ĐỀ TÀI: Phân lập các thành phần có khả năng chống oxy hóa trong lá chum ngay

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012
Nghiên cứu Y học

Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền

163
PHÂN LẬP CÁC THÀNH PHẦN CÓ TÁC DỤNG CHỐNG OXI HÓA
TRONG LÁ CHÙM NGÂY (MORINGA OLEIFERA LAM.)
Salihah*, Bùi Thế Vinh*, Trần Công Luận*
TÓM TẮT
Mục tiêu nghiên cứu: Xác định và phân lập các thành phần hóa học có tác dụng chống oxi hóa trong
lá Chùm ngây
Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Lá Chùm ngây tươi thu hái tại Tri tôn, An Giang được chiết
bằng phương pháp ngâm với cồn 96% thu được cao cồn toàn phần. Chiết phân đoạn với dung môi có độ
phân cực tăng dần: Dietyl eter, cloroform, etyl acetat, thu được các cao phân đoạn. Định lượng phenolic
toàn phần trong cao cồn toàn phần và các cao phân đoạn bằng phương pháp Folin – Ciocalteu với chất
chuẩn là acid gallic. Xác định các thành phần có hoạt tính oxi hóa trong cao etyl acetat bằng phương pháp
sắc ký lớp mỏng và phát hiện bằng cách phun thuốc thử DPPH. Sau đó phân lập các thành phần có hoạt
tính chống oxi hóa bằng phương pháp sắc ký nhanh – cột khô và sắc ký cột cổ điển. Xác định cấu trúc của
các chất phân lập được bằng các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, phổ MS và so sánh với các
thông số phổ NMR của các hợp chất đã công bố.
Kết quả: Từ 10 kg lá tươi, thu được 600g cao cồn toàn phần. Chiết phân đoạn thu được 168 g cao eter,
2,63 g cao cloroform, 28,4 g cao etyl acetat và 120g cao nước. Hàm lượng phenolic toàn phần trong cao cồn
toàn phần là 108,011

g/mg. Hàm lượng phenolic toàn phần trong cao eter, cao cloroform, cao etyl acetat và
cao nước lần lượt là 44,528

g/mg, 110,914

g/mg, 271,822


g/mg và 90,881

g/mg tính theo acid gallic
chuẩn. Trong phân đoạn etyl acetat, xác định được 6 vết chất có hoạt tính chống oxi hóa với giá trị Rf lần
lượt là 0,45; 0,29; 0,27; 0,16; 0,12; 0,1 với hệ dung môi: Etyl acetat – metanol – nước (100: 17: 13). Từ
phân đoạn etyl acetat phân lập được 2 hợp chất có hoạt tính chống oxi hóa là chủ yếu là isoquercitrin (200
mg) và vitexin (25 mg).
Kết luận: Lá Chùm ngây chứa nhiều hợp chất phenolic có hoạt tính chống oxi hóa. Trong đó đã phân
lập được 2 hợp chất có hoạt tính chống oxi hóa chủ yếu là vitexin và isoquercitrin. Vitexin là một flavon C-
glycosid được tìm thấy lần đầu tiên từ lá cây này.
Từ khoá: chùm ngây, chống oxy hoá.
ABSTRACT
ISOLATING THE ANTIOXIDANT COMPOUNDS FROM LEAVES OF MORINGA OLEIFERA
LAM.
Salihah, Bui The Vinh, Tran Cong Luan
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 16 - Supplement of No 1 – 2012: 163 - 168
Objects: To define and isolate the antioxidants from leaves of Moringa oleifera Lam.


Materials and Methods: Moringa oleifera fresh leaves collected from Tri ton - An Giang province were
extracted with 96% alcohol. The crude alcohol extract was separated using three solvents: Diethyl ether,
chloroform, and ethyl acetate. Total phenolic contents of extracts were measured with Folin-Ciocalteu reagent
using gallic acid as a standard.
Defining the antioxidants from ethyl acetate extract using thin layer chromatography with DPPH reagent.

Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp. HCM – Viện Dược Liệu
Tác giả liên lạc: PGS.TS. Trần Công Luận, ĐT: 0903671323, Email:

Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012

Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền
164
Then, those antioxidants were isolated by dry-column flash chromatography method and open- column
chromatography method. The structure elucidations were based on analyses of spectroscopic data including 1D-
and 2D-NMR, and MS.
Results: 600 g crude alcohol extract macerated from 10 kg fresh leaves of M. oleifera was fractionated to 168
g diethyl ether, 2.63 g chloroform, 28.4 g ethyl acetate and 120 g water fraction, respectively. Total phenolic
contents of extracts were (1)- alcohol crude extract: 108.011

g GAE/mg, (2)- diethyl ether extract: 44.528

g
GAE/mg, (3)- chloroform extract: 110.914

g GAE/mg, (4)- ethyl acetate extract: 271.822

g GAE/mg, (5)-
water extract: 90.881

g GAE/mg. Six spots on chromatogram having antioxidant activity were defined in ethyl
acetate fraction with Rf values of 0.45, 0.29, 0.27, 0.16, 0.12 and 0.1 with solvent system as etyl acetat – metanol
– water (100: 17: 13). Two antioxidants isolated from ethyl acetate fraction were isoquercitrin (200 mg) and
vitexin (25 mg).
Conclusion: Two antioxidants of phenolic compounds islolated from M. oleifera leaves are vitexin and
isoquercitrin, in which vitexin is found from those leaves at the first time.
Keywords: Moringa oleifera, antioxidant.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) được gọi

là cây “Thần Diệu” vì nó chứa rất nhiều chất
dinh dưỡng quan trọng như: Vitamin C, β-
caroten, protein, các acid amin, và nhiều hợp
chất có tác dụng sinh học như: Zeatin, flavonoid
(quercetin, kaempferol ), α-sitosterol, axit
caffeoylquinic, niazirinin, niaziminin A và B,
benzyl isothiocyanat
(7,8)
. Chính vì thế, nó đã
được nghiên cứu và ứng dụng rất nhiều trong
thực phẩm, y dược học tại nhiều quốc gia trên
thế giới như: Ấn Độ, Pakistan, Ghana, Malaysia,
Thái Lan
(4,6)
. Nhưng tại Việt Nam, Chùm ngây
chưa được quan tâm và nghiên cứu nhiều,
chúng chỉ mọc hoang ngoài tự nhiên, sống rải
rác ở một số vùng từ Quảng Nam đến Phú
Quốc, các bộ phận của cây như quả, lá non, hoa
các nhánh non chỉ dùng làm rau ăn trong dân
gian
(8)
. Gần đây người ta cũng đã quan tâm và tổ
chức trồng ở một số nơi như Tri tôn - An Giang,
Long Khánh - Đồng Nai và đã có một số chế
phẩm ở dạng thực phẩm chức năng được lưu
hành trên trị trường. Nhằm góp phần phát triển
cây Chùm ngây như là một nguồn nguyên liệu
tiềm năng cho các dạng thuốc hay thực phẩm
chức năng trong chăm sóc sức khỏe cho cộng

đồng, chúng tôi tiến hành phân lập các hợp
chính có tác dụng chống oxy hóa trong lá Chùm
ngây.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Lá Chùm ngây được thu hái tại Tri Tôn, An
Giang vào đầu tháng 8/2010. Mẫu sử dụng bao
gồm cả cuống lá và lá chét còn tươi.
Chiết xuất dược liệu
10 kg lá tươi được chiết bằng phương pháp
ngâm ở nhiệt độ phòng, với dung môi chiết là
cồn 96%, theo tỉ lệ 6: 1 và chiết 6 lần. Cô dưới áp
suất giảm thu được cao cồn toàn phần, chiết
phân đoạn lần lượt với các dung môi có độ
phân cực tăng dần: Dietyl eter, cloroform, etyl
acetat, nước thu được các cao phân đoạn: Cao
eter, cao cloroform, cao etyl acetat và cao nước.
Định lượng phenolic toàn phần
Bằng phương pháp Folin – Ciocalteu theo
Waterman và Mole (1994)
(2)
. Dựng đường chuẩn
acid gallic với giai mẫu 10 g, 20 g, 30 g, 40
g, 50g, dựa và phương trình đường chuẩn để
xác định hàm lượng phenolic toàn phần trong
mẫu thử. Hàm lượng phenolic toàn phần được
tính bằng g đương lượng acid gallic có trong 1
mg mẫu thử (g GAE/ mg). Tiến hành thí
nghiệm như sau: Hút một thể tích xác định mẫu
(Chất chuẩn acid gallic hoặc mẫu cần định
lượng được pha loãng ở nồng độ thích hợp) cho

vào bình định mức 10 ml.Thêm 6 ml nước cất,
lắc đều. Cho vào bình 0,5 ml thuốc thử Folin-
Ciocalteu, lắc đều. Để yên trong 5 phút.Thêm 1,5
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012
Nghiên cứu Y học

Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền

165
ml Na
2
CO
3
, lắc đều. Thêm nước cho vừa đủ
10ml. Để yên trong tối 2h. Sau đó tiến hành đo
độ hấp thu ở bước sóng 758 nm.
Xác định các thành phần có hoạt tính
chống oxi hóa trong phân đoạn etyl acetat
Bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng với hệ
dung môi khai triển: etyl acetat – metanol –
nước (100: 17: 13)
(1)
. Sau khi khai triển, bản mỏng
được quan sát dưới đèn UV 254 nm và UV 365
nm. Sau đó phun thuốc thử DPPH 0,05% lên bề
mặt của bản mỏng và ủ ở nhiệt độ phòng trong
10 phút. Những thành phần có hoạt tính chống
oxi hóa sẽ tạo những vạch màu vàng trên nền
tím của bản mỏng, do chất chống oxi hóa làm
mất màu tím của thuốc thử DPPH. Chứng

dương là vitamin C. So sánh bằng mắt thường
độ mất màu của vạch chứng dương và các vạch
có hoạt tính khác để xác định mức độ mạnh yếu
của hoạt tính. Những vạch có hoạt tính chống
oxi hóa được ghi nhận lại bằng giá trị Rf của
chúng.
Sắc ký nhanh – cột khô
(7)

Sử dụng phễu Buchner thành cao đường
kính trong 10 cm, bình tam giác, máy hút chân
không áp suất 70 mmHg. Chất hấp phụ là
silicagel hạt vừa 40 – 60 m. Chiều cao cột chất
hấp phụ 5 cm. Nạp mẫu ở dạng bột khô, khối
lượng mẫu 20 g. Hệ dung môi rửa giải:
Cloroform 100%, etyl acetat 100%, etyl acetat –
metanol (50: 50). Thể tích phân đoạn rửa giải:
500 ml. Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp
mỏng với hệ dung môi etyl acetat – metanol –
nước (100: 17: 13). Các phân đoạn giống nhau
được gộp chung. Cô đến cắn và cân khối lượng.
Sắc ký cột cổ điển
Chất hấp phụ là silicagel hạt vừa (40 – 60
m). Khối lượng chất hấp phụ 350g. Quy cách
cột 4 x 50 cm. Khối lượng mẫu 6 g. Nạp mẫu
bằng phương pháp nhồi bột khô. Dung môi rửa
giải là etyl acetat: metanol. Tốc độ dòng 20 giọt/
phút. Thể tích mỗi phân đoạn 20 ml.
Xác định cấu trúc của các chất phân lập
được bằng phổ

1
H-NMR,
13
C-NMR, DEPT,
COSY, HSQC, HMBC, và phổ MS.
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Chiết xuất dược liệu
Từ 10 kg lá Chùm ngây tươi, chiết bằng cồn
96% thu được 600 g cao cồn toàn phần, độ ẩm
cao là 19,8 %. Hiệu suất chiết là 5,88 %.
Kết quả lắc phân đoạn thu được khối lượng
cao theo bảng 1
Bảng 1: Kết quả thu cao phân đoạn
Phân đoạn Khối lượng
cao (g)
Độ ẩm cao
(%)
Hiệu suất
chiết
Cao eter 168 10,53 28%
Cao cloroform 2,63 15,62 0,44 %
Cao etyl acetat 28,40 18,25 4,7 %
Cao nước 120 19,42 20 %
Định lượng phenolic toàn phần
Hình 1: Phương trình đường chuẩn acid gallic
Dựa vào đường chuẩn acid gallic để xác định
hàm lượng phenolic toàn phần với phương
trình hồi quy: y = 0,014x – 0,0021 và R2 = 0,9955
Bảng 2: Hàm lượng phenolic toàn phần trong cao
cồn toàn phần và cao phân đoạn

Mẫu
Khối
lượng
cao (mg)
OD
758 nm

Hàm lượng
phenolic toàn
phần (g GAE/mg)
Cao toàn phần 0,4 0,483 108,011
Cao eter 0,4 0,221 44,528
Cao cloroform 0,4 0,522 110,914
Cao etyl acetat 0,1 0,309 271,822
Cao nước 0,4 0,408 90,881
Ghi chú: GAE: Gallic acid equivalent (tương đương với
acid gallic)
Nghiên cứu Y học
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012

Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền
166
Hàm lượng phenolic toàn phần trong cao
cồn toàn phần là 108,011 g GAE/ mg. và trong
các cao phân đoạn: Cao eter, cao cloroform, cao
etyl acetat và cao nước lần lượt là 44,528 g
GAE/mg, 110,914 g GAE/mg, 271,822 g
GAE/mg và 90,881 g GAE/mg. Trong đó cao
etyl acetat là phân đoạn có hoạt tính chống oxi
hóa nhất và được lựa chọn để tiếp tục phân lập

các chất có hoạt tính chống oxi hóa trong lá
Chùm ngây.
Xác định các thành phần có hoạt tính chống oxi hóa trong phân đoạn etyl acetat



UV
254 nm
UV
365 nm
Thuốc thử FeCl
3
Thuốc thử DPPH 0,05%
Hình 2: Kết quả sắc ký lớp mỏng phân đoạn etyl acetat, hệ EtOAc – MeOH – H
2
O (100:17:13)
Khi bắt đầu phun thuốc thử DPPH lên bản
mỏng, vitamin C ngay lập tức làm mất màu của
DPPH và tạo vết vàng trên sắc đồ. Đối với các
vết chất trong phân đoạn etyl acetat cũng có tình
trạng tương tự, không cần ủ 10 phút mà các vết
ngay lập tức làm mất màu DPPH. Điều này cho
thấy hoạt tính chống oxy hóa của các thành
phần trong phân đoạn này là rất cao. Trong
phân đoạn etyl acetat có 6 vết chất có màu vàng,
thể hiện hoạt tính chống oxy hóa. Chúng có giá
trị Rf lần lượt là 0,45 ; 0,29 ; 0,27 ; 0,16 ; 0,12; 0,1 ở
hệ EtOAc – MeOH – H
2
O (100:17:13) và đều hiện

màu với thuốc thử FeCl
3.
Sắc ký nhanh – cột khô
Bảng 3: Kết quả các phân đoạn thu được từ sắc ký nhanh – cột khô
Hệ dung môi Phân đoạn tập hợp Phân đoạn
Khối lượng cao
(g)
Thành phần Ghi chú
CHCl
3
C1 1 – 6 0,2 Tạp
C2 7 – 10 0,3044 Tạp
Có các hợp chất phenolic
kém phân cực
EtOAc
E1 11 1,0 Vết X1 + tạp
E2 12 1,2552 X2
E3 13 0,5537 X2 + tạp
E4 14 – 30 8,5278 X3 + X4
Thành phần có hoạt tính
chống oxy hóa
EtOAc – MeOH
(5: 5)
EM 31 – 36 8,3309
Thành phần có hoạt tính
chống oxy hóa
Cao EtOAc
Cao EtOAc
Cao EtOAc
Cao EtOAc

Vitamin C
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012
Nghiên cứu Y học

Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền

167
Phân đoạn E4 được chọn để tiến hành sắc ký
cột cổ điển, phân tách các hợp chất có hoạt tính
chống oxi hóa trong lá Chùm Ngây.
Sắc ký cột cổ điển
Bảng 4: Các phân đoạn thu được từ sắc ký cột cổ điển
Hệ dung
môi
Phân đoạn
tập hợp
Phân
đoạn
Khối lượng
cao (g)
Thành
phần
EtOAc
100%
MO1 1 – 40 0,56 Tạp
MO2 41 – 49 0,35
Tạp + chất
1
MO3 50 – 54 0,11
chất I + ít

tạp
MO4 55 – 80 0,65
chất I +
chất II
MO5 81 – 160 2,19
chất II +
tạp phía
dưới
EtOAc –
MeOH
(95:5)
MO6 136 – 208 1,55 chất II
MO7 209 – 258 1,92
chất II +
chất III
Từ phân đoạn MO3, để qua đêm, xuất hiện
tủa màu vàng lắng dưới đáy. Tách riêng tủa và
rửa tủa bằng metanol, thu được chất I. Từ phân
đoạn MO5 và MO6 để qua đêm, xuất hiện kết
tinh hình kim màu vàng. Tách riêng kết tinh,
làm sạch bằng cách cho tái kết tinh trong dung
môi etyl acetat, thu được chất II
Xác định cấu trúc của hợp chất phân lập
được
Chất I và chất II được đo và giải phổ NMR
(phổ H, phổ C, DEPT, HSQC, COSY, HMBC) và
khối phổ MS. Dựa vào kết quả phổ NMR một
chiều và 2 chiều, dự đoán cấu trúc của chất I là
vitexin và chất II là isoquercitrin. Phổ H và phổ
C của chất I và chất II được đối chiếu với phổ

của chất chuẩn đã được công bố.
Bảng 5: Thông số phổ
1
H (500 MHz, DMSO-d
6
) và
13
C-NMR (125 MHz, DMSO-d
6
) của chất I đối chiếu
với vitexin
(9)


Chất I

Vitexin

C

13C

1H

13C

1H


δ

(ppm)
δ
(ppm)
δ
(ppm)
δ
(ppm)

2

163,85
102,37
181,97
155,90
98,08
164,98

Chất I

Vitexin

162,49
104,55
160,32
103,96
121,54
128,81
115,73
161,03
115,73

128,81
73,31
70,82
78,62
70,54
81,72
61,26
3
102,37 6,77 102,51 6,94 (1H, s, H-3)
4
181,97 182,73
5
155,90 13,16 155,64 13,17 (1H, s, 5-OH)
6
98,08 98,45 6,44 (1H, s, H-6)
7
162,49 162,31 10,83(1H, s, 7-OH)
8
104,55 104,56
9
160,32 160,28
10
103,96 104,07
1’

1
121,54
122,07

2’

128,81 8,03
128,99
8,26 (1H, d, J = 8,7
Hz, H-2’)
3’
115,73 6,90
115,01
7,05 (1H, d, J= 8,7
Hz, H-3’)
4’
161,03
161,32
10,35 (1H, s, 4’-OH)
5’
115,73 6,88
115,01
7,05 (1H, d, J= 8,7
Hz, H-5’)
6’
128.81 8,01
128,99
8,26 (1H, d, J = 8,7
Hz, H-6’)
1”
73,31 4,93
73,93
4,94 (1H,d, J = 9,8
Hz, H-1’’)
2”
70,82

71,03

3”
78,62
79,01

4”
70,54
70,20

5”
81,71
81,29

6”
61,26
61,36

Bảng 6: Kết quả phổ
1
H (500 MHz, DMSO-d
6
) và
13
C-
NMR (125 MHz, DMSO-d
6
) của chất II đối chiếu với
isoquercitrin
(3)

Chất II

isoquercitrin

C

13C

1H

13C

1H


δ
(ppm)
δ
(ppm)
δ
(ppm)
δ
(ppm)

2
156,16 156,0
3
133,35 133,2

Nghiên cứu Y học
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012

Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền
168

Chất II

isoquercitrin

4
177,39 177,2
5
161,18 161,0
6
98,58 6,20 98,6
6,18 (1H, d, J = 1,8
Hz, H-6)
7
164,03 164,0
8
93,42 6,40 93,5
6,39 (1H, d, J = 1,8
Hz, H-8)
9
156,27 156,1
10
103,95 103,9
1’
1

121,15
121,0

2’
115,15 7,56
115,1
7,56 (1H, br s, H-2′)
3’
144,72
144,6

4’
148,37
148,3

5’
116,19 6,83
116,1
6,83 (1H, d, J = 9,0
Hz, H-5′)

Chất II

isoquercitrin

6’
121,51 7,58
121,5
7,58 (1H, d, J = 9,0
Hz, H-6′)

1”
100,96 5,45
100,8
5,45 (1H, d, J = 6,9
Hz, H-1″)
2”
74,06
74,1

3”
76,49
76,5

4”
69,94
70,0

5”
77,42
77,5

6”
60,97
61,0

Cấu trúc chất I là vitexin (C
21
H
20
O

10
: (1S)-1,5-anhydro-
1-[5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4-oxo-4H-
chromen-8-yl]-D-glucitol) và chất II là isoquercitrin
(C
21
H
20
O
12
: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-4-
oxo-4H-chromen-3-yl β-D-glucopyranosid).



Cấu trúc của chất I - vitexin Cấu trúc của chất II - isoquercitrin
Hình 3: Cấu trúc của vitexin và isoquercitrin
KẾT LUẬN
Lá Chùm ngây chứa nhiều hợp chất có
hoạt tính chống oxi hóa, các hợp chất này liên
quan đến nhóm hợp chất phenolic. Trong đó
hai hợp chất flavonoid có hoạt tính chống oxi
hóa chủ yếu của lá đã được xác định là vitexin
và isoquercitrin. Vitexin là một flavon C-
glycosid được phân lập từ lá cây này lần đầu
tiên.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bhattarai H. D., Babita P., Hong S.G., Lee H.K., Yim J.H.
(2008), Thin layer chromatography analysis of antioxidant
constituents of lichens from Antarctica, Journal of Natural

Medicine, 62, pp. 481 – 484.
2. Chumark P., Panya K., Yupin S., Srichan P., Noppawan M.
(2008), The in vitro and ex vitro antioxidant properties,
hypolipidaemic and antitherosclerotic activities of water
extract of Moringa oleifera Lam. leave, Journal of
Ethnopharmacology, 119, pp. 439 – 436.
3. Deepralard K., Kawanishi K., Moriyasu M., Thitima P.,
Suttisri R. (2009), Flavonoid glycosides from the leave of
Uvaria rufa with advanced glycation end – products
inhibitory activity, Thai J. Pharm. Sci., 33, pp. 84 – 90.
4. Fahey J.W. (2005), Moringa oleifera: A Review of the Medical
Evidence for Its Nutritional, Therapeutic, and Prophylactic
Properties. Trees for Life Journal,1: pp. 5.
5. Monzon R.B. (1995), Traditional medicine in the treatment of
parasitic diseases in the Philippines, Southeast Asian Journal
of Tropical Medicine and Public Health, 26(3): pp. 421-428.
6. Sabale V., Patel V., Paranjape A., Arya C., Sakarkar S. N. and
Sabale P.M. (2008), Moringa Oleifera (Drumstick): An
Overview, Pharmacognosy Reviews, 2(4), pp. 7-13.
7. Trần Hùng (2006), Phương pháp chiết xuất dược liệu, Bộ môn
Dược liệu, Khoa Dược- Đại học Y Dược, Tp. HCM, tr. 119 -
127.
8. Võ Văn Chi, (1999), Tự điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y Học,
tr. 248.
9. Zhou X., Peng J., Fan G.(2005), Isolation and purification of
flavonoid glycosides from Trollius ledebouri using high-speed
counter-current chromatography by stepwise increasing the
flow-rate of the mobile phase, J Chromatoqr A., 1092 (2), pp.
216 – 221.