Áp dụng phương pháp VNTR – Miru định kiểu Gene các chủng Mycobacterium Tuberculosis phân lập tại Việt Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN




Nguyễn Thị Hồng Duyên





ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP VNTR – MIRU
ĐỊNH KIỂU GENE CÁC CHỦNG MYCOBACTERIUM
TUBERCULOSIS PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM





LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC







Thành phố Hồ Chí Minh – 2010
LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp luận văn thạc sĩ tôi xin bày tỏ lòng biết ơn
sâu sắc đến

Đơn vi nghiên cứu lâm sàng Đại học Oxford, Bệnh viện Bệnh nhiệt đới, bệnh
viện Phạm Ngọc Thạch và Giáo sư Jeremy Farrar đã tạo điều kiện giúp tôi
thực hiện khóa luận này.

Tiến sĩ khoa học Maxine Caws đã tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ tôi từng bước
ngay khi bắt tay vào thí nghiệm, đến khi hoàn tất luận văn, và tiến sĩ khoa
học Ngô Thị Hoa đã giúp tôi chăm chút từng câu chữ viết luận văn.

Các anh phòng IT đã hết lòng giúp đỡ tôi trong quá trình soạn thảo.

Các anh chị, bạn và các em đồng nghiệp tại OUCRU, phòng thí nghiệm sinh
học phân tử trên vi khuẩn lao đã hỗ trợ cho tôi rất nhiều trong quá trình thí
nghiệm.

Và các bạn của tôi, chính nhờ sự thăm hỏi, động viên tôi liên tục không mệt
mỏi đã tiếp sức cho tôi qua những giai đoạn khó khăn.

Trên tất cả, con xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn đến ba mẹ - chỗ dựa tinh thần
vững chắc của con.

Tp Hồ Chí Minh, tháng 2 năm 2010
Nguyễn Thị Hồng Duyên
MỤC LỤC

Trang
Lời cảm ơn
Mục lục

Danh mục bảng
Danh mục hình
Danh mục chữ viết tắt
Lời mở đầu………………………………………………………………………… 1
Mục tiêu đề tài…………………………………………………………………… 2
Tính cấp thiết, ý nghĩa lí luận và thực tiễn của đề tài……………………………. 3
1. Tổng quan tài liệu………………………………………………………………… 4
1.1. Bệnh lao………………………………………………………………………… 4
1.1.1. Bệnh lao xét ở mức độ toàn cầu và ở Việt Nam……………………………… 4
1.1.1.1. Gánh nặng bệnh lao trên thế giới…………………………………………… 4
1.1.1.2. Gánh nặng bệnh lao ở Vi
ệt Nam…………………………………………… 4
1.1.2. Phân loại bệnh lao…………………………………………………………… 5
1.1.2.1. Lao phổi AFB(+)…………………………………………………………… 5
1.1.2.2. Lao phổi AFB (-)…………………………………………………………… 5
1.1.2.3. Lao ngoài phổi……………………………………………………………… 6
1.1.3. Phân loại và đặc điểm vi khuẩn lao………………………………………… 6
1.1.3.1. Phân loại…………………………………………………………………… 6
1.1.3.2. Các đặc điểm sinh học cơ bản của mycobacteria…………………………… 10
1.1.4. Bộ gene vi khuẩn lao…………………………………………………………. 15
1.1.4.1. Cấu trúc bộ gene vi khuẩn lao……………………………………………… 15
1.1.4.2. Cơ chế tiến hoá chung của vi khuẩn lao và chiến lược xuất hiện đa
dạng di truyền của vi khuẩn lao……………………………………………………
16
1.2. Các kĩ thuật sinh học phân tử xác định ki
ểu gene vi khuẩn lao………………… 17
1.2.1. Các kĩ thuật sinh học phân tử phổ biến hiện nay trong tình hình nghiên
cứu tại Việt Nam…………………………………………………………………….
17
1.2.2. Kĩ thuật dựa trên Variable Number of Tandem Repeats – Mycobacterial

Interspersed Repetitive Unit…………………………………………………………
21
1.2.3. Các thông số chung để đánh giá và kiểm định phương pháp định kiểu
gene…………………………………………………………………………
23
1.2.3.1. Khả năng thực hiện…………………………………………………………. 23
1.2.3.2. Sự tiện lợi…………………………………………………………………… 23
1.3. Nghiên cứu dịch tễ phân tử trên M.tuberculosis (đặc biệt kiểu gene Beijing)…. 24
1.3.1. Những đặc điểm di truyền xác đị
nh M.tuberculosis họ Beijing……………… 25
1.3.2. Dịch tễ học họ Beijing……………………………………………………… 26
1.3.3. Những kết quả ban đầu trong nghiên cứu lâm sàng họ Beijing………………. 28
2. Vật liệu và phương pháp………………………………………………………… 29
2.1. Đối tượng nghiên cứu………………………………………………………… 29
2.2. Kỹ thuật sinh học phân tử xác định kiểu gene dựa trên VNTR – MIRU………. 29
2.2.1. Khuếch đại trình tự đích……………………………………………………… 30
2.2.1.1. Nguyên tắc………………………………………………………………… 30
2.2.1.2. Tiến hành…………………………………………………………………… 30
2.2.2. Điện di mao quản…………………………………………………………… 31
2.2.3. Xử lí thông tin thu nhận được………………………………………………… 33
3. Kết quả………………………………………………………………………… 35
3.1. Tối ưu hóa m
ột số điều kiện phản ứng trong phương pháp VNTR –
MIRU định kiểu gene các chủng Mycobacterium tuberculosis phân lập tại
Việt Nam…………………………………………………………………………
35
3.2. Đánh giá mức độ áp dụng của kỹ thuật định kiểu gene dựa trên VNTRMIRU… 38
3.2.1. Khả năng định kiểu gene (Typability) ………………………………………. 44
3.2.2. Độ lặp lại của kỹ thuật (Reproducibility) ……………………………………. 44
3.2.3. Allelic diversity: Chỉ số phân biệt để tính độ đa dạng kiểu gene dựa trên

từng vị trí VNTR……………………………………………………………………
45
3.2.4. Độ phân giải của kỹ thuật (Discriminatory power) ………………………… 46
4. Thảo luận…………………………………………………………………………. 51
4.1. Áp dụng phương pháp VNTR – MIRU………………………………………… 51
4.2. Tính ổn định của phương pháp…………………………………………………. 52
4.3. Giá trị của phương pháp trong bối cảnh dịch tễ, lâm sàng…………………… 53
5. Kết luận và Đề nghị………………………………………………………………. 55
Danh mục công trình tác giả………………………………………………………… 57
Tài liệu tham khảo
Phụ lục


DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1.1: Một số vi khuẩn mycobacteria có liên hệ với bệnh
7
Bảng 1.2: Phức hợp M.tuberculosis và các bệnh liên quan
9
Bảng 1.3: So sánh ưu và khuyết của 2 phương pháp định kiểu gene vi
khuẩn lao thông dụng
20
Bảng 1.4: Tỷ lệ nhiễm lao do kiểu gene Beijing phân chia theo độ tuổi
bệnh nhân tại Việt Nam
27
Bảng 2.1: Tóm tắt quy trình phân tích kiểu gene vi khuẩn lao
29
Bảng 2.2: Thành phần trong PCR trong phương pháp MIRU - VNTR
31
Bảng 2.3 :Chương trình phản ứng trong máy luân nhiệt

31
Bảng 3.1: Các thông số nhiệt độ, cường độ dòng điện,
điện thế dùng cho máy DNA sequencer khi phân giải mẫu
36
Bảng 3.2: Thống kê khả năng định kiểu gene của kỹ thuật trên một số
dấu hiệu sinh học có xuất hiện kết quả âm tính.
44
Bàng 3.3: Một số lỗi kĩ thuật thường gặp ở phương pháp VNTR –
MIRU
44
Bảng 3.4: Thống kê giá trị đa dạng kiểu gene trên từng vị trí loci
45
Bảng 3.5: Sự phân bố kiểu genes vào các nhóm tương đồng (cluster)
dựa trên các cách phối hợp loci
47
Bảng 3.6: Các cách phối hợp các loci để phân giải chủng
48
Bảng 6.1: Locus designations, PCR primer sequences of each VNTR
locus
i.1
Bảng 6.2: Điểu kiện tiến hành 16 nhóm PCR
ii.1


DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1: Cây phả hệ các chủng mycobacteria dựa trên trình tự 16S rRNA. 8
Hình 1.2: A. nhuộm Ziehl-Neelse,trực khuẩn M.tb đỏ B. nhuộm
auramine,trực khuẩn M.tb vàng-cam
11

Hình 1.3: Chromosome của M.tuberculosis H37Rv. 15
Hình 1.4: Spoligotyping. 18
Hình 1.5: IS6110-RFLP 19
Hình 1.6: Vị trí của một số loci trên nhiễm sắc thể M.tuberculosis H37Rv. 21
Hình 1.7: Kiểu mẫu IS6110 RFLP đại diện 25
Hình 1.8: Kết quả spoligotyping của (A) chủng Beijing (B) chủng Việt
Nam ST 139
25
Hình 1.9: Sơ đồ phân bố M.tb kiểu gene Beijing trên toàn thế giớ
i 26
Hình 2.1: Một ví dụ tiêu biểu cho giai đoạn khuếch đại sản phẩm. 30
Hình 2.2: Quy trình thực hiện điện di mao quản bằng máy ABI 3130xl 32
Hình 3.1: Kết quả PCR khác biệt gradient nhiệt độ bắt cặp mồi Iw-07 &
Iw-08
35
Hình 3.2: Kết quả chạy điện di gradient nồng độ MgCl
2
Iw-01, Iw-02 36
Hình 3.3: Biểu diễn thang đo ROX với các nấc thang dao động từ 50 bp –
1000 bp
37
Hình 3.4: Biểu diễn mẫu với 3 sản phẩm PCR được nhuộm 3 loại dye: xanh
dương (FAM), xanh lá cây (HEX), đen (NED). X: hỗn hợp primer dimer
37
Hình 3.5: Đồ thị biểu diễn sự phân bố genotypes vào các cluster dựa trên
các loại dâu ấn sinh học
39
Hình 3.6: Cây biểu diễn mối tương quan giữa 93 chủng bằng VNTR –
MIRU trên 18 loci
49

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ
AFB (Acid-fast bacilli): sự hiện diện của Mycobacteria khi xét nghiệm đàm hoặc các
mẫu bệnh phẩm khác trên kính hiển vi
CD4: cluster of differentiation 4
Fucsin: thuốc nhuộm tổng hợp xanh đen, dùng để nhuộm vi khuẩn lao
MIRU (Mycobacterial Interspersed Repetitive Units): những đơn vị lặp lại phân tán ở
các vị trí khác nhau trên bộ gene vi khuẩn lao
M.tb, M.tuberculosis: Mycobacterium tuberculosis
MDR: multidrug-resistance, lao đa kháng thuốc, kháng với ít nhất isoniazid và rifampicin
Kết quả kháng sinh đồ FS: full susceptible, nhạy với mọi kháng sinh
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) IS6110 : kỹ thuật phân tích kiểu
gen dựa trên việc đo đạc số lượng và chiều dài các đoạn DNA cắt từ bộ gen nhờ các
enzyme cắt giới hạn đặc biệt, ở đây sử dụng mẫu dò IS6110.
Thuốc điều trị lao H: Isoniazid
Thuốc điều trị lao R: Rifampicin
Thuốc điều trị lao S: Streptomycin
Thuốc điều trị lao E: Ethambutol
Thuốc điều trị lao Z: Pyrazynamide
UNAIDS: Joint United Nations Programme on HIV/AIDS
VNTR (Variable Number of Tandem Repeats): những đơn vị lặp lại lặp lại ở các vị trí
khác nhau trên bộ gene vi khuẩn lao
Ziehl-Neelsen: thuốc nhuộm hiện màu Mycobacteria. Thành phần gồm Ziehl-Neelsen
carbol fucshin, alcohol acid và methylene blue
WHO: World Health Organization


~ 1 ~

………………………………………………………………………………………………….


LỜI MỞ ĐẦU
Y văn nhân loại đã ghi nhận sự tồn tại của bệnh lao từ thời cổ đại, lịch sử
bệnh lao là lịch sử ghi lại những thách thức trong khoa học và y khoa. Bệnh lao
vẫn đang là vấn đề nhức nhối cho sức khoẻ từng cá nhân và cộng đồng. Theo
thống kê của WHO, hằng năm trên thế giới trung bình 8 triệu người bệnh lao
mới đượ
c phát hiện, trong số đó 2 đến 3 triệu người chết vì lao. Năm 1993, WHO
tuyên bố lao là vấn đề cấp bách trên toàn cầu. Cùng với HIV và sốt rét, lao là một
trong những nguồn bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất. Lao thật sự là gánh nặng y
tế ở những nước đang phát triển, nhất là trong tình hình các chủng mycobacteria
kháng thuốc trị lao ngày càng nhiều. Nhiều bệnh nhân lao mắc thêm HIV và
nhiều bệnh nhân HIV nhiễm thêm bệnh cơ hội như lao; khi số
lượng tế bào
CD4 giảm từ 500 đến 250/mm
3
, nguy cơ nhiễm lao tăng từ 10 đến 30 lần (23).
Chính tình hình cấp bách này đòi hỏi cộng đồng thế giới tìm ra chiến lược phòng
chống lao đồng bộ và hiệu quả hơn.
Bệnh lao là do vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis gây ra. Từ sự phổ biến
của một chủng lao ở Bắc Kinh (Trung Quốc), chủng lao ở New York có liên hệ
mật thiết với kháng đa thuốc, vi khuẩn lao kiểu gene Beijing đã thu hút sự chú ý
trong giới nghiên c
ứu khoa học cận lâm sàng.
Số liệu thống kê cho thấy kiểu gene Beijing (chiếm 37% trong tổng số mẫu vi
khuẩn phân lập tại Việt Nam) có thể có liên hệ với tính kháng thuốc (14), có thể là
nhân tố góp phần vào tỉ lệ kháng thuốc cao trong thời gian dài, mặc dù Chương trình
chống lao Quốc gia của Việt Nam đã được thiết lập và đưa vào hoạt động tốt từ vài

thập kỉ qua. Kiểu gene Việt Nam, một kiểu gene trong nhóm Indo-Oceanic, chi
ếm
khoảng 20% tổng số mẫu, không thể được phân biệt rạch ròi bằng các kỹ thuật định
kiểu gene đang được áp dụng ở Việt Nam hiện nay.
Kĩ thuật IS6110 – RFLP được sử dụng như kĩ thuật chuẩn định kiểu gene
M.tuberculosis, nhưng không thể phân biệt các kiểu gene trong dòng Indo-Oceanic
do bản chất những M.tb kiểu gene này có ít các bản sao IS6110. Spoligotyping là kĩ
thuật định kiểu gene nhanh,
đơn giản nhưng không thể phân biệt các chủng trong họ
~ 2 ~
………………………………………………………………………………………………….


Beijing. Như vậy cần có sự tìm tòi, áp dụng và phát triển một kĩ thuật có khả năng
phân giải tốt để phân biệt các chủng vi khuẩn lao có nguồn gốc châu Á này.
Kĩ thuật VNTR áp dụng trên 31 loci cho thấy một số dấu ấn sinh học có mức
độ đa hình cao trên quần thể Nhật Bản (tổng số mẫu trong quần thể là 235 chủng,
trong đó có 185 chủng là kiểu gene Beijing) (17), cho thấy khả năng áp dụng như
kĩ
thuật để phân tách kiểu gene trong tập hợp chủ yếu gồm họ Beijing và kiểu gene địa
phương Việt Nam.
Chiến lược lâu dài cho sự áp dụng và phát triển các kĩ thuật định kiểu gene
phân tách chủng vi khuẩn lao có nguồn gốc châu Á: Trên 450 mẫu lâm sàng đã thu
nhận được tại Tp Hồ Chí Minh, kĩ thuật VNTR – MIRU trên 31 loci được tối ưu hoá
các điều kiện thí nghiệm như nhiệt độ bắt cặp, n
ồng độ mồi… Từ những thông tin đó,
nhận diện những loci mang tính đa hình cao và áp dụng lên tập hợp mẫu lớn thu thập
từ Chương trình chống lao Quốc gia được thu nhận theo chiến lược phân tầng rồi bốc
ngẫu nhiên, rút ra 100 mẫu tiêu biểu đại diện toàn bộ tập hợp mẫu cho dự án giải toàn
bộ bộ gene.

Mục tiêu đề tài
Một phần trong chiến lược lâu dài đó, phạ
m vi luận văn để giải quyết việc áp
dụng kĩ thuật VNTR - MIRU với 31 loci trên 95 mẫu đại diện đầu tiên trong tập hợp
mẫu thu nhận được tại Tp HCM để hoàn thiện phương pháp trong điều kiện áp dụng
phòng thí nghiệm tại địa phương, loại bỏ những loci không có tính đa dạng, tìm kiếm
những loci cho thông tin ổn định mà vẫn mang tính phân biệt giữa các chủng trong
họ Beijing và Việt Nam:
-
Tiến hành tối ưu hoá 31 PCR với các bộ mồi gắn màu
- Điều chỉnh các điều kiện điện di mao quản trên hệ thống máy DNA
analyzer Applied Biosystems Inc. 3130xl
- Thiết lập qui trình xử lí thông tin bằng phần mềm GeneMapper v3.0
- Phân tích độ tương đồng kiểu gene giữa các chủng bằng phần mềm
BioNumerics v4.0 (Applied Maths, Belgium)
~ 3 ~
………………………………………………………………………………………………….


- Đánh giá độ đa dạng allele trên từng vị trí loci theo chỉ tiêu PIC, khả năng
phân biệt các chủng theo chỉ tiêu HGI bằng các cách phối hợp loci khác
nhau.
- Kết luận những loci, những cách kết hợp loci nào đủ khả năng để phát triển
nghiên cứu trên một diện mẫu lớn hơn, có tính đại diện và đa dạng cao hơn
Tính cấp thiết, ý nghĩa lí luận, và thực tiễn của đề tài
Kế
t quả nghiên cứu này đóng góp vào quá trình tìm hiểu sinh bệnh học phân
tử và cơ chế gây độc do vi khuẩn lao M.tuberculosis. Trước đây vài thập kỉ người ta
cho rằng vi khuẩn lao rất đồng nhất về mặt di truyền học, những kết quả phân tích
kiểu gene bằng phương pháp VNTR – MIRU cho thấy việc phân biệt kiểu gene M.tb

là vấn đề hoàn toàn khả thi. Nghiên cứu tại phòng thí nghiệm sinh học phân tử bệnh
viện lao và bệ
nh phổi Phạm Ngọc Thạch cho thấy mối liên hệ giữa tính kháng thuốc
và sự nhiễm phổ biến ở các thanh niên 15-24 tuổi(8). Việc áp dụng phương pháp định
kiểu gene sẽ giúp phân tách các nhóm nhỏ có thể có mối liên hệ nhân quả với những
độc tính này, tạo thuận lợi cho các nghiên cứu cơ bản xa hơn. Các chủng vi khuẩn lao
thường được nhắc đến như BCG (chủng được sử dụng làm ra vaccine), H37Rv
(chủng vi khu
ẩn lao thường được dùng như chủng chứng trong phòng thí nghiệm)
đều có kiểu gene nguồn gốc châu Âu. Trong khi đó, các M.tb kiểu gene Beijing gần
đây cho thấy có mối liên hệ với độc tính cao lại có kiểu gene nguồn gốc châu Á. Việc
phân giải tốt M.tb kiểu gene Beijing là nền tảng cho việc hiểu rõ đáp ứng vaccine với
việc ngăn ngừa nhiễm các loại kiểu gene gây bệnh khác nhau. Bên cạnh đó, các
nghiên cứu sự tươ
ng tác giữa kiểu gene vật chủ và kiểu gene tác nhân gây bệnh đòi
hỏi độ phân giải chi tiết kiểu gene M.tb nhờ phương pháp VNTR - MIRU.
~ 4 ~
………………………………………………………………………………………………….


1. Tổng quan tài liệu
1.1. Bệnh lao
1.1.1. Bệnh lao xét ở mức độ toàn cầu và ở Việt Nam
1.1.1.1. Gánh nặng bệnh lao trên thế giới
Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới WHO năm 2009 (35), hiện nay lao đang
là bệnh có tỷ lệ mắc phải và tỷ lệ tử vong cao, cả thế giới có khoảng 1,9 tỷ
người nhiễm lao (1/3 dân số thế giới), mỗi năm có thêm 8-9 triệu ng
ười nhiễm
lao, tương đương tỷ lệ 139/100,000 dân, 14,4 triệu người bệnh lao cũ và mới lưu
hành và 1,7 triệu người chết do lao, trong đó 0,2 triệu người nhiễm HIV. 0,5 triệu

trường hợp mắc lao kháng đa thuốc. Số người bệnh lao chủ yếu tập trung ở các
nước Ấn Độ, Trung Quốc, Indonesia, Nam phi và Nigeria. Số người chết do lao
ở các nước đang phát triển chiếm đến 98% tổng số người chế
t vì lao trên thế
giới. Đặc biệt 80% trong số tử vong đó là trong lứa tuổi lao động, nguồn nhân
lực chính sản xuất ra của cải vật chất cho xã hội (15-50 tuổi). Theo dự đoán của
các nhà khoa học, trong 20 năm tới 200 triệu người có nguy cơ phát bệnh nếu vẫn
giữ điều kiện sống như hiện nay.
1.1.1.2. Gánh nặng bệnh lao ở Việt Nam
Theo WHO 2009, Việt Nam đứng thứ 12 trong 22 qu
ốc gia có tỷ lệ lao cao trên
thế giới
Dân số 86,2 triệu dân
Tỷ lệ người bệnh lao mới các thể 173/100,000 dân
Tỷ lệ người bệnh lao phổi AFB+ mới 77/100,000 dân
Tỷ lệ hiện mắc các thể 225/100,000 dân
Tỷ lệ tử vong do lao 23/100,000 dân
Tỷ lệ người bệnh lao mới nhiễm HIV 5,0%
Tỷ lệ kháng đa thuốc ở người bệnh lao mới 2,7%
Tỷ lệ kháng đa thuốc ở ng
ười bệnh lao đã điều trị 19%


~ 5 ~
………………………………………………………………………………………………….


1.1.2. Phân loại bệnh lao (7)
Năm 1882 Robert Koch xác định tác nhân gây bệnh lao là
Mycobacterium tuberculosis. Trong tất cả các thể lao, lao phổi là thể lao phổ biến

nhất (chiếm 80 – 85%) và là nguồn lây bệnh lao cho người xung quanh.
Hiện nay phần lớn bệnh nhân lao có thể được chữa trị khỏi. Tuy nhiên, vấn
đề của bệnh lao là không được chẩn đoán kịp thời. Xét nghiệm chuẩn để phát hiện
nhiễm vi khuẩn lao là nuôi cấy vi khuẩn lao trong phòng thí nghiệm từ mẫu bệ
nh
phẩm; tuy nhiên, phương pháp này mất hàng tuần có khi hàng tháng nếu nuôi cấy
trên môi trường thạch đặc. Các phương pháp nuôi cấy lỏng hiện đại đã có thể
khẳng định kết quả chẩn đoán trong vòng 1-2 tuần. Hiện nay, phương pháp nhanh
nhất để phát hiện vi khuẩn lao là phương pháp soi đờm, nhuộm Ziel-Neelsen, có
thể trả kết quả trong vòng vài giờ. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi tải lượng
vi khuẩn lao cao, ít nhất khoảng 10 000 tế bào/mL mẫu
đờm, trong đó hơn 50 %
bệnh nhân âm tính mẫu đờm đã cho kết quả dương tính nuôi cấy.
1.1.2.1. Lao phổi AFB(+) : một ca lao bệnh phổi AFB (+) được xác định phải
thoả mãn một trong ba tiêu chuẩn sau:
- Tối thiểu có 2 tiêu bản AFB (+) từ 2 mẫu đờm khác nhau
- Một tiêu bản đờm AFB (+) và có hình ảnh trên phim Xquang phổi nghĩ đến
lao tiến triển
- Một tiêu bản đờm AFB (+) và nuôi cấy dương tính.
Riêng đố
i với người bệnh HIV(+) chỉ cần có ít nhất một tiêu bản xét nghiệm đờm
AFB(+) được coi là lao phổi AFB(+).
1.1.2.2. Lao phổi AFB (-): một ca lao bệnh phổi AFB (-) phải thoả mãn một
trong hai tiêu chuẩn sau:
- Kết quả xét nghiệm đờm AFB âm tính ít nhất 6 mẫu đờm khác nhau qua 2
lần khám cách nhau khoảng 2 tuần, có tổn thương nghi lao tiến triển trên phim
Xquang phổi và được bác sỹ chuyên khoa tuyến tỉnh chẩn đoán.
- Kết quả xét nghiệm đờm AFB âm tính nhưng nuôi cấy dương tính.
~ 6 ~
………………………………………………………………………………………………….

Riêng đối với người bệnh HIV(+) chỉ cần ≥ 2 tiêu bản đờm AFB(-), điều trị
kháng sinh phổ rộng không thuyên giảm, có hình ảnh Xquang phổi nghi lao và
bác sỹ chuyên khoa lao quyết định được coi là Lao phổi AFB (-).
1.1.2.3. Lao ngoài phổi
Bệnh nhân có các dấu hiệu lâm sàng, cận lâm sàng nghi lao ở các cơ quan
tương ứng, và một trong các điều kiện sau:
- Có kết quả nuôi cấy dương tính từ bệnh phẩm tổn thươ
ng cơ quan tương
ứng
- Có kết quả chẩn đoán mô tế bào bệnh thuộc các cơ quan tương ứng
- Có chẩn đoán từ các thầy thuốc chuyên khoa tuyến tỉnh
* Các yếu tố ảnh hưởng đến sự biểu hiện các triệu chứng lâm sàng ở bệnh lao (2):
- yếu tố cơ địa: tuổi tác, tình trạng miễn dịch (tình trạng suy giảm miễn dịch,
suy dinh dưỡng, yếu tố
di truyền), đồng nhiễm những bệnh khác, chủng ngừa
BCG (bacillus Calmette-Guérin)
- yếu tố vi sinh vật: độc lực của vi sinh vật, sự tấn công vào các mô, cơ
quan chuyên biệt
- tương tác vật chủ-vi sinh vật: vị trí xảy ra tương tác, mức độ nghiêm trọng
của
bệnh
1.1.3. Phân loại và đặc điểm vi khuẩn lao
1.1.3.1. Phân loại (20)
Mycobacteria nằm trong số những vi khuẩn gây bệnh ở người được nghiên cứu
đầ
u tiên. Chúng có mối liên hệ mật thiết với nhóm trực khuẩn Gram-dương bao
gồm bộ Corynebacterium (bao gồm tác nhân gây bệnh C.diphtheriae), Nocardia
(bao gồm tác nhân gây bệnh cơ hội N.asteroides) và Streptomyces.

Tên Mycobacterium lần đầu tiên xuất hiện vào năm 1896, chỉ bao gồm 2 chủng –
M.tuberculosis và M.leprae. Sau đó các chủng khác được định danh, trong đó một
số ít được biết đến như là tác nhân gây bệnh, đặc biệt M.avium, M.intracellulare,
M.kansasii, M.marium, và M.ulcerans có thể
gây bệnh trên người. Ngoài nhóm
tác nhân M.tuberculosis và M.leprae, hầu hết các tác nhân gây bệnh cơ hội khác
~ 7 ~
………………………………………………………………………………………………….


hiếm khi gây bệnh trên người có hệ miễn dịch bình thường. Nhóm vi khuẩn đặc
biệt quan trọng là nhóm M.avium-intracellulare có thể gây bệnh ở bệnh nhân
AIDS.
Bảng 1.1: Một số vi khuẩn mycobacteria có liên hệ với bệnh
Nhóm vi sinh vật Bệnh ở người
M.tuberculosis
M.leprae
M.avium -
intracellulare
M.scrofulaceum
M.kansasii
M.chelonae
M.fortuitum
M.simiae
M.xenopi
M.ulcerans
M.marium
C.diphtheria
M.asteroids
Bệnh lao

Bệnh phong hủi
Nhiễm trùng phổi, viêm hạch bạch huyết cổ tử cung , nhiễm trùng lan
tỏa ở bệnh nhân AIDS
Viêm h
ạch cổ tử cung
Bệnh phổi mãn tính, viêm hạch bạch huyết cổ tử cung, bệnh về da
Nhiễm trùng hậu phẫu; nhiễm trùng da và mô mềm
Nhiễm trùng hậu phẫu; nhiễm trùng da và mô mềm
Nhiễm trùng phổi
Nhiễm trùng phổi
Buruli ulcer
Bệnh về da
Bệnh bạch hầu
Nhiễm trùng phổi
Mycobacteria có thể chia thành 2 nhóm chính tuỳ thuộc vào tốc độ tăng trưởng
trong phòng thí nghiệm in vitro:
• Tăng trưởng nhanh, có thể t
ạo khuẩn lạc nhìn thấy bằng mắt thường trong 2-4
ngày
• Tăng trưởng chậm, có thể cần 10 ngày hoặc lâu hơn nữa để tạo khuẩn lạc có
thể nhìn thấy bằng mắt thường
Tốc độ tăng trưởng chỉ là một đặc điểm; có những đặc điểm khác để phân biệt 2
nhóm này, ví dụ hầu hết các chủng tăng trưởng nhanh có 2 bộ gene mã hoá RNA
củ
a ribosome, trong khi các chủng tăng trưởng chậm chỉ có 1. Các tác nhân gây
bệnh thường thuộc nhóm tăng trưởng chậm.
~ 8 ~
………………………………………………………………………………………………….

Hình 1.1: Cây phả hệ các chủng mycobacteria dựa trên trình tự 16S rRNA.
(25)
Sự phân chia thành mycobacteria tăng trưởng nhanh hay chậm phản ánh lịch
sử tiến hoá của chúng. Nhánh tận cùng bằng một vòng tròn là gốc gắn vào cây
phả hệ lớn hơn.

Sự tăng trưởng chậm của M.tuberculosis khiến cho nghiên cứu sinh học cơ bản về
M.tuberculosis phát triển chậm. Nhiều nghiên cứu vì vậy chỉ tiến hành trên các
chủng tăng trưởng nhanh, vớ
i giả thuyết rằng chúng có những đặc điểm tương tự
Tăng trưởng nhanh Tăng trưởng chậm
~ 9 ~
………………………………………………………………………………………………….


M.tuberculosis giúp cho sự hiểu biết của chúng ta tăng lên nhanh chóng. Chủng
thường được nghiên cứu là M.smegmatis, và sau đó áp dụng vào M.tuberculosis.
Bảng 1.2: Phức hợp M.tuberculosis và các đối tượng mắc bệnh liên quan
M.tuberculosis
M.africanum
M.canetii
M.microti
M.bovis

M.pinnipedii
Bệnh lao ở người
Bệnh lao ở người (hiếm gặp, chủ yếu ở châu Phi)
Bệnh lao ở người (hiếm)
Bệnh lao ở gặm nhấm (không gây bệnh cho người)

Bệnh lao ở các độ
ng vật hữu nhũ, bao gồm gia súc, người, dê,
trâu, mèo, heo, chó…
Bệnh lao ở hải cẩu, chuột thí nghiệm guinea pigs, thỏ, người,
và gia súc
*M.microti thường được xem là không gây bệnh và trước đây sử dụng trong điều
chế vaccine. Tuy nhiên, xác định kiểu gene cho thấy đôi khi chúng gây bệnh trên
người.
Các nghiên cứu mức độ phân tử đã chứng minh sự khác biệt trong di truyền của
các chủng M.tuberculosis tồn tại ở các vùng khác nhau trên thế gi
ới và có giả
thuyết cho rằng các vi khuẩn lao cổ xưa đã tiến hoá thành các chủng hiện đại với
độc tính tăng cường. Hiện nay nhiều nghiên cứu đang được tiến hành để tìm hiểu
sự khác biệt này và nhận dạng nhân tố gây độc để hỗ trợ việc thiết kế vaccine và
tìm kiếm thuốc điều trị.
Trên phương diện lâm sàng, nhóm vi khuẩn lao gây bệnh cho người được chia
làm 2 loại: vi khu
ẩn lao điển hình Mycobacterium tuberculosis và vi khuẩn lao
không điển hình (non-tuberculous mycobacteria), có thể có tên khác bao gồm
MOTT (mycobacteria other than tubercle) và mycobacteria trong môi trường. Nếu
xét về hình thái học, đặc điểm lâm sàng, dấu hiệu X-quang, dấu hiệu mô học thì
2 nhóm này không có gì khác nhau rõ rệt. Tuy nhiên, hai nhóm vi khuẩn lao
này lại khác nhau đáng kể khi đề cập về tình trạng nhiễm trùng, sinh hoá, sinh
học phân tử, sự nhạy cảm với thuốc điều trị lao, khả năng gây bệnh, đáp ứng
điều
trị hiệu quả của điều trị dự phòng.
~ 10 ~
………………………………………………………………………………………………….

Hiện nay, chủng vi khuẩn lao được các nhà di truyền học phân loại như sau: [the
Comprehensive Microbial Resource webpage - />scripts/CMR/CmrHomePage.cgi ]
Giới Vi khuẩn
Ngành Actinobacteria
Lớp Actinobacteridae
Bộ Actinomycetales
Họ Corynebacterineae
Chi Mycobacteriaceae
Loài
Mycobacterium tuberculosis
1.1.3.2. Các đặc điểm sinh học cơ bản của mycobacteria (20)
Mycobacteria thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, mặc dù chúng nhuộm màu yếu
vì cấu trúc thành tế bào đặc biệt. Chúng hiếu khí, không sinh bào tử và không di
động. Mycobacteria không có plasmid, nhiều mycobacteriophage đã được phân
lập.
M.tb là trực khuẩn dài 3-5 μm, ngang 0,3-0,5 μm, không có lông mao, hai
đầu
tròn, có tính chất kháng cồn kháng toan. Trên tiêu bản nhuộm bằng phương
pháp Ziehl-Neelsen, các AFB bắt màu đỏ fuchsin, phân bố thành cụm hoặc
đứng riêng rẽ (hình 1.2 A,B,C).
Không chỉ như các vi khuẩn khác có peptidoglycan ở vách tế bào, vách vi khuẩn
kháng cồn kháng toan Mycobacterium chứa nhiều glycolipid, đặc biệt là các
mycolic acid. Phía ngoài màng sinh chất, vách M.tb gồm lớp peptidoglycan
gắn với arabinogalactan (D-arabinose và D-galactose) và kết hợp với các mycolic
acid. Lớp arabinogalactan/mycolic acid nằm dưới lớp polypeptide và các mycolic
acid gồm lipid tự do, các glycolipid, và các peptidoglycolipid. Các glycolipid
gồm lipoarabinomannan (LAM) và phosphatidyinositol mannoside (PIM)
(hình 1.2 D). Các peptidoglycan, mycolic acid và glycolipid ngăn cản hoá chất
thấm qua vách, vì vậy làm cho vi sinh vật sinh sản chậm và dễ kháng thuốc, khó
bị thực bào tiêu diệt hơn các vi khuẩn khác.

~ 11 ~
………………………………………………………………………………………………….



Hình 1.2: A. nhuộm Ziehl-Neelse,trực khuẩn M.tb đỏ B. nhuộm
auramine,trực khuẩn M.tb vàng-cam C. M.tb qua kính hiển vi điện tử D. Lớp vỏ
của vi khuẩn kháng cồn kháng toan
Phân tử mycolic acid và phân đoạn peptidoglycan gắn với các thụ thể đặc hiệu
trên bề mặt đại thực bào vật chủ, làm cho đại thực bào tiết ra các cytokine như
tumor necrosis factor-alpha
(TNF-α)
gây phản ứng viêm tiêu diệt M.tb.
Điều kiện sống của vi khuẩn lao (20)
Ở điều kiện bình thường vi khuẩn lao sinh sản chậm (trung bình 20-24
giờ/chu kì). Vi khuẩn nằm ở vùng tổn thương có khi hàng tháng không bị chết,
khi gặp điều kiện thuận lợi chúng lại phát triển. Cách sinh sản của vi khuẩn
thông thường là phân đôi tế bào, nhưng M.tb có thể sinh sản theo kiểu bào tử
giống như

nấm.

Trong không khí, khi không có các yếu tố bất lợi, vi khuẩn có thể tồn tại 3-4
tháng. Trong phòng thí nghiệm vi khuẩn có thể được bảo quản trong nhiều năm ở
-70
o
C. Dưới ánh nắng mặt trời vi khuẩn chết sau 1,5 giờ. Khi chiếu tia cực tím
chúng chỉ tồn tại được 2-3 phút. Ở 42
o
C, vi khuẩn ngừng phát triển và chết sau 10

phút ở 80
o
C. Đàm của bệnh nhân lao sau 3 tháng trong phòng tối, ẩm vẫn còn vi
~ 12 ~
………………………………………………………………………………………………….


khuẩn tồn tại và giữ được độc lực, đun sôi đàm trong 5 phút M.tb chết, với cồn
90
o
C vi khuẩn tồn tại được 3 phút, trong acid phenic 5% vi khuẩn chết ngay sau 1
phút.
Để vi khuẩn lao có thể phát triển thuận lợi, trong điều kiện phòng thí nghiệm, môi
trường nuôi cấy phải giàu chất dinh dưỡng như môi trường Lowenstein-Jensen.
Bên cạnh đó, M.tb phát triển tốt nhất ở môi trường có pH 6,2-7,2, chúng cũng có
thể phát triển được trong môi trường pH acid 5,5, kiềm 8,0. Vi khuẩn lao có thể
phát triển ở 29-42
o
C (thuận lợi nhất là 37-38
o
C). Sau khi nuôi cấy 4-6 tuần trong
môi trường LJ có thể quan sát được khuẩn lạc.
Cơ chế M.tb xâm nhập và gây bệnh (18)
Vi khuẩn lao tồn tại trong các hạt khí dung nhỏ lơ lửng ngoài không khí. Khi
được hít vào, vi khuẩn sẽ đi vào phổi, đến phế nang. Tại đây, vi khuẩn sẽ nhân
lên hoặc bị ức chế tuỳ thuộc vào tình trạng hệ thống miễn dịch của cơ thể.
Trong vòng 2-10 tuần, các đại thực bào
được hoạt hoá, bao quanh vi khuẩn tạo
nên lớp vỏ cứng giúp kềm hãm và kiểm soát vi khuẩn (giai đoạn lao nhiễm).
Nếu hệ thống miễn dịch của cơ thể không thể kiểm soát được vi khuẩn, vi

khuẩn sẽ nhân lên nhanh chóng và có thể theo đường máu và đường bạch huyết
tấn công vào các bộ phận khác nhau như phổi, thận, não, xương (giai đoạn lao
bệnh).
Trong lao màng não, trực khuẩn lao theo đường máu đến màng não. Sau giai
đoạ
n tiềm tàng, yên lặng trong nhiều tuần, nhiều tháng hoặc nhiều năm, trực
khuẩn lao phát triển thành các hạt lao, củ lao. Khi có kích thích như kích thích
do chấn thương, tình trạng miễn dịch thay đổi, trực khuẩn lao và các kháng
nguyên chứa trong các củ lao được giải phóng vào các khoang màng não gây
bệnh.
Các yếu tố của M.tb độc tính đối với vật chủ (18)
Mycobacterium tuberculosis không có các độc tố thường thấy như ở các vi
khuẩn khác như chất độc, v
ỏ ngoài (capsules fimbriae). Tuy nhiên, nhiều đặc
điểm về cấu trúc, sinh lý của loại vi khuẩn này biểu hiện độc tính vi khuẩn và khả
~ 13 ~
………………………………………………………………………………………………….


năng sinh bệnh lao.
M.tb có cơ chế đặc biệt để tấn công vào tế bào. Trực khuẩn lao có thể gắn
trực tiếp vào thụ thể mannose trên đại thực bào nhờ glycolipid đã được
mannose hoá trên vách (cell wall-associated mannosylated glycolipid), LAM
(lipoarabinomannan), hay gắn gián tiếp nhờ thụ thể bổ thể, thụ thể Fc. Thông
thường khi vật lạ bị đại thực bào bắt giữ sẽ bị cơ chế thực bào qua trung gian
chất oxy hoá tiêu diệt.
M.tb biến đổi cơ chế gây độc này, ngăn cản sự kết hợp
phagosome với lysosome. Vách Mycobacterium có loại mycolic acid là lipid
chuyên biệt nhánh alpha, những phân tử kị nước mạnh, hình thành lớp vỏ lipid
bao quanh vi sinh vật , ảnh hưởng đến khả năng thấm vật chất qua bề mặt tế

bào. Cho đến nay người ta cho rằng mycolic acid là nhân tố chính quyết định
độc tính của M.tb, có thể nhờ đó mycobacteria tránh được các protein tích
điệ
n dương, lysozyme và các gốc tự do trong các hốc thực bào, giúp
mycobacteria ngoại bào thoát khỏi sự tấn công của các bổ thể trong huyết thanh.
Một trong những sản phẩm liên kết mycolic acid với các chất lipid phức tạp là
cord factor - yếu tố gây độc đối với tế bào động vật hữu nhũ. Chủng M.tb
độc tính sinh ra rất nhiều nhân tố thừng này (Cord factor).
Yếu tố quyết định khả năng M.tb lây truyền (18)
Về
mặt dịch tễ học, những bệnh nhân lao phổi khác nhau thì khả năng lây
bệnh cho người khác cũng khác nhau, tùy thuộc vào
- số lượng vi sinh vật thoát ra ngoài môi trường
- mật độ vi sinh vật trong không khí
- thời gian vật chủ phơi nhiễm không khí đã bị ô nhiễm
- tình trạng miễn dịch của từng cá thể như ở bệnh nhân nhiễm HIV và
những bệnh nhân rối loạn miễn dịch qua trung gian tế bào thì bệnh càng
trầ
m trọng khi bị nhiễm M.tb. Tuy vậy khả năng lan truyền bệnh của những
bệnh nhân này không cao.
Những lợi điểm giúp M.tb gây bệnh rất phức tạp và chưa được hiểu đầy đủ.
Các bằng chứng thực nghiệm cho thấy các chủng vi khuẩn có độc tính khác
~ 14 ~
………………………………………………………………………………………………….


nhau, đột biến trên những gen nhất định đã ảnh hưởng đến độc tính của vi
khuẩn. Người ta vẫn chưa biết liệu có những chủng nào dễ gây bệnh đối với hệ
thống thần kinh trung ương hay không. Arvanitakis và cộng sự (6) nghiên cứu
kết quả RFLP của một nhóm bệnh nhân lao ở hệ thống thần kinh trung ương,

trong đó lao màng não chiếm đa số do một chủng gây bệnh chiếm
ưu thế, tuy
nhiên cơ chế vi khuẩn lao gây bệnh ở hệ thần kinh vẫn chưa được hiểu rõ.
Đồng nhiễm lao và HIV (Human Immunodeficiency Virus)
Tỷ lệ bệnh nhân nhiễm HIV đang ngày càng gia tăng, đến năm 1996 đã có
khoảng 1,5 triệu người chết mỗi năm vì HIV trên toàn cầu, đến năm 1999 đã có
khoảng 30 triệu người nhiễm. Bên cạnh đó, theo UNAIDS, tại TPHCM, những
người nhiễm lao ngày càng có khuynh hướng nhiễm HIV, trong năm 1997 số

bệnh nhân lao nhiễm HIV là 0,9%, nhưng đến năm 2002, tỷ lệ này tăng đến
9,4%. Tỷ lệ chữa trị khỏi cho những trường hợp này khoảng 50%, tỷ lệ tử vong
cao hơn 30%. HIV và lao, hai tác nhân truyền nhiễm này tương tác với nhau
dẫn đến những kết quả đáng quan tâm về mặt sinh bệnh học, lâm sàng và dịch
tễ.
Cơ thể vật chủ đáp ứng với M.tuberculosis hữ
u hiệu nhờ miễn dịch qua trung
gian tế bào, nhưng cũng chính loại đáp ứng miễn dịch này bị HIV làm biến đổi
nhiều nhất vì tế bào chủ của HIV là tế bào CD4 và đại thực bào. Khả năng cơ
thể phản ứng kháng sự tiến triển lao trong giai đoạn sơ nhiễm hay sự tái hoạt
động của vi khuẩn nhiễm tiềm tàng tương xứng với mức độ ứ
c chế miễn dịch liên
quan đến nhiễm HIV. Khi bệnh nhân đồng nhiễm HIV-1 tiến trình M.tb xâm
nhiễm cũng bị biến đổi. Bệnh nhân nhiễm HIV-1 tăng nguy cơ nhiễm M.tb từ
bên ngoài gấp 20 lần, khả năng M.tb tiềm tàng trỗi dậy tăng cao, dễ mắc lao
ngoài phổi (24).
Vi khuẩn lao và virus HIV có tác dụng tăng cường khả năng xâm nhiễm lẫn
nhau. HIV thúc đẩy sự phân chia và phát triển của M.tuberculosis trong c
ơ thể
vật chủ và ngược lại, có những bằng chứng cho thấy M.tuberculosis giúp HIV
nhân bản nhanh in vivo và in vitro (11).

~ 15 ~
………………………………………………………………………………………………….


1.1.4. Bộ gene vi khuẩn lao (10)
Hình 1.3: Chromosome của M.tuberculosis H37Rv.
Vòng tròn ngoài cùng biểu hiện thang cho M.tb, 0 – nơi bắt đầu sao chép. Vòng
tròn đầu tiên tính từ ngoài vào cho thấy vị trí gene RNA ổn định, trình tự DR đại
diện bằng hình khối hồng. Vòng tròn thứ 2 bên trong chỉ trình tự mã hoá (theo
chiều kim đồng hồ - xanh lá đậm, ngược chiều kim đồng hồ - xanh lá nhạt). Vòng
tròn thứ 3 minh họa trình tự DNA lặp (trình tự chèn – cam, họ 13E12 REP –
hồng đậm, prophage – xanh dương), vòng tròn thứ 4 chỉ vị trí họ PPE (xanh
lá), vòng tròn thứ 5 chỉ họ PE (tím, ngo
ại trừ PGRS), và vòng tròn thứ 6 chỉ vị
trí trình tự PGRS (đỏ sậm). Biểu đồ tròn khu vực trung tâm biểu hiện lượng GC,
màu vàng chỉ ít hơn 65% GC, khu vực màu đỏ là GC cao hơn 65%.
1.1.4.1. Cấu trúc bộ gene vi khuẩn lao
Từ năm 1998, nhờ Cole và cộng sự (10), toàn bộ trình tự của Mycobacterium
tuberculosis chủng H37Rv đã được giải mã và phân tích, cung cấp những kiến
thức sinh học về loài vi khuẩn sinh sản chậm này, mở ra những khái niệm m
ới
trong can thiệp phòng và điều trị bệnh. Toàn bộ bộ gene gồm 4 411 529 bp chứa
khoảng 4000 gen, với tỷ lệ GC cao khoảng 65%. Điểm khác cơ bản trong bộ gene
~ 16 ~
………………………………………………………………………………………………….


giữa M.tuberculosis với những vi sinh vật khác là phần lớn các gene mã hoá
những enzyme có liên quan đến việc tổng hợp và phân giải lipid, có 2 họ protein
mới (PE và PPE) giàu glycine với cấu trúc lặp lại.

M.tuberculosis thường kháng ngẫu nhiên với nhiều thuốc làm cho việc điều trị lao
trở nên khó khăn. Sự kháng thuốc này chủ yếu là do vách tế bào kỵ nước tác dụng
như là rào cản thấm, tuy vậy nhiều yếu tố quyết định s
ự kháng thuốc được mã hóa
trong bộ gene vi khuẩn như là enzyme thủy phân, enzyme biến đổi tác dụng của
thuốc như β- lactamases, aminoglycoside acetyl transferases, và nhiều hệ thống
vận chuyển thuốc ra khác.
Các nghiên cứu cho thấy phức hợp M.tuberculosis có bộ gene bảo tồn cao. Các
thành viên trong họ M.tuberculosis có tính đa dạng cao khi xét về kiểu hình hoặc
kiểu kí chủ, đây là ví dụ điển hình cho tính ổn định di truyền giữa các chủng
(interspecies), vớ
i tốc độ đột biến vô nghĩa làm nên điểm đa hình uớc tính khoảng
0,01% - 0,03%, nhất là không có bằng chứng nào cho thấy có sự chuyển ngang
vật chất di truyền trong cùng thế hệ giữa các vi khuẩn lao như các vi khuẩn khác.
1.1.4.2. Cơ chế tiến hoá chung của vi khuẩn lao và chiến lược xuất hiện đa
dạng di truyền của vi khuẩn lao
Bộ gene vi khuẩn càng nhỏ càng chịu nhiều sức ép tiến hoá, khi nhiễm sắ
c thể
càng nhỏ, bộ gene sao chép càng nhanh, vi khuẩn có khả năng sinh trưởng nhanh
hơn và chiếm ưu thế về số lượng trong quần thể. Nếu một quần thể chuyển đến
một môi trường trong đó một loại amino acid thiết yếu có rất nhiều, một số chủng
trong quần thể vi khuẩn sau vài thế hệ sẽ mất khả năng tổng hợp amino acid đó.
Dần dà cuố
i cùng, mọi thành viên trong quần thể sẽ mất khả năng đó do mất đoạn
trình tự DNA mã hoá cho con đường chuyển hoá amino acid kể trên. Quá trình
này diễn ra rất chậm, áp lực tiến hoá đồng thời khiến cho kích thước bộ gene giảm,
và bảo vệ vi sinh vật khỏi bị tiệt chủng do sự thoái hoá của bộ gene.
Khi chủng vi khuẩn biến đổi theo đáp ứng với môi trường, chúng tuân theo cơ chế
cơ chế
phân tử: (i) đột biến trong giai đoạn tăng trưởng, (ii) đột biến trong giai

đoạn ổn định. Khi tế bào đang tăng trưởng gặp sự thay đổi từ môi trường, chúng
~ 17 ~
………………………………………………………………………………………………….


vẫn đủ khả năng biến dưỡng để tạo đáp ứng bù (nghĩa là tăng cường độ dịch mã
và đột biến). Tuy nhiên, sau 4-5 ngay nếu không có nguồn năng lượng hỗ trợ từ
bên ngoài, các đột biến không chuyên biệt trong tế bào cũng sẽ tăng, sản sinh ra
một chủng vi khuẩn mới để tồn tại. Tốc độ đột biến có thể bị ảnh hưởng bởi mộ
t
số các yếu tố khác như nhân tố oxy hoá, tia UV, hoạt động của các enzyme sửa
sai trong sao chép DNA, các biếtn số bị ảnh hưởng do môi trường thiếu thốn
(chẳng hạn nguồn nucleotide). Một nghiên cứu khảo sát 26 gene cấu trúc của 842
mẫu M.tuberculosis, cho thấy hơn 95% sự thay thế nucleotide do sự thay thế
amino acid trong các gene liên hệ tính kháng thuốc.
Phân tích khác biệt kiểu di truyền, hay chính là định kiểu gene, được sử dụng để
theo dõi các chủng vi khuẩn lao khác nhau, để
thu thập thông tin liên quan đến
hình thái phát tán, nhiễm và sinh bệnh. Tốc độ thay đổi ở mức phân tử rất khác
nhau giữa các nhân tố như những dấu ấn sinh học này, tuỳ thuộc vào sự quan sát
trong thời gian ngắn hay dài. Một dấu ấn sinh học với tốc độ thay đổi nhanh có
thể để định xem một trường hợp nhiễm lao có phải là do sự hoạt hoá trở lại của vi
khuẩn lao tồn tại trong ngườ
i từ lâu. Mặt khác, một dấu ấn sinh học thay đổi với
tốc độ chậm có thể dùng để tìm hiểu sự tiến hoá trải qua thời kì hàng chục ngàn
năm. Tốc độ tiến hoá dựa trên khoảng cách tương đồng di truyền thường xét trên
sự thay đổi trình tự nội bộ trong một gene chuyên biệt, những thay đổi này ảnh
hưởng khác nhau lên các vùng DNA khác nhau,nên rất khó để định chính xác tốc
độ tiến hoá.
1.2. Các kĩ

thuật sinh học phân tử xác định kiểu gene vi khuẩn lao
1.2.1. Các kĩ thuật sinh học phân tử phổ biến hiện nay trong tình hình nghiên
cứu tại Việt Nam (12)
Các phương pháp định kiểu gene được phát triển để nghiên cứu sự lan truyền và
động học quần thể vi khuẩn (5) trong các điều kiện lâm sàng và sinh thái, không
chỉ xét trên phương diện tồn tại trong một vật chủ mà còn xét đến toàn bộ hệ sinh
thái toàn cầu nói chung.