BÁO CÁO THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG

Báo cáo thực hành vi sinh đại cương
BÀI 1: GÓI VÀ SẤY DỤNG CỤ
NGÀY THỰC HÀNH: 15/9/2009
I/ YÊU CẦU:
- Sinh viên phải cẩn thận, bao kín các dụng cụ trước, nắm vững các thao tác bao gói
dụng cụ và sấy dụng cụ trước khi tiến hành thí nghiệm.
II/MỤC ĐÍCH:
- Rèn luyện cho sinh viên cách bao gói dụng cụ thí nghiệm, đồng thời đảm bảo điều kiện
vô trùng trước khi làm thí nghiệm
III/ DỤNG CỤ:
- Giấy giói
- Bông gòn không thấm nước
- Lò sấy, nồi hấp
- Các dụng cụ cần bao gói
IV/ CÁCH TIẾN HÀNH:
- Đối với ống nghiệm và bình tam giác, pibet :
+ lấy một lượng bông gòn vừa đủ miệng ống nghiệm và miệng bình tam giác, pibet
+ Dùng ngón cái ấn mạnh bông gòn về một phía ( nhằm tạo độ mịn cho nút bông gòn)
hạn chế việc vsv ra khỏi ống nghiệm
- Sau khi đã tạo được nút bông gòn ta tiến hành dùng báo bao gói miệng ống nghiệm,
pipet và bình tam giác
+ Lấy một miếng báo nhỏ hình chữ nhật bao vừa đủ miệng ống ống
+ Dùng báo cuốn tròn xung quanh miệng ống, khi đã cuốn gần hết, ta gấp một cạch của
miếng báo lại
+ Cuối cùng ta gấp phần báo dư từ miệng ống lại
- Đối với hộp petri:
- Gói hai hộp petri một lần, lấy một miếng báo vừa đủ, gấp hai bên mép báo lại, sau đó
gấp giống như hình bánh ú
- Mỗi dụng cụ có một cách gói riêng làm sao cho khi mở ra dễ dàng nhất.
- Dụng cụ sau khi được gói thì được đem đi hấp, có thể hấp bằng lò sấy (không được sử
dụng đối với dụng cụ có chứa nước, dụng cụ bằng nhựa ), hay lò hấp hơi nước.

- Đối với lò sấy khô ta có 3 cách sấy:
1 hấp 180
0
C thời gian 30 phút
2 hấp 170
0
C thời gian 60 phút
3 hấp 160
0
C thời gian 1h 30 phút
- Đối với lò hơi nước ta hấp áp suất là 1at trong vòng 30 phút.
- Sau khi hấp song mang dụng cụ ra ngoài để nguội để làm thí nghiệm.
CDMT10
1
Báo cáo thực hành vi sinh đại cương
BÀI 2: NẤU MÔI TRƯỜNG
NGÀY THỰC HÀNH: 22/9/2009
I. Mục đích và yêu cầu
- Biết cách nấu môi trường nuôi cấy vi sinh
- Cách đổ môi trường vào petri và ống nghiệm
II. Dụng cụ
- Betcher 250ml - 8 đĩa petri
- 30 ống nghiệm - 3 erlen 250ml
- Bếp điện - Đũa khuấy thủy tinh
- cân
III. Hóa chất
- Nước cất
- Agar
- Đường
- Giá

- Muối NaCl
IV.Tiến hành thí nghiệm
1. Môi trường lỏng: dung dịch nước muối sinh lý 9/1000.
Pha 500 ml nước muối sinh lý cần 4,5g muối NaCl.
Cho 4,5 g NaCl vào 500 ml nước cất, hòa tan cho muối tan hoàn toàn. Ta được nước
muối sinh lý 9/1000.
1.1 Môi trường bán lỏng
Công thức:
- 200 ml dung dịch nước giá - 0,93 g agar
- 10g đường
Cách chế tạo:
Cho 100 g giá vào trong 200 ml nước cất, nấu cho sôi, sau đó vớt bỏ giá chỉ lấy phần
nước. Sau đó, cho 10 g đường và 0,93 g agar vào trong 200 ml dung dịch nước giá. Khuấy
cho đường và agar tan hết trong dung dịch.
CDMT10
2
Báo cáo thực hành vi sinh đại cương
1.2 Môi trường rắn
Công thức:
- 500 ml dung dịch nước giá - 7,5 g agar
- 15 g đường
Cách chế tạo:
Cho 100 g giá vào trong 500 ml nước cất, nấu cho sôi, sau đó vớt bỏ giá chỉ lấy phần
nước. Sau đó, cho 7,5 g agar và 15 g đường vào trong 150 ml dung dịch nước giá. Khuấy
cho đường và agar tan hết trong dung dịch.
1.3 Khử trùng dụng cụ
Lấy 30 ống nghiệm và 8 hộp petri đem gói và đi hấp thanh trùng trong 15 phút, nhiệt
độ 121
0
C. Sau 15 phút lấy ra để chuẩn bị đổ môi trường.

1.4 Đổ môi trường
Sau khi nấu môi trường xong, ta cho tương ứng 3 môi trường lỏng, bán lỏng, rắn vào 3
erlen tương ứng.
- Erlen 1 chứa 500 ml môi trường lỏng.
- Erlen 2 chứa 200 ml môi trường bán lỏng.
- Erlen 3 chứa 500 ml môi trường rắn.
Sau đó, gói lại và đem đi hấp trong 15 phút, nhiệt độ 121
0
C. Sau 15 phút lấy môi
trường ra, làm nguội bằng nước lạnh đến 50-60
0
C và tiến hành đổ môi trường vào đĩa petri
và ống nghiệm.
- Đĩa petri nhỏ cho vào khoảng 6-8 ml môi trường.
- Đĩa petri lớn cho vào khoảng 12-15 ml môi trường.
- Ống nghiệm cho vào khoảng 5-10 ml môi trường.
Đổ môi trường xong, ta đem gói các hộp petri và ống nghiệm cho vào tủ ấm để bảo
quản.
CDMT10
3
Báo cáo thực hành vi sinh đại cương
BÀI 3: SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI
NGÀY THỰC HÀNH:29/09/2009
I. MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU
- Biết được cấu tạo và chức năng của các bộ phận chính của kính hiển vi.
- Củng cố và hình thành kỹ năng sử dụng kính hiển vi, đặc biệt là kỹ năng sử dụng vật
kính dầu. Kỹ năng bảo quản thường xuyên và định kỳ kính hiển vi.
II. DỤNG CỤ
- Kính hiển vi quang học - Phiến kính, lá kính
- Mẫu để quan sát

III. TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM
1. Sử dụng kính hiển vi.
1.1 Nguyên tắc:
Ảnh thật của vật mẫu mà ta quan sát được thông qua vật kính và thị kính có độ phóng
đại của vật kính với độ phóng đại của thị kính.
Ví dụ: Độ phóng đại của thị kính là (x10); độ phóng đại của vật kính là (x100): Độ
phóng đại của ảnh là: 10x100 = 1000 lần.
1.2 Cấu tạo:
Phần cơ học:
- Thân kính
- Đế kính
- Bàn kính
- ống kính
Thân kính: có thể chuyển động theo hướng lên
xuống trong phạm vi 50 mm nhờ một cơ cấu được lắp
trong thân kính. Cơ cấu này chuyển động nhờ tay vặn
điều chỉnh thô và tay vặn điều chỉnh tinh để đưa ảnh của vật đang nghiên cứu vào đúng tiêu
điểm. Khi quay các tay vặn theo chiều kim đồng hồ thì thân kính hạ xuống, còn khi quay
ngược chiều kim đồng hồ thì thân kính đi lên. Phía trên thân kính có bàn xoay, các vật kính
được lấp vào các lỗ của bàn xoay.
CDMT10
4
Báo cáo thực hành vi sinh đại cương
Ống kính: có thể xoay quanh 1 trục thẳng đứng đến vị trí nào thích hợp cho người
quan sát, và được giữ chặt lại nhờ ốc giữ kính. Phía trên cùng của ống có gắn thị kính. Ống
kính có khả năng di chuyển lên xuống nhồ các ốc điều chỉnh theo hai chiều ngược nhau:
ốc di chuyển nhanh (ốc chỉnh thô): có nhiệm vụ tìm ảnh của vật.
ốc di chuyển chậm (ốc chỉnh tinh): sau khi có ảnh của vật mới điều chỉnh ốc này để có ảnh
rõ nét hơn.
Bàn kính: Có thể di chuyển theo mặt phẳng ngang nhờ ốc vặn di chuyển bàn kính ở 2

bên. Nhờ đó có thể chuyển tiêu bản ở bất kỳ vị trí nào vào giữa. Trên bàn kính có 2 thanh
kim loại giữ tiêu bản. Dưới bàn kính có giá giữ bộ tụ quang.
Phần quang học
- Bộ phận chiếu sáng
- Vật kính
- Thị kính
Bộ phận chiếu sáng: có bộ tụ quang và đèn để hội tụ ánh sáng để chiếu sáng tiêu bản.
Bộ tụ quang: Được gắn ở phía trên gương và được cấu tạo từ các thấu kính dùng để
hội tụ các tia sáng xuất phát từ nguồn sáng và phản xạ lại qua gương. Trong bộ tụ quang có
lắp màng chắn sáng. Màng chắn sáng cho phépđiều chỉnh lượng ánh sáng rọi vào một cách
phù hợp nhất. Dưới bộ tụ quang có giá dùng để gắn các kính lọc sáng.
đèn để hội tụ ánh sáng: ta chỉ cần bật đèn và điều chỉnh cường độ ánh sáng phù hợp.
Vật kính: tạo ra ảnh thật được phóng đại lên nhiều lần và nằm ở vị trí ngược với vật
được quan sát. Vật kính được cấu tạo từ một hệ thống các thấu kính và được đặt trong vỏ
bọc bằng kim loại. Phần quan trọng nhất là thấu kính mặt ngoài, nơi mà khoảng cách tiêu cự
của nó sẽ quyết định độ phóng đại của vật được nghiên cứu. Độ cong của thấu kính ngoài
càng lớn thì tiêu cự càng ngắn và độ phóng đại của vật kính càng lớn. Độ phóng đại của vật
kính luôn được ghi phía bên ngoài của thấu kính. Có 4 loại vật kính với độ phóng đại khác
nhau là: (x4); (x10); (x40); (x100). Khi quan sát tiêu bản nếu sử dụng vật kính ở độ phóng
đại (x4); (x10); (x40) thì không sử dụng dầu. Còn nếu dùng vật kính (x100) thì phải sử dụng
dầu soi kính.
Thị kính: gồm 2 thấu kính: thấu kính mắt (phía trên) và thấu kính tụ (phía dưới). Giữa
2 thấu kính này có 1 màn chắn chỉ cho tia sáng gần với trục đi qua, đồng thời làm cho hình
rõ nét hơn. Thị kính có nhiệm vụ phóng đại thêm ảnh của vật kính, Mỗi loại thị kính cũng
có độ phóng đại khác nhau và ghi ở mặt ngoài thị kính.
CDMT10
5
Báo cáo thực hành vi sinh đại cương
1.3 Cách sử dụng
Các thao tác điều chỉnh nguồn sáng:

- Đưa vật kính vào vị trí có thể nhận được nguồn sáng.
- Cắm điện và bật công tắc đèn (nếu dùng ánh sáng đèn).
Mắt nhìn vào thị kính đồng thời dùng tay phải điều chỉnh gương phản chiếu để tập
trung nguồn sáng vào tâm điểm của vùng quan sát. Điều chỉnh sao cho đạt mức ánh sáng
nhiều nhất.
Dùng tay trái điều chỉnh kính tụ quang sao cho:
+ Được nâng lên ở mức hợp lý.
+ Mở hệ thống chắn sáng sao cho có thể nhìn được vật một cách hoàn hảo nhất.
Các thao tác điều chỉnh vật kính và quan sát tiêu bản:
- Đặt tiêu bản lên bàn kính và kẹp chặt lại.
- Điều chỉnh tiêu bản để chọn được vùng định quan sát.
- Nhìn vào thị kính, điều chỉnh nhẹ nhàng, thận trọng các ốc chỉnh thô, rồi ốc chỉnh
tinh cho đến khi thấy rõ ảnh của mẫu vật.
Có thể phải điều chỉnh cả vị trí của tiêu bản trên bàn kính nếu thấy cần thiết.
Nếu dùng vật kính dầu nên chú ý:
+ Nhỏ một giọt dầu soi kính vào vị trí vùng định quan sát trên tiêu bản.
+ Hạ từ từ vật kính cho đến khi chạm nhẹ vào giọt dầu.
+ Nhẹ nhàng điều chỉnh ốc thô cho đến khi thoáng xuất hiện ảnh trên vi trường.
+ Điều chỉnh thêm ốc chỉnh tinh cho ảnh rõ nét.
2. Bảo quản kính hiển vi
Bảo quản sau khi sử dụng kính:
- Nâng vật kính lên, lấy tiêu bản ra.
- Nếu là vật kính dầu, lấy khăn vải mềm tẩm xylen, lau nhẹ vào dầu vật kính cho thật
sạch.
- Hạ kính tụ quang, xoay gương phản chiếu.
- Đưa vật kính nhỏ nhất vào vị trí tiêu bản.
- Tắt đèn, rút phích cắm ra khỏi ổ điện.
- Cho kính vào tủ bảo quản.
Bảo quản thông thường:
- Hàng năm, định kỳ mời thợ chuyên môn tới tu chỉnh, lau chùi kính hiển vi.

CDMT10
6
Báo cáo thực hành vi sinh đại cương
- Di chuyển kính phải thật nhẹ nhàng và chỉ di chuyển khi thật cần thiết.
- Khi không sử dụng nên đặt kính vào tủ bảo quản.
BÀI 4: NẤU MÔI TRƯỜNG THẠCH PEPTON - GLUCOZA, CẤY
VI SINH.
NGÀY THỰC HÀNH: 06/10/2009
I. MỤC ĐÍCH YÊU CẦU
- Biết các nguyên tắc cơ bản của quá trình gieo, cấy, nuôi vi sinh vật.
- Các kiểu cấy khác nhau trên các loại môi trường thạch nghiêng, thạch đứng, thạch
đĩa.
II. DỤNG CỤ
- Ống nghiệm - Giá để ống nghiệm.
- Hộp petri - Pipet 1ml
- Que cấy đầu tròn, đầu nhọn - Que trang
- Bình tia - đũa thủy tinh
III. HÓA CHẤT
- Pepton - Glucoza
- K
2
HPO
4
- MgSO
4
.7H
2
O
- Thạch - Nước cất
- Mẫu vi sinh vật.

IV. TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM
Tiến hành hấp khử trùng dụng cụ gồm: đĩa petri và ống nghiệm trong 15 phút nhiệt độ
121
0
C.
1. Nấu môi trường thạch pepton-glucoza:
Công thức:
- Glucoza: 5g - K
2
HPO
4
: 0.5g
- Nước cất: 500 ml - MgSO
4
.7H
2
O: 0.25g
- Thạch (agar): 10g - pH=7
- Bếp điện -pepton 2,5g
Cách chế tạo:
CDMT10
7
Báo cáo thực hành vi sinh đại cương
Cân các hóa chất với khối lượng như trên, đem glucoza, K
2
HPO
4
, MgSO
4
.7H

2
O hòa
vào nước cất cho tan hoàn toàn. Sau đó đem dung dịch đi đo pH, điều chỉnh cho đến khi
pH=7. Cho agar vào dung dịch trên, nấu cho agar tan hết.
Sau khi đủ thời gian, lấy dụng cụ đã hấp khử trùng ra, tiến hành đổ môi trường. Sau
khi đổ môi trường vào thì xoay hộp petri cho thạch dàn đều ở đáy hộp. Sau đó dể cho môi
trường đông lại.
2. Cấy vi sinh:
- Dùng que cấy đầu tròn lấy mẫu vi sinh vật trong ống nghiệm đựng mẫu, cấy lên trên
môi trường. Phương pháp lấy mẫu như sau:
- Đốt đèn cồn lên.
- Tay trái cầm ống nghiệm có đựng môi trường chứa vi sinh vật, ngửa lỏng bàn tay lên
trên, đặt ống nghiệm giữa ngón tay trái và ngón trỏ giữ nó hơi nghiêng nhưng không được
để cho môi trường vi sinh vật chạm vào nút bông.
- Dùng tay phải xoay nhẹ nút bông một vòng để sau đó dễ rút ra.
- Tay phải dùng que cấy và vô trùng nó trên ngọn đèn cồn. Trước hết để que cấy thẳng
đứng trên ngọn lửa cho đến lúc đầu que cấy đỏ lên rồi từ từ chuyển sang toàn bộ que cấy và
một phần que cầm trên ngọn lửa, kh dùng pipet pasto thì bẻ gãy đầu mao dẫn đi một đoạn
và cũng vô khuẩn tương tự.
- Đốt miệng ống nghiệm trên đèn cồn.
- Cho que cấy vào ống nghiệm để lấy vi sinh vật. Với môi trường lỏng chỉ cần nhúng
que cấy vào môi trường chứa vi sinh vật, không nên để môi trường vi sinh vật chạm vào tay
cầm, với môi trường đặc thì quệt lấy một phần nhỏ của khuẩn lạc, không cấy mặt thạch lên.
- Rút que cấy ra, đốt miệng ống nghệm, đậy nút bông lại đặt ống nghiệm vào giá.
- Đem mẫu vi sinh vật có trên đầu que cấy cấy vào môi trường.
- Vô trùng lại que cấy trên đèn cồn rồi để vào giá.
- Việc cấy vi sinh vật lên môi trường được thực hiện trong môi trường vô trùng, đốt
đèn cồn lên, ta thực hiện trong khoảng không gian cách đèn cồn khoảng 25 cm.
3. Phương pháp cấy:
3.1 Phương pháp của việc cấy truyền:

Cấy truyền là phương pháp lấy vi sinh vật từ ống nghiệm này sang ống nghiệm khác.
Gồm các thao tác:
CDMT10
8
Báo cáo thực hành vi sinh đại cương
+ Dán nhãn ghi: tên loại vi sinh vật, ngày cấy vào thành ống nghiệm dưới nút bông
một chút.
+ Tay trái cầm hai ống nghiệm: 1 ống giống, 1 ống môi trường.
+ Tay phải cầm que cấy và khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi nóng đỏ dây
cấy.
+ Dùng ngón út và ngón áp út kẹp nút bông ào lòng bàn tay xoay nhẹ, kéo nút bông ra.
+ Hơ nóng để khử trùng không khí ở miệng 2 ống nghiệm.
+ Đợi khi que cấy vừa nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với vi sinh vật trong ống
giống.
+ Rút que cấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm và đưa vào ống môi
trường để thực hiện thao tác cấy truyền.
+ Khử trùng lại phần không khí nơi miệng 2 ống nghiệm rồi đậy nút bông.
+ Khử trùng lại que cấy sau khi đã sử dụng xong…
Nếu ống giống là môi trường lỏng có vi sinh vật thì dùng pipet hút môi trường thay
que cấy.
3.2 Phương pháp cấy trên thạch nghiêng:
- Dán nhã ghi: tên loại vi sinh vật, ngày cấy vào thành ống nghiệm dưới nút bông một
chút.
- Sử dụng que cấy đầu tròn thực hiện các thao tác cấy.
- Tay trái cầm hai ống nghiệm: 1 ống giống, 1 ống môi trường.
- Tay phải cầm que cấy và khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi nóng đỏ dây
cấy.
- Dùng ngón út và ngón áp út kẹp nút bông vào lòng bàn tay xoay nhẹ, kéo nút bông
ra.
- Hơ nóng để khử trùng không khí ở miệng 2 ống nghiệm.

- Đợi khi que cấy vừa nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với vi sinh vật trong ống
giống.
- Rút que cấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm và đưa vào ống môi
trường để thực hiện thao tác cấy:
+ Hòa giống ở đầu que cấy và giọt nước ở đáy ống nghiệm
+ Nhẹ nhàng lướt que cấy trên mặt thạch theo kiểu:
 Hình chữ chi.
CDMT10
9
Báo cáo thực hành vi sinh đại cương
 Hình vòng xoắn.
 Hình vạch ngang song song.
- Khử trùng lại phần không khí nơi miệng 2 ống nghiệm rồi đậy nút bông.
- Khử trùng lại que cấy sau khi đã sử dụng xong…
3.3 Phương pháp cấy trên thạch đứng:
- Sử dụng que cấy đầu tròn.
- Sau khi lấy giống vi sinh vật,dùng que cấy này đâm sâu vào phần khối thạch hình
trụ.
- Đâm sát đáy ống nghiệm và đâm thành 3 đường: 1 đường chính giữa, 2 đường sát
thành ống tùy yêu cầu.
- Đường cấy phải thẳng, nhẹ nhàng để không gây nứt, vỡ môi trường.
3.4 Phương pháp cấy trên hộp petri:
- Sử dụng que cấy đầu tròn
CDMT10
10
Một số dạng môi trường trong ống nghiệm và hộp pêtri
Báo cáo thực hành vi sinh đại cương
- Dùng que cấy đầu tròn lấy vi sinh vật bằn tay phải theo đúng quy cách đã hướng dẫn
ở trên.
- Tay trái cầm hộp petri khẽ hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn.Sau đó để cách đèn cồn

chừng 1-2cm, khẽ mở nghiêng một bên hộp (phần hơ lửa), sao ch vừa đủ để cho que cấy
vào.
- Nhẹ nhàng, nhanh chóng lướt que cấy trên mặt thạch theo một trong các kiểu sau:
 Theo hình chữ chi trên toàn bộ mặt thạch.
 Theo những đường song song
 Theo 4 hình chữ chi 4 góc.
- Dùng pipet
Cách 1:
- Trộn dịch cấy vào thạch bằng cách hút 0.1 ml dịch nghiên cứu cho vào ống nghiệm
có môi trường thạch ở nhiệt độ 50
0
C.
- Đậy nút bông lại, lắc nhẹ cho vi sinh vật phân phối đều trong môi trường.
- Đổ thạch này vào hộp petri đã khử trùng.
- Xoay tròn hộp petri cho thạch dàn đều ở đáy hộp.
- Để yên cho thạch đông đặc lại và đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp.
Cách 2:
- Hút 0.1 ml dịch cấy, nhỏ vào hộp petri có môi trường đặc.
- Dùng que trang phân phối giọt dịch đều khắp mặt hộp.
- Đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp.
CDMT10
11
Báo cáo thực hành vi sinh đại cương
BÀI 5: ĐẾM TRỰC TIẾP – ĐẾM GIÁN TIẾP
I. Mục đích và yêu cầu
- Cách xác định tổng số vi sinh vật có trong mẫu bằng phương pháp trực tiếp.
- Kỹ năng cấy môi trường lỏng.
- Kỹ năng kiểm tra số lượng vi sinh vật trong mẫu lỏng và mẫu đặc.
II. Dụng cụ
- Kính hiển vi quang học - Phiến kính, lá kính

- Đèn cồn - Bình tia
III. Hóa chất
- Cồn đốt - Dung dịch fuchsin loãng
- Dung dịch lugol, gential violet - Nước cất vô trùng
- Nước muối sinh lý - Mẫu thực
IV. Tiến hành thí nghiệm
1. Cấu tạo của phiến kính Goriaep:
Phiến kính có khung đếm Goriaep dùng để xác định số lượng vi sinh vật có kích thước
tương đối lớn như nấm men, bào tử nấm mốc, các loại tảo.
Nguyên tắc cấu tạo:
Khung điếm là một phiến kính dày, hình chữ nhật, giữa là phần lõm phẳng, tại đây có
kẻ một lưới gồm 400 hình vuông co diện tích tổng cộng là 1mm
2
.
Vì vậy diện tích 1 hình vuông nhỏ nhất là 1/400 mm
2
và 1 hình vuông lớn hơn là 1/25
mm
2
.
2. Cách đếm trực tiếp:
Nhỏ một giọt dịch huyền phù có vi sinh vật vào giữa khung đếm và đậy bằng lá kính.
Di chuyển nhẹ nhàng khung đếm để dịch huyền phù tràn đầy các khoang sao cho dịch
huyền phù không rơi xuống các rãnh và không tạo thành bọt khí. Khí đó dịch nằm trong
khoang có độ dầy khoảng 0.1 mm.
CDMT10
12
Cấy E.coli trên đĩa petri
Trên đĩa coliforms có màu hồng và E.
coli có màu tím.

Báo cáo thực hành vi sinh đại cương
Sau đó đặt phiến kính đã có vi sinh vật lên kính hiển vi, quang sát và đếm vi sinh vật
có trong buồng kính. Đếm theo nguyên tắc trên trái hoặc dưới phải, dính 1/3 không lấy, dính
2/3 lấy. Khi điều chỉnh kính hiển vi ở vật kính 4 sẽ thấy 9 ô lớn, vật kính 10 thấy 1 ô lớn,
vật kính 40 sẽ thấy 1 ô vừa.(hình)
Thể tích của khối vuông nhỏ sẽ là:
1/400 mm
2
x 0.1 mm = 1/4000 mm
3
hay 1/4000000 ml
Bắt đầu đếm tế bào sau khi nhỏ giọt dịch từ 3-5 phút.
Đếm 10 vuông lớn hay 20 ô vuông nhỏ.
Tính số lượng tế bào theo công thức:
Ν
=
n
sh
a
.
.
1000.
Với:
N: Số lượng tế bào trong 1 ml dịch huyền phù.
a: Số lượng tế bào trung bình trong 1 ô nhỏ.
h: Chiều sâu của khung đếm.
n: Độ pha loãng của mẫu (dịch huyền phù).
s: Diện tích hình vuông của lưới
Sau khi sử dụng xong phải rửa buồng đếm và lau thật khô để bảo quản.
Trị số trung bình của tế bào đếm được trong một ô nhỏ phải đảm bảo:

2.5< a < 10.
3. Pha loãng mẫu:
- Chuẩn bị một số bình tam giác chứa 90 ml nước cât vô trùng, một số ống nghiệm
chứa 9 ml nước cất vô trùng và một số pipet 1ml vô trùng.
- Hút 1 ml mẫu nghiên cứu cho vào ống nghiệm có 9 ml nước cất vô trùng. Trộn đều
dung dịch bằng cách hút lên , thổi xuống 3-5 lần. Ta được độ pha loãng 1/10 hay 10
-1
.
- Tiếp tục hút 1 ml ở ống nghiệm 1 cho vào ống nghiệm có 9 ml nước cất vô trùng thứ
2. Trộn đều dung dịch bằng cách hút lên, thổi xuống 3-5 lần. Ta được độ pha loãng 1/100
hay 10
-2
.
- Tiếp tục như vậy hút từ ống 2 sang ống 3, từ ống 3 sang ống 4 ta sẽ có được các
nồng độ pha loãng tương ứng 10
-3
, 10
-4
.
3.1 Cách cấy mẫu:
- Pha loãng dịch huyền phù ở các nồng độ khác nhau: 10
-1
, 10
-2
, 10
-3
…10
-9
.
- Ghi vào nắp hộp petri có môi trường thạch các thông tin: nồng độ pha loãng, ngày

cấy, nhóm, lớp.
CDMT10
13
Báo cáo thực hành vi sinh đại cương
- Dùng pipet đã vô trùng lấy 1 ml dịch huyền phù cho vào mỗi đĩa petri (đã vô trùng).
- Cho khoảng 15 ml môi trường ở nhiệt độ khoảng 45
0
C vào hộp petri. Xoay chậm cho
hỗn hợp trộn đều. Để yên cho nguội. Lật ngược cho vào tủ ấm. Nuôi cấy ở 30
0
C trong 72
giờ.
- Mỗi nồng độ cấy 3 hộp petri.
- Sau đó lấy ra kiểm tra kết quả.
3.2 Cách đếm gián tiếp:
Lấy bút chì kẻ 2 đường vuông góc ở đáy hộp petri và đánh dấu thứ tự từng vùng I, II,
III, IV.
Đếm số lượng khuẩn lạc từng vùng. Nhớ đánh dấu các khuẩn lạc đã đếm.
Số lượng tế bào trong một gram mẫu được tính theo công thức sau đây:
( )
( )
ii
vdnvdn
C
mlhayCFUCFU
++
=Ν
∑

//

11
Với:
-N: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong 1g hay 1 ml mẫu.
-
∑
C
:tổng số khuẩn lạc đếm được trên hộp petri đã chọn
-n
1
: số hộp petri cấy tại độ pha loãng thứ i
-d
i
: hệ số pha loãng tương ứng
-v: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa.
Trong trường hợp số lượng khuẩn lạc có trong cả hai hộp petri nhỏ hơn 15 ta tính như
sau:
- Gọi m là lượng khuẩn lạc trung bình có trên hai hộp petri
- Lượng khuẩn lạc có trong mẫu lỏng là: N
E
= m / ml
- Nếu trong mẫu đặc thì lượng huẩn lạc có trong 1 g mẫu sẽ là: N
E
= mxd
-k
, với d là hệ
số pha loãng.
- Trong trường hợp khuẩn lạc có trong cả hai hộp petri nhỏ hơn 1 ta tính như sau:
- Lượng khuẩn lạc có trong mẫu lỏng: N
E
<1/ml

- Nếu là mẫu đặc thì lượng khuẩn lạc có trong 1g mẫu sẽ là: N
E
<1xd
-k
, với d là hệ số
pha loãng.
- Độ pha loãng thích hợp nhất nếu ở nồng độ này cấy trên thạch đĩa cho số khuẩn lạc
trung bình từ 50-150 với vi khuẩn, xạ khuẩn; 30-50 với nấm.
CDMT10
14
Báo cáo thực hành vi sinh đại cương
BÀI 6: NHUỘM PHỨC VI KHUẨN
I. Mục đích và yêu cầu
- Củng cố các kiến thức về cấu trúc – chức năng của các yếu tố tạo nên tế bào vi
khuẩn.
- Củng cố kỹ năng làm tiêu bản nhuộm phức vi khuẩn.
- Củng cố kỹ năng sử dụng vật kính dầu.
II. Dụng cụ
- Kính hiển vi quang học - Phiến kính, lá kính
- Que cấy đầu tròn - Đèn cồn
- Bình tia
III. Hóa chất
- Cồn đốt - Dung dịch fuchsin loãng
- Dung dịch lugol, Gential violet - Nước cất vô trùng, nước muối sinh lý
- Vi khuẩn Gram âm, Gram dương
IV. Tiến hành thí nghiệm
1. Làm tiêu bản vi sinh vật nhuộm màu
1.1 Làm vết bôi (đồ phiến)
- Chọn phiến kính sạch khô. Nếu chưa sạch phải rửa lại
- Lấy bút chì màu khoanh một vòng (1-2cm

2
) lên một phía của phiến kính, quay ngược
phiến kính lại và để lên giá.
- Dùng que cấy vòng lấy môi trường để vào vòng đã khoanh. Với môi trường đặc thì
dùng que cấy cho một giọt nước muối sinh lý lên vùng đã khoanh, sau đó lấy ít môi trường
hòa vào.
- Nghiêng que cấy 10-15 độ, nhẹ nhàng dàn giọt môi trường ra khắp diện tích đã
khoanh, không xát mạnh.
- Làm xong, vô khuẩn que cấy trên đèn cồn rồi để vào giá. Một vết bôi làm tốt phải:
CDMT10
15
Báo cáo thực hành vi sinh đại cương
- Hết sức mỏng, vi sinh vật không tập trung vào một chỗ hoặc chồng chất thành nhiều
lớp, mà phân phối đều trên vết bôi.
- Có hình dạng và kích thước thích hợp: tròn hoặc bầu dục, rộng 1-2cm
2
, bé quá khó
quan sát, lớn quá mất thì giờ, tốn thuốc nhuộm.
1.2 Làm khô vết bôi:
Để vết bôi khô ở nhiệt độ trong phòng. Muốn nhanh có thể hơ nhẹ trên đèn cồn, cách
xa ngọn lửa (25cm) hoặc hơ nóng gián tiếp tuyệt đối không hơ nóng trực tiếp hoặc hơ nóng
quá vì như vậy tế bào bị quắt lại, cấu tạo của nó bị thay đổi. Phải để vết bôi thật khô mới
tiếp tục. Vết bôi làm vàng mỏng càng chóng khô.
1.3 Cố định vết bôi:
Nhằm mục đích:
- Giết chết vi sinh vật để sử dụng tiếp tục không nguy hiểm.
- Gắn chặt vi sinh vật vào kính để lúc nhuộm, rửa không bị trôi.
- Làm cho vi sinh vật dễ bắt màu.
Có nhiều phương pháp cố định, phương pháp đơn giản nhất là hơ nóng trên ngọn đèn
cồn: kẹp phiến kính giữa hai ngón tay cái và ngón trỏ, đưa qua lại 4-5 lần trên phần không

nóng lắm của đèn cồn, chú ý xoay phía kính có vết bôi lên trên.
Khi nghiên cứu cấu tạo tế bào thì cố định bằng cách hơ nóng không lợi, mà phải cố
định bằng hóa chất, thường dùng các chất sau:
- Rượu etylic: nhỏ rượu lên vết bôi hoặc nhúng vết bôi vào rượu. Rượu tuyệt đối tác
dụng tức thời, rượu 95% trong 5-15 phút rượu càng loãng thời gian càng lâu.
- Rượu metylic trong 2-5 phút.
- Axeton 5 phút.
- Dùng rượu etylic và đốt cháy: cho vài giọt rượu 90-95% lẹn vết bôi rồi đốt cháy và
dập tắt ngay, làm thế vài lần rồi để khô, phương pháp này nhanh gọn nên hay dùng.
2. Nhuộm màu
Nguyên tắc:
Vi sinh vật bắt màu thuốc nhuộm là một quá trình hấp phụ. Trong đa số trường hợp
thuốc nhuộm kết hợp với vi sinh vật rất bền vững khó bị phá hủy hoặc bị nước làm phai đi.
Thuốc nhuộm thường dùng là chất màu anilin, chủ yếu là kiềm hoặc trung tính.
CDMT10
16
Báo cáo thực hành vi sinh đại cương
Vì thành phần hóa học của tế bào các loài vi sinh vật cũng như các bộ phận trong tế
bào rất khác nhau nên khả năng và mức độ bắt màu không giống nhau, do đó ta có nhiều
phương pháp nhuộm.
- Nhuộm đơn giản: trên tiêu bản chỉ dùng một thứ thuốc nhuộm.
- Nhuộm phức tạp: trên cùng một tiêu bản dùng nhiều loại thuốc nhuộm: nhuộm
Gram, nha bào, tiên mao
Tùy yêu cầu nghiên cứu mà ta áp dụng phương pháp thích hợp.
Cách nhuộm:
- Vết bôi đã cố định phải để khô mới đem nhuộm.
- Đặt phiến kính có vết bôi lên khung bằng que thủy tinh hoặc tay trái cầm kẹp cooc-
ne giữ lấy phiến kính.
- Dùng ống nhỏ giọt nhỏ thuốc nhuộm phủ đều vết bôi. Chú ý không cho thuốc nhuộm
nhiều quá và trong thời gian nhuộm trên vết bôi luôn luôn có 1 lớp thuốc nhuộm phủ đều,

không được để cạn hoặc khô đi.
- Thời gian nhuộm tùy tính chất tiêu bản và thuốc nhuộm đem dùng. Thường nhuộm ở
nhiệt độ phòng.
- Để tăng cường tác dụng của thuốc nhuộm hoặc rút ngắn thời gian ta hơ nóng nhẹ
trên đèn cồn hoặc dùng que bông tẩm cồn đốt ở dưới.
- Khi nhuộm xong, đổ hết thuốc nhuộm đi, rửa sạch bằng cách nghiêng phiến kính và
cho một dòng nước chảy nhẹ lên mặt, nước sẽ kéo thuốc nhuộm đến khi nước chảy ra không
còn màu nữa. Sau đó dùng giấy thắm khô hoặc hơ khô nhẹ trên đèn cồn. Phải để tiêu bản
thật khô mới đem quan sát.
Nhuộm Gram:
Phương pháp này do Christim Gram đưa ra vào năm 1884, ngày nay nó được thông
dụng trong vi sinh vật học. Đây là một phương pháp nhuộm quan trọng dùng để định loại vi
sinh vật dựa trên thành phần cấu tạo của chúng. Người ta cho rằng trong nguyên sinh chất tế
bào của 1 số loài vi sinh vật có chứa phức chất protein đặc biệt mà trong thành phần của nó
có muối ribonucleat Mg, khi nhuộm phức chất này kết hợp với thuốc nhuộm triphenylmetan
(như gentian violet, cristal violet, metyl violet ) và iod sẽ cho màu tím rất bền vững, khó
tác dụng của cồn. Những vi sinh vật có tính chất này gọi là vi sinh vật Gram dương, nếu
không gọi là vi sinh vật Gram âm.
CDMT10
17
Báo cáo thực hành vi sinh đại cương
Cách nhuộm gồm các bước:
Sau khi nhuộm xong, cho 1 giọt dầu soi kính lên mẫu vi sinh vật đã nhuộm để tiến
hành quan sát bằng kính hiển với vật kính x100.
Kết quả: sau khi nhuộm một mẫu vi sinh vật thì trong mẫu có vi khuẩn Gram âm: bắt màu
hồng, có hình que; vi khuẩn Gram dương: bắt màu tím, hình cầu.
3. Điếm trực tiếp:
Như đã trình bày ở bài trước.
CDMT10
18

Vết đồ
Phủ tím tinh thể
Rửa nước
Phủ glucol
Rửa nước
Tẩy cồn
Rửa nước
Phủ fushing
Rửa nước
Đã
nhuộm
1 phút
2 phút
30 giây
30 giây
Báo cáo thực hành vi sinh đại cương
BÀI 7: CẤY NẤM MỐC
I. Mục đích và yêu cầu:
Củng cố cách cấy môi trường.
II. Dụng cụ:
- Que cấy đầu tròn - Đèn cồn
- Bình tia - Bếp điện
- Cân - 8 đĩa petri
- 1 ống nghiệm - đũa thủy tinh
III. Hóa chất:
- Cồn đốt - Nước cất vô trùng, nước muối sinh lý
- Mẫu nấm mốc cần nghiêng cứu - Pepton
- Maltoza hay glucoza - Thạch
- Nước cất - saccaroza
- NaNO

3
- K
2
HPO
4
- FeSO
4
- MgSO
4
IV. Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị dụng cụ:
- Đem hấp 8 đĩa petri trong 15 phút, nhiệt độ 121
0
C.
- Lấy 1 ống nghiệm chứa nước muối sinh lý, lấy mẫu nấm mốc cần nghiên cứu hòa
vào.
Nấu môi trường nuôi cấy nấm mốc:
Công thức:
Môi trường Sabouraud:
 Peton: 1g  Glucoza: 4g
 Nước: 100 ml  Thạch: 2g
pH = 5.6
Môi trường Czapek:
 Saccaroza: 3g  NaNO
3
: 3g
CDMT10
19
Báo cáo thực hành vi sinh đại cương
 K

2
HPO
4
: 0.1g  MgSO
4
: 0.05g
 FeSO
4
: 0.001g  Thạch: 2g
 Nước cất: 100 ml  pH = 6
Cách làm:
Môi trường Sabouraud: lấy 1g Peton, 4g Glucoza hòa vào 100 ml nước cất, khuấy cho
tan ra hoàn toàn, sau đó đem đo pH, điều chỉnh đến pH = 5.6. Cho 2g thạch (agar) vào nấu
cho đến khi agar tan hết.
Môi trường Czapek: lấy 0.1g K
2
HPO
4
, 0.001g FeSO
4
, 3g NaNO
3
, 3g Saccaroza, 0.05g
MgSO
4
hòa vào 100 ml nước cất, ta cũng khuấy cho tan ra rồi đem đo pH, điều chỉnh pH =
6. Cho 2g thạch (agar) vào nấu cho tan hoàn toàn.
Sau 15 phút, lấy 8 đĩa petri ra và tiến hành đổ môi trường. Môi trường Sabouraud cho
vào 4 đĩa petri, môi trường Czapek cho vào 4 đĩa còn lại. Ghi rõ tên lớp, ngày thực hành,
môi trường, tổ, nhóm. Chờ một khoảng thời gian cho môi trường đặc lại. Sau đó tiến hành

cấy nấm mốc lên môi trường. Có thể cấy thành đường hoặc thành 1-3 chấm trong mỗi hộp.
Cách cấy như đã trình bày ở bài trước.
Nuôi ở nhiệt độ 30
0
C sau 3-5 ngày đem ra quan sát.
CDMT10
20
Báo cáo thực hành vi sinh đại cương
BÀI 8: XEM NẤM MỐC – KHẢO SÁT pH.
I. Mục đích và yêu cầu:
- Quan sát nấm mốc
- Khảo sát sự phát triển của vi khuẩn trong các môi trường có pH khác nhau.
II. Dụng cụ:
- Kính hiển vi - bếp điện
- 10 erlen - phiến kính
- máy đo pH - 20 ống nghiệm
- 10 betcher - cân
- đũa thủy tinh
III. Hóa chất:
- Dung dịch lugol, Gential violet - Dung dịch fuchsin loãng
- pepton - NaCl
- nước cất
IV. Tiến hành thí nghiệm:
1. Quan sát nấm mốc:
Lấy mẫu nấm mốc đã tiến hành nuôi cấy ở bài trước ra quan sát.
Nấm mốc là một loài vi sinh vật lớn, có cấu tạo hình sợi phân nhánh nhiều lần. Sợi
nấm còn gọi là khuẩn ty. Khi phát triển chúng chằng chịt với nhau làm thành hệ sợi nấm
(khuẩn ty thể) bằng mắt thường chúng ta có thể nhìn thấy chúng được.
Nấm mốc có thể sinh sản bằng nhiều cách nhưng cách sinh sản chủ yếu là tạo thành
bào tử. Khảo sát một số giống nấm mốc đặc trưng:

- Mucor và Rhizopus thì sợi nấm đơn bào: bào tử được hình thành trong các túi và
được gọi là bào tử nang, chúng còn được gọi là nấm mốc có bào tử kín (bào tử nội sinh)
 Mucor: cuống của bào tử nang thường có phân nhánh và mọc lên ở bất kì chỗ nào
của sợi nấm.
 Rhizopus: cuống bào tử nang không phân nhánh chỉ mọc lên ở chỗ sợi nấm tiếp xúc
với môi trường và mọc thành cụm từ 3-4 cụm, trông giống rễ của bụi lúa.
CDMT10
21
Báo cáo thực hành vi sinh đại cương
- Với Aspergillus và Penicilium: sợi nấm đa bào. Đầu sợi nấm sinh sản phình to ra, tạo
thành các thể hình chai và các chuỗi đỉnh bào tử vì thế gọi là bào tử hở hay bào tử ngoại
sinh.
 Aspergillus: cuống của đỉnh bào tử đơn bào, các tế bào hình chai và chuỗi đỉnh bào
tử tỏa điều trên đầu sợi nấm.
 Penicilium: Cuống của đỉnh bào tử đa bào,đầu cuống phân
nhánh nhiều lần rồi mới thành các chuỗi đỉnh bào tử. Các tế bào
hình chai và chuỗi đỉnh bào tử hướng lên cùng một phía trông
giống như cái chổi.
Kết quả: quan sát ta thấy đây là giống nấm mốc bào tử đính,
màu xám vàng.
2. Khảo sát pH:
Khảo sát vi khuẩn ecoli, pH từ 3-11, cho cùng một lượng vi khuẩn vào, môi trường
lỏng.
Nấu môi trường:
- pepton: 7g - NaCl: 5.95g
- nước cất: 700 ml
Đun để hòa tan các thành phần trên trong nước cất. Cho vào 10 betcher mỗi betcher
chứa 70 ml môi trường, lần lượt đem từng betcher đi điều chỉnh pH lần lượt từ pH=3 đến
pH=11. Sau đó lần lượt cho vào 10 erlen, ghi rõ tên lớp, ngày thực hành, nhóm, pH. Đem
hấp thanh trùng. Đồng thời cũng đem 10 ống nghiệm đi thanh trùng.

CDMT10
22
Bào tử túi
Bào tử nấm mốc được phóng đại dưới
kính hiển vi
Bào tử đính
Báo cáo thực hành vi sinh đại cương
Sau khi hấp xong, lấy môi trường ra cho lần lượt từng môi trường có pH lần lượt từ 3-
11 vào 20 ống nghiệm có ghi rõ tên lớp, ngày thực hành, nhóm, pH, mỗi ống nghiệm chứa
10 ml môi trường. Lấy ống nghiệm chứa 12 ml nước muối sinh lý để chứa vi khuẩn. Hút 1
ml dung dịch vi khuẩn cho vào 10 ống nghiệm. 10 ống còn lại dùng làm ống đối chứng
không chứa vi khuẩn. Sau 48 tiếng phải xem kết quả cấy.
Kết quả:
- pH=11, vi khuẩn phát triển nhiều nhất, ống đục hơn các ống còn lại.
- pH: 10-3, độ đục giảm dần, chứng tỏ vi khuẩn kém phát triển hơn.
→ Môi trường càng cao, môi trường càng có tính bazo thì vi khuẩn phát triển càng tốt.
Lấy mẫu ống có pH=11 đem nhuộm Gram.
CDMT10
23
Báo cáo thực hành vi sinh đại cương
BÀI 9: KHẢO SÁT ÁP SUẤT THẨM THẤU
I. Mục đích và yêu cầu:
Khảo sát sự phát triển của vi sinh vật trong môi trường có áp suất khác nhau.
II. Dụng cụ:
- 18 đĩa petri - 6 betcher
- 6 erlen - bếp điện
- cân - đũa thủy tinh
- máy đo pH - que cấy
III. Hóa chất:
- mẫu vi sinh vật khảo sát - muối NaCl

- pepton - thạch (agar)
- nước cất
IV. Tiến hành thí nghiệm:
Trong bản thân tế bào của vi sinh vật có dịch tế bào duy trì áp suất để cân bằng áp suất
bên ngoài, chất duy trì áp suất thẩn thấu là NaCl (nồng độ 0.85 – 0.9%) tạo ra áp suất tương
đối với áp suất bên ngoài. Áp suất thẩm thấu tác dụng đến sự phát triển của vi sinh vật.
Khảo sát ở nồng độ muối 0%, 0.5%, 1%, 5%, 10%, 20%.
Nấu môi trường:
- 700 ml nước cất - 7g pepton
- 10,5 g agar - NaCl: 0.5g, 1g, 5g, 10g, 20g
Cho 7g pepton vào 700 ml nước cất, hoà tan, điều chỉnh pH=7. Cho agar vào, nấu cho
agar tan ra. Cho lần lượt các khối lượng muối 0g, 0.5g, 1g, 5g, 10g, 20g vào 6 betcher ghi rõ
tên lớp, ngày thực hành, nhóm, nồng độ muối.Sau khi agar tan hoàn toàn thì cho lần lượt
vào 6 betcher, mỗi betcher 100 ml môi trường, khuấy cho muối tan ra, betcher chứa 20g
muối không tan được. Cho vào 6 erlen ghi rõ tên lớp, ngày thực hành, nhóm, nồng độ muối.
Đem hấp thanh trùng trong 15 phút-121
0
C.
Lấy môi trường ra, đổ môi trường vào đĩa petri, mỗi nồng độ muối cho vào 3 đĩa petri
ghi rõ tên lớp, ngày thực hành, nhóm, nồng độ muối. Chờ cho môi trường đông lại, hút 0.1
CDMT10
24
Báo cáo thực hành vi sinh đại cương
ml huyền dịch vi sinh vật trong ống nghiệm đựng mẫu cho lần lượt vào các đĩa petri, dùng
que cấy trải đều. Ủ sau từ 2-4 ngày quan sát khuẩn lạc mọc trên môi trường.
Kết quả:
- nồng độ muối 0%, 0.5%, 1%: vi sinh vật phát triển nhiều thành từng mảng lớn.
- nồng độ muối 5%: Vi sinh vật phát triển ít dần và tạo thành những khuẩn lạc riêng
rẽ.
- nồng độ muối 10%: khuẩn lạc mọc ít dần

- nồng độ muối 20%: vi sinh vật không phát triển
Nồng độ càng cao áp suất thẩm thấu càng cao ảnh hưởng đến vi sinh vật vi
sinh vật kém phát triển.
CDMT10
25