BÁO CÁO THỰC HÀNH VI SINH VẬT CÔNG NGHIỆP

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC














BÁO CÁO THỰC HÀNH
VI SINH VẬT CÔNG NGHIỆP

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
TRẦN VŨ PHƯƠNG NGUYỄN BÁ TRƯỜNG
MSSV: B1203178
LỚP: VI SINH VẬT K38




Cần Thơ, Tháng 4/2014
Báo cáo thực hành Vi Sinh Vật Công Nghiệp Trường ĐHCT

i
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
MỤC LỤC
Trang
MỤC LỤC i
DANH SÁCH HÌNH ii
DANH SÁCH BẢNG ii
BÀI 1: LÊN MEN RƯỢU NHO 1
I. GIỚI THIỆU 1
II. PHƯƠNG TIỆN 1
III. PHƯƠNG PHÁP 2
IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 2
1. Kết quả: 3
2. Thảo luận: 4
V. KẾT LUẬN 6
BÀI 2: SẢN XUẤT SINH KHỐI NẤM MEN 7
I. GIỚI THIỆU 7

II. PHƯƠNG TIỆN 7
III. PHƯƠNG PHÁP 8
IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 8
1. Kết quả: 8
2. Thảo luận: 9
V. KẾT LUẬN 9
BÀI 3: SẢN XUẤT BÀO TỬ MỐC TƯƠNG 11
I. GIỚI THIỆU 11
II. PHƯƠNG TIỆN 12
III. PHƯƠNG PHÁP 12
IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 13
1. Kết quả: 13
2. Thảo luận: 14
V. KẾT LUẬN 14
TÀI LIỆU THAM KHẢO 15



Báo cáo thực hành Vi Sinh Vật Công Nghiệp Trường ĐHCT

ii
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 1: Rượu vang đỏ 1
Hình 2: Khuẩn lạc S. cerevisiae 7
Hình 3: Tế bào S. cerevisiae 7
Hình 4: Aspergillus oryzae phát triển 11
Hình 5: Aspergillus oryzae 12
Hình 7: Mặt trước túi nilon nuôi cấy 13

Hình 6: Mặt sau túi nilon nuôi cấy 13

DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 1: Sự thay đổi pH qua các giai đoạn 3
Bảng 2: Sự thay đổi độ Brix qua các giai đoạn 3
Bảng 3: Sự lên men của nấm men 3
Bảng 4: Nồng độ rượu sau lên men 4
Bảng 5: Kết quả đánh giá cảm quan 4
Bảng 6: Sinh khối nấm men sau lên men thu được 9

Báo cáo thực hành Vi Sinh Vật Công Nghiệp Trường ĐHCT

1
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Bài 1:

LÊN MEN RƯỢU NHO


I. GIỚI THIỆU

Rượu nho (tên gọi khác là rượu vang hay
rượu chát) là một loại thức uống có cồn được lên
men từ nước nho. Rượu vang đỏ thường được lên
men từ nước ép và vỏ quả nho, còn rượu vang
trắng được lên men chỉ từ nước nho. Đã xuất hiện
từ lâu trên thế giới. Ở Việt Nam, nho được trồng
nhiều ở các tỉnh phía nam Miền trung như tỉnh
Ninh Thuận và rượu nho mang nhãn hiệu rượu
vang Đà Lạt, rượu vang Biên Hòa, rượu vang Hà
Nội… đã xuất hiện trên thị trường.
Sản xuất rượu nho dựa trên cơ sở về hoá sinh
xảy ra trong quá trình lên men nước quả nho dưới
tác dụng của enzyme nấm men (Saccharomyces

cerevisiae). Hiện nay có hai phương pháp lên men
cơ bản: lên men tự nhiên và lên men nhờ vào chủng nấm men thuần khiết. Khác với
các loại thức uống lên men khác, rượu nho có thời gian lên men khá dài (vài tháng đến
vài năm).
Phân loại:
Theo màu sắc: có vang đỏ và vang trắng.
Theo lượng đường trong rượu: có vang chat và vang ngọt.
Trong nước nho có chứa glucose, fructose (khoảng 40%), các chất pectin, các
acid hữu cơ, các chất màu, hợp chất chứa nitơ (protein, acid amine), vitamin, muối
khoáng,…Trong quá trình lên men, nấm men sử dụng lượng đường trong dịch quả để
tăng sinh khối và tổng hợp một số sản phẩm (rượu, CO
2
, acid acetic, acid lactic,
este…). Các chất pectin thuỷ phân kéo theo sự tạo thành một lượng nhỏ methanol.
Nấm men Saccharomyces cerevisiae phổ biến trong quá trình lên men và chiếm
80% trong tổng số Saccharomyces có trong nước quả khi lên men. Đa số các tế bào
hình ovan sinh sản theo lối nảy chồi và tạo bào tử. Saccharomyces cerevisiae có khả
năng sinh enzyme invertase xúc tác phản ứng thuỷ phân saccharose thành glucose và
fructose (tỉ lệ mol 1:1). Vì vậy trong lên men ta có thể bổ sung đường saccharose với
hàm lượng được tính toán để tạo độ Brix cần đạt, giúp quá trình lên men hiệu quả.

II. PHƯƠNG TIỆN

 Nho chính
Hình 1: Rượu vang đỏ
Báo cáo thực hành Vi Sinh Vật Công Nghiệp Trường ĐHCT
2
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
 Đường cát
 Nấm men khô Saccharomyces cerevisiae

 Bộ dụng cụ ép nước trái cây
 Bình tam giác 500 ml
 Waterlock
 Tủ ủ
 Máy li tâm
 Hệ thống chưng cất cồn
 Cồn kế
 pH kế
 Khúc xạ kế cầm tay (Brix kế)

III. PHƯƠNG PHÁP
















Phương pháp nhằm xem xét khả năng lên men rượu của nấm men
Saccharomyces cerevisiae và khả năng lên men rượu tự nhiên, xem xét các yếu tố ảnh
hưởng tới quá trình lên men nhằm tạo ra điều kiện tối ưu cho việc lên men rượu nho.

IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Nho chính (khoảng 600g)
Bỏ cuốn, rửa sạch và nghiền
Chia ra 2 phần bằng nhau
(khoảng 300g dịch và vỏ)
Bình tam giác 500ml
(bình 1)
Bình tam giác 500ml
(bình 2)

Saccharomyces
cerevisiae
Để yên, lên men 7 ngày, đếm bọt khí trên waterlock mỗi ngày 2 phút
Đo độ Brix và pH
Bổ sung lượng
đường để đạt độ
Brix yêu cầu
Chưng cất
100ml dịch
lên men
Li tâm phần
còn lại
Chưng cất
100ml dịch
lên men
Li tâm phần
còn lại
Đo độ rượu
Đo độ Brix; pH; Đánh giá cảm quan

Đo độ Brix; pH; Đánh giá cảm quan
Đo độ rượu

Thành phẩm
Thành phẩm
Báo cáo thực hành Vi Sinh Vật Công Nghiệp Trường ĐHCT
3
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

1. Kết quả:

Bảng 1: Sự thay đổi pH qua các giai đoạn
Nhóm
Độ Brix ban đầu
Nấm men (%)
pH ban đầu
pH rượu thành phẩm
1
20,8
0
3,81
4,06
0,1
3,96
2
27
0
3,96

4,12
0,1
4,10
3
32
0
3,91
4,06
0,1
4.05

Bảng 2: Sự thay đổi độ Brix qua các giai đoạn
Nhóm
Đọ Brix ban đầu
Nấm men (%)
Độ Brix rượu thành phẩm
1
20,8
0
8
0,1
6
2
27
0
11,5
0,1
11
3
32

0
26
0,1
16

Bảng 3: Sự lên men của nấm men
Nhóm
Độ Brix
ban đầu
Nấm men
(%)
Số bọt khí sinh ra trong 2 phút
Ngày 1
Ngày 2
Ngày 3
Ngày 4
Ngày 5
Ngày 6
Ngày 7
1
20,8
0
0
0
3
10
8
5
2
0,1

15
11
8
4
1
1
0
2
27
0
0
1
18
11
7
7
4
Báo cáo thực hành Vi Sinh Vật Công Nghiệp Trường ĐHCT
4
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
0,1
30
16
8
4
3
1
0
3
32

0
0
0
3
2
8
10
8
0,1
20
15
11
5
3
2
1

Bảng 4: Nồng độ rượu sau lên men
Nhóm
Độ Brix ban đầu
Nấm men (%)
Độ rượu sau lên men (20
o
C)
1
20,8
0
9,95
0,1
11,78

2
27
0
12,21
0,1
11,18
3
32
0
7,675
0,1
11,35

Bảng 5: Kết quả đánh giá cảm quan
Nhóm
Độ Brix
ban đầu
Nấm men
(%)
Độ trong
và màu sắc
Mùi

Vị
Ý thích
Trung bình
chất lượng
1
20,8
0

5
5
5
5
5
0,1
5
5
4
5
5
2
27
0
5
5
5
5
5
0,1
5
5
4
5
5
3
32
0
4
5

5
5
5
0,1
5
4
4
5
4,5

2. Thảo luận:
Cơ chế lên men rượu:
Rượu được tạo ra chủ yếu nhờ các tế bào nấm men phân giải glucose thông qua
con đường EM (Embden-Meyerhoff). Quá trình lên men rượu là một quá trình phức
tạp. Đầu tiên, đường thẩm thấu vào tế bào nấm men. Ở đó, đường được chuyển hóa
qua hàng loạt sản phẩm trung gian và tạo thành acid pyruvic. Acid pyruvic dưới tác
Báo cáo thực hành Vi Sinh Vật Công Nghiệp Trường ĐHCT
5
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
dụng của enzym Pyruvat-decacboxylase sẽ bi mất CO
2
và tạo thành Acetaldehit.
Enzym này có coenzym là Thiaminpyrophosphat và cần có ion Mg
++
làm chất hoạt
hóa. Sau đó, acetaldehit bị khử thành cồn etylic và CO
2
do enzym Acoldehdrogenase
xúc tác.

Phương trình tóm tắt quá trình lên men rượu

C
6
H
12
O
6


Lên men
2C
2
H
5
OH + 2CO
2
+ 113,4 KJ

Về nhiệt độ:
Nấm men hoạt động tốt nhất ở 20-30
0
C, dưới 16
0
C lên men rất chậm, trên 35
0
C
các hệ enzym trong cơ thể nấm men bị giảm hoạt lực đến mức tối thiểu, hoạt động trao
đổi chất bị ngưng trệ. Nếu nhiệt độ trên 40
0

C nấm men do không tổng hợp được năng
lượng dự trữ cần thiết nên sẽ chết. Trong thực nghiệm ta lên men ở nhiệt độ phòng
không quá 30
0
C thuộc trong khoảng nhiệt độ thích hợp cho lên men.

Về độ pH:
Nhìn chung, nấm men có thể phát triển trong môi trường có pH = 2 - 8, nhưng
thích hợp nhất là từ 4 - 4,5. Mặt khác, vi khuẩn bắt đầu phát triển ở pH = 4,2 và cao
hơn. Vì vậy trong lên men rượu để ngăn ngừa hiện tượng nhiễm khuẩn, người ta thực
hiện trong giới hạn pH = 3,8 - 4,0. Độ pH còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố: loài, chủng,
nấm men, thành phần của môi trường lên men, điều kiện lên men. Thực tế pH đo được
từ dịch nước nho của ba nhóm trình bày ở bảng 1 giao động cao nhất là 3,96 và thấp
nhất là 3,81 thuộc trong khoảng pH giới hạn. Độ pH phụ thuộc vào chủng loại nho
nguyên liệu dùng để lên men, góp phần vào hương vị của từng loại rượu nho bên cạnh
chủng loại nấm men được dùng.

Về nồng độ đường trong dịch lên men:
Ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất lên men, nấm men Saccharomyces cerevisiae có
khả năng sinh enzyme invertase xúc tác phản ứng thuỷ phân saccharose thành glucose
và fructose (tỉ lệ mol 1:1). Vì thế nấm men có khả năng lên men đường thành rượu
trong khoảng phù hợp từ 22 - 25
0
Brix. Trong giới hạn này, nếu nồng độ đường cao,
rượu càng mạnh do hàm lượng etylic cao, nên thêm đường vào dịch lên men là biện
pháp phổ biến nâng cao độ cồn. Tuy nhiên việc bổ sung vượt quá lượng trong khoảng
phù hợp sẽ dẫn đến hiện tượng co nguyên sinh ở tế bào nấm men, làm giảm khả năng
lên men, hiệu suất không cao. Lưu ý trong khi tính toán độ Brix bằng Brix kế ta cần
phải tính lượng đường hoà tan vào đúng lượng dung dịch nước nho và trừ ra phần vỏ
không hoà tan đường, vì nếu không trừ phần vỏ ra thì độ Brix sẽ vượt khỏi độ Brix

tính toán (quá trình lên men rượu vang đỏ).
Công thức tính lượng đường bổ sung :

Trong đó:
a: Độ Brix dịch quả

x
: Lượng đường cần bổ sung cho 100g dịch quả
b: Độ Brix cần đạt được.
Tổng lượng đường cần bổ sung là:
x
xab



100100
Báo cáo thực hành Vi Sinh Vật Công Nghiệp Trường ĐHCT
6
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

m
d
.
x
.10 (kg)

(m
d
: Khối lượng dịch quả ban đầu)

Bảng 2 cho thấy chủng nấm men sử dụng lượng đường hiệu quả nhất với độ Brix
27 của nhóm 2 (có và không bổ sung nấm men); Với độ Brix 32 ở nhóm 3 ở bình
không bổ sung nấm men, dựa vào bảng 3 thì quá trình lên men diễn ra khá chậm đến
ngày 3 mới xuất hiện bọt khí đếm được trong 2 phút và đến ngày thứ 7 vẫn còn tiếp
tục lên men ở hai bình, trong khi bình có bổ sung nấm men ở nhóm 1 và 2 sinh bọt khí
rất ít không đếm được bọt khí nào trong 2 phút, dấu hiệu lên men yếu dần.
Về thời gian lên men:
Phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhiệt độ, nồng độ đường, chủng nấm men. Trong bài
thực hành thì do khoảng thời gian giới hạn nên chỉ lên men 7 ngày, hiệu suất chưa thật
sự cao so với khoảng trung bình từ 15 – 20 ngày. Để tăng giá trị cảm quan cần trữ
rượu 3 tháng trở lên.

Về nồng độ rượu etylic:
Lượng rượu tạo ra là hỗn hợp không thuần khiết etylic, có thể có methanol, ester,
aldehyde,… như chủ yếu là rượu etylic an toàn cho người sử dụng. Bảng 4 nồng độ
rượu cao nhất là bình lên men tự nhiên ở nhóm 2 với độ rượu cao nhất là 12,21 ở 20
0
C.
Nhìn chung việc bổ sung nấm men ở 3 nhóm giúp tăng hiệu suất lên men, tăng nồng
độ rượu cho thành phẩm. Việc nồng độ rượu tăng trong quá trình lên men cũng làm ức
chế nấm men hoạt động, khi độ rượu đạt 7 - 8% thể tích, sự trao đổi chất trong nấm
men bị ngừng trệ hầu như toàn phần, quá trình lên men chuyển sang thời kỳ lên men
thầm lặng.

Về đánh giá cảm quan:
Dựa vào bảng 5 nhìn chung tất cả các thành phẩm rượu đều đạt các tiêu chí về độ
trong, màu, mùi, vị, ý thích. Nhưng nếu được lên men thời gian dài hơn thì thành phẩm
sẽ ngon hơn.

V. KẾT LUẬN

Trong quá trình lên men rượu nho cần chú ý đặc biệt đến các yếu tố ảnh hưởng
đến suốt quá trình lên men và đến nấm men. Lên men trong khoảng nhiệt độ 20 –
30
0
C, khoảng pH thích hợp từ 3,8 – 4,0, độ Brix từ 22 - 25
0
Brix, và khoảng thời gian
đủ dài để tạo hương vị tốt cho thành phẩm, cần chú ý đến nồng độ cồn thành phẩm đối
với việc lên men với số lượng lớn thương mại.





Báo cáo thực hành Vi Sinh Vật Công Nghiệp Trường ĐHCT
7
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Bài 2:

SẢN XUẤT SINH KHỐI NẤM MEN


I. GIỚI THIỆU

Nấm men là loài nấm đơn bào, thường sinh sôi nẩy nở bằng cách nảy chồi, với
một số ít loài thường được sử dụng để lên men bánh mì hay sản xuất đồ uống có cồn.
Phần lớn các loài nấm men thuộc về ngành Ascomycota, mặc dù một số loài thuộc về
ngành Basidiomycota. Chúng phân bố rộng trong tự nhiên, từ xa xưa con người đã biết
sử dụng nấm men để sản xuất thực phẩm lên men. Hàm lượng protein trong tế bào rất

cao từ 40 – 50% trọng lượng khô, chất lượng protein cao, có đầy đủ các acid amine
thành phần và đặc biệt là các acid amine không thay thế có giá trị dinh dưỡng cao,
thành phần vitamin, khoáng, glucid, lipid…nên nấm men được sử dụng trong việc sản
xuất protein đạm đơn bào. Tuy nhiên vẫn có nhiều loài gây hại cho người và động vật,
làm hỏng thực phẩm.
Saccharomyces là một chi nấm men được sử dụng rộng rãi trong ngành thực
phẩm như làm bánh mì, sản xuất rượu bia cồn thương mại. Saccharomyces được sản
xuất với quy mô lớn trên thế giới, chúng có khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng qua
màng tế bào trong môi trường nước mạch nha như các loại đường hòa tan, các hợp
chất nitơ (các acid amin, peptit), vitamin và các nguyên tố vi lượng trong môi
trường… Sau đó, hàng loạt các phản ứng sinh hóa mà đặc trưng là quá trình trao đổi
chất để chuyển hóa các chất này thành những dạng cần thiết cho quá trình phát triển và
lên men của nấm men được tiến hành. Quá trình nuôi tăng sinh khối nấm men
Saccharomyce cần phải cung cấp lượng khí cần thiết trong quá trình nuôi tăng sinh
khối.












II. PHƯƠNG TIỆN
Hình 2: Khuẩn lạc S. cerevisiae
Hình 3: Tế bào S. cerevisiae

Báo cáo thực hành Vi Sinh Vật Công Nghiệp Trường ĐHCT
8
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

 Nấm men Saccharomyces cerevisiae
 Dung dịch đường mía 10%
 (NH
4
)
2
SO
4
0,1%, KH
2
PO
4
0,1%
 Bình tam giác 250ml
 Tủ ủ
 Máy li tâm
 pH kế
 Đĩa petri

III. PHƯƠNG PHÁP

Phương pháp xem xét khả năng phát triển, các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng
của chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae với nghiệm thức 2 lần lặp lại. Thu
hoạch sinh khối, so sánh số liệu thu được.

IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1. Kết quả:
Dung dịch đường mía 10%
KH
2
PO
4
0,1%
(NH
4
)
2
SO
4
0,1%

Bình tam giác (2)
1ml men giống

Bình tam giác (1)
Khử trùng 115
o
C,
15 phút
1ml men giống
Chuyển vào tủ ủ có chế độ lắc
Li tâm 5000 vòng/ phút, 25
0
C, 10 phút
Sấy 105
0
C, 48h
Cân, tính kết quả
Bình 1
Cân, tính kết quả
Bình 1

Báo cáo thực hành Vi Sinh Vật Công Nghiệp Trường ĐHCT
9
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Kết quả số liệu sinh khối nấm men được thống kê trong bảng sau:
Bảng 6: Sinh khối nấm men sau lên men thu được
Nhóm
Sinh khối nấm men sau lên men (g)
1
A: 0,9473

B: 0,6994
2
A: 0,7241
B: 0,6862
3
A: 0,6096
B: 0,6030

2. Thảo luận:
Nấm men Saccharomyces cerevisiae được coi là vi sinh vật sống hiếu khí tuỳ
nghi. Trong quá trình nuôi tăng sinh khối cần cung cấp nhiều oxy để quá trình sinh sản
diễn ra mạnh mẽ hơn, vì vậy lượng sinh khối tăng lên nhanh và trở thành sản phẩm
chủ yếu trong môi trường lên men. Ngược lại, trong điều kiện thiếu hoặc không có mặt
O
2
, nấm men sẽ chuyển từ hoạt động hô hấp sang lên men kỵ khí, khi đó sản phẩm
trong môi trường là etanol sẽ trở thành chủ yếu. Tuy nhiên, hai kiểu hô hấp trên đều có
mối quan hệ chung với nguồn đường có trong môi trường. Qua thực tế sản xuất rượu
vang cho thấy: lượng đường tiêu hao cho hô hấp hiếu khí chiếm khoảng 1/5, tiêu hao
cho hô hấp kỵ khí là 4/5 (thực chất là lên men để tạo etanol).
Đường mía cung cấp ngoài lượng sucrose chính còn có nhiều khoáng vi lượng
cần thiết cho nấm men phát triển. Ngoài ra còn bổ sung lượng (NH
4
)
2
SO
4
0,1%,
KH
2

PO
4
0,1% vào môi trường dung dịch đường mía 10% nhằm cung cấp nguồn nitơ
và photpho vô cơ cho nấm men. Trong môi trường nuôi cấy cần chú ý nguyên tố đa
lượng khác. Ngoài ra các yếu tố ảnh hưởng đến chủng như nhiệt độ, pH, nồng độ
đường cũng đã trình bày ở bài 1.
Kết quả sinh khối nấm men thu được cho thấy sinh khối nấm men thu được đều
quanh mức 0,6 gram, cá biệt bình A của nhóm 1 lên đến 0,9473 gram. Xét thấy nấm
men phát triển tăng sinh khối khá đồng đều giữa các bình trong đều kiện nuôi cấy
giống nhau. Trường hợp bình nuôi cấy A của nhóm 1 và bình nuôi cấy A của nhóm 2
khối lượng sinh khối thu được cao hơn các bình con lại, có thể là do một phần sự tăng
sinh trong môi trường tối ưu hơn, nấm men có sức sống cao hoặc một phần do sai sót
thao tác lấy men giống, chuẩn bị môi trường, sai sót trong quá trình chuyển sinh khối li
tâm.

V. KẾT LUẬN

Để thu được sinh khối nấm men cao cần cung cấp đầy đủ oxy, chất dinh dưỡng,
điều kiện cần thiết, hạn chế quá trình lên men kỵ khí. Ngoài ra chủng men giống phải
Báo cáo thực hành Vi Sinh Vật Công Nghiệp Trường ĐHCT
10
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
có sức sống tốt, tăng trưởng nhanh. Cần tìm hiểu thêm về các điều kiện tối ưu, quy
trình nuôi cấy liên tục ở quy mô thương mại.

Báo cáo thực hành Vi Sinh Vật Công Nghiệp Trường ĐHCT
11
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Bài 3:

SẢN XUẤT BÀO TỬ MỐC TƯƠNG
(Aspergillus oryzae)


I. GIỚI THIỆU

Aspergillus oryzae là một loại nấm
vi thể thuộc bộ Plectascales, lớp
Ascomycetes (nang khuẩn). Cơ thể sinh
trưởng của chủng là một hệ sợi bao gồm
những sợi rất mảnh, chiều ngang 5 – 7
µm, phân nhánh rất nhiều và có vách
ngang, chia sợi thành nhiều bao tế bào.
Sinh sản vô tính. Đính bào tử của Asp.
oryzae có màu vàng lục hay màu vàng
hoa cau.
Nấm mốc Aspergillus oryzae giàu
các enzyme thuỷ phân nội bào và ngoại
bào như: amylase, protease,
invertase,…phân giải tinh bột thành đường, protein thành acid amine, phân giải
sucrose thành glucose và fructose. Asp. oryzae được ứng dụng trong sản xuất nước
tương bằng phương pháp vi sinh vật và là tác nhân lên men chủ yếu. Chủng được sử
dụng chủ yếu trong ẩm thực truyền thống của Trung Quốc, Hàn Quốc và Nhật Bản để
lên men đậu nành.

Aspergillus oryzae, khuẩn lạc trên môi trường Czapek (nhiệt độ nuôi cấy 27
0
C,
10 ngày tuổi) có đường kính 5 – 6 cm, màu lục, vàng lục, lục nâu sau chuyển thành
nâu lục, nâu. Khối bào tử trần đỉnh bọng hình tia toả tròn, phần lớn 150 – 300 đến 400
– 500 m đường kính. Giá bào tử trần nhẵn hoặc ráp, thường dài 1,0 – 2,5 cm, có thể
tới 4 – 5 cm. Bọng đỉnh giá hình gần cầu, đường kính 40 – 50m, hoặc mang cuống
thể bình và thể bình hoặc chỉ mang thể bình. Cuống thể bình 4 – 5 x 8 – 12 m. Thể
bình mọc trực tiếp trên bọng đỉnh giá 3 – 5 x 12 – 15 m, thể bình mọc trên cuống thể
bình 3,0 – 3,5 x 8 – 10m. Bào tử trần phần lớn hình cầu, đôi khi hình elip có đường
kính 4,5 –7,0 m hoặc 8-10 m trục lớn, nhẵn hoặc ráp, có gai mịn.
Độ ẩm môi trường tối ưu cho sự hình thành bào tử: 45%, độ ẩm môi trường tối
ưu cho sự hình thành enzyme: 55 – 58%, độ ẩm không khí: 85 – 95%, pH môi trường:
5,5 – 6,5. Chúng hiện diện dễ thấy ở các kho nguyên liệu, trong các dụng cụ chứa bột,
gạo…đã hết nhưng chưa được rửa sạch, ở bã bia, bã rượu, bã sắn,… Chúng mọc và
phát triển có khi thành lớp mốc, có màu sắc đen, vàng, xanh,… Màu do các bào tử già
có màu sắc. Các bào tử này dễ bị gió cuốn bay xa và rơi vào đâu khi gặp điều kiện
thuận lợi sẽ mọc thành mốc mới. Có rất nhiều ứng dụng Aspergillus oryzae để sản
xuất ra các loại enzyme trên môi trường lên men bán rắn hay lên men chìm. Tuy nhiên,
Aspergillus oryzae sẽ sinh ra nhiều enzyme hơn trong lên men bán rắn.
Hình 4: Aspergillus oryzae phát triển
Báo cáo thực hành Vi Sinh Vật Công Nghiệp Trường ĐHCT
12
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Môi trường trong bài tạo môi trường thuận lợi cho nấm mốc Asp. oryzae phát
triển. Sử dụng 20 gram gạo cộng với 50% nước sau đó đem hấp, để chủng bột bào tử
có sẵn trong điều kiện hiếu khí.

II. PHƯƠNG TIỆN

 Nấm mốc Aspergillus oryzae
 Gạo
 Tủ ủ
 Cân
 Nồi khử trùng nhiệt ướt
 Túi nilon có cổ túi và đậy nút gòn

III. PHƯƠNG PHÁP

Hai sản phẩm mục tiêu chính từ nấm mốc là bột bào tử và chế phẩm enzyme.
Mục tiêu của bài là nuôi cấy thu bào tử nấm mốc từ chủng nấm mốc Aspergillus
oryzae có sẵn trong môi trường chuẩn bị sẵn.

20g gạo
10ml H
2
O
Hấp
Khử trùng121
0
C,
15’, Để nguội
Cho vào túi nilon
0,2g bột bào tử
Ủ và quan sát 7 ngày
Trộn đều
Thu hoạch


Hình 5: Aspergillus oryzae
Báo cáo thực hành Vi Sinh Vật Công Nghiệp Trường ĐHCT
13
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Phương pháp tạo điều kiện thuận lợi cho nấm mốc phát triển, quan sát ghi nhận
sự phát triển của khuẩn ty, sự hình thành bào tử, ghi nhận sự thay đổi qua từng ngày,
thu hoạch kết quả vào ngày thứ 7.

IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1. Kết quả:
Qua ngày thứ 2 quan sát ghi nhận thấy có hình thành sợi khuẩn ty chủ yếu bao

quanh hạt cơm, bắt đầu hình thành bào tử nhưng ít, nhiều hạt cơm áo màu vàng xung
quanh hạt, một số hạt xuất hiện những đóm màu xanh nhưng rất ít. Mặt trên túi nilon
hướng lên trên khuẩn ty phát triển nhiều hơn so với mặt dưới túi nilon tiếp xúc với vỉ
tủ ủ ít khuẩn ty phát triển. Vì mặt trên túi tiếp xúc với không khí nhiều hơn so với mặt
dưới tiếp xúc với vỉ, các hạt cơm đè lên nhau tạo điều kiện không thoáng khí.
Qua ngày thứ 7 quan sát ghi nhận được đa số hình thành rất nhiều bào tử, màu
xanh chiếm đa số bên cạnh đó là màu vàng cũng xuất hiện nhiều hơn ngày 2 quanh hạt
cơm trong túi nilon, mặt trên túi nilon bào tử phát triển nhiều hơn màu xanh nhiều hơn
mặt dưới tiếp xúc với vỉ tủ ủ bào tử phát triển ít hơn. Bào tử phát triển mạnh sau 7
ngày ủ. Vì mặt trên túi tiếp xúc với không khí nhiều hơn so với mặt dưới tiếp xúc với
vỉ.

Hình 7: Mặt trên túi nilon nuôi cấy
Hình 6: Mặt dưới túi nilon nuôi cấy
Báo cáo thực hành Vi Sinh Vật Công Nghiệp Trường ĐHCT
14
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
2. Thảo luận:
Cơm hấp cung cấp tương đối đầy đủ các thành phần cho nấm mốc phát triển,
đảm bảo nguồn cacbon, nitrogen, độ ẩm, thành phần khoáng,…trong điều kiện nhiệt
độ ổn định của tủ ủ, pH của cơm hấp trong giới hạn cho phép cộng với sự hoạt động
rộng của chủng Asp. oryzae pH từ 4 – 8 theo Michell (1988). Aspergillus oryzae đảm
bảo được các yêu cầu không đòi hỏi điều kiện vô trùng nghiêm ngặt, dễ nuôi ở điều
kiện tự nhiên, phát triển nhanh, có khả năng tạo nhiều bào tử. Vì thế trong điều kiện
nuôi cấy quy mô thí nghiệm trong bài tạo điều kiện cho nấm mốc phát triển tương đối
cao, hình thành hệ khuẩn ty dày đặc vào ngày thứ 2 và nhiều bào tử vào ngày thu
hoạch.
Thêm vào đó theo Lotong và Suwanarit, (1983) cho rằng 3 ngày sau khi ủ khối
cơ chất tấm được bao phủ bởi những bào tử Aspergillus oryzae màu vàng xanh nhạt,
sau đó màu sắc trở nên đậm hơn theo thời gian, việc ủ từ 4 – 5 ngày cho lượng bào tử
cao nhất. Còn theo Võ Thị Hạnh et al., (2000) cho rằng thời gian thích hợp để sản xuất
lượng bào tử Aspergillus oryzae là 5 – 7 ngày sau khi nuôi cấy. Xét thấy sự phát triển
của hệ khuẩn ty và bào tử khá phù hợp với mô tả của các nhà nghiên cứu trước đó.
Nấm mốc là vi sinh vật hiếu khí bắt buộc, do đó việc cung cấp đầy đủ oxi là cần
thiết cho nấm mốc hô hấp và phát triển tăng sinh khối. Thiếu oxi sẽ kiềm hãm sự phát
triển của nấm. Việc làm cổ túi và đậy nút gòn trong phương pháp sản xuất bào tử
nhằm giúp cho sự trao đổi khí với môi trường bên ngoài một cách tương đối. Trong
quy trình sản xuất ở quy mô thương mại cần tạo độ thoáng khí trong môi trường bên

cạnh bổ sung chất dinh dưỡng để sự phát triển của nấm được cao nhất gia tăng hiệu
quả, năng suất cao.

V. KẾT LUẬN

Aspergillus oryzae dễ nuôi ở điều kiện tự nhiên, phát triển nhanh, có khả năng
tạo nhiều bào tử, tuy nhiên cần phải kiểm soát tốt độ pH, nhiệt độ và độ ẩm nhất là độ
thoáng khí đảm bảo cung cấp đủ oxy cho nấm phát triển. Nghiên cứu khoảng thời gian
nuôi cấy đạt bào tử nhiều nhất, nhằm giảm chi phí gia tăng năng suất.











Báo cáo thực hành Vi Sinh Vật Công Nghiệp Trường ĐHCT
15
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt
1. Bài giảng thực hành Vi Sinh Công Nghiệp – thầy Trần Vũ Phương, năm 2014
2. Bài giảng Vi Sinh Công Nghiệp – thầy Nguyễn Văn Thành, năm 2014
3. Giáo trình Vi Sinh Vật Học Công Nghiệp – PGS. TS. Nguyễn Xuân Thành.
Nhà xuất bản Giáo Dục.

Trang web
(ngày 1/5/2014)
/>KE3days1.gif (ngày 1/5/2014)
/>giam-thinh-luc.jpg (ngày 1/5/2014)
/>scopy.jpg (ngày 1/5/2014)
(ngày 1/5/2014)