Tạo kháng thể độc tố thần kinh Alpha trong nọc rắn hổ mang chúa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC

**********************

NGUYỄN HỮU HÙNG





TẠO KHÁNG THỂ
KHÁNG ĐỘC TỐ THẦN KINH ALPHA
TRONG NỌC RẮN HỔ MANG CHÚA
(OPHIOPHAGUS HANNAH)




KHÓA LUẬN CỬ NHÂN KHOA HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH Y DƯC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2003
HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS-TSKH NGUYỄN LÊ TRANG
Th.S NGUYỄN THỊ NGUYỆT THU
Luận văn tốt nghiệp. Ngành CNSH Nguyễn Hữu Hùng
Khóa 1999-2003


2





Trong cuộc sống, tôi không thể làm được gì nếu
tôi sinh ra và lớn khôn không có ba, không có mẹ,
không có người thân, không có thầy cô cũng như
không có bạn bè. Sự thành công của tôi hôm nay và
ngày mai không thể phủ nhận những gì mà họ đã
giành cho tôi. Chỉ xin nhờ luận văn này để bày tỏ
lòng biết ơn của tôi.


Xin kính dâng hương hồn ba.

Xin cảm ơn mẹ.

Xin cảm ơn PGS-TS Nguyễn Lê Trang, Th.S

Nguyễn Thò Nguyệt Thu cùng các anh chò Phòng
Miễn dòch học, Khoa Vi sinh Miễn dòch, Viện
Pasteur thành phố Hồ Chí Minh.

Xin cảm ơn quý thầy cô Khoa Sinh học cùng
toàn thể các bạn lớp 99CNSH Trường Đại học
Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh.

Ngày 12 tháng 7 năm 2003.
Nguyễn Hữu Hùng

Luận văn tốt nghiệp. Ngành CNSH Nguyễn Hữu Hùng
Khóa 1999-2003


3
MỤC LỤC

Giới thiệu............................................................................................................1
Mục tiêu nghiên cứu...........................................................................................2

Phần I: Tổng quan tài liệu

1. Tai nạn do rắn cắn. ..................................................................................4
2. Rắn Hổ mang chúa Ophiophagus hannah................................................6
3. Nọc độc và độc tố thần kinh alpha. ........................................................10
4. Khớp thần kinh-cơ....................................................................................11
5. Kháng thể chống độc tố và giải độc........................................................13

Phần II: Vật liệu và Phương pháp nghiên cứu

1. Vật liệu. ...................................................................................................17

2. Phương pháp nghiên cứu..........................................................................17

A
.
Giai đoạn I
: Tinh chế độc tố thần kinh alpha................................19

1. Phương pháp Sắc ký lọc................................................................19
2. Kiểm tra mức độ tinh chế bằng phương pháp điện di gel
polyacrylamide gradient 8-18%T có SDS.....................................21
3. Xác đònh độc lực. ..........................................................................24

B. Giai đoạn II
: Tạo kháng thể kháng độc tố thần kinh alpha........28

1. Gây miễn nhiễm thỏ để tạo kháng thể kháng độc tố thần kinh alpha
.................................................................................................................28
2. Tinh chế kháng thể bằng dung dòch Amonium sulfate bão hòa ...31
3. Đònh tính kháng thể bằng phương pháp Ouchterlony. ..................32
Luận văn tốt nghiệp. Ngành CNSH Nguyễn Hữu Hùng
Khóa 1999-2003


4
4. Đònh lượng kháng thể bằng phương pháp quang hấp thụ A
280
và phương

pháp Bradford..........................................................................................33

C. Giai đoan III
: Kiểm tra khả năng chống độc của kháng thể thu được
đối với nọc toàn phần .......................................................................36

Phần III: Kết quả và Thảo luận

1.
Kết quả thực nghiệm ...............................................................................39

2.
Thảo luận.................................................................................................44

Phần IV: Kết luận và Đề nghò

1. Kết luận ...................................................................................................47
2. Đề nghò.....................................................................................................47

Phần V: Tài liệu tham khảo

1. Tài liệu trong nước...................................................................................50
2. Tài liệu ngoài nước..................................................................................50
3. Tài liệu Internet.......................................................................................51
Luận văn tốt nghiệp. Ngành CNSH Nguyễn Hữu Hùng
Khóa 1999-2003


5

Giới thiệu




Hiện nay, ngành y tế còn gặp rất nhiều khó khăn trong việc chế tạo và sử
dụng kháng huyết thanh chống nọc độc của rắn. Khi gây miễn nhiễm động vật
bằng nọc độc của rắn để tạo kháng huyết thanh, đáp ứng miễn dòch xảy ra không
cao (kháng thể đặc hiệu thu được ít và ái lực thấp). Bên cạnh đó, tình trạng sốc
phản vệ thường xảy ra đối với bệnh nhân bò rắn cắn khi sử dụng kháng huyết thanh
kháng nọc.

Các thành phần trong nọc (K. F. Stocker, 1990 & A. T. Tu, 1991) bao gồm
các thành phần độc và không độc. Trong đó, một số thành phần dù không mang
độc tính nhưng khi kết hợp với globulin miễn dòch lại gây phản ứng cho cơ thể nên
cần phải loại bỏ, ví dụ yếu tố CVF (Cobra venom factor) (có hoạt tính như C
3b
của
bổ thể). Về độc tính, ở những loài thuộc dòng nhỡn kính (Elapidae), phải kể đến
thành phần gây độc chủ yếu là độc tố thần kinh (độc tố alpha) và thành phần kém
quan trọng hơn là độc tố tim (độc tố gamma).

Trong giới hạn của đề tài, đối tượng nghiên cứu là rắn Hổ mang chúa
(Ophiophagus hannah) thuộc dòng nhỡn kính (Elapidae) chứa độc tố hậu khớp thần
kinh alpha (post synaptic neurotoxin). Do vậy, mục tiêu của chúng tôi là tạo kháng
thể đặc hiệu kháng một kháng nguyên là độc tố thần kinh alpha tinh chế với
cấu trúc nguyên dùng làm huyết thanh kháng nọc toàn phần. Xử lý huyết thanh
có được để loại trừ toàn bộ chất gây sốt, gây phản ứng quá mẫn và khi dùng, có thể
tiêm trực tiếp vào tónh mạch, dễ dàng sử dụng đối với y bác só. Từ đó, việc cứu
chữa trở nên hiệu quả, có thể cứu sống nhanh chóng, hạn chế tối đa thương tật cho

nạn nhân bò rắn cắn. Khi đó, góp phần giải quyết những khó khăn của ngành y tế.

Luận văn tốt nghiệp. Ngành CNSH Nguyễn Hữu Hùng
Khóa 1999-2003


6


Mục tiêu nghiên cứu



1. Mục tiêu

Tạo kháng thể kháng độc tố thần kinh alpha và đánh giá khả năng chống
độc của kháng thể này đối với nọc toàn phần của rắn Hổ mang chúa
(Ophiophagus hannah).

2. Các bước tiến hành

• Tinh chế độc tố thần kinh alpha từ nọc rắn Hổ mang chúa

• Gây miễn nhiễm thỏ để tạo kháng thể kháng độc tố thần kinh alpha

• Kiểm tra khả năng bảo vệ của kháng thể kháng độc tố thần kinh
alpha đối với nọc toàn phần


Luận văn tốt nghiệp. Ngành CNSH Nguyễn Hữu Hùng

Khóa 1999-2003


7




Phần I

Tổng quan tài liệu
Luận văn tốt nghiệp. Ngành CNSH Nguyễn Hữu Hùng
Khóa 1999-2003


8
6. Tai nạn do rắn cắn


Vì mục đích sinh tồn (khả năng tự nuôi sống và tự bảo vệ) đối với môi
trường xung quanh, rắn buộc phải có vũ khí để tự vệ và tấn công, đó là nọc độc [2,
14]. Tính độc có được của nọc là do các thành phần độc tố có trong nọc tác động
vào các quá trình sinh lý bình thường của con mồi nhằm mục tiêu bất hoạt chúng.

Khi sống trong vùng có nhiều rắn, nhất là các loài rắn độc, con người cần
phải có hiểu biết về rắn và các tập tính của nó để có biện pháp tốt nhất trong việc
đề phòng rắn cắn. Trong tự nhiên, rắn không phải là con vật hung dữ vì chúng
không tấn công người mà luôn tìm cách tránh xa họ [2]ï. Vì những lợi ích của rắn
trong các bài thuốc y học cổ truyền hoặc thòt rắn có thể làm các món ăn “khoái
khẩu”… nên người ta đã cố tình săn đuổi để bắt chúng, hoặc vì chúng cảm thấy

mình đang bò tấn công khi con người đến gần hoặc vô tình con người động phải nơi
ẩn núp của chúng nên chúng mới cắn để tự vệ. Trong mùa sinh sản, rắn hay tấn
công hơn để bảo vệ trứng hoặc rắn con trong tổ làm bằng lá cây. Nếu không may
dậm phải tổ rắn thì sẽ bò cắn.

Vì rắn thường săn mồi về đêm và không phổ biến rộng nên số tai nạn xảy ra
do rắn cắn chủ yếu là nông dân bao gồm những người sống bằng nghề nuôi rắn,
những người làm công tác kiểm lâm, những người làm vườn và những thợ săn…
Những báo cáo có được về các tai nạn rắn cắn đều dựa trên những trường hợp nhập
viện. Con số thật sự còn cao hơn rất nhiều.

Nước ta thuộc khu vực Châu Á chòu ảnh hưởng khí hậu nhiệt đới và cận
nhiệt đới nên rất thích hợp cho việc phát triển của các loài rắn độc. Theo y văn [3,
4], tỉ lệ tử vong trong khu vực Châu Á chiếm 80% tổng số nạn nhân bò rắn cắn trên
thế giới . Tuy vậy, chưa có hệ thống giám sát nào về tai nạn do rắn cắn. Một số
trường hợp nhập viện do rắn cắn chủ yếu là rắn Cạp nong (Bungarus faciatus), rắn
Luận văn tốt nghiệp. Ngành CNSH Nguyễn Hữu Hùng
Khóa 1999-2003


9
Lục tre (Trimeresurus albolabris), rắn Hổ mang đất (Naja kaouthia), rắn Hổ mang
chúa (Ophiophagus hannah)…

Do vậy, cần có các biện pháp hữu hiệu nhằm đạt được kết quả thống kê rõ
ràng để có thông tin chính xác về tình hình rắn cắn ở Việt Nam.
Một số hình ảnh sau mô tả một số hậu quả do rắn cắn để nói lên tính trầm
trọng của thương tích khi nạn nhân thoát chết.

Hình 1: Hoại tử tổ chức mô tại vò
trí bò rắn Hổ (Elapidae) cắn (S.
Minton, 2002).





Hình 2: Hoại tử mô do Naja antra
cắn (S. Minton, 2002).




Hình 3: Hoại tử mô do rắn Hổ
mang chúa (Ophiophagus hannah)
cắn (Nguyễn Lê Trang, 2002).

Luận văn tốt nghiệp. Ngành CNSH Nguyễn Hữu Hùng
Khóa 1999-2003


10

7. Rắn Hổ mang chúa (Ophiophagus hannah)

Bộ: Squamata.
Bộ phụ: Serpentes (Ophidia).
Dòng: Elapidae.
Họ: Bungarinae.


Tông: Najini.
Giống: Ophiophagus.
Loài: Ophiophagus hannah.
Tên thường gọi: rắn Hổ mang chúa.




Hổ mang chúa là loài rắn độc có cơ thể dài và lớn nhất trong tất cả các loài
rắn trên thế giới [20, 22], chiều dài trung bình từ 3,9m đến 5,4m. Chúng phân bố
chủ yếu từ Ấn Độ đến Philipines, có mặt ở Thái Lan, Campuchia, Lào, Việt Nam
và Trung Quốc. Chúng di chuyển bằng cách trườn trên mặt đất, tuy nhiên, chúng có
thể ngẩn đầu lên cao 1,8m bằng một phần ba chiều dài cơ thể và ngang với chiều
cao của người trưởng thành (hình 5).

Da rắn Hổ mang chúa được phủ bởi một lớp vảy có bản chất là keratin, cơ
thể tròn dài và thu nhỏ về phía đuôi. Đầu rắn phẳng phía trên với hai mắt đen lánh
phía trước [20]. Cổ rắn có thể phình to ra hai bên và trở nên ghê sợ khi bò kích động
(hình 1). Sắc tố da rắn Hổ mang chúa rất phong phú. Tùy vào nơi sinh sống, chúng
có thể có màu nâu, đen xen kẽ các vạch trắng hay vàng. Màu sắc ở bụng cũng khá
biến động, có khi là màu kem sáng đồng nhất, có khi lại xen với các vạch đen.
Nhìn chung, màu sắc của rắn Hổ mang chúa sống trong các vùng âm u thì xậm hơn
những con sống trong vùng nhiều ánh sáng.

Hình 4: Rắn Hổ mang chúa
Ophiophagus hannah [30].
Luận văn tốt nghiệp. Ngành CNSH Nguyễn Hữu Hùng
Khóa 1999-2003


11





Rắn Hổ mang chúa thay da từ 4-6 lần trong năm để trưởng thành. Để làm
được việc này, rắn phải cọ xát cơ thể vào những vật có cạnh cứng nhám. Việc thay
da làm cho rắn Hổ mang chúa giảm tầm quan sát trong 10 ngày. Số lượng và sự sắp
xếp của vảy hầu như không có gì thay đổi sau mỗi lần thay da. Vảy trên lưng thì
nhỏ và trơn, còn vảy ở bụng thì dài, rộng bằng với chiều rộng của bụng và xếp
thành một cột duy nhất theo chiều hướng xuống.

Nọc rắn Hổ mang chúa được chú ý nhiều nhất. Nó có trong tuyến hạch nọc
ngay đằng sau mắt dẫn đến hai răng móc thẳng đứng gắn vào phía trước xương
hàm trên. Răng móc có ống dẫn nọc, dài 12mm, bất động và nằm ở hàm trên. Hàm
dưới có hai xương nối khớp theo kiểu bản lề với nhau giúp rắn có thể nuốt chửng
các con mồi lớn. Con mồi có thể là một con rắn cùng kích thước, thậm chí dài hơn.

Rắn Hổ mang chúa có tầm quan sát rất tốt, có thể quan sát trong phạm vi
100m bán kính. Mặc dù không có tai nghe nhưng chúng vẫn có thể cảm nhận được
âm thanh. Chúng nếm và ngửi bằng lưỡi chẻ, thường thò ra ngoài để cảm nhận
(hình 1). Tuổi thọ của rắn có thể đạt 20 năm.

Hình 5: Rắn Hổ mang chúa
Ophiophagus hannah (Nguyễn Lê
Trang, 2002).
Luận văn tốt nghiệp. Ngành CNSH Nguyễn Hữu Hùng
Khóa 1999-2003


12
Nhìn chung, rắn Hổ mang chúa được tìm thấy ở rất nhiều nơi như rừng mưa
nhiệt đới, rừng đước ngập mặn, rừng tre, bãi cỏ và thậm chí nơi con người cư ngụ [3,
23]. Chúng bơi rất giỏi và trèo rất tài nên có thể tìm thấy ở các bờ suối hay trên
cây hoặc trên các vùng cao như đồi, núi. Chúng có khả năng săn mồi suốt ngày
đêm. Thức ăn của rắn Hổ mang chúa là các loài bò sát, kể cả các loài rắn khác.
Chúng săn các loài rắn như rắn Chuột Châu Á (Asian ratsnake), trăn Ấn Độ (Indian
cobros), rắn Cạp nong, thậm chí rắn Hổ mang chúa cùng loài. Ngoài ra, chúng cũng
ăn cả các loài thằn lằn.

Rắn Hổ mang chúa có cách săn mồi rất độc đáo bằng cách ngửi (đánh hơi)
không khí nhờ cái lưỡi chẻ của nó. Khi tìm thấy con mồi, chúng nâng một phần ba
cơ thể lên và mổ con mồi. Trong trường hợp con mồi tẩu thoát, chúng có thể bám
theo dấu vết ở một khoảng cách rất xa. Khi chúng cắn (mổ) con mồi, các sợi cơ ở
bộ phận tổ chức hạch co lại làm giải phóng nọc độc từ tuyến nọc vào con mồi nhờ
hai răng móc. Nọc độc gồm chủ yếu một chất độc thần kinh alpha (alpha-
neurotoxin) [3, 4, 20, 22] làm cho cơ thể con mồi tê liệt, bất tỉnh và chết. Triệu
chứng bắt đầu chỉ 15-30 phút sau khi bò cắn. Con mồi liệt hay chết sẽ bò nuốt chửng
và rắn Hổ mang chúa có thể không ăn lại trong những tuần kế tiếp.

Rắn Hổ mang chúa có rất nhiều kẻ thù tự nhiên, chúng bò săn đuổi bởi chồn,
cầy hương, kiến, rếch khổng lồ… Trứng của chúng bò ăn, tổ và nơi trú ẩn bò hủy
hoại bởi heo rừng và chồn.

Tuy nhiên, kẻ thù lớn nhất của rắn Hổ mang chúa là con người. Chúng bò
giết vì mục đích thương mại. Da, thòt và mật được dùng trong các bài thuốc Trung
Hoa cổ truyền và nọc được dùng để chữa trò thấp khớp, lao phổi, dòch tả…

Rắn Hổ mang chúa thường sống đơn độc và chỉ đến với nhau khi bắt cặp
giao phối. Rắn thuần thục giới tính khi đạt 5-6 tuổi. Mùa sinh sản bắt đầu từ tháng
Giêng và biểu hiện bằng việc thay da. Ở con cái, việc thay da làm tiết chất dẫn dụ
Luận văn tốt nghiệp. Ngành CNSH Nguyễn Hữu Hùng
Khóa 1999-2003


13
Pheromone hướng con đực tìm đến. Khi chúng tìm thấy nhau, con đực quấn quanh,
“âu yếm” con cái trong nhiều giờ. Tinh trùng con đực thụ tinh cho trứng và con cái
mang thai. Con cái có thể tồn lưu tinh trùng trong nhiều năm và dùng nó để tự thụ
tinh cho bản thân nhiều lần.

Con cái đẻ 20-50 trứng sau thụ tinh hai tháng. Trứng được đẻ trong tổ làm
trong suốt hai tháng mang thai. Rắn Hổ mang chúa là loài rắn duy nhất biết cách
làm tổ. Sau thời gian ấp trứng 60-70 ngày, trứng bắt đầu nở. Cho đến khi nào rắn
con tự nổi trên mặt nước được thì rắn mẹ mới bỏ chúng, để chúng độc lập và cũng
để tránh được việc rắn mẹ ăn thòt các con của mình.

Rắn con có các sọc vàng và đen xen kẻ, có kích thước 35cm chiều dài và
1,25cm chiều rộng. Nọc của chúng chỉ có hiệu lực như một con rắn trưởng thành
sau 10 ngày tuổi. Lúc đó, chúng đã sẵn sàng cho việc săn mồi bằng vũ khí của

mình, nọc độc.

8. Nọc độc và độc tố thần kinh alpha
Rắn Hổ mang chúa có nhiều cách để đưa nọc
độc gây chết vào con mồi [3, 22]. Một số phun nọc
vào mắt gây đau và mù mắt. Tuy nhiên, cách tốt
nhất là đưa trực tiếp vào cơ thể con mồi bằng cú mổ,
mục đích làm bất tỉnh con mồi.

Rắn Hổ mang chúa thuộc nhóm nhỡn kính
(Elapidae). Có hơn 270 loài rắn thuộc nhóm này.
Nọc rắn Hổ mang chúa có nhiều thành phần có và
không có độc lực [12, 19]. Độc lực mạnh nhất do
thành phần độc tố thần kinh alpha đảm nhiệm
Hình 6: Phân tử độc tố
thần kinh alpha [22].
Luận văn tốt nghiệp. Ngành CNSH Nguyễn Hữu Hùng
Khóa 1999-2003


14
chiếm khoảng 30% protein trong nọc toàn phần. Độc tố này được phân bố theo
đường tuần hoàn con mồi để tác động vào tế bào đích (tế bào cơ).

Phân tử độc tố thần kinh alpha (hình 6) có phân tử lượng 7000-8000D, chúng
kết hợp đặc hiệu với phân tử thụ quan hậu khớp thần kinh-cơ. Ái lực của phân tử
độc tố thần kinh alpha với thụ quan rất cao so với chất dẫn truyền thần kinh
Acetylcholine (ACh) ( hằng số phân ly của độc tố là 10
-9
-10

-10
M trong khi hằng số
phân ly của Acetylcholine là 10
-6
M) [17].

Người ta đã xác đònh rằng chỉ cần một phần ba vò trí thụ quan trên cơ hoành
bò khóa bởi độc tố thần kinh này sẽ gây liệt thở [22]. Với nọc rắn Hổ mang chúa,
quá trình này xảy ra khoảng 30 phút sau khi bò cắn. Tiếp đó, oxy không được đưa
đủ vào phổi nên gây nhiều hậu quả bệnh lý dẫn đến tử vong. Cách chống độc đặc
hiệu duy nhất hiện nay là sử dụng ngay kháng huyết thanh kháng nọc càng sớm
càng tốt sau khi bò cắn. Trong trường hợp kháng huyết thanh kháng nọc không được
chuẩn bò sẵn thì mạng sống sẽ phải được giữ bằng máy hô hấp nhân tạo cho tới khi
cơ hoành hoạt động lại bình thường (nếu như độ nhiễm độc không quá trầm trọng).


9. Khớp thần kinh-cơ

Chức năng co của cơ được điều khiển bằng các xung động thần kinh. Các
xung thần kinh này nhanh chóng lan truyền dọc axon của tế bào thần kinh bằng cơ
chế đảo cực điện thế cục bộ ở màng dẫn truyền đến các tế bào đích (tế bào cơ) để
thực hiện chức năng như co thắt cơ hay bài tiết… [10]. Kiểu liên lạc nội bào này xảy
ra theo hai cơ chế: cơ chế điện hoặc/và cơ chế hóa học ngang qua khớp (synapse)
giữa tế bào thần kinh (tế bào tiền khớp) và tế bào cơ (tế bào hậu khớp). Cơ chế
điện xảy ra do sự tiếp xúc trực tiếp từ tế bào này với tế bào nối tiếp nhờ vào các
ống dẫn ion cho phép điện thế hoạt động được dẫn truyền liên tục từ tế bào này
đến tế bào kia. Tuy nhiên, cơ chế dẫn truyền hóa học thông dụng hơn, sự dẫn
Luận văn tốt nghiệp. Ngành CNSH Nguyễn Hữu Hùng
Khóa 1999-2003

15
truyền có được nhờ vào các chất dẫn truyền thần kinh (neurotransmiter) được
phóng thích ở màng tế bào tiền khớp. Các chất hóa học này sau đó khuếch tán tới
các thụ quan đặc hiệu gắn trên các tế bào hậu khớp là tế bào cơ, các thụ quan là
Nicotinic acetylcholine receptor (nAChR), tạo ra một điện thế hoạt động mới.

Acetylcholine là chất dẫn truyền thần kinh thông thường được biết đến nhiều
nhất. Nó được tổng hợp trong tế bào thần kinh nhờ enzyme Choline acetyl
transferase như sau:

Choline + Acetyl-CoA Acetylcholine + CoA-SH

Khoảng 10
3
-10
4
phân tử ACh được đóng gói thành một túi gọi là túi chứa
chất dẫn truyền thần kinh nằm gần màng của axon tiền khớp. Sự xuất hiện điện thế
hoạt động của tế bào tiền khớp sẽ khởi động sự gia tăng lớn về tính thấm của màng
tiền khớp với ion Ca
2+
. Dòng ion này đi vào trong axoplasm xuôi theo chiều
gradient hóa học. Sự hợp nhất túi chứa chất dẫn truyền thần kinh với màng tế bào
và phóng thích ACh vào trong khe khớp (quá trình xuất bào) được tăng cường bởi
sự gia tăng nồng độ Ca
2+
nội bào (hình 7).

Hình 7: Sự truyền tín hiệu qua khớp thần kinh-cơ bằng cơ chế hóa học [10].



Choline acetyl transferase
Lưới sợi liên kết
Luận văn tốt nghiệp. Ngành CNSH Nguyễn Hữu Hùng
Khóa 1999-2003


16

Hằng trăm túi chứa chất dẫn truyền thần kinh đổ ACh vào trong khe khớp
làm tăng mạnh nồng độ ACh nội tại và được cảm nhận bởi thụ quan nAChR đònh vò
trên màng tế bào hậu khớp. Sự kết hợp chất dẫn truyền thần kinh với nhiều phân tử
thụ quan sẽ khởi động một điện thế hoạt động trong tế bào hậu khớp bằng cách
tăng tính thấm đối với ion Na
+
và K
+
. ACh sau đó nhanh chóng bò thủy phân thành
acetate và choline bởi một enzyme trong khe khớp là Acetylcholinesterase. Khi đó,
điện thế nghỉ của màng tế bào hậu khớp được khôi phục lại.

Acetylcholine + nước Choline + Acetate
10. Kháng thể chống độc tố và giải độc
Người mở đầu cho vấn đề tạo huyết thanh kháng nọc độc của rắn ở Việt
Nam là A. Calmette (1894) và cũng là người sáng lập ra Viện Pasteur thành phố
Hồ Chí Minh (Viện Pasteur thứ hai trên thế giới sau Viện Pasteur Pari, Pháp).
Nguyên tắc cơ bản là gây miễn nhiễm động vật với nọc độc để sản xuất kháng thể

đặc hiệu có khả năng trung hòa nọc độc này [4].

Kháng thể là sản phẩm của các dòng tế bào bạch huyết B trưởng thành
(tương bào) có tính đặc hiệu với kháng nguyên [2, 8, 12]. Kháng thể gồm chuỗi
nặng (H) và chuỗi nhẹ (L) gắn kết với nhau bằng các cầu nối disulfide (hình 8).


Hình 8: Cấu trúc một phân tử Immunoglobulin điển hình [26].
Acetylcholinesterase
Luận văn tốt nghiệp. Ngành CNSH Nguyễn Hữu Hùng
Khóa 1999-2003


17

Có nhiều loại phân tử kháng thể khác nhau do sự khác biệt ở các chuỗi
polypeptide như nêu trong bảng 1 sau:

Bảng 1: Các lớp kháng thể và nồng độ sinh lý
của chúng trong huyết thanh.


Chuỗi nặng Chuỗi nhẹ Lớp KT Nồng độ (g/l)
µ κ, λ IgM 0,57-3,4
γ
κ, λ IgG 6,2-16,5
α
κ, λ IgA 0,6-3,7
δ
κ, λ IgD 0,6-3,7

ε
κ, λ IgE 0,0-0,41



Tạo kháng huyết thanh chống nhiễm chủ yếu là tạo IgG có ái lực cao đối với
độc tố cần trung hòa độc lực. Tuy vậy, phần Fc của IgG sẽ được loại bỏ do trên
nhiều loại tế bào như đại thực bào (macrophage), dưỡng bào (mast cell) có thụ
quan FcγR có thể được hoạt hóa dẫn đến tình trạng sốc phản vệ hoặc hoạt hóa bổ
thể tạo phản ứng Arthus [2, 8]. Vì thế, chỉ F(ab’)
2
tinh chế được sử dụng để làm
kháng huyết thanh.

Vậy, khi nhiễm độc (rắn cắn), trong cơ thể sẽ có độc tố tự do lưu hành trong
máu tuần hoàn và dòch kẽ tế bào. Các phân tử độc tố tự do đến gần các thụ quan
đặc hiệu và tạo thành phức hợp Thụ quan-Độc tố ngăn cản sự tiếp nhận
Acetylcholine. Đây là nguyên nhân làm cho các tín hiệu thần kinh bò tắt nghẽn dẫn
đến sự mất chức năng vận động, bài tiết… của cơ quan đích đáp ứng với đòi hỏi
trong hoạt động sinh lý bình thường của cơ thể.

+
Giải độc: khi sử dụng kháng thể làm nhân tố giải độc (cách giải độc đặc
hiệu duy nhất được biết hiện nay), kháng thể có hai vai trò như sau:
Thụ quan tự do

Thụ quan-Độc tố

Độc tố
Luận văn tốt nghiệp. Ngành CNSH Nguyễn Hữu Hùng

Khóa 1999-2003


18

i. Kháng thể ngăn chặn độc tố tự do bám vào thụ quan

n(Kháng thể) + m(Độc tố tự do) (Kháng thể)
n
-(Độc tố)
m

Phức hợp (Kháng thể)
n
-(Độc tố)
m
không bám vào được thụ quan do hoặc
kháng thể gắn vào vò trí gắn thụ quan của độc tố hoặc phức hợp trở nên quá lớn
không kết hợp được với thụ quan. Đã có nghiên cứu cho biết m = 1 và n = 4 đối với
độc tố thần kinh alpha.

ii. Tách phức hợp Thụ quan-Độc tố


Trong trường hợp này, các phân tử độc tố alpha đã gắn với các thụ quan trên
các tế bào đích nhưng không đồng trò. Các phân tử kháng thể đặc hiệu (từ kháng
huyết thanh) sẽ gắn vào phân tử độc tố alpha này làm biến đổi cấu trúc của chúng
khiến cho ái lực gắn thụ quan bò suy giảm và mất hẳn. Khi đó, các thụ quan được
giải phóng [3].

Thụ quan-Độc tố + Kháng thể Kháng thể-Độc tố + Thụ quan

Theo cơ chế đó, toàn bộ độc tố được giải phóng nếu lượng kháng thể được
tiêm vào đầy đủ cho bệnh nhân. Phức hợp Kháng thể-Độc tố và kháng thể thừa
tiếp đó đi theo qui trình bài tiết qua đường niệu ra khỏi cơ thể.

Luận văn tốt nghiệp. Ngành CNSH Nguyễn Hữu Hùng
Khóa 1999-2003


19











Phần II

Vật liệu &
Phương pháp nghiên cứu
Luận văn tốt nghiệp. Ngành CNSH Nguyễn Hữu Hùng
Khóa 1999-2003

20
1. Vật liệu

1.1. Đối tượng nghiên cứu

_ Nọc rắn Hổ mang chúa (Ophiophagus hannah), Trung tâm Nuôi trồng, Chế
biến và Nghiên cứu dược liệu Quân khu 9 cung cấp.
_ Chuột nhắt trắng 18-20g, Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh cung cấp.
_ Thỏ 2-2,5kg, Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh cung cấp.

1.2. Hóa chất và dung môi

_ Sephadex G-50 SF, Pharmacia (Thụy Điển).
_ Albumine huyết thanh bò (BSA) (Sigma).
_ Mọi hóa chất và đệm đạt mức phân tích.

1.3. Nơi tiến hành thí nghiệm

Thí nghiệm được thực hiện tại Phòng Miễn dòch học, Khoa Vi sinh-Miễn
dòch, Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh.

2. Phương pháp nghiên cứu

Đề tài tiến hành theo 3 giai đoạn, mỗi giai đoạn bao gồm một số kỹ thuật.
Một quá trình từ khi tinh chế độc tố thần kinh alpha đến khi thu được kháng thể IgG
đặc hiệu kháng độc tố này được tóm tắt bằng sơ đồ 1 như sau:


Luận văn tốt nghiệp. Ngành CNSH Nguyễn Hữu Hùng
Khóa 1999-2003

21




Nọc toàn phần
Tinh chế độc tố thần kinh bằng Sắc ký lọc
Xác đònh độc lực

Tạo kháng thể
kháng
độc tố thần kinh alpha
SDS-PAGE gradient
8-18%T
Tinh chế kháng thể
Đònh tính kháng thể

Đònh lượng kháng thể

Trung hòa độc lực nọc toàn
phần in vivo
(I)
(III)
(II)
Sơ đồ 1: Qui trình thí nghiệm tạo kháng thể chống độc tố thần kinh alpha.
Giai đoạn I
Giai đoạn II
Giai đoạn III

Luận văn tốt nghiệp. Ngành CNSH Nguyễn Hữu Hùng
Khóa 1999-2003


22
A. Giai đoạn I: Tinh chế độc tố thần kinh alpha

1.
Phương pháp Sắc ký lọc
1.1. Nguyên tắc
Sắc ký lọc dùng vật liệu là những vi hạt gel có khả năng ngậm nước rất cao.
Các hạt gel này là những sợi polymer (polyoside, polyacrylamide…) dài, có những
cầu nối liên kết ngang để làm giảm bớt độ mềm, chòu được sức ép khi bò nén mà
không bò biến dạng, vẫn cho phép dung môi lưu thông.

Trên bề mặt cũng như ở phía trong của
hạt gel, kích thước của các kẽ không gian
trống giữa các sợi polymer cho phép các phân
tử tan trong dung môi có thể thấm vào không
gian trong hạt gel và do đó có thể di chuyển
quanh co trong cấu trúc của hạt gel (hình 9A).
Ví dụ: một lớp mỏng dung dòch mẫu gồm hai
loại phân tử khác nhau được đặt rải trên bề
mặt đi vào của cột gel, một loại không thể
thấm vào hạt gel do phân tử quá lớn đối với
kẽ giữa các sợi polymer và loại phân tử kia
nhỏ hơn có thể đi qua các kẽ giữa lưới sợi
polymer. Khi lớp mẫu đã vào trong gel, dung
môi được cho vào liên tục để di chuyển các
phần tử qua cột sắc ký.

Cách tiến hành trên nhằm mục đích để tách hai loại phân tử lẫn lộn lúc ban
đầu.

Phân tử tan trong dung môi khi gặp pha gel sẽ được phân phối theo cơ chế
khuếch tán giữa pha gel tónh (không di) và pha lỏng động (di) phía ngoài các hạt

Hình 9: Sắc ký lọc
A
B
A
Luận văn tốt nghiệp. Ngành CNSH Nguyễn Hữu Hùng
Khóa 1999-2003


23
gel. Sự phân phối đó sẽ nhanh chóng được cân bằng giữa hai pha (hai mũi tên trên
hình 9B biểu hiện điều đó). Để sự thấm vào pha gel được hiệu quả, cần thực hiện
tốc độ di của pha lỏng tối ưu để khuếch tán của các phân tử đủ đạt cân bằng giữa
hai pha động và tónh. Đối với một cột gel, nếu tổng khối của cột gel là V
t
, pha gel
chỉ chiếm một khối V
g
và ngoài các hạt gel, pha lỏng chiếm khối V
o
. Một phân tử
thấm được vào hạt gel nhưng không thể phân phối được vào toàn bộ khối hạt gel,
mà chỉ một phần của khối hạt gel, một phân số của khối có thể vào được, phân số
K
v

. Do đó, đối với một phân tử, sau khi đã đi qua cột gel, tổng khối của pha gel cho
phép phân tử đó có thể thấm vào là K
v
x V
g
. Đối với một phân tử không thấm được
vào pha gel, qua toàn bộ quá trình di qua cột, sẽ ra khỏi cột khi một khối dung môi
V
e
= V
o
được đi qua cột. Trong trường hợp của các phân tử không thấm được, K
v
=
0. Đối với một phân tử thấm được vào thì V
e
= V
o
+ (K
v
x V
g
). Như vậy:



got
VVV +=

ot
oe
g
oe
v
VV
VV
V
VV
K
−
−
=
−
=



Như vừa nêu, đối với các phân tử không thấm được vào pha gel, K
v
= 0.
Ngược lại, đối với các phân tử (rất nhỏ đối với kẽ giữa các sợi polymer) thấm được
tối đa vào toàn bộ khối pha gel V
g
, V
e
-> V
t

, K
v
-> 1. Đối với các phân tử thấm
được vào hạt gel, nếu K
v
càng cao thì phân tử ra khỏi cột ở V
e
càng lớn.

1.2. Tiến hành
Sử dụng vật liệu Sephadex G-50 SF. Quá trình được thực hiện ở điều kiện:

_ Nhiệt độ phòng thí nghiệm: 22
o
C-30
o
C.
_ Khối gel trong cột: 27 x 5,5cm.
_ Kích thước hạt gel: 20-50µm.

Luận văn tốt nghiệp. Ngành CNSH Nguyễn Hữu Hùng
Khóa 1999-2003


24
Cho vào cột 6ml dung dòch nọc rắn Ophiophagus hannah (pha trong đệm
Amonium acetate 0,05M pH7,2) nồng độ là 117mg/ml. Như vậy, có 702mg nọc khô
trong 6ml dung dòch nọc.

Đẩy protein bằng dung dòch đệm Amonium acetate 0,05M pH7,2.

Hứng đoạn 10ml/đoạn/40 phút.

Đo A
280
bằng máy quang phổ để xác đònh nồng độ protein trong các phân
đoạn thu được.

2.
Kiểm tra mức độ tinh chế bằng phương pháp điện di gel
polyacrylamide gradient 8-18%T có SDS

2.1. Nguyên tắc
Kỹ thuật điện di dựa trên nền tảng các phân tử mang điện tích (DNA, RNA,
protein…) có khả năng di chuyển khi đặt chúng trong một điện trường [7].


Người ta sử dụng gel agarose hoặc polyacrylamide làm môi trường điện di.
Đối với các phân tử protein, gel polyacrylamide được ưa chuộng hơn. Các thành
phần tham gia tạo thành mạng lưới gel polyacrylamide này bao gồm Acrylamide,
N,N’-Methylene-bis-(acrylamide), Tetramethylenediamine (TEMED) và Amonium
persulfate (APS).

Khi tan trong nước, APS tạo các gốc tự do theo cơ chế:

S
2
O
8
2-

2SO
4
-



Các gốc tự do này hoạt hóa các phân tử Acrylamide và N, N’-Methylene-
bis-(acrylamide) tạo thành mạng lưới polymer liên kết chéo giữa các phân tử này.
Khi đó, trong mạng lưới sẽ tạo nên các vi lỗ phụ thuộc vào hai thông số: một là
Luận văn tốt nghiệp. Ngành CNSH Nguyễn Hữu Hùng
Khóa 1999-2003


25
lượng acrylamide tổng số sử dụng, hai là mức độ liên kết chéo. Nhìn chung, lượng
acrylamide tổng số càng cao thì lỗ tạo nên càng nhỏ và nếu 5% tổng acrylamide là
do bis-(acrylamide) thì lỗ sẽ có kích thước nhỏ nhất.

TEMED thường được thêm vào ở nồng độ 0,4% để xúc tác cho việc tạo gel
vì vai trò làm tồn tại các gốc tự do của nó.

Hệ thống đệm giúp duy trì pH không đổi trong thùng chứa đệm, trong gel và
có vai trò như một chất điện phân cho phép dẫn dòng điện ngang qua điện trường.
Do vậy, hệ đệm phải hội đủ 3 điều kiện sau:

• Không tương tác với các đại phân tử cần phân tích.
• pH của môi trường điện di không làm biến tính các đại phân tử.
• Lực ion và nồng độ đệm phải thích hợp.

Có hai phương pháp diện di dùng gel polyacrylamide: có SDS và không SDS
(SDS: Sodium dodecylsulfate). SDS có vai trò làm biến tính protein do SDS kết
hợp với các vùng kò nước của protein và tách chúng thành các tiểu phần, đồng thời
làm âm tính hóa các tiểu phần này.

Ngoài ra, nếu các tiểu phần của protein gắn với nhau bằng các liên kết
disulfite, những liên kết này bò bẽ gãy khi có mặt SDS và β-Mercaptoethanol hay
Dithiothreitol (DTT) tạo thành nhóm –SH. Những nhóm này sau đó sẽ bò khóa bởi
tác nhân alkyl hóa để chống lại sự tái tạo liên kết disulfite.
Hầu hết protein đều tích điện âm, do đó, khi di chuyển trong điện trường,
protein sẽ hướng về điện cực dương (anode). Tại cực âm (cathode) và cực dương
(anode) xảy ra quá trình điện phân nước như sau:
•
Cực âm: 2H
2
O + 2e
-
-> 2OH
-
+ H
2

HA + OH
-
<-> A
-
+ H
2
O

•
Cực dương: H
2
O - 2e
-

-> 2H
+
+ ½ O
2

H
+
+ A
-
<-> HA