Nghiên cứu tuyển chọn một sốchủng vi khuẩn Bacilluscó hoạt tính enzyme proteaza kiềm

i
LỜI CẢM ƠN

Sau gần 3 tháng thực tập tại phòng Vi sinh vật – Viện Sinh học Nông
Nghiệp, trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, dưới sự hướng dẫn của PGS
– TS. Lương Đức Phẩm nên tôi đã hoàn thành cuốn luận văn này.
Qua đây tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS – TS.
Lương Đức Phẩm người đã định hướng nghiên cứu, quan tâm và tận tình
chỉ bảo cho tôi trong suốt quá trình thực tập, cùng các anh chị phòng Vi
sinh vật, những người đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt
nhiệm vụ của mình.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo trường Đại học Nha
Trang, cùng toàn thể các thầy cô giáo trong Viện Công nghệ sinh học đã
tận tình chỉ bảo và truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong những
năm học vừa qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn các anh, chị đang công tác tại Viện Sinh
học Nông Nghiệp, trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội và các bạn cùng
thực tập đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình cùng toàn thể bạn bè
thân thiết, những người đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học
tập, nghiên cứu.

Hà Nội, tháng 6 – 2009
Sinh viên

Nguyễn Thị Phương Như

ii
MỤC LỤC
Trang
Phần I TỔNG QUAN TÀI LIỆU......................................................................3

1.1. Đại cương về Bacillus ...............................................................................4
1.2. Protease...................................................................................................10
1.2.1. Tính chất, đặc điểm của protease ......................................................10
1.2.2. Ứng dụng của protease ....................................................................12
1.2.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng protease trong sản xuất ở Việt
Nam ...........................................................................................................15
Phần II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................16
2.1 Đối tượng – Vật liệu.................................................................................17
2.1.1. Đối tượng .........................................................................................17
2.1.2. Vật liệu.............................................................................................17
2.1.2.1.Thiết bị...........................................................................................17
2.1.3. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật ........................................................18
2.1.3.1. Môi trường NA (dùng để phân lập, giữ giống và nuôi cấy)
(g/l):........................................................................................................18
2.1.3.2. Môi trường thử hoạt tính amylase, protease................................18
2.1.3.3. Cách chuẩn bị môi trường ..........................................................19
2.2. Các phương pháp nghiên cứu ..................................................................19
2.2.1. Phương pháp phân lập ......................................................................19
2.2.2. Phương pháp giữ giống cấy chuyển ..................................................19
2.2.3. Một số phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn.....20
2.2.3.1. Phương pháp quan sát đặc điểm khuẩn lạc .................................20
2.2.3.2. Phương pháp làm tiêu bản tế bào sống .......................................20
2.2.3.3. Phương pháp nhuộm Gram.........................................................21
2.2.3.4. Phương pháp xác định sự hình thành bào tử ...............................22
2.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính Catalase..........................................22
iii
2.2.5. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đo mật độ quang
(OD620nm )...............................................................................................22
2.2.6. Nghiên cứu khả năng thủy phân tinh bột, protein..............................23
2.2.7. Nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn nguyên liệu khác nhau lên

khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme của các chủng Bs, Bm,
BM.............................................................................................................24
2.2.8. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ oxy hòa tan lên khả năng sinh
trưởng của các chủng Bs, Bm, BM .............................................................25
Phần III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN................................26
3.1. Phân lập chủng Bacillus ..........................................................................27
3.2. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc...............................................................27
3.3. Đặc điểm hình thái tế bào ....................................................................28
3.4. Nghiên cứu hoạt tính Catalase .............................................................30
3.5. Nghiên cứu khả năng sinh enzym thuỷ phân tinh bột, protein của ba
chủng Bs, Bm và BM.....................................................................................31
3.6. Nghiên cứu quá trình sinh trưởng của các chủng Bs, Bm và BM trên
môi trường không có chất cảm ứng ............................................................33
3.7 Nghiên cứu quá trình sinh trưởng và sinh enzmy amylaza của 3
chủng vi khuẩn Bs, Bm và BM trên môi trường có chất cảm ứng là tinh
bột tan ........................................................................................................34
3.7.1. Nghiên cứu quá trình sinh trưởng của 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm và
BM trên môi trường có chất cảm ứng là tinh bột tan...................................34
3.7.2. Nghiên cứu quá trình sinh enzyme của 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm
và BM trên môi trường có chất cảm ứng là tinh bột tan..............................35
3.8 Nghiên cứu quá trình sinh trưởng và sinh enzmy proteaza của 3 chủng
vi khuẩn Bs, Bm và BM trên môi trường có chất cảm ứng là cazein...............37
3.8.1. Nghiên cứu quá trình sinh trưởng của 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm và
BM trên môi trường có chất cảm ứng là cazein ..............................................37
iv
3.8.2. Nghiên cứu quá trình sinh enzyme proteaza của 3 chủng vi khuẩn
Bs, Bm và BM trên môi trường có chất cảm ứng là cazein .........................39
3.9. Nghiên cứu quá trình sinh trưởng và sinh enzyme của các chủng Bs,
Bm, BM trên môi trường có bổ sung CaCO3 .................................................41
3.9.1. Nghiên cứu nuôi vi khuẩn trong môi trường có CaCO3 thu

amylaza......................................................................................................41
3.9.2. Nghiên cứu nuôi vi khuẩn trong môi trường có CaCO3 thu
proteaza......................................................................................................44
3.10. Ảnh hưởng của nồng độ oxy hòa tan.................................................47
3.11. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH tới sự sinh trưởng và phát triển của
ba chủng nghiên cứu...................................................................................50
3.12. Nghiên cứu sử dụng bột đậu tương làm nguồn nguyên liệu thay thế ..51
3.13. Nghiên cứu đồ thị tổng hợp động học của quá trình lên men..............54
Phần IV KẾT LUẬN.......................................................................................56
TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................................58

v
DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1: Phân lập khuẩn lạc chủng Bs.........................................................................27
Hình 2: Phân lập khuẩn lạc chủng Bm........................................................................28
Hình 3: Phân lập khuẩn lạc chủng BM.......................................................................28
Hình 4: Hình thái tế bào chủng Bs..............................................................................29
Hình 5: Hình thái tế bào của chủng BM.....................................................................29
Hình 6: Hình thái tế bào của chủng Bm......................................................................30
Hình 7: Thử hoạt tính phân giải protease và amylase của 3 chủng Bs, Bm và BM ....32
Hình 8: Hoạt tính enzyme amylase của chủng Bs trên môi trường có chất cảm ứng là
tinh bột tan..................................................................................................................36
Hình 9: Hoạt tính enzyme amylase của chủng Bm trên môi trường có chất cảm ứng là
tinh bột tan..................................................................................................................36
Hình 10: Hoạt tính enzyme amylase của chủng BM trên môi trường có chất cảm ứng
là tinh bột tan..............................................................................................................37
Hình 11: Hoạt tính enzyme proteaza của chủng Bs trên môi trường có chất cảm ứng là
cazein..........................................................................................................................39
Hình 12: Hoạt tính enzyme proteaza của chủng Bm trên môi trường có chất cảm ứng

là cazein......................................................................................................................40
Hình 13: Hoạt tính enzyme proteaza của chủng BM trên môi trường có chất cảm ứng
là cazein......................................................................................................................40
Hình 14: Ảnh hưởng của CaCO
3
đến sinh enzyme trên môi trường có tinh bột tan của
chủng Bs.....................................................................................................................42
Hình 15: Ảnh hưởng của CaCO
3
đến sinh enzyme trên môi trường có tinh bột tan của
chủng Bm...................................................................................................................42
Hình 16: Ảnh hưởng của CaCO
3
đến sinh enzyme trên môi trường có tinh bột tan của
chủng BM...................................................................................................................43
Hình 17: Ảnh hưởng của CaCO
3
đến sinh enzyme trên môi trường có cazein của
chủng Bs.....................................................................................................................44
vi
Hình 18: Ảnh hưởng của CaCO
3
đến sinh enzyme trên môi trường có cazein của
chủng Bm...................................................................................................................45
Hình 19: Ảnh hưởng của CaCO
3
đến sinh enzyme trên môi trường có cazein của
chủng BM...................................................................................................................45
Hình 20: Ảnh hưởng của độ hiếu khí lên hoạt tính enzyme amylaza của 3 chủng Bs,
Bm và BM trên ở môi trường có bổ sung CaCO

3
.......................................................49
Hình 21: Ảnh hưởng của độ hiếu khí lên hoạt tính enzyme proteaza của 3 chủng Bs,
Bm và BM trên ở môi trường có bổ sung CaCO
3
.......................................................50
Hình 22: Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng Bs, Bm
và BM.........................................................................................................................51
Hình 23: Đồ thị biến đổi pH, hoạt độ enzyme proteaza và mật độ tế bào của Bs trong
môi trường bột đậu tương có CaCO
3
..........................................................................55


vii
DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 3.1: Đường kính phân giải của các enzym và các chủng sinh ra:...............31
Bảng 3.2: Sự sinh trưởng của 3 chủng Bs, Bm, và BM trên môi trường không có
chất cảm ứng .....................................................................................................33
Bảng 3.3. Sự sinh trưởng của chủng Bs trên môi trường có tinh bột tan.............34
Bảng 3.4. Sự sinh trưởng của chủng Bm trên môi trường có tinh bột tan ...........34
Bảng 3.5. Sự sinh trưởng của chủng BM trên môi trường có tinh bột tan...........35
Bảng 3.6. Sự sinh trưởng của chủng Bs trên môi trường có cazein.....................38
Bảng 3.7. Sự sinh trưởng của chủng Bm trên môi trường có cazein...................38
Bảng 3.8. Sự sinh trưởng của chủng BM trên môi trường có cazein...................38
Bảng 3.9: Ảnh hưởng của CaCO
3
đến sự sinh trưởng trên môi ..........................43
trường có tinh bột của 3 chủng Bs, Bm và BM ..................................................43

Bảng 3.10: Ảnh hưởng của CaCO
3
đến sự sinh trưởng trên môi trường có cazein
của 3 chủng Bs, Bm và BM ...............................................................................46
Bảng 3.11: Ảnh hưởng của độ hiếu khí lên khả năng sinh trưởng của 3 chủng Bs,
Bm, BM ............................................................................................................48
Bảng 3.12: Ảnh hưởng của độ hiếu khí tới khả năng sinh trưởng của 3 chủng Bs,
Bm, BM trên môi trường có bổ sung CaCO
3
.....................................................48
Bảng 3.13: Ảnh hưởng của bột đậu tương lên khả năng sinh proteaza, amylaza
của ba chủng Bs, Bm, BM.................................................................................52
Bảng 3.14: Ảnh hưởng của nồng độ CaCO
3
đến khả năng sinh amylaza, proteaza
trên môi trường có bột đậu tương ......................................................................53
1
MỞ ĐẦU

Vi sinh vật trong tự nhiên rất phong phú và đa dạng. Chúng ở xung
quanh ta: trong đất, trong nước, không khí thậm chí cả trong cơ thể con
người. Chúng có thể gây cho ta cả những bất lợi khôn lường như những
bệnh lao, dịch hạch, dịch tả, đại dịch cúm ở người và gia cầm, lở mồm,
long móng ở bò lợn... nhưng chúng cũng có thể đem lại cho chúng ta nguồn
lợi vô cùng to lớn nếu ta biết, hiểu chúng và biết sử dụng chúng vào mục
đích sẽ giúp cho cuộc sống con người tốt đẹp hơn.
Từ thời xa xưa, con người đã biết ứng dụng những hoạt tính có lợi
của vi sinh vật phục vụ cho đời sống của mình như tạo ra các loại rượu quý
nhờ quá trình lên men của vi sinh vật, những bài thuốc chữa bệnh từ vi sinh
vật...

Ngày nay chúng ta đang sống ở thế kỷ 21, thế kỷ của khoa học kỹ
thuật thì công nghệ sinh học và đặc biệt là công nghệ vi sinh càng chứng tỏ
ưu thế của mình.
Hiện nay đã có rất nhiều chất có hoạt tính sinh học khác nhau đã
được tổng hợp từ vi sinh vật đã được đưa vào sản xuất ở mức độ công
nghiệp để phục vụ cho nghiên cứu, công - nông nghiệp, y học và đời sống
của con người.
Các chủng vi khuẩn như: Bacillus, Lactobacillus… đã và đang được
sử dụng trong các chế phẩm sinh học để phục vụ cho các ngành sản xuất
như: rượu, bia, công nghiệp dệt, thuộc da, y học, bổ sung vào thức ăn gia
súc, thức ăn trong nuôi trồng thủy sản, phân hủy thức ăn thừa của tôm, phế
thải hữu cơ làm sạch môi trường nuôi trồng thủy sản... là nhờ khả năng sinh
enzyme thủy phân amylaza, proteaza, xenlulaza của chúng.
2
Xuất phát từ thực tế đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
”Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng vi khuẩn Bacillus có hoạt tính
enzyme proteaza kiềm”. Với các nội dung sau:
1. Phân lập từ đất vườn qua trung gian là cỏ khô và khoai tây để chọn
các chủng Bacillus.
2. Nghiên cứu các đặc điểm về hình thái tế bào khuẩn lạc, nghiên
cứu một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng đã được tuyển chọn.
3. Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy để thu sinh khối có hoạt tính
cao.
Đề tài được thực hiện tại phòng Vi sinh vật của Viện Sinh học Nông
nghiệp thuộc trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội.

3




Phần I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU












4
1.1. Đại cương về Bacillus
Vi khuẩn Bacillus là những vi khuẩn Gram dương. Thuộc chi
Bacillaceae, có nội bào tử hình ovan có khuynh hướng phình ra ở một đầu.
Bacillus được phân biệt với các loài vi khuẩn sinh nội bào tử khác bằng
hình dạng tế bào hình que, sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí
không bắt buộc. Tế bào Bacillus có thể đơn hoặc chuỗi và chuyển động
bằng tiêm mao. Nhờ khả năng sinh bào tử nên vi khuẩn Bacillus có thể tồn
tại trong thời gian rất dài dưới các điều kiện khác nhau và rất phổ biến
trong tự nhiên nên có thể phân lập từ rất nhiều nguồn khác nhau như đất,

nước, trầm tích biển, thức ăn, sữa,... nhưng chủ yếu là từ đất nơi mà đóng
vai trò quan trọng trong chu kỳ C và N [ 10 ]
Tất cả các loài thuộc chi Bacillus đều có khả năng dị dưỡng và hoại
sinh nhờ sử dụng các hợp chất hữu cơ đa dạng như đường, acid amin, acid
hữu cơ,... Một vài loài có thể lên men carbohydrat tạo thành glycerol và
butanediol; một vài loài như Bacillus megaterium thì không cần chất hữu
cơ để sinh trưởng, một vài loài khác thì cần acid amin, vitamin B. Hầu hết
đều là loài ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ tối ưu là 30 - 45
0
C, nhưng cũng
có nhiều loài ưa nhiệt với nhiệt độ tối ưu là 65
0
C [11].
Đa số Bacillus sinh trưởng ở pH = 7, một số phù hợp với pH = 9 –
10 như Bacillus alcalophillus, hay có loại phù hợp với pH = 2 – 6 như
Bacillus acidocaldrius.
Bacillus có khả năng sản sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease,
cellulase…), do đó chúng được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp,
trong bảo vệ môi trường, …
Sau đây là một số loài Bacillus thường gặp trong tự nhiên:


5
Bacillus subtilis
Bacillus subtilis được nhà khoa học cùng thời với Robert Koch tên là
Ferdinand Cohn phát hiện và đặt tên năm 1872 [13] .
Bacillus subtilis được gọi là trực khuẩn cỏ khô vì nó phân bố nhiều
trong đất và đặc biệt là ở cỏ khô.
Chúng phân hủy pectin và polysaccarit ở mô thực vật và góp phần
gây nên các nốt trên củ khoai tây bị u. Chúng sinh trưởng trên môi trường

nguyên thủy xác định mà không cần bổ sung thêm yếu tố kích thích sinh
trưởng. Sự sinh trưởng phát triển của chúng góp phần làm hỏng các nguyên
liệu có nguồn gốc động thực vật. Chúng không sinh trưởng trên thực phẩm
có tính axit ở điều kiện tối ưu. Chúng là nguyên nhân gây hư hỏng bánh mì.
Phần lớn thông tin chúng ta có về đặc điểm sinh học, hóa sinh, di truyền
của các vi khuẩn Gram dương khác đều nhận được từ việc nghiên cứu
Bacillus subtilis [13].
Chúng là những vi khuẩn hình que, ngắn, nhỏ, kích thước
( 3 – 5) x 0,6 m.
Chúng phát triển riêng rẽ như những sợi đơn bào ít khi kết chuỗi sợi
[13]. Khuẩn lạc khô, vô màu hay xám nhạt, có thể màu trắng hơi nhăn hoặc
tạo ra lớp màng mịn lan trên bề mặt thạch, mép nhăn hoặc lồi lõm nhiều
hay ít, bám chặt vào môi trường thạch.
Bacillus subtilis sinh trưởng tốt nhất ở 36
0
C – 50
0
C, tối đa khoảng
60
0
C. Là loại ưa nhiệt cao. Bào tử của Bacillus subtilis cũng chịu được
nhiệt khá cao.
Bào tử hình bầu dục, kích thước 0,6m – 0,9m. Phân bố không theo
nguyên tắc chặt chẽ nào, lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm. Chúng
phát tán rộng rãi. Chúng là một thể nghỉ sinh ra vào cuối thời kỳ sinh
trưởng phát triển của vi khuẩn. Chúng không có khả năng trao đổi chất nên
6
có thể sống được vài năm đến vài chục năm, thậm chí đến 200 – 300 năm
[1].
Vi khuẩn Bacillus subtilis được xem là vi sinh vật điển hình vì có

những đặc tính tiêu biểu không gây hại nên đây là một trong những vi
khuẩn được sử dụng để sản xuất enzyme và các hóa chất đặc biệt như:
amylase, protease, inosine, ribosides, acid amin, subtilisin [14]. Ngoài ra
nhờ khả năng bám dính proton lên bề mặt mà B. subtilis có thể loại bỏ được
chất thải phóng xạ như Thorium (IV) và Plutonium (IV) [12]. Đặc biệt,
B.subtilis được sử dụng trong lên men Natto của Nhật – một thực phẩm
chức năng rất bổ dưỡng cho sức khỏe [15].
Bacillus megaterium
Megaterium có nghĩa là “ con thú lớn” [13]. Tế bào của nó khá lớn
khoảng gấp hơn 2 lần tế bào của Bacillus subtilis, chiều ngang (1,2 –
1,5)m có thể đến 2 m, dài từ 3 – 12 m, ở các ống nuôi già thì tế bào
ngắn hơn, tròn hơn, đôi khi hình thoi với đầu hẹp lại. Tế bào chứa nhiều hạt
nhỏ và chất dinh dưỡng dự trữ (hạt mỡ, glycogen) [2].
Bào tử lớn hình ovan hay bầu dục, kích thước 1,5 x (0,7-1)m, bào
tử lớn nhất có đường kính từ 1,2 đến 1,5 m [13]. Chúng nằm lệch tâm
thường theo chiều ngang hoặc xiên của tế bào.
Khuẩn lạc tròn đều không thùy, không nếp, mép tròn đều hoặc hơi
lượn sóng, trông giống giọt bạch lạp, lồi nhẵn, nhưng thường có vòng viền
quanh đồng tâm trên bề mặt, màu trắng sữa hay đục.
Sinh trưởng trên môi trường dinh dưỡng đơn giản không cần thêm
bất kỳ một yếu tố sinh trưởng nào.
Bacillus megaterium cũng sản sinh ra các enzyme tương tự
B.subtilis, do đó nó cũng được ứng dụng nhiều trong công nghiệp.

7
Bacillus mensentericus
Bacillus mensentericus còn được gọi là trực khuẩn khoai tây do nó
có mặt chủ yếu trên khoai tây. Trực khuẩn gần giống Bacillus subtilis,
mảnh dài hoặc ngắn ( 3- 10 ) x ( 0,5 – 0,6 ) m, có thể đứng riêng rẽ hoặc
chuỗi dài.

Bào từ hình bầu dục và kéo dài 0,5 – 0,9 m, nằm ở vị trí bất kỳ
trong tế bào, tế bào Bacillus mensentericus không bị phình to khi mang bào
tử.
Khuẩn lạc bám chặt vào môi trường thạch, có khi dính vào môi
trường, mỏng, nhăn nheo, xám nhạt – trắng, có thể màu Crem, vàng nâu,
hồng hoặc đen như Bacillus mensentericus niger ( đen ), Bacillus
mensentericus ruber (hồng).
Bacillus mensentericus sinh trưởng và phát triển tốt nhất ở nhiệt độ
36 – 45
0
C tối đa 50 – 55
0
C. pH = 4,5 – 5 thì nó ngừng phát triển.
Bacillus mensentericus có hoạt tính amylase và protease lớn hơn hẳn
Bacillus subtilis, nhưng lên men đường lại kém hơn.
Hai loại trực khuẩn này rất phổ biến trong tự nhiên, chúng lây nhiễm
làm hư hỏng thực phẩm, nhất là các thực phẩm có chứa nitơ và các sản
phẩm giàu đường ( bánh kẹo, hoa quả) đây cũng là loại được ứng dụng vào
ngành công nghệ sản xuất enzyme protease, amylase… Ngoài ra, nó còn
sinh ra một loại hợp chất có hoạt tính kháng với một số vi khuẩn khác ( như
Vibrio) gọi là bacterioxin, ở Bacillus subtilis gọi là subtilin hay Irutin A, B
Bacillus cereus
Đây là loại có mối quan hệ gần gũi với Bacillus anthracis, Bacillus
mycoides, Bacillus thuringiensis. Bào tử của chúng phát tán khắp nơi, trong
đất, không khí… Chúng thường sinh sôi nảy nở trên thực phẩm như cơm và
có thể sinh ra độc tố làm cho thực phẩm hư hỏng. Chúng được áp dụng để
8
sản xuất kháng sinh, giống Bacillus này có độc tính, gây ngộ độc thực
phẩm [13].
Tế bào Bacillus cereus dày, kích thước (1 – 1,5) x (3 – 5)m, có khi

dài hơn, chúng đứng riêng rẽ hay xếp chuỗi. Bào tử hình bầu dục kích
thước 0,9 x (1,2 – 1,5)m nằm lệch tâm, tế bào chất của nó chứa các hạt và
không bào [2]. Khuẩn lạc của Bacillus cereus phẳng, khá khuyếch tán, hơi
lõm, trắng đục, mép lồi lõm [3] .
Bacillus pumilus
Bào tử phát tán rộng khắp mọi nơi, thường B.pumilus có mặt trong
đất nhiều hơn subtilis.
Khuẩn lạc nhỏ, xung quanh viền mờ lan không ranh giới. Tế bào của
nó gần giống tế bào B.subtilis.
Bacillus polymyxa
Bacillus polymyxa có khuẩn lạc vô màu, phẳng hoặc lồi , trơn, nhày,
lan dần ra xung quanh, mép đôi khi có thùy.
Tế bào của Bacillus polymyxa có kích thước (0,6 – 1) x (2 – 7)m,
đứng riêng rẽ hay xếp thành đôi, chuỗi ngắn. Khi hình thành bào tử tế bào
đó sẽ phồng lên hình quả chanh [3].
Bào tử hình bầu dục kéo dài, trên bề mặt cắt ngang như hình sao.
Chúng phát tán rộng, kích thước dài khoảng (1,7 – 2,6)m, nằm giữa tế bào
[13]. Loại vi khuẩn này làm giảm pectin và polysaccarit trong cây. Chúng
còn có khả năng cố định đạm.
Chúng thường sinh trưởng phát triển trên thực vật đang bị hỏng. Vì
vậy người ta thường phân lập chúng từ thực phẩm. Môi trường kem và
những môi trường có tính axit yếu phù hợp với loại vi khuẩn này. Chúng là
nguồn để sản xuất kháng sinh polymyxin. Đây là một loại vi khuẩn rất phổ
biến và có ích, chủ yếu là cho công nghiệp dược.
9
Bacillus brevis
Người ta thường tìm thấy và phân lập chúng từ đất và thực phẩm.
Khuẩn lạc của chúng màu trắng, đôi khi có sắc vàng, lồi hoặc phẳng
lấp lánh, mép răng cưa giống dạng mỡ đặc.
Bacillus brevis là trực khuẩn kích thước (0,7 – 1) x (3 – 5)m.

Chúng thường đứng riêng rẽ. Bào tử hình bầu dục, có kích cỡ ( 0,8 – 1)
m, nằm cuối tế bào làm cho đầu tế bào hơi phồng to lên [3].
Về nhu cầu dinh dưỡng, Bacillus brevis yêu cầu một hỗn hợp axit
amin cho sinh trưởng và phát triển, không cần bổ sung vitamin [13] .
Bacillus simplex
Khuẩn lạc giống khuẩn lạc B.cereus, phẳng, khá khuyếch tán, với bề
mặt hơi xù xì (dạng bột hoặc hạt nhỏ), hơi lõm, màu đục, mép lồi lõm. Đặc
biệt khuẩn lạc của Bacillus simplex có khả năng sinh sắc tố lục nhạt, vàng
và tiết vào môi trường [3].
Tế bào của nó nhỏ bé, có kích thước (2 – 5) x 0,6m, thường đứng
riêng rẽ không kết thành chuỗi.
Bào tử hình bầu dục, có kích thước 0,6 x 0,9 m, nằm lệch tâm.
Bacillus lincheniformis
Chúng được áp dụng trong việc sản xuất loại vỏ bao poly D –
glutamate và phẩm đỏ cùng với nhiều chủng khác.
Bào tử của chúng phát tán chủ yếu trong đất. Chúng sinh trưởng phát
triển trên các loại thực phẩm. Đặc biệt chúng có khả năng sản xuất ra
bacitracin, một kháng sinh có ích trong y học, nên chúng được ứng dụng
phổ biến trong công nghiệp dược [13].
10
1.2. Protease
1.2.1. Tính chất, đặc điểm của protease
Protease là enzyme xúc tác cho sự thủy phân liên kết peptid [ - CO-
NH-] giữa các loại acid amin trong phân tử protein (hay các nhóm
polypeptide). Sản phẩm thủy phân là các acid amin, sản phẩm trung gian là
các peptide có mạch dài ngắn khác nhau và peptone – sản phẩm thủy phân
không hoàn toàn của protein

H
2

N – CH – CO – NH – CH – CO -…- NH – CH – COOH


H
2
N – CH – COOH + H
2
N – CH – COOH + … + H
2
N – CH – COOH


Protease là một nhóm enzyme phân giải protein ( gồm proteinase,
peptidase, desaminase,…) mà phần lớn được tế bào tiết ra ngoài và hoạt
động ở bên ngoài tế bào.
Protease có chức năng sinh học rất đa dạng, đóng vai trò quan trọng
trong việc điều hòa quá trình trao đổi chất ở sinh vật sống. Ngoài chức
năng xúc tác cho phản ứng thủy phân protein thành acid amin và các hợp
chất có phân tử lượng thấp mà các tế bào có thể dễ dàng hấp thu, protease
còn có vai trò quyết định trong thiết lập, duy trì sự cân bằng giữa tổng hợp
và phân giải protein. Bên cạnh đó chúng còn tham gia vào quá trình hình
thành và nảy mầm bào tử của vi sinh vật, quá trình đông tụ máu, điều chỉnh
huyết áp, biến hình các enzyme và điều hòa biểu hiện gen [4]. So với
protease động vật và protease thực vật thì protease vi sinh vật là một hệ
thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối
lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng
H
2
O
R

1
R
x
R
2

R
2
R
1

R
x
11
nhất. Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi
sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để
và đa dạng.
Người ta cũng phân loại protease theo vùng pH hoạt động tối thích:
protease acid, trung tính và kiềm tính. Tuy nhiên sự phân loại này chỉ có ý
nghĩa thực dụng không thật sự chính xác vì pH hoạt động tối thích của mỗi
enzyme còn phụ thuộc vào bản chất cơ chất và nhiều yếu tố khác nữa [7].
Vi khuẩn B.subtilis là một trong những nhóm vi sinh vật gây thối rữa
tạo nhiều protease ngoại bào và đây là một enzyme protease kiềm (protease
serin). Enzyme này có pH tối ưu trong vùng kiềm (9 – 11) và chứa một
nhóm serin quan trọng ở trung tâm hoạt động.
*Sự phân giải protein ( quá trình thối rữa )
Khác với lên men, cơ chất của quá trình thối rữa là protein. Protein là
thành phần quan trọng của xác động thực vật và vi sinh vật. Protein thường
chứa khoảng 15 – 17 % Nitơ (tính theo chất khô). Nếu như tổng lượng
cacbon trong cơ thể sinh vật sống trên mặt đất là khoảng 7 tỷ tấn thì tổng

lượng nitơ sinh ra cũng tới 10 – 25 tỷ tấn. Trong lớp đất sâu 30cm bao
quanh trái đất và người ta còn thấy thường xuyên có khoảng 3 – 7,5 tỷ tấn
nitơ mà phần lớn là tồn tại trong các hợp chất hữu cơ chứa nitơ. Sự phân
giải các hợp chất chứa nitơ có ý nghĩa rất lớn đối với nông nghiệp và đối
với vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên. Người ta gọi quá trình này là
quá trình amon hóa.
Muốn phân giải protein cũng như đối với các hợp chất cao phân tử
khác, đầu tiên vi sinh vật phải tiết ra các enzyme phân giải protein ngoại
bào và làm chuyển hóa protein thành các hợp chất có phân tử lượng nhỏ
hơn (các polypeptid và các olygopeptid). Các chất này hoặc tiếp tục được
phân hủy thành axitamin nhờ các peptidase ngoại bào, hoặc được xâm nhập
12
ngay vào tế bào vi sinh vật sau đó mới chuyển hóa thành axit amin. Một
phần các axit amin này được các vi sinh vật sử dụng trong quá trình tổng
hợp protein của chúng, một phần khác được tiếp tục phân giải theo những
con đường khác để sinh ra NH
3
, CO
2
và những sản phẩm trung gian khác.
Những vi sinh vật không có khả năng sinh ra những enzyme phân
giải protease ngoại bào rõ ràng là không có khả năng đồng hóa được các
loại protein thiên nhiên. Chúng chỉ có thể sử dụng các sản phẩm thủy phân
của protease (polypeptide, oligopeptid, axit amin) [5]. Các loài thuộc giống
Bacillus (B.subtilis, B.mesentericus, B.megaterium…) có khả năng amon
các hợp chất hữu cơ có chứa nitơ. Chúng là những vi sinh vật đầu tiên tham
gia vào quá trình phân cắt các protein để tạo thành những chất có phân tử
lượng thấp hơn cho các vi sinh vật khác dễ sử dụng.
1.2.2. Ứng dụng của protease
Trong khi cả protease từ động vật, từ thực vật được nghiên cứu và ứng

dụng từ khá lâu trong các ngành công nghiệp sản xuất phomat, thuộc da,
làm bánh mỳ, làm trong bia tươi, thủy phân các protein, làm mềm thịt… thì
protease từ vi sinh vật mới được chú ý nghiên cứu từ 1950, mặc dù từ 1918
– 1919 Waksman đã phát hiện được khả năng sinh protease từ xạ khuẩn
[6]. Do vậy, ngày nay protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành
công nghiệp thực phẩm, công nghiệp nhẹ, công nghiệp dược, nông
nghiệp…
 Ứng dụng trong xử lý nước thải và bảo vệ môi trường
Protease đã được sử dụng dưới dạng chế phẩm thô để xử lý các chất
protein tồn đọng trong môi trường. Vi sinh vật có khả năng sinh protease
cũng được ứng dụng trong lĩnh vực phân hủy sinh học.
 Trong công nghiệp thực phẩm
13
Trong sản xuất thịt, protease được sử dụng làm mềm thịt nhờ sự thủy
phân một phần protein trong thịt, kết quả là làm cho thịt có độ mềm thích
hợp và tăng hương vị thịt sau chế biến. Phương pháp làm mềm thịt nhờ tác
dụng của protease cho phép nâng cao chất lượng thịt đưa vào chế biến, làm
tăng tỷ lệ thịt có thể đưa vào sản xuất và rút ngắn thời gian chín của thịt
nhiều lần.
Người ta cũng dùng protease để sản xuất dịch đạm thủy phân từ các phế
liệu giàu protein như thịt vụn, da… Người ta sử dụng dịch đạm thủy phân
làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực phẩm và bổ sung vào thức ăn
gia súc. Dùng protease để thủy phân thường ít bị hao hụt axit amin như khi
dùng phương pháp hóa học.
Trong công nghiệp sữa, protease được dùng để sản xuất phomat nhờ
hoạt tính làm đông tụ sữa của chúng. Để làm đông tụ sữa có thể dùng
rennin, pepxin hoặc một số protease vi sinh vật có hoạt tính làm đông tụ
sữa được tách từ nấm mốc và vi khuẩn. Trong số các enzyme này, rennin là
enzyme có giá trị đặc biệt, cho phép thu được sản phẩm có chất lượng cao
nhất còn các protease vi sinh vật thì ngoài khả năng làm đông tụ sữa còn có

khả năng thủy phân sâu sắc cazein, gây ảnh hưởng xấu đến mùi vị của
phomat. Vì vậy người ta cố gắng tìm ra những chủng vi sinh vật sinh
protease có đặc tính đông tụ sữa tương tự như rennin hoặc thay thế một
phần rennin ( 25 – 50 %) [7]
Trong công nghiệp nước giải khát, protease được sử dụng để làm trong
bia, trong nước hoa quả.
 Trong sản xuất các chất tẩy rửa và xà phòng
Xà phòng có bổ sung protease đang chiếm lĩnh thị trường: “xà phòng
sinh học”. Tuy tỷ lệ bổ sung protease vào xà phòng rất thấp (1g/kg) nhưng
hàng năm trên thế giới đã sử dụng tới 50.000 – 60.000 tấn protease trong
14
công nghiệp xà phòng, chất tẩy [A6]. Hiện nay, ở Châu Âu sử dụng 80 – 85
% chất tẩy rửa có enzyme.
 Trong nông nghiệp
Protease được sử dụng để xử lý thức ăn thô chuyển hóa thành dạng dễ
hấp thụ, bổ sung vào thức ăn gia súc.
 Trong công nghiệp da
Protease được dùng trong công nghiệp làm mềm da, làm sạch, tách
lông,… nhờ sự thủy phân một phần protein của da. Chúng ta đã biết, chất
quan trọng của da là collagen. Phân tử của nó gồm những acid amin kết
hợp với nhau thành mạch dài vì vậy làm cho da bị cứng. Dưới tác dụng của
protease các chất nhờn bị tách ra và một liên kết trong sợi collagen bị phá
hủy. Kết quả của sự làm mềm da là loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm
cho da có độ mềm dẻo nhất định, tính chất đó được hoàn thiện hơn sau khi
thuộc da [8].
Trước đây, để làm mềm da người ta dùng protease khu trú trong cơ
quan tiến hóa của động vật. Hiện nay, việc đưa ra các protease tách từ vi
khuẩn (là chủ yếu) vào công nghiệp da đã đem lại nhiều kết quả và dần
chiếm một vị trí quan trọng.
 Trong sản xuất tơ tằm

Quá trình làm tơ tự nhiên tương đối phức tạp và khó khăn. Chúng ta
đã biết tơ là sợi ngoại bào được nhả ra bởi cặp tuyến trùng của con tằm. Sợi
tơ gồm hai sợi fibroin sơ cấp dính lại với nhau nhờ lớp vỏ bằng xerixin.
Sau khi tách hết xerixin thì sẽ được sợi fibroin tinh khiết. Sợi thu được khi
kéo ở kén ra thường có chứa 30% xerixin. Muốn tách xerixin thì phải nấu
tơ tằm trong dung dịch xà phòng trong thời gian từ 1,5 – 2 giờ. Chỉ sau khi
có sự gia công này tơ mới bắt đầu kéo chỉ. Một lượng nhỏ xerixin nằm lại
trên lụa làm giảm độ đàn hồi của lụa, làm cho lụa bắt màu không đồng đều
15
và khó trang trí trên lụa. Người ta đã sử dụng chế phẩm protease từ nấm
mốc, vi khuẩn để tách lượng xerixin còn lại này [8].
Ngoài ra, protease còn được ứng dụng trong công nghiệp mỹ phẩm, y
học:
 Trong hương phẩm và mỹ phẩm: dưới tác dụng của protease trong
kem, các biểu b́ của da đã chết được tách ra, da non sẽ xuất hiện trên bề
mặt, đồng thời sự phát triển lông (tóc) cũng chậm lại.
 Trong công nghiệp y học: các chế phẩm protease cũng được sử dụng
để sản xuất các môi trường dinh dưỡng hỗn hợp có protein dùng trong nuôi
cấy vi khuẩn và các vi sinh vật khác. Chẳng hạn, môi trường dinh dưỡng để
nuôi các vi sinh vật sản xuất ra các kháng sinh kháng độc. Dĩ nhiên, các
protein có trong môi trường phải ở dạng dễ đồng hóa đối với vi sinh vật.
Do đó, phải thủy phân sơ bộ các protein bằng protease để cô đặc và tinh
khiết các huyết thanh kháng độc để chữa bệnh (huyết thanh kháng độc) [8].
1.2.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng protease trong sản xuất ở
Việt Nam
Ở Việt Nam protease chịu kiềm cũng đang được nghiên cứu ở Viện
công nghệ sinh học thuộc trung tâm Khoa Học Tự Nhiên và Công Nghệ
Quốc Gia, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên (Đại Học Quốc Gia Hà Nội), Đại
Học Bách Khoa Hà Nội, viện Công nghệ Thực Phẩm, viện Sinh Học Nhiệt
Đới thành phố Hồ Chí Minh và một số trường Đại Học, Viên nghiên cứu

khác.
Nhiều ứng dụng của protease đã được ứng dụng trong các lĩnh vực
và ngành nghề sản xuất ở Việt Nam như: Trong các ngành nghề công
nghiệp rượu, bia, sữa...Trong sản xuất chất tẩy rửa, trong công nghiệp
thuộc da và trong sản xuất nước tương, nước mắm...

16




Phần II
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU













17
2.1 Đối tượng – Vật liệu
2.1.1. Đối tượng

Các chủng được phân lập từ đất vườn, cỏ khô quanh Viện Sinh học
Nông nghiệp trường Đại học Nông nghiệp I Hà Nội, và khoai tây.
2.1.2. Vật liệu
2.1.2.1.Thiết bị
- Tủ cấy vô trùng - Bình tam giác
- Cân điện tử - Bếp ga
- Kính hiển vi quang học - Máy lắc
- Tủ ấm - Máy đo OD
- Tủ sấy - Tủ lạnh
- Nồi hấp thanh trùng - Máy đo pH
- Bình trụ - Các dụng cụ khác: Pipet, đầu típ, nồi,
đũa thủy tinh, đĩa petri, lam kính,…

2.1.2.2. Hóa chất
Các hóa chất phòng Vi sinh vật – Viện sinh học Nông nghiệp –
Trường Đại học Nông nghiệp I Hà Nội
NaCl Cao men
Agar Glucose
KI Cazein
Iốt Tinh bột tan
Fucshin HgCl
2

Cao thịt Tím gential
Pepton Cồn 96
0

18
2.1.3. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật
2.1.3.1. Môi trường NA (dùng để phân lập, giữ giống và nuôi cấy) (g/l):
Pepton 10
Cao thịt 5
NaCl 5
Glucose 10
Agar 20
Nước cất 1000
pH = 5,5 – 7,8
Môi trường lỏng nuôi Bacillus không cho agar
2.1.3.2. Môi trường thử hoạt tính amylase, protease
Môi trường cơ sở: (g/l)
Pepton 5
Cao men 2,5
Nước 1000ml
pH = 5,5 – 7,8
Enzyme cần xác định Thành phần môi trường
Amylase Môi trường cơ sở + 1% tinh bột tan
Protease Môi trường cơ sở + 1% cazein

Tất cả các môi trường đều được hấp ở 0,8 – 1 atm trong 30 phút
Pha chế thuốc thử:
+ Pha thuốc thử Lugol: 1g I
2
+ 2g KI cho vào 100 ml nước cất,
khuấy cho tan hết trong phòng tối, sau đó đổ vào lọ tối màu, để nơi thiếu
ánh sáng và thoáng mát.