Tinh sạch Protein bằng phương pháp tủa

Tinh sạch protein
bằng phương pháp tủa



Phương pháp tủa được sử dụng tương
đối rộng rãi để thu nhận các phân tử
sinh học mà nhất là protein. Để tủa,
người ta có thể dùng nhiều cách khác
nhau: tủa bằng muối, tủa bằng các
dung môi hữu cơ hoặc thay đổi pH
của dung dịch có chứa protein.

1. Tủa bằng muối
Đây là cách phổ biến để tủa protein.
Khả năng hòa tan của protein tùy
thuộc vào nhiều yếu tố: đặc tính lý
hóa tự nhiên của protein, pH, nhiệt độ,
nồng độ của muối…
Ở nồng độ muối thấp, tính tan của
protein tăng nhẹ (salting in). Tuy
nhiên, ở nồng độ muối cao, tính tan
của protein giảm mạnh (salting out).
Đầu tiên, giả thuyết salting in ở nồng
độ muối thấp được giải thích bởi
Debye - Huckel. Trong dung dịch,
protein được bao bọc xung quanh bởi
các ion muối mang điện tích trái dấu.
Chính đặc tính này gia tăng hoạt tính

của các dung môi, làm giảm các phân
tử protein không mang điện tích, do
đó làm tăng tính tan của protein trong
dung môi. Giả thuyết của Debye –
Huckel cho rằng: tính tan của protein
được biểu diễn bằng một hàm logarit,
giá trị của hàm tỉ lệ với căn bậc hai
của cường độ ion trong dung dịch.
Thuật ngữ salting out trong môi
trường có nồng độ muối cao được giải
thích bởi Kirkwood. Sự gia tăng
lượng ion muối trong dung dịch làm
giảm quá trình Solvate hóa, giảm tính
hòa tan của protein dẫn đến sự tủa.
Ở nồng độ muối cao, độ hòa tan tuân
theo công thức sau của Cohn:
log S = B - KI
Trong đó
S: độ hòa tan của protein
B: hằng số (tùy thuộc vào chức năng
của protein, pH và nhiệt độ)
K: hằng số salting out (tuỳ thuộc vào
pH, hỗn hợp và lượng muối có trong
dung dịch)
I: cường độ ion của muối.
Đồ thị hàm log biểu diễn độ hòa tan
của protein biến thiên theo nồng độ
muối:

Hình 1. Độ tan theo nồng độ muối


Những đường biểu diễn khác nhau tùy
theo từng protein khác nhau. Vì thế,
khi muốn tách 1 protein từ một hỗn
hợp gồm nhiều protein khác nhau, ta
có thể lựa chọn nồng độ muối thích
hợp sao cho phù hợp nhất với protein
mục tiêu.
Độ dốc của đường salting out mô tả ở
trên phụ thuộc vào chức năng của
protein và nồng độ muối, không phụ
thuộc vào nhiệt độ và độ pH. Ngoài
ra, nếu trọng lượng phân tử của
protein tăng thì lượng muối cần cho
phương pháp tủa giảm xuống.
Hiệu quả tủa protein của các anion
muối khác nhau thì khác nhau, có thể
xếp theo thứ tự giảm dần như sau:
citrate > phosphate > sulphate >
acetate/chloride > nitrate >
thiocyanate.

2. Tủa protein bằng các dung môi
hữu cơ
Khi thêm dung môi hữu cơ vào môi
trường, hằng số điện môi của môi
trường giảm xuống. Công thức biểu
diễn mối quan hệ giữa độ hòa tan và