt mỏi, giảm bạch cầu và tiểu cầu, sốt thiếu máu, gây vô sinh
hay quái thai,…
19

2.1.3.2. Xạ trị
Xạ trị là phương pháp điều trị bằng cách sử dụng tia bức xạ có năng lượng cao
tác động vào khối u để tiêu diệt các tế bào ung thư hoặc ngăn không cho chúng phát
triển. Dưới tác dụng bức xạ ion hoá trực tiếp tác động vào DNA làm DNA bị đứt, gãy
liên kết làm cho tế bào ung thư không phân bào được và chết. Hay bức xạ ion hoá tác
dụng gián tiếp lên phân tử nước gây hiện tượng ion hoá, các phân tử nước tạo thành
các ion hay các hợp chất có khả năng oxy hoá cao, chúng tác động làm tổn thương
DNA.Tia phóng xạ cũng tác động lên chu trình tế bào làm cho tế bào trở nên già yếu
và chết theo chu trình.
Bên cạnh đó xạ trị còn làm thay đổi các đặc tính hay phá hủy tế bào thường,

tăng sai lệch nhiễm sắc thể, gây rối loạn về chuyển hoá. Kết quả cuối cùng là những
biểu hiện như: suy nhược, rụng tóc, đục thuỷ tinh thể, xuất huyết, vô sinh, ung thư và
thậm chí có thể gây tử vong khi sử dụng bức xạ liều cao.
19


2.1.3.3. Phẫu thuật

12
Phẫu thuật là phương pháp điều trị xuất hiện sớm và đến nay nó vẫn là phương
pháp hiệu quả trong điều trị ung thư tuyến tụy. Tùy tình trạng bệnh nhân và tình trạng
khối u mà phương pháp phẫu thuật sẽ được chọn là cắt bỏ một phần hay hoàn toàn
tuyến tụy. Trong điều trị ung thư tuyến tụy, phẫu thuật được phân ra 2 kỹ thuật chính:
Giải phẫu khối u ở phần đầu tụy tạng (Whipple): thực hiện khi ung thư ở
phần đầu hoặc phần móc của tuyến tụy. Phẫu thuật này loại bỏ đầu và phần móc của
tuyến tụy, cùng lúc với tá tràng, túi mật, một phần của dạ dày. Sau đó các phần còn lại
của tuyến tụy, dạ dày và ruột sẽ được nối với nhau tái lập sự lưu thông của đường mật
và dịch tụy giúp cho sự tiêu hóa.
Giải phẫu khối u ở thân và đuôi tụy tạng (Diatt Pancreatectomy): thực hiện
khi ung thư ở thân hoặc ở đuôi tụy. Phẫu thuật này loại bỏ phần thân và đuôi của tuyến
tụy cùng với lá lách.
18,19

2.1.3.4. Phƣơng pháp hỗ trợ điều trị
Phương pháp tốt nhất để điều trị ung thư tuyến tụy là phẫu thuật cắt bỏ, nhưng
cũng không thể loại bỏ tất cả các tế bào ung thư và phải sử dụng hóa trị hay xạ trị để
giảm khả năng tái phát của ung thư.
Do đó, có một nhu cầu cấp bách là phát triển phương pháp trị liệu và tìm kiếm
các tác nhân mới nhằm cải thiện kết quả cho các bệnh nhân ung thư tuyến tụy. Với sự
phát triển của y học giúp hiểu biết thêm về mức độ sinh học phân tử của căn bệnh,

cùng với việc thiết kế mô hình thử nghiệm in vitro và in vivo sử dụng các tác nhân ức
chế trên các dòng tế bào ung thư tuyến tụy, phản ánh ngày càng đúng hơn về bệnh ung
thư tuyến tụy và cho kết quả thử nghiệm chính xác hơn trên cơ thể người.
20

2.1.4. Một số dòng tế bào ung thƣ tuyến tụy
Một số dòng ung thư tuyến tụy thường gặp:
PANC-1: ung thư biểu mô tuyến trên ống tụy.
PSN-1: ung thư biểu mô tuyến trên tụy.
BxPC-3: ung thư biểu mô tuyến trên tụy.
Capan-1: di căn gan của ung thư biểu mô tuyến trên tụy.
PL45: chủ yếu ở ung thư biểu mô tuyến trên gốc ống tụy.
AsPC-1: do sự ghép mô giữa chuột không lông với tế bào cổ trướng ở
người bị ung thư tuyến tụy.

13
Trong đó, dòng tế bào PANC-1 được tách ra và nuôi dưỡng từ biểu mô của ống
dẫn trên tuyến tụy của bệnh nhân bị ung thư tuyến tụy dạng biểu mô. Dòng tế bào này
có chu kỳ sống ngoài cơ thể là 52 giờ. Các thử nghiệm cho thấy, dòng tế bào PANC-1
vẫn duy trì một số đặc điểm riêng biệt của các tế bào biểu mô ống tụy. Đây là yếu tố
quan trọng để lựa chọn dòng tế bào PANC-1 cho các nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng
của bệnh ung thư tuyến tụy.
21
2.2. Một số hợp chất phân lập từ tự nhiên có khả năng kháng ung thƣ tuyến
tụy trên dòng tế bào PANC-1 -1
2.2.1.
Keo ong Mexico: Mẫu keo ong được lấy ở Caborca, bang Sonora, Mexico vào
tháng 5 năm 1999. Feng Li và các cộng sự đã phân lập được 46 hợp chất, trong đó có 5
hợp chất mới thuộc khung flavonoid lần đầu tiên được công bố. Tất cả 46 hợp chất
được phân lập từ keo ong Mexicođã được thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư tuyến

tụy trên dòng PANC-1, kết quả cho thấy có 31 hợp chất có giá trị PC
50
< 100 µM, đặc
biệt hợp chất (2R,3R)-3-O-(2-methylbuthanoyl)-5-hydroxy-7-methoxyflavanone cho
giá trị PC
50
thấp nhất là 4.6 µM (hình 7), so với chất đối chứng dương arctigenin
(PC
50
= 0.4 µM).
22,23

Hình 7. Cấu trúc của (2R,3R)-3-O-(2-methylbuthanoyl)-5-hydroxy-7-methoxyflavanone
Keo ong đỏ Brazil: Mẫu keo ong đỏ Brazil được lấy từ miền Nam bang
Paraiba, Brazil năm 2005. Suresh Awale cùng các cộng sự đã phân lập được 43 hợp
chất, trong đó có 3 hợp chất mới lần đầu tiên được công bố.Các hợp chất phân lập từ
keo ong đỏ Brazil được thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư tuyến tụy trên dòng
PANC-1, kết quả cho thấy có 7 hợp chất có giá trị PC
100
< 100 µM, đặc biệt hợp chất
(6aR,11aR)-3,8-dihydroxy-9-methoxypterocarpan có giá trị PC
100
thấp nhất là 12.5 µM
(hình 8), cùng với chất đối chứng dương là arctigenin (PC
100
=1.0 µM).
24


14

Hình 8. Cấu trúc của (6aR,11aR)-3,8-dihydroxy-9-methoxypterocarpan
Keo ong Myanmar: Mẫu keo ong được lấy tại làng Ywar Taw, Myanmar vào
năm 2006. Feng Li cùng các cộng sự đã phân lập được 17 hợp chất có trong keo ong
này, trong đó có 2 hợp chất mới triterpene khung cycloartane lần đầu tiên được công
bố. Tất cả 17 hợp chất này được thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư tuyến tụy dòng
PANC-1, kết quả cho thấy có 10 hợp chất có giá trị PC
50
< 100 µM, đặc biệt hợp chất
(24E)-27,28-dihydro-3-oxoxycycloart-24-en-26-oic acid cho giá trị PC
50
thấp nhất là
4.3 µM (hình 9), cùng với chất đối chứng dương là arctigenin (PC
50
= 0.4 µM).
25,26

Hình 9. Cấu trúc của (24E)-27,28-dihydroxy-3-oxocycloart-24-en-26-oic acid
2.2.2.
Hạt tô mộc Việt Nam: Theo nghiên cứu của N. T. T. Mai cùng các cộng sự,
mẫu hạt tô mộc được lấy tại tỉnh An Giang, Việt Nam vào năm 2009 đã phân lập được
3 hợp chất mới diterpene khungcleistanthane lần đầu tiên được công bố. Các hợp chất
này được thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư tuyến tụy dòng PANC-1, kết quả cho
thấy cả 3 hợp chất đều cho giá trị PC
50
< 100 µM, đặc biệt là hợp chất tomocinon cho
giá trị PC
50
thấp nhất là 34.7 µM(hình 10), so với chất đối chứng dương arctigenin
(PC

50
= 0.8 µM).
27

Hình 10. Cấu trúc của các hợp chất phân lập từ hạt tô mộc