TIỂU LUẬN MÔN VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA VI SINH VẬT

1

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TPHCM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM





MÔN: VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM
ĐỀ TÀI:
CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ SỰ
SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN
CỦA VI SINH VẬT
GVHD: TRẦN QUỐC HUY
LỚP: 01DHTP1-Thứ 2-Tiết 3,4
NHÓM THỰC HIỆN: 11
MỤC LỤC
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1
CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN
CỦA VI SINH VẬT 3
2.1. Phương pháp xác định số lượng 3
2.1.1. Phương pháp xác định tế bào tổng cộng 3
2.1.1.1. Đếm tế bào trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu 3
2.1.1.2. Đếm trực tiếp bằng kính hiển vi huỳnh quang 4
2.1.1.3. Đếm bằng máy đếm điện tử 5
2.1.2. Phương pháp xác định tế bào riêng biệt 5
2.1.2.1. Phương pháp đếm khuẩn lạc 5
2.1.2.2. Phương pháp lọc màng 12
2.2. Phương pháp xác định sinh khối 14

2.2.1. Phương pháp trực tiếp 14
2.2.1.1. Phương pháp xác định sinh khối khô 14
2.2.1.2. Phương pháp xác định hàm lượng Nitơ tổng số ( Micro-Kejldahl ) 15
2.2.1.3. Phương pháp định lượng protein 17
2.2.2. Phương pháp gián tiếp 20
Phương pháp đo độ đục 21
2.2.3.Một số phương pháp khác 22
TÀI LIỆU THAM KHẢO 24





1

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN

Sinh trưởng và phát triển là thuộc tính cơ sở của vi sinh vật. Cũng như động vật và
thực vật, vi sinh vật cũng sinh trưởng và phát triển. Sinh trưởng là sự tăng kích thước và
khối lượng của tế bào, còn phát triển (hoặc sinh sản) là sự tăng số lượng tế bào. Sinh trưởng
và phát triển ở các vi sinh vật khác, chủ yếu là ở vi sinh vật đơn bào, không khác lắm so với
ở vi khuẩn, những kiến thức chung về sinh trưởng và phát triển ở vi khuẩn cũng có thể ứng
dụng vào các vi sinh vật khác.
Điều cần chú ý là khi nói về sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn tức là đề cập đến
sinh trưởng và phát triển của một số lượng lớn tế bào của cùng một loại. Rõ ràng, việc
nghiên cứu ở một cá thể tế bào vi khuẩn quá nhỏ là rất khó.
Tuy nhiên, sự tăng số lượng tế bào không phải bao giờ cũng diễn ra song song với sự
tăng sinh khối. Chẳng hạn, khi chất dinh dưỡng trong môi trường đã cạn, vi khuẩn tuy còn
phân chia 1-2 lần nhưng cho 2-4 tế bào nhỏ hơn tế bào bình thường; trong pha mở đầu, sinh

khối vi khuẩn tăng lên, nhưng số tế bào không thay đổi, ngược lại, vào cuối pha logarit kích
thước tế bào giảm đi nhưng số tế bào vẫn còn tăng.
Một vi sinh vật trong điều kiện môi trường thích hợp sẽ không ngừng hấp thụ chất
dinh dưỡng và tiến hành trao đổi chất. Nếu quá trình đồng hóa lớn hơn quá trình dị hóa thì
tổng số nguyên sinh chất (khối lượng, thể tích, kích thước) sẽ không ngừng tăng lên. Đó là
hiện tượng sinh trưởng của cá thể. Nếu là quá trình sinh trưởng cân bằng thì các thành phần
của tế bào cũng tăng lên theo những tỉ lệ thích hợp, khi đạt đến một mức độ nhất định sẽ
hình thành sự sinh sản. Khi đó số lượng cá thể tăng lên. Cá thể ban đầu sẽ phát triển dần lên
thành một quần thể, sự tiếp tục sinh trưởng của cá thể trong quần thể tạo ra sự sinh trưởng
của quần thể. Do đó:
Sinh trưởng cá thể  sinh sản cá thể  sinh trưởng quần thể.
Sinh trưởng quần thể = sinh trưởng cá thể + sinh sản cá thể
Trong vi sinh vật học khi nói đến sinh trưởng là nói đến sự sinh trưởng của cả quần
thể (khác với khi nói tới sinh trưởng ở các sinh vật có kích thước lớn)
Như đã nói ở trên, giữa số lượng tế bào và sinh khối mặc dù có mối liên hệ theo tỉ lệ
thuận y = kx nhưng mối liên hệ này chỉ đúng trong điều kiện thí nghiệm rất hạn chế, không
có ý nghĩa phổ biến. Điều này chính là do kích thước và khối lượng của từng vi khuẩn thay
đổi tùy theo loài và chủng, trong quá trình sinh trưởng thì phụ thuộc vào thời gian (ở các pha
đường cong sinh trưởng), vào tốc độ sinh trưởng, thành phần môi trường cấy và vào điều

2

kiện nuôi cấy. Vì vậy trong việc theo dõi sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn cần phân
biệt các phương pháp xác định số lượng tế bào và sinh khối. Chính vì vậy, qua quá trình tìm
hiểu và chọn lọc, nhóm đã đưa ra một số phương pháp có khả năng áp dụng trong nghiên
cứu và thực tế sản xuất, bao gồm hai nhóm phương pháp chính:
+ Các phương pháp xác định số lượng tế bào : tùy theo mục đích thí nghiệm, ta có thể
xác định số lượng tế bào tổng cộng (cả tế bào sống và chết) hoặc số lượng tế bào sống.
+ Các phương pháp xác định sinh khối tế bào: trong thực tế có thể dùng các phương
pháp trực tiếp (xác định sinh khối khô, xác định hàm lượng Nitơ, xác định hàm lượng

protein) hoặc gián tiếp (đo độ đục).

















3

CHƯƠNG 2
PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN
CỦA VI SINH VẬT

2.1. Phương pháp xác định số lượng
2.1.1. Phương pháp xác định tế bào tổng cộng
2.1.1.1. Đếm tế bào trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu
Buồng đếm hồng cầu được sử dụng để đếm vi sinh vật thuộc nhóm eukaryote có kích
thước lớn. Buồng đếm có cấu tạo đặc biệt, gồm những phòng có chiều sâu xác định, phần
đáy có kẻ ô. Số lượng vi sinh vật được tính dựa trên thể tích và độ pha loãng của mẫu.

Phương pháp tiến hành
Thêm vài giọt formalin vào trong những lọ chứa mẫu, trộn đều. Pha loãng mẫu cần
đếm sao cho trong mỗi ô nhỏ của buồng đếm có khoảng 5 -10 tế bào vi sinh vật. Để đạt được
độ pha loãng như vậy cần phải ước lượng được số lượng vi sinh vật trong mẫu, đồng thời
phải thử vài lần trong quá trình pha loãng. Mẫu phải được pha loãng bằng dung dịch pha
loãng chứa 0,1% pepton, 0,1% laurylsulphat và 0,01% methyl blue. Tất cả các dung dịch pha
loãng đều phải cần lọc trước khi sử dụng.
Đặt một giọt mẫu được pha loãng vào trong đĩa
đếm trên buồng đếm, đậy bằng kính đậy vật. Tất cả các
buồng đếm và kính đậy vật phải được lau thật sạch.Thể
tích mẫu chứa trong buồng đếm là khoảng không gian
giữa đĩa đếm và kính đậy vật, không để mẫu tràn ra bên
ngoài rãnh của đĩa.
Sau khi đặt mẫu, để yên khoảng 5 phút để ổn
định vị trí của các tế bào trong buồng đếm. Đếm ngẫu
nhiên khoảng 50-100 ô nhỏ. Tính trung bình số lượng Hình 1: Buồng đếm vi sinh vật
vi khuẩn trong tất cả các ô đã đếm. Sau đó nhân với
20000 và với độ pha loãng mẫu trước khi đếm để có được số lượng tế bào trong 1ml.
Lặp lại hai lần hay nhiều hơn để lấy giá trị số đếm trung bình. Đối với các vi sinh vật
tụ thành từng cụm, không thể phân biệt từng tế bào thì mỗi cụm được xem là một vi khuẩn.
Với những kinh nghiệm của mỗi cá nhân về độ pha loãng, thao tác kỹ thuật thành
thạo có thể nhận được các số đếm chính xác. Tuy vậy kết quả có chính xác hay không còn

4

phụ thuộc vào sự sạch sẽ của buồng đếm, kính đậy vật nhằm đảm bảo không có vi khuẩn
khác không phải từ mẫu hiện diện trong buồng đếm và trong kính đậy vật.

Hình 2: Phòng đếm Petroff-Hauser
(a)- Mặt nhìn nghiêng của phòng đếm- Phòng
đếm chứa dịch huyền phù vi khuẩn là khoảng không gian
bên dưới lá kính;
(b)- Giữa phiến kính có phòng đếm với các ô nhỏ;
(c) Ở độ phóng đại khoảng X 400-500 tiến hành
đếm số lượng vi khuẩn trong các ô nhỏ. Lấy số lượng
bình quân để tính ra mật độ vi khuẩn trong mẫu vật.
Trong phạm vi 1mm
2
có 225 ô nhỏ, do đó số lượng vi
khuẩn trên 1mm
2
là (số vi khuẩn/mm) X 25; vì phòng đếm
có chiều dầy là 0,02mm do đó nồng độ vi khuẩn trong
phòng đếm là: (số vi khuẩn)/m
2
X 25 (tổng số ô nhỏ) X
50=số vi khuẩn/mm
3
.
Vì 1cm
3
=1mm
3
X 10
3
cho nên giả thử số lượng vi
khuẩn bình quân trong mỗi ô nhỏ là 28 thì trong 1cm
3

có
nồng độ vi khuẩn là 28 X 25 X 50 X 10
3
= 3,5 X 10
7
vi
khuẩn. Nhân với độ pha loãng ban đầu (nếu có) sẽ biết
được nồng độ vi khuẩn trong mẫu kiểm tra.


Ưu điểm:
Phương pháp này đơn giản, rẻ tiền và tương đối nhanh chóng. Cung cấp đồng thời
những thông tin về kích thước, số lượng và hình thái vi sinh vật.
Nhược điểm:
Mật độ vi sinh vật cần đạt đủ độ đậm đặc, bởi vì mẫu được lấy ở một thể tích rất nhỏ.
Khó phân biệt tế bào sống và tế bào chết. Dễ nhầm lẫn, độ chính xác không cao, không thích
hợp cho huyền phù vi sinh vật có mật độ thấp.

2.1.1.2. Đếm trực tiếp bằng kính hiển vi huỳnh quang
Phương pháp

5

Sử dụng dầu nhúng phát quang thấp là một phát minh quan trọng trong việc hạn chế
sự phát huỳnh quang của các màng lọc. Màng carbonate Nuclepore là một màng cellulose
cao cấp dùng trong việc đếm trực tiếp vi khuẩn bởi vì chúng có kích thước lỗ đồng nhất và
bề mặt màng phẳng, chúng có thể giữ lại tất cả các vi sinh vật trên bề mặt của chúng.
Màng Nuclepore có thể nhuộm với thuốc nhuộm Irgalan đen hay các loại thuốc
nhuộm phù hợp khác để tạo nên một nền màu đen tương phản với màu phát quang của vi
sinh vật vì thế việc đếm được thực hiện dễ dàng.

Khi sử dụng thuốc nhuộm là acridine cam, vi khuẩn và các vi sinh vật khác phát
quang màu xanh hay màu cam. Màu phát quang xanh hay cam là phụ thuộc vào tình trạng
sinh lý của từng vi sinh vật.
Tuy nhiên khả năng phân biệt tế bào đang sống hay tế bào đã chết bởi màu phát
quang đôi khi đưa đến sự nhầm lẫn. Sử dụng ADPI nhuộm DNA của tế bào vi khuẩn, chúng
đưa đến sự phát quang màu xanh dương được cho là tối ưu hơn so với việc sử dụng acridin
cam để nhuộm các vi khuẩn có kích thước nhỏ.
Ưu điểm: Loại bỏ sai số do các chất vẩn. Kết quả phản ánh đúng với sinh khối
Nhược điểm: Đếm cả tế bào sống và tế bào chết.

2.1.1.3. Đếm bằng máy đếm điện tử
Đối tượng của phương pháp này là những vi sinh vật có kích thước lớn hơn như tảo,
protozoa, nấm men không có dạng sợi,… được đếm trực tiếp bằng máy đếm điện tử

Phương pháp
Cho dịch huyền phù vi khuẩn đi qua một khe nhỏ có dòng điện đi qua. Mỗi lần một
tế bào vi sinh vật đi qua hệ thống này thì điện trở sẽ gia tăng (hay sự dẫn điện giảm) và tế
bào đó sẽ được đếm.
Ưu điểm: Cho kết quả chính xác đối với những tế bào lớn
Nhược điểm: Không được dùng để đếm vi khuẩn do sự lầm lẫn trong trường hợp vi
khuẩn sinh ra những thành phần có thể hạt hay sự thành lập thể sợi.

2.1.2. Phương pháp xác định tế bào riêng biệt
2.1.2.1. Phương pháp đếm khuẩn lạc
Nguyên tắc
Với kỹ thuật đếm khuẩn lạc, các mẫu cần phân tích phải được pha loãng thành chuỗi
pha loãng liên tiếp và được xác định một vài nồng độ pha loãng nhất định để cấy vào các

6

môi trường đã chọn phù hợp với các đối tượng cần xác định. Mổi khuẩn lạc được hình thành
được gán cho một đơn vị hình thành khuẩn lạc (cfu-colony forming units).

Các bước tiến hành
+ Bước 1: Chuẩn bị dịch pha loãng mẫu
Một số dung dịch dùng để pha loãng có thể làm chết tế bào như: nước muối, nước cất.
Các dung dịch pha loãng không được dùng ngay khi lấy ra từ tủ lạnh có thể gây sốc và làm
cho vi sinh vật không thể phát triển được. Dung dịch pepton water là dung địch pha loãng
được sử dụng nhiều nhất và được xem là dung dịch pha loãng cho tất cả các loại mẫu. Nếu
trong mẫu còn có một ít các chất khử trùng thì phải thêm vào dung dịch pha loãng tác nhân
giảm thiểu khả năng khử trùng của chúng, ví dụ: nếu trong mẫu còn dư lượng của các hợp
chất amonium (NH
4
-) thì có thể thêm vào đó Tween 80 hay lecithin. Ngược lại nếu trong
mẫu có chứa các hợp chất chlorin hay iodin thì cần thêm vào đó các muối như sodium
thiosulphate.

+ Bước 2: Chuẩn bị các chuỗi pha loãng mẫu

Hình 3: Chuỗi pha loãng mẫu

Bơm chính xác 9ml dung dịch pha loãng vào trong ống nghiệm có nắp đậy. Nếu sử
dụng các ống nghiệm có nắp không đóng chặt được thì phải khử trùng ống nghiệm, sau đó
bơm dung dịch pha loãng vào, các thao tác này phải được thực hiện một cách vô trùng. Phân
phối dung dịch pha loãng vào các ống sau khi khử trùng còn có ý nghĩa đảm bảo thể tích

7

dung dịch pha loãng không bị mất do quá trình khử trùng. Các thao tác pha loãng tuỳ thuộc
vào từng loại mẫu. Cụ thể như sau:

Nếu pha loãng các mẫu là chất lỏng, trước khi pha loãng mẫu phải được lắc kỹ, cắm
đầu pipette sâu vào trong mẫu khoảng 1” hút ra 1ml, cho vào trong ống chứa dung dịch pha
loãng đầu tiên, lắc kỹ ống nghiệm chứa mẫu, bỏ pipette vừa sử dụng, dùng một pipette mới
thực hiện lại thao tác như trên với các độ pha loãng tiếp theo. Cứ tiếp tục như vậy cho đến
khi đạt được độ pha loãng mong muốn. Mỗi độ pha loãng chỉ được phép sử dụng 1 pipette.
Hàm lượng mẫu trong 1ml dung dịch các độ pha loãng của dãy như sau:

Ống số
Tỉ lệ pha loãng
Thể tích mẫu ban
đầu (ml)
Độ pha loãng
1
1/10
0.1
10-1
2
1/100
0.01
10-2
3
1/1000
0.001
10-3
4
1/10000
0.0001
10-4

Đối với các mẫu rắn hay bán lỏng, các thao tác được tiến hành như sau: Cân 10g mẫu

vào trong các bao dập mẫu hay các máy xay vô trùng, thêm 90ml dung dịch pha loãng và
đồng nhất mẫu, phải đảm bảo sao cho vi khuẩn phân tán đều vào trong dung dịch. Sau khi
mẫu và dung dịch pha loãng được đồng nhất ta được dung dịch pha loãng 1/10. Các độ pha
loãng sau được tiến hành tương tự như phần pha loãng mẫu lỏng. Trong 1ml các dung dịch
pha loãng chứa hàm lượng mẫu như sau:

Ống số
Tỉ lệ pha loãng
Thể tích mẫu ban
đầu (g)
Độ pha loãng
1
1/10
0.1
10-1
2
1/100
0.01
10-2
3
1/1000
0.001
10-3
4
1/10000
0.0001
10-4

8

+ Bước 3: Cấy mẫu vào môi trường, ủ mẫu


Hình 4: Tách khuẩn lạc và phương
pháp kiểm tra số lượng vi sinh vật
thông qua đếm khuẩn lạc mọc trên môi
trường thạch đĩa.
(a) (b)- Cách ria cấy để tách
khuẩn lạc riêng rẽ (không dùng để đếm
số lượng)
(c)(d)- Cách pha loãng rồi trộn
với môi trường thạch chưa đông
(e)(f)- Cách dàn dịch pha loãng
bằng que gạt trên mặt thạch (cho số
lượng khuẩn lạc nhiều hơn).
(Theo sách của K.P.Talaro,2005)




Có hai phương pháp là phương pháp đổ đĩa và phương pháp cấy bề mặt.

a. Phương pháp đổ đĩa
Phương pháp
Các môi trường agar được đun chảy trong các chai hay trong các ống nghiệm có thể

tích phù hợp. Được làm mát trong các bể điều nhiệt ở 45
0
C.
Hút 1ml mỗi dung dịch pha loãng cho vào trong đĩa petri vô trùng. Mỗi độ pha loãng
thường được cấy vào hai đĩa petri hay nhiều hơn. Cũng sử dụng các pipette sạch cho mỗi độ
pha loãng. Chỉ chọn cấy vào đĩa petri những độ pha loãng có mật độ vi sinh vật phù hợp,
thường trong khoảng 25-300 tế bào/ml.
Đổ vào mỗi đĩa đã cấy 10-15ml môi trường đã được đun chảy và làm nguội, lắc đĩa
theo chiều và ngược chiều kim đồng hồ khoảng 5-6 lần, đặt đĩa lên mặt phẳng ngang và đợi
cho đến khi môi trường trong đĩa đông đặc. Lật ngược đĩa và ủ trong điều kiện nhiệt độ và
thời gian xác định.

9

Ưu điểm :
Cấy được thể tích mẫu lớn (1ml). Xác định được các vi sinh vật cần dinh dưỡng tiếp
xúc từ nhiều phía. Cho phép đếm được mật độ vi sinh vật cao, khoảng 150-300 khuẩn lạc.
Nhược điểm:
Không định lượng được những vi sinh vật quá nhạy nhiệt. Không xác định được hình
dạng khuẩn lạc nhất định. Khó làm thuần một dòng vi sinh vật.

b. Phương pháp cấy bề mặt
Môi trường phải được chuẩn bị trên đĩa trước 1-2 ngày để khô mặt.

Phương pháp
Đây là phương pháp thay thế cho phương pháp đổ đĩa để phân tích các chỉ tiêu vi sinh
trong thực phẩm, nhất là các chỉ tiêu vi sinh vật nhạy cảm với nhiệt độ như Pseudomonas,
các vi sinh vật này sẽ bị suy yếu khi tiếp xúc với nhiệt độ của môi trường agar ở trạng thái
lỏng. Phương pháp này cũng được dùng để phân tích các chỉ tiêu mà các dòng nhận được
phải cấy chuyền ở các bước tiếp theo.

Cấy 0,1ml hay thể tích phù hợp lên bề mặt bằng pipette hay bằng que cấy lên đĩa môi
trường đã được làm khô và trải đều bằng que cấy trang hay que cấy vòng để trải mẫu trên
khắp bề mặt môi trường.
Ủ các đĩa đã cấy ở điều kiện nhiệt độ và thời gian xác định tuỳ theo từng chỉ tiêu phân
tích, đếm các khuẩn lạc đặc trưng hay tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa.
Khi đếm các khuẩn lạc, trong một số trường hợp xuất hiện các khuẩn lạc mọc lan,
thông thường các khuẩn lạc khác cũng được nhìn thấy bên trong các vết khuẩn lạc loang.
Khi đếm ta chỉ coi khuẩn lạc loang là một đơn vị hình thành khuẩn lạc và đến các khuẩn lạc
khác trong khuẩn lạc loang. Các khuẩn lạc loang này là do các vi khuẩn tập trung thành từng
tập đoàn trong quá trình phát triển.

Ưu điểm: Định lượng được các vi sinh vật nhạy nhiệt. Có thể nhận dạng được các
dạng khuẩn lạc đặc trưng. Dễ dàng làm thuần chủng vi sinh vật mục tiêu.
Nhược điểm: Chỉ cấy được thể tích mẫu nhỏ. Chỉ cho phép đếm được số lượng khuẩn
lạc thấp.

+ Bước 4: Đếm số khuẩn lạc hình thành

10


Hình 5: Các máy đếm khuẩn lạc

 Môi trường và các điều kiện nuôi cấy khuẩn lạc
Phương pháp đếm khuẩn lạc sử dụng nhiều loại môi trường và các điều kiện nuôi cấy
khác nhau. Agar là chất thường được dùng để làm đặc các môi trường nuôi cấy vì hầu hết
các vi sinh vật đều mất các gen tổng hợp enzyme phân giải agar. Các mẫu đã được pha loãng
để trãi lên bề mặt môi trường agar (phương pháp trãi) hay khuyếch tán vào trong môi trường
trước khi làm đặc (phương pháp đổ đĩa).
Một vấn đề cần phải cân nhắc là các vi sinh vật cần xác định có thể tồn tại và phát

triển trong môi trường agar hay không. Một số vi sinh vật có thể bị chết khi trãi trên bề mặt
môi trường trong qui trình cấy trải bề mặt. Một số loài vi khuẩn khác không thể sống trong
điều kiện nhiệt độ duy trì trạng thái lỏng của agar trong qui trình đổ đĩa. Bởi vì agar chỉ là
tác nhân làm rắn môi trường nuôi cấy trong qui trình định lượng vi sinh vật vì thế trong một
số trường hợp agar có thể được thay thế bằng các tác nhân làm rắn khác. Trong một số
trường hợp các vi sinh vật có các nhu cầu dinh dưỡng đặc biệt khác, các chất như silicagel
có thể được thay thế để làm rắn môi trường. Nhưng vì chuẩn bị môi trường silicagel khó
khăn hơn chuẩn bị môi trường agar nên chỉ dùng môi trường silicagel khi không thể thay thế
được môi trường agar.
Phương pháp ống cuộn được dùng để định lượng các vi sinh vật kỵ khí bắt buộc. Đây
là một phương pháp cải biên của phương pháp đổ đĩa. Các đĩa hay các ống sau khi cấy vi
khuẩn được ủ trong điều kiện nhiệt độ đặc biệt trong một thời gian nhất định để cho sinh vật
phát triển thành các khuẩn lạc có thể nhìn thấy bằng mắt thường, số lượng khuẩn lạc xuất
hiện trên đĩa sẽ được đếm. Số lượng khuẩn lạc sẽ được gán cho số tế bào đơn lẻ trong mẫu
ban đầu. Để số lượng khuẩn lạc phản ánh được số lượng tế bào vi khuẩn, mẫu phải được
phân tán đều vào trong môi trường hay trên bề mặt môi trường rắn. Những đĩa có quá nhiều

11

khuẩn lạc xuất hiện thì không thể cho số lượng đếm chính xác bởi vì chúng có thể chồng lấp
lên nhau. Những đĩa có quá ít khuẩn lạc cũng phải bỏ đi vì theo nguyên tắc của xác suất.
Những vấn đề chính yếu cần xem xét trong qui trình đếm khuẩn lạc là thành phần môi
trường, điều kiện và thời gian nuôi ủ. Môi trường để định lượng các vi sinh vật dị dưỡng
không thể cố định nitơ phải chứa các nguồn nitơ, carbon, phosphate dễ sử dụng và các
cation, anion cần thiết như sắt, mangie, calci, natri, clo và sulphate. Thành phần của các hàm
lượng không nhất định, chúng đặc thù cho từng loại môi trường và từng loại mẫu nhất định
để có thể nhận được số lượng vi sinh vật mục tiêu cao nhất. Như vậy môi trường nuôi cấy
phải có các thành phần dinh dưỡng phù hợp với từng yêu cầu của loài vi sinh vật, bao gồm
cả các nhân tố cần thiết khác cho sự phát triển của một hệ vi sinh vật nhất định. Mục đích
chung của môi trường là hàm lượng dinh dưỡng phải cao hơn các thành phần có trong các

mẫu đang phân tích. Hàm lượng dinh dưỡng trong các loại môi trường đếm tổng số vi sinh
vật phải đủ cao, và độc tính của môi trường đối với sinh vật ở mức thấp nhất.
Để nâng cao hiệu quả của qui trình định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc, các điều kiện cần phải điều chỉnh sao cho chỉ có các thành viên vi sinh vật cần
phát hiện theo định nghĩa được đếm. Các môi trường đếm đĩa được chọn lọc hay phân biệt
với các thành viên vi sinh vật khác. Qui trình đếm đĩa chọn lọc được thiết kế cho thích hợp
với sự phát triển của vi sinh vật mong muốn. Sự phát triển của các nhóm vi sinh vật khác
được loại bỏ bởi các thành phần của môi trường hay điều kiện nuôi ủ. Môi trường phân biệt
là môi trường không loại bỏ các nhóm vi sinh vật không mong muốn mà ngược lại cho phép
chúng phát triển cũng trên môi trường đó nhưng có thể phân biệt các nhóm vi sinh vật mong
muốn với các nhóm khác bằng các đặc điểm nhận dạng.
Môi trường cũng có thể được thiết lập để chọn lọc các loài nấm mốc.Mặt dù kỹ thuật
đếm khuẩn lạc không phải là phương pháp được chọn cho việc xác định số lượng nấm mốc
trong các mẫu thực phẩm và trong môi trường. Bởi vì kỹ thuật này chỉ thích hợp cho việc
định lượng các loài vi sinh vật không có sợi hay bào tử. Dĩ nhiên phương pháp đếm khuẩn
lạc cũng thích hợp cho việc định lựơng các loài nấm men.Vì số lượng của vi khuẩn luôn
nhiều hơn số lượng của nấm mốc nên để ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn trong các
khuẩn lạc của nấm mốc, các tác nhân ức chế vi khuẩn được thêm vào trong các môi trường
nuôi cấy. Các thuốc nhuộm bengal rose và các kháng sinh như streptomycine, neomycine
thường được sử dụng là những tác nhân ức chế vi khuẩn. Một biện pháp đơn giản để ức chế
sự phát triển của vi khuẩn là hạ thấp pH của môi trường nuôi cấy xuống khoảng 4,5 - 5,5.
Hầu hết các nấm mốc đều không bị tác động khi phát triển trong khoảng pH này nhưng khi
đó vi khuẩn bị ức chế.

12

Môi trường chọn được xác lập công thức để ức chế sự phát triển của nhóm vi sinh vật
và cho phép một nhóm vi sinh vật khác phát triển. Ví dụ môi trường Saubouraud Dextrose
Agar được dùng để định lượng nấm mốc dựa trên nguyên tắc pH thấp và nguồn
carbohydrate. Bổ sung vào môi trường các chất kháng sinh khác như peniciline hay methyl

bule là những tác nhân ức chế vi khuẩn Gram âm. Các vi sinh vật kháng kháng sinh cũng có
thể được định lượng trên môi trường bằng cách thêm vào đó một liều lượng kháng sinh. Môi
trường phân biệt được thiết lập dựa trên nhiều cách. Các thuốc thử được thêm vào trong môi
trường để cho phép nhận ra các sự khác biệt của những vi sinh vật mong muốn. Có thể thêm
thuốc thử vào môi trường sau khi nuôi cấy để nhận ra các loài vi sinh vật đặc trưng cần tìm.
Chìa khoá nâng cao khả năng phân biệt của môi trường là qui trình nuôi cấy để cho phép
môi trường phân biệt một cách tốt nhất với vi sinh vật cần định lượng và các vi sinh vật khác
có trong mẫu.
Môi trường Eosin methyl blue (EMB) và MacConkey agar là những môi trường được
sử dụng rộng rãi trong việc phân tích vi sinh vật trong nước. Những môi trường này bao gồm
tính chọn lọc và tính phân biệt. Chúng chọn lọc cho sự phát triển của các vi khuẩn Gram âm
bởi trong đó có thêm vào các tác nhân ức chế các vi khuẩn Gram dương. Môi trường này có
thể phân biệt các vi khuẩn có thể sử dụng lactose bởi sự hình thành các khuẩn lạc có thể
phân biệt bằng màu sắc. Trên môi trường EMB, vi khuẩn thuộc nhóm coliforms là nhóm
Gram âm tạo nên những khuẩn lạc có màu tím ánh kim. Định lượng số lượng coliform bằng
cách đếm số lượng khuẩn lạc có các đặc điểm này. Cách này thường xuyên được sử dụng
trong việc phân biệt các vi sinh vật chỉ thị trong nước và trong thực phẩm.

 Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp đếm khuẩn lạc
Ưu điểm:
Cho phép xác định số tế bào sống. Định lượng chọn lọc vi sinh vật
Nhược điểm:
Không chính xác trong trường hợp tế bào vi sinh vật kết thành đám, không phân tán
đều trong quá trình trải.

2.1.2.2. Phương pháp lọc màng
Phương pháp này thường được áp dụng cho các mẫu lỏng như nước, sữa
Các mẫu chất lỏng được lọc qua màng lọc có kích thước lỗ lọc nhỏ hơn kích thước
của vi sinh vật. Vi sinh vật được giữ lại trên màng lọc. Màng được đặt trên môi trường agar

13

hay trên giấy thấm được ngấm trong môi trường nuôi cấy lỏng đã chọn và ủ trong điều kiện
xác định.Sau khi ủ, đếm các khuẩn lạc sẽ xuất hiện trên bề mặt màng lọc.
Thiết bị lọc có thể bằng thủy tinh, bằng kim loại hay bằng nhựa, bao gồm phễu lọc
giá đỡ màng lọc, bộ thiết bị hỗ trợ hút chân không và bình chứa. Màng lọc được làm bằng
cellulose ester có lỗ lọc nằm trong khoảng 0,1-1 µm, các loại màng lọc dùng cho việc phân
tích tổng số vi sinh vật thường có kích thước lỗ lọc là 0,47µm, đường kính màng lọc có
nhiều kích cỡ khác nhau phù hợp với đường kính của phễu lọc, bề dày của màng khoảng
120µm. Khi lọc tất cả các vi khuẩn đều được giữ lại trên màng. Khi đặt màng lọc sao cho bề
trên của màng hướng lên phía trên, vi khuẩn không tiếp xúc trực tiếp với môi trường nhưng
các thành phần của môi trường dễ dàng thấm qua màng và nuôi vi khuẩn phát triển thành
khuẩn lạc. Một số loại màng lọc có gắn các lưới kỵ nước chỉ cho phép khuẩn lạc phát triển
trong mỗi ô của lưới và không cho lan sang các ô khác nhằm tạo điều kiện thuận tiện khi
đếm.

Hình 6: Phương pháp lọc màng để xác định số lượng vi sinh vật


Hình 7: Thiết bị lọc vi sinh vật

14


Hình 8: Các loại khuẩn lạc mọc trên màng lọc.
Theo sách của Prescott,Harley và Klein (2005)
(a)- Tổng số vi khuẩn mọc trên môi trường tiêu chuẩn, dùng chỉ thị màu để nhuộm đỏ
khuẩn lạc cho dễ đếm;
(b)- Dùng môi trường thích hợp để kiểm tra nhóm vi khuẩn coliform có nguồn gốc từ
phân (khuẩn lạc bắt màu xanh);

(c)- Dùng môi trường thạch m-Endo để xác định vi khuẩn E.coli và các Coliform
khác- khuẩn lạc có màu lục;
(d)- Nắm sợi và nấm men mọc trên môi trường Thạch - Mạch nha.

Ưu điểm: Xác định được mật độ vi sinh vật cụ thể trong một thể tích mẫu lớn: 10ml,
100ml …
Nhược điểm: Không thích hợp cho việc phân tích các mẫu thực phẩm rắn.

2.2. Phương pháp xác định sinh khối
2.2.1. Phương pháp trực tiếp
Nếu hàm lượng một số vật chất trong mỗi tế bào là giống nhau thì tổng lượng chất đó
trong tế bào có tương quan trực tiếp với tổng sinh khối vi sinh vật. Chẳng hạn, thu tế bào
trong một thể tích nhất định của dịch nuôi cấy, rửa sạch đi rồi đo tổng lượng protein hay
tổng lượng Nitơ, có thể thấy sự tăng quần thể vi sinh vật là phù hợp với sự tăng tổng lượng
protein hay Nitơ.

2.2.1.1. Phương pháp xác định sinh khối khô
Sự sinh trưởng của vi sinh vật không chỉ biểu hiện ở số lượng tế bào mà còn ở cả sự
tăng trưởng của tổng khối lượng tế bào. Phương pháp trực tiếp nhất là xác định trọng lượng
khô của tế bào.
Để xác định sinh khối khô của tế bào người ta sẽ tiến hành các bước sau:

15

+ Bước 1: Ly tâm để thu nhận sinh khối tế bào.
+ Bước 2: Rửa tế bào rồi làm khô trong lò sấy.
+ Bước 3: Cân trọng lượng khô thu được.

Ưu điểm: Phương pháp này thích hợp để xác định sự sinh trưởng của nấm.
Nhược điểm: Tốn thời gian tiến hành và không thật nhạy cảm. Không dùng được với

vi khuẩn vì trọng lượng từng cá thể là rất nhỏ, thậm chí phải ly tâm tới vài trăm ml mới đủ
số lượng để xác định trọng lượng sinh khối khô.

2.2.1.2. Phương pháp xác định hàm lượng Nitơ tổng số
Nguyên lý
Tất cả các dạng Nitơ có trong cơ thể hay trong các mô được gọi là Nitơ tổng số.
Nitơ có trong thành phần amino acid của protein là Nitơ protein. Nitơ không có trong
thành phần protein như của các muối vô cơ, acid nitric, các amino acid tự do, các peptide,
urea và các dẫn xuất của urea, các alkaloid, các base purine và pyrimidine,
là Nitơ phi protein.
Nitơ tổng số = Nitơ protein + Nitơ phi protein
Do hàm lượng Nitơ tổng số đặc trưng cho sự phát triển sinh khối tế bào của vi sinh
vật. Sự gia tăng sinh khối sẽ dẫn đến sự gia tăng hàm lượng Nitơ tổng số, vì thế ta có thể
đánh giá mức độ gia tăng sinh khối thông qua việc so sánh hàm lượng Nitơ giữa các mẫu thử
sau các thời gian nuôi cấy khác nhau.
Đối tượng áp dụng phương pháp này là các vi sinh vật được nuôi cấy trong môi
trường lỏng.

Phương pháp tiến hành
Để thực hiện phương pháp này, từ thang vi sinh, ta tiến hành lấy một mẫu nhỏ chứa
sinh khối đã được tách khỏi môi trường nuôi cấy bằng phương pháp li tâm.
Tiếp theo xác định lượng đạm tổng trong mẫu bằng phương pháp Micro – Kjeldahl.
Phương pháp Micro – Kjeldahl thường được dùng để xác định lượng đạm tổng trong các
phẩm vật có nguồn gốc sinh vật.
Sau một thời gian nuôi cấy, ta tiếp tục lấy mẫu và xác định hàm lượng Nitơ tổng
trong mẫu rồi đem so sánh với mẫu đầu tiên để đánh giá sự thay đổi sinh khối vi sinh vật.

Xác định hàm lượng Nitơ trong mẫu bằng phương pháp Micro – Kjeldahl

16

 Nguyên lý
Dưới tác dụng của H
2
SO
4
đậm đặc ở nhiệt độ cao và có chất xúc tác , các hợp chất
hữu cơ có chứa Nitơ bị phân hủy và bị oxi hóa đến CO
2
và H
2
O, Nitơ chuyển thành
Amoniac (NH
3
) và tiếp tục kết hợp với H
2
SO
4
tạo thành muối Amoni sunfua (NH
4
)
2
SO
4
tan
trong dung dịch.
Đuổi NH
3
ra khỏi dung dịch bằng NaOH đồng thời cất và thu NH
3

bằng một lượng dư
H
2
SO
4
0,1N; định phân lượng H
2
SO
4
0,1N còn lại bằng dung dịch NaOH 0,1N chuẩn, qua
đó dễ dàng tính được lượng Nitơ có trong mẫu nguyên liệu thí nghiệm.

 Các bước tiến hành
+ Bước 1: Vô cơ hóa mẫu
Trước tiên mẫu được vô cơ hóa bằng H
2
SO
4
đặc ở nhiệt độ cao và có chất xúc tác.
Các phản ứng của quá trình vô cơ hóa xảy ra như sau:
2H
2
SO
4
→ 2H
2
O +2SO
2
↑+ O
2

Oxi tạo thành trong phản ứng lại oxi hóa các nguyên tố khác. Các phân tử

chứa Nitơ
dưới tác dụng của H
2
SO
4
tạo thành NH
3
. Ví dụ các protein bị thủy phân

thành acid amine;
carbon và hidro của acid amine tạo thành CO
2
và H
2
O; còn Nitơ

được giải phóng dưới dạng
NH
3
kết hợp với H
2
SO
4
dư tạo thành (NH
4
)
2
SO

4
tan trong

dung dịch

2 NH
3
+ H
2
SO
4
→ (NH
4
)
2
SO
4

Các nguyên tố P, K, Ca, Mg, chuyển thành dạng oxide: P
2
O
5
, K
2
O, CaO,MgO, tuy
tồn tại trong dung dịch mẫu nhưng không ảnh hưởng đến kết quả phân tích.

+ Bước 2: Chưng cất đạm
Đuổi NH
3

ra khỏi dung dịch bằng NaOH
(NH
4
)
2
SO
4
+ 2 NaOH → Na
2
SO
4
+ 2H
2
O + 2 NH
3
↑
NH
3
bay ra được làm lạnh biến đổi thành NH
4
OH rơi vào bình hứng, bình hứng chứa
H
2
SO
4
0.1N
2NH
4
OH + H
2

SO
4
→ (NH
4
)
2
SO
4
+ 2H
2
O + H
2
SO
4
dư

+ Bước 3: Chuẩn độ H
2
SO
4
dư
Chuẩn độ H
2
SO
4
dư bằng NaOH 0.1N
H
2
SO
4

dư + 2NaOH → Na
2
SO
4
+ 2H
2
O
Chuẩn độ H
2
SO
4
dư trong bình hứng bằng NaOH 0.1N cho đến khi mất màu tím hồng
và chuyển sang màu xanh lá mạ. Ghi nhận thể tích NaOH 0.1 N sử dụng.

17

+ Bước 4: Tính kết quả
Hàm lượng % nitơ tổng số được tính theo công thức
N (%) =










Trong đó:

V
1
: số ml H
2
SO
4
cho vào bình hứng
V
2
: số ml NaOH 0.1N đã chuẩn độ
a: số miligam nguyên liệu
1,42: hệ số, cứ 1 ml H
2
SO
4
dùng để trung hòa NH
4
OH thì tương đương với
1,42mg Nitơ

Ưu điểm:
Phương pháp này cho kết quả có độ chính xác cao nhờ việc tiến hành chuẩn độ các
chất trong quá trình thí nghiệm.
Nhược điểm:
Tuy cho kết quả có độ chính xác cao nhưng tiến hành phức tạp, từ giai đoạn lấy mẫu
cho đến khi chuẩn độ phải mất nhiều thời gian.
Phương pháp này không áp dụng cho các vi sinh vật nuôi cấy trong môi trường đặc
do khó tiến hành tách chiết như ở môi trường lỏng.

2.2.1.3. Phương pháp định lượng protein

Phương pháp định lượng protein là phương pháp dùng để xác định hàm lượng protein
trong sinh khối của vi sinh vật . Vì hầu hết trong cơ thể của vi sinh vật là protein do một mặt
protein là thành phần của mọi chất khô, mặt khác đó là những thành phần hoạt động trong
sinh khối (hầu hết protein của tế bào là ezyme), do đó có thể dựa vào hàm lượng protein để
đánh giá sự sinh trưởng của vi sinh vật
Phân loại : có 2 loại phản ứng vì acide amin của protein có 2 dạng là mạch thẳng và
mạch vòng, nên khi protein có chứa các acide amin dạng mạch thẳng thì ta sử dụng phương
pháp Biure còn các protein có chứa mạch vòng (triozin,tryptophan,…) thì ta sử dụng phương
pháp Lowry

 Phương pháp Biure
Bản chất của phản ứng : xảy ra khi từ 2 liên kết peptide trở lên mới có phản ứng
này.Tạo phức tím hồng với CuSO
4
trong môi trường kiềm. Cực đại hấp thụ tại 540 nm.

18



CuSO
4
+ 2NaOH
Cu(OH)
2
+ Na
2
SO
4

C
O
N
H
CH
R
1
C
O
N
H
CH
R
2
C
O
N
H
CH
R
3
C
O
N
H
CH
R
4

+NaOH

C
OH
N
CH
R
1
C
OH
N
CH
R
2
C
OH
N
CH
R
3
C
OH
N
CH
R
4
Cu(OH)
2
C
N

CH
R
2
C
N
CH
CH
R
1
R
3
N
C
C
OH
N
CH
R
4
Cu
O
O



Ta có thể đánh giá hàm lượng protein thông qua biểu đồ của một loại protein chuẩn.

Hình 9: Đồ thị protein chuẩn

Phức màu xanh tím
Nồng Độ
OD
0

19

Dựa trên phản ứng màu Biure tạo màu thì người ta sẽ sử dụng phản ứng màu Biuret
để định lượng protein bằng cách đo mật độ quang của dung dịch phức tạo thành ở bước sóng
540nm.
Từ đồ thị protein chuẩn mà ta đã có, ta sẽ thực hiện phản ứng màu Biure rồi lợi dụng
tính chất hấp thụ bước sóng của nó đem đo OD . Sau đó dựa trên đồ thị của protein chuẩn để
xác định các nồng độ của protein cần xác định, từ đó có thể đánh giá được sự sinh trưởng
của vi sinh vật thông qua định lượng protein.

 Phương pháp Lowry
Thuốc thử Lowry có chứa LiSO
4
và molipdat Na.Tác dụng với các axit amin có vòng
thơm, hấp thụ cực đại ở 750 nm. Độ nhạy cao, tạo phức màu xanh tím.
Phương pháp này dựa trên cơ sở dùng máy đo màu để xác định sản phẩm khử

phosphomolipden-phophowolframate với phức hợp đồng – protein. Cường độ màu của hỗn
hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ protein.
Dựa vào đồ thị chuẩn của protein (thông thường dùng tinh thể albumin huyết thanh
bò) ta có thể tính được hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu.
Phương pháp này được sử dụng rộng rãi để xác định nhiều loại protein khác
nhau.Phương pháp này cho kết quả chính xác khi xác định protein đã được tinh sạch.

 Đối tượng
Có thể áp dụng cả 2 phương pháp trên đối với những vi sinh vật có chứa các protein
hòa tan và tiết ra những protein ngoại bào (như tảo,vi khuẩn Gram âm…).
 Ưu điểm và nhược điểm
Ưu điểm : Được sử dụng rộng rãi thích hợp nhất trong việc xác định hàm lượng
protein, nhanh tiết kiệm thời gian, cho kết quả tốt.
Nhược điểm : Chỉ áp dụng được đối với những vi sinh vật có chứa các protein hòa
tan.

 Một số phương pháp xác định protein theo phương pháp quang phổ
Protein sau khi đã được tách chiết và làm sạch có thể định lượng được. Nếu protein
nghiên cứu là enzyme thì việc định lượng thông qua xác định hoạt độ của enzyme. ( Theo
quy ước quốc tế: 1 đơn vị hoạt độ enzyme là lượng enzyme làm chuyển hóa 1 mol cơ chất
trong 1 phút ở các điều kiện tiêu chuẩn ).

20

Như vậy cứ sau các bước tách chiết và làm sạch protein người ta thấy tổng lượng
protein giảm nhưng hoạt độ enzyme tăng nghĩa là hoạt độ riêng tăng rất cao. Protein được
coi là sạch nếu những bước tách chiết và làm sạch sau không làm tăng hoạt độ riêng của
chúng nữa và chỉ khi đó ta mới hoàn thành việc tách chiết và làm sạch protein.
Nếu protein không phải là enzyme thì ta có thể định lượng chúng bằng các phương
pháp khác.

Nếu protein ta nghiên cứu là hormone hoặc các độc tố thì chúng được xác định qua
hiệu ứng sinh học mà chúng gây ra. Ví dụ như hormone sinh trưởng sẽ kích thích sự sinh
trưởng của các tế bào đích nuôi cấy.
Nếu là protein vận chuyển thì có thể xác định chúng thông qua nồng độ chất mà
chúng vận chuyển.
Phương pháp đơn giản nhất để đo nồng độ protein trong dung dịch là độ hấp thụ tia
cực tím của nó .
+ Nếu protein tinh sạch thì nồng độ tuyệt đối của nó được tính theo giá trị đo được.
+ Nếu protein không tinh sạch ( dịch chiết từ một sắc ký,… ) thì nồng độ của protein
tổng được tính tương đối từ độ hấp thụ.
+ Nguyên tắc của phương pháp này là các protein hấp thụ tia cực tím cực đại ở bước
sóng 280 nm do các acid amin thơm như : tryptophan ,tyrosine và phenylalanine . Độ hấp
thụ ở 280 nm thay đổi tùy loại protein nhưng hệ số tắt đo được ( nghĩa là độ hấp thụ của
dung dịch protein 1% với đường sóng truyền qua 1cm ) cho mỗi protein cho phép tính nồng
độ của protein tinh sạch.
+ Với một hỗn hợp các protein hoặc với bất cứ một loại protein nào mà không biết hệ
số tắt thì nồng độ protein được tính như sau :
Nồng độ protein (mg/ml)=1,55. A280 – 0,77 . A260
Trong đó:
A280 : độ hấp thụ ở bước sóng 280nm
A260 : độ hấp thụ ở bước sóng 260nm
Phương pháp này không dùng được cho các dung dịch có nồng độ protein thấp hơn
0,1mg/ml hoặc khi có mặt nhiều chất khác mà hấp thụ cùng một vùng cực tím (ví dụ: đệm ,
acid nucleic và một số chất béo), hoặc khi protein ở trong dịch huyền phù chứ không phải
trong dung dịch (ví dụ: trong màng hoặc các phức hợp có trọng lượng phân tử lớn). Cũng
cần chú ý là nếu tỷ lệ A280/A260 thấp hơn 0,6 nghĩa là dung dịch protein chưa sạch, bị lẫn
các chất khác, đặc biệt với acid nucleic thì nên sử dụng phương pháp Lowry để do nồng độ
protein.

21

2.2.2. Phương pháp gián tiếp
 Phương pháp đo độ đục
Đây là phương pháp gián tiếp để xác định mật độ tế bào. Khi một pha lỏng có chứa
nhiều phân tử không tan thì sẽ hình thành một hệ huyền phù và có độ đục bởi các phần tử
hiện diện trong môi trường lỏng cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới. Tế bào vi
sinh vật cũng là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trường cũng làm môi trường trở
nên đục.
Phương pháp này có ưu điểm lớn là có thể thực hiện trong thời gian ngắn, đặc biệt
không gây phá hủy tế bào và độ nhạy cảm cao hơn so với phương pháp xác định sinh khối
khô của tế bào.
Nguyên lý của phương pháp đo độ đục bằng cách đo mật độ quang (OD) là dựa trên
hiện tượng tán xạ ánh sáng: Khi truyền qua dung dịch huyền phù, ánh sáng sẽ bị tán xạ. Mức
độ tán xạ ánh sáng tỷ lệ thuận với nồng độ tế bào.
Nguyên tắc: Dùng chùm tia sáng đơn sắc chiếu xuyên qua huyền phù chứa vi sinh vật
muốn đo, vi sinh vật làm phân tán bớt chùm tia sáng nhiều hoặc ít tùy thuộc vào số lượng
của chúng trong huyền phù. Số tia sáng còn lại khi xuyên qua huyền phù sẽ kích thích một tế
bào quang điện.

Hình 10: Tiến hành đo độ đục

22

Lúc nồng độ vi khuẩn đạt đến 10
7
tế bào/ml thì dịch nuôi cấy sẽ vẩn đục, nồng độ
càng tăng thì độ đục cũng tăng theo và làm cản trở ánh sáng đi qua dịch nuôi. Có thể đo độ
tán xạ ánh sáng bằng quang phổ kế (spectrophotometer).
Ở một mức độ hấp thụ ánh sáng thấp, giữa nồng độ tế bào và giá trị hấp thụ ánh sáng
có quan hệ tuyến tính. Chỉ cần nồng độ vi sinh vật đạt tới nồng độ có thể đo được là đều có

thể dùng phương pháp đo độ đục trên quang phổ kế để xác định sự sinh trưởng của vi sinh
vật.
Lưu ý: Chỉ tiến hành đo độ đục các mẫu mà ở đó vi sinh vật sinh trưởng làm đục
đồng đều môi trường nuôi cấy, không tạo thành váng, khối.
Thông thường, để xác định nồng độ tế bào, ta cần phải xác định mật độ quang (OD).
Mật độ quang được xác định dựa vào tỷ số giữa cường độ ánh sáng trước khi qua mẫu và sau
khi qua mẫu:

Trong đó:
A
λ
là mật độ quang tại bước sóng λ.
I
0
là cường độ sáng trước khi qua mẫu.
I là cường độ sáng sau khi qua mẫu.

Người ta sử dụng bước sóng λ = 600 nm để xác định nồng độ tế bào theo công thức
sau:
[Số tế bào/ml] = A
600
.k .f
Trong đó:
k = 5x10
8
là hệ số chuyển đổi.
f là hệ số pha loãng.

Thông qua việc đo độ hấp thụ ánh sáng có thể xác định được sinh khối vi sinh vật.
Khi số lượng tế bào tăng lên sẽ dẫn đến việc tăng độ đục, mức độ tán xạ ánh sáng nhiều hơn

và quang phổ kế sẽ đo được mức độ tăng lên của trị số hấp thụ ánh sáng. Trên quang phổ kế
có hai thang chia độ: phía dưới là trị số hấp thụ ánh sáng, phía trên là mức độ thấu quang.
Khi trị số hấp thụ ánh sáng tăng lên thì mức độ thấu quang hạ xuống.

2.2.3. Một số phương pháp xác định sinh khối khác
Ngoài các phương pháp đã đề cập ở trên, còn một số phương pháp khác cũng có thể
dùng để xác định sinh khối nhưng không thường được ứng dụng trong thực tế do cách thức

23

tiến hành phức tạp hoặc độ chính xác không cao, chỉ giới hạn trong một vài trường hợp cụ
thể như:
+ Phương pháp xác định hàm lượng Cacbon tổng số
+ Đo các chỉ số cường độ trao đổi chất như hấp thụ O
2
, tạo thành CO
2
hay axit, vì các
chỉ số này liên quan trực tiếp với sinh trưởng. Dĩ nhiên ta chỉ dùng các phương pháp này
trong trường hợp không sử dụng được các phương pháp khác, ví dụ khi mật độ sinh khối rất
nhỏ. Để đo các chỉ số này có thể dùng các phương pháp chuẩn độ, manomet, điện hóa…