Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin phòng bệnh tay chân miệng EV71 ở quy mô phòng thí nghiệm

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ Y TẾ

CHƯƠNG TRÌNH KHCN TRỌNG ĐIỂM CẤP NHÀ NƯỚC KC.10/11-15
“ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ TIÊN TIẾN
PHỤC VỤ BẢO VỆ CHĂM SÓC SỨC KHỎE CỘNG ĐỒNG”

BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VẮC XIN
PHÒNG BỆNH TAY CHÂN MIỆNG EV71 Ở QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM
MÃ SỐ: KC.10.TN08/11-15

Chủ nhiệm đề tài: Cơ quan chủ trì đề tài:





ThS. Vũ Hồng Nga GS. TSKH. Nguyễn Thu Vân
Ban chủ nhiệm chương trình Bộ Khoa học và Công nghệ

Hà Nội - 2012


MỤC LỤC


NỘI DUNG
Trang
MỞ ĐẦU
1
CHƯƠNG 1-TỔNG QUAN
3
1.1.VIRÚT ĐƯỜNG RUỘT TYP 71
3
1.1.1. Phân loại
4
1.1.2. Hình thái học
4
1.1.3. Axít nucleic và protein của virút
6
1.1.4. Tính chất hóa học
7
1.1.5. Kháng nguyên
8
1.1.6. Sự nhân lên của EV71
8
1.2. BỆNH TAY CHÂN MIỆNG DO EV71
10
1.2.1. Đường lây truyền

10
1.2.2. Đặc điểm lâm sàng
11
1.3. CHẨN ĐOÁN PHÒNG THÍ NGHIỆM
13
1.4. DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ
14
1.4.1. Kiểu gen và đặc điểm lưu hành chung của EV71
14
1.4.2. Dịch tễ học bệnh ở Việt Nam
17
1.5. NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN VẮCXIN PHÒNG BỆNH
TAY CHÂN MIỆNG EV71
19
1.5.1. Các vắcxin EV71 dự tuyển
19


1.5.2. Công nghệ sản xuất vắcxin tiềm năng
23
1.6. TẾ BÀO SỬ DỤNG TRONG SẢN XUẤT VẮCXIN
24
1.6.1. Yêu cầu chất lượng của tế bào sử dụng sản xuất vắcxin
24
1.6.2. Dòng tế bào thường trực Vero
26
1.7. CHỦNG GIỐNG VIRÚT SỬ DỤNG TRONG
SẢN XUẤT VẮCXIN
29
1.8. QUY TRÌNH SẢN XUẤT VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

VẮCXIN PHÒNG EV71 TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO
30
1.8.1. Quy trình sản xuất vắcxin EV71 trên nuôi cấy tế bào
30
1.8.2. Kiểm tra chất lượng vắcxin EV71 trên nuôi cấy tế bào
32
CHƯƠNG 2-VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
35
2.1. THIẾT LẬP HỆ THỐNG CHỦNG EV71 GIỐNG GỐC
VÀ GIỐNG SẢN XUẤT
35
2.1.1.Nuôi cấy tế bào vero sử dụng trong sản xuất chủng giống
và vắcxin
35
2.1.2. Kiểm tra chất lượng tế bào Vero
35
2.1.2.1. Thử nghiệm vô khuẩn
35
2.1.2.2. Thử nghiệm kiểm tra Mycoplasma
38
2.1.2.3. Thử nghiệm kiểm tra các virut ngoại lai trên tế bào
40
2.1.2.4. Thử nghiệm kiểm tra các virút hấp phụ hồng cầu
41
2.1.3. Sản xuất chủng EV71 giống gốc và giống sản xuất
42
2.1.4. Kiểm tra chất lượng chủng giống gốc và chủng sản xuất

43

2.1.4.1. Thử nghiệm kiểm tra các virút ngoại lai trên
động vật thí nghiệm
43
2.1.4.2. Thử nghiệm chuẩn độ hiệu giá virút TCID50
45
2.1.4.3. Thử nghiệm kiểm tra tính ổn định di truyền
46
2.1.4.4. Thử nghiệm kiểm tra vi khuẩn lao
51
2.1.4.5. Thử nghiệm kiểm tra virút viêm gan A
53
2.1.4.6. Thử nghiệm kiểm tra virút viêm gan B
54
2.1.4.7. Thử nghiệm kiểm tra virút viêm gan C
56
2.1.4.8. Xác định nhận dạng EV71 bằng phương pháp
hiển vi điện tử
56
2.2. QUY TRÌNH SẢN XUẤT VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG
VẮCXIN EV71 TRÊN TẾ BÀO VERO
57
2.2.1. Quy trình sản xuất vắcxin EV71 trên tế bào Vero
57
2.2.1.1. Gây nhiễm và nuôi cấy virut
57
2.2.1.2. Thu hoạch và tinh sạch virut.
58
2.2.1.3. Cô đặc, bất hoạt, tinh chế virút, pha bán thành phẩm
cuối cùng

59
2.2.2. Kiểm tra chất lượng trong quá trình sản xuất
59
2.2.2.1. Thử nghiệm ELISA định lượng EV71
60
2.2.2.2. Phát hiện ADN tồn dư bằng phương pháp lai điểm
61
2.2.2.3. Thử nghiệm kiểm tra hiệu quả bất hoạt trên tế bào
65
2.2.3. Kiểm tra chất lượng văcxin thành phẩm
66
2.2.3.1. Phương pháp kiểm tra an toàn chung
66


2.2.3.2. Phương pháp kiểm tra chất gây sốt
68
2.2.3.3. Phương pháp kiểm tra công hiệu
70
2.2.3.4. Phương pháp xác định hàm lượng protein tổng số
73
2.2.3.5. Phương pháp xác định pH
74
2.2.3.6. Phương pháp định lượng Thimerosal
75
2.2.3.7. Phương pháp định lượng nhôm
77
2.2.3.8. Phương pháp định lượng Formaldehyde tồn dư
79
2.2.3.9. Kiểm tra tính chất vật lý

81
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
82
3.1. XÂY DỰNG HỆ THỐNG CHỦNG GIỐNG EV71
CHO SẢN XUẤT VẮCXIN
82
3.1.1. Nguồn gốc chủng EV71
83
3.1.2. Tế bào sử dụng sản xuất hệ chủng giống EV71
84
3.1.2.1. Tế bào Vero sản xuất chủng EV71 giống gốc
và giống sản xuất
84
3.1.2.2. Kiểm tra tế bào Vero sử dụng cho sản xuất chủng EV71
giống gốc và giống sản xuất
85
3.1.3. Quy trình sản xuất chủng EV71 giống gốc (Master seed lot)
86
3.1.4. Quy trình sản xuất chủng EV71 giống sản xuất
(Working seed lot)
87
3.1.5. Kết quả xây dựng hệ thống chủng giống EV71
88
3.1.5.1. Kết quả sản xuất hệ chủng giống EV71
88
3.1.5.2. Hình ảnh chủng EV71 trên kính hiển vi điện tử
88


3.1.5.3. Tính ổn định di truyền của chủng gốc giống (MSV),

chủng giống sản xuất (WSV)
89
3.1.5.4. Kết quả kiểm tra các tác nhân ngoại lai trong hỗn dịch
chủng giống gốc và chủng giống sản xuất.
91
3.1.5.5. Kết quả đáp ứng miễn dịch trên chuột nhắt thí nghiệm
94
3.2. XÂY DỰNG QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT
VẮCXIN PHÒNG BỆNH TAY CHÂN MIỆNG EV71 Ở QUY
MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM.
97
3.2.1. QUY TRÌNH NUÔI CẤY VÀ CHUẨN BỊ TẾ BÀO VERO
99
3.2.1.1. Môi trường nuôi cấy tế bào
99
3.2.1.2. Nhiệt độ và thời gian nuôi cấy tế bào
101
3.2.2. QUY TRÌNH GÂY NHIỄM EV71 VÀO TẾ BÀO VERO
102
3.2.2.1. Môi trường và nhiệt độ nuôi cấy virút
102
3.2.2.2. Xác định liều gây nhiễm và thời gian gian nhân lên
thích hợp của EV71 trên tế bào Vero
103
3.2.3. QUY TRÌNH NUÔI CẤY VÀ THU HOẠCH VIRÚT
105
3.2.3.1. Kết quả nuôi cấy EV71 theo thời điểm thay môi trường
duy trì tế bào
105
3.2.3.2. Kết quả nuôi cấy EV71 trên các dạng chai nuôi cấy

107
3.2.4. QUY TRÌNH TINH SẠCH HỖN DỊCH VIRÚT
108
3.2.5. QUY TRÌNH BẤT HOẠT VIRÚT
109
3.2.6. QUY TRÌNH CÔ ĐẶC HỖN DỊCH VIRÚT
111
3.2.7. QUY TRÌNH TINH CHẾ VIRÚT
112


3.2.7.1. Loại ADN tồn dư
112
3.2.7.2. Siêu ly tâm
114
3.2.8. QUY TRÌNH PHA BÁN THÀNH PHẨM CUỐI CÙNG
117
3.2.9. QUY TRÌNH SẢN XUẤT VẮCXIN THÀNH PHẨM
118
3.3. SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM VẮCXIN EV71 Ở QUY MÔ
PHÒNG THÍ NGHIỆM
118
3.3.1. Kết quả nuôi cấy và chuẩn bị tế bào Vero
119
3.3.2. Kết quả gây nhiễm EV71 vào tế bào Vero
119
3.3.3. Kết quả nuôi cấy, thu hoạch và tinh sạch virút
120
3.3.4. Kết quả bất hoạt virút
120

3.3.5. Kết quả cô đặc hỗn dịch virút
121
3.3.6. Kết quả tinh chế virút
121
3.3.7. Kết quả pha bán thành phẩm cuối cùng và sản xuất
vắcxin thành phẩm
122
3.3.8. Kết quả chất lượng vắcxin thành phẩm tại cơ sở
123
3.3.9. Xây dựng quy trình kiểm tra chất lượng cho vắcxin EV71
trên nuôi cấy tế bào Vero
124
3.3.10. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho vắc xin EV71 trên nuôi cấy
tế bào Vero
125
3.4. ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN VÀ TÍNH SINH MIỄN
DỊCH CỦA VẮCXIN TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM
126
3.4.1. Tính an toàn của vắcxin EV71 trên động vật thí nghiệm

126


3.4.2. Tính sinh miễn dịch của vắcxin EV71 trên động vật
thực nghiệm
127
KẾT LUẬN
128
KIẾN NGHỊ
130

TÀI LIỆU THAM KHẢO
131
PHỤ LỤC





DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ATTC
Ngân hàng tế bào của Mỹ (American type culture
collection)
ADN
Axít desoxyribonucleic (Desoxyribonucleic acid)
ARN
Axít ribonucleic (Ribonucleic acid)
CPE
Hủy hoại tế bào (Cytopathetic Effect)
CT Scan
Chụp cắt lớp vi tính (Computed Tomography scan)
ELISA
Thử nghiệm miễn dịch gắn enzym (Enzyme-Linked
ImmunoSorbent Assay)
EV71
Virút đường ruột typ 71(Enterovirus 71)
FBS
Huyết thanh bê bào thai (Fetal Bovin serum)
IgA
Imuno globulin A

IgG
Imuno globulin G
IgM
Imuno globulin M
GMT
Hiệu giá trung bình nhân (Geometric Mean Titer)
MCB
Ngân hàng tế bào giống gốc (Master Cell Bank)
MEM
Môi trường dinh dưỡng tối thiểu (Minimum Essential
medium)
MOI
Liều gây nhiễm (Multiplicity of Infection)
MRC5
Dòng tế bào nguyên bào sợi phổi người lưỡng bội (Human
diploid lung fibroblasts)


MSV
Chủng virút giống gốc (Master seed virus)
MRI
Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic resonance
imaging)
OD
Mật độ quang (Optical density)
PBS
Đệm muối phốt phát (Phosphate-buffered Saline)
PBS-T
Đệm muối phốt phát Tween (Phosphate-buffered Saline-
Tween)

PCR
Phản ứng khuyếch đại gen (Polymerase chain reaction)
RK
Tế bào thận thỏ (Rabbit Kidney)
RT-PCR
Reverse transcription polymerase chain reaction
SDS-PAGE
Điện di trên gel acrylamide (Sodium dodecyl sulfate
polyacrylamide gel electrophoresis)
TBE
Tris-Borate-EDTA
TCID
50
Liều gây nhiễm 50% tế bào (Tissue Culture Infectious Dose
50)
TCYTTG
Tổ chức y tế thế giới (WHO)
VABIOTECH
Công ty TNHH MTV Vắcxin và Sinh phẩm số 1
VVSDT
Viện Vệ sinh dịch tễ Trung Ương
Vero
Tế bào thận khỉ xanh châu Phi
VLP
Virus like particle
WCB
Ngân hàng tế bào sản xuất (Working cell bank)
WSV
Chủng virút giống sản xuất ( Working seed virus)

DANH MỤC CÁC BẢNG


Bảng số
Tên bảng
Trang
1.1.
Các loài thuộc chi Enterovirus
4
1.2.
Phân bố kiểu gen EV71 trên thế giời từ năm 1997-2010
15
1.3.
Thống kê số ca mắc và tử vong do EV71 khu vực Châu
Á từ 1997-2009
16
1.4.
Kết quả phân tích các typ virút gây bệnh tay chân
miệng năm 2011 tại Việt Nam
18
1.5.
Một số vắcxin EV71 bất hoạt toàn hạt virút dự tuyển
đang tiến hành thử nghiệm lâm sàng
21
2.1.
Công thức cho một phản ứng RT-PCR/EV71
48
2.2.

Công thức cho một phản ứng PCR giải trình tự
49
2.3.
Công thức cho một phản ứng PCR/Lao
53
2.4.
Công thức cho một phản ứng PCR/HAV (Vòng 2)
54
2.5.
Công thức cho một phản ứng PCR/HBV (Vòng 1)
55
2.6.
Công thức cho một phản ứng PCR/HBV (Vòng 2)
55
2.7.
Công thức cho một phản ứng PCR/HCV (Vòng 2)
56
2.8.
Tiêu chuẩn đánh giá chất gây sốt
70
3.1.
Đặc điểm chủng 0822 phân lập từ bệnh nhân Việt Nam
sử dụng trong nghiên cứu sản xuất vắcxin phòng bệnh
tay chân miệng EV71

83


3.2.
Tế bào Vero sản xuất chủng EV71 giống gốc và giống

sản xuất
84
3.3.
Kết quả kiểm tra vô khuẩn, Mycoplasma trong tế bào
Vero sử dụng cho sản xuất chủng giống gốc và chủng
giống sản xuất
85
3.4.
Kết quả kiểm tra tác nhân ngoại lai trên nuôi cấy tế bào
85
3.5.
Kết quả sản xuất chủng giống gốc và chủng giống sản
xuất
88
3.6.
Kết quả kiểm tra vô khuẩn, Mycoplasma trong hỗn dịch
chủng giống gốc và chủng giống sản xuất
91
3.7.
Kết quả kiểm tra các tác nhân ngoại lai trong hỗn dịch
chủng giống gốc và chủng giống sản xuất bằng phương
pháp PCR
92
3.8.
Kết quả kiểm tra tác nhân ngoại lai trên nuôi cấy tế bào
92
3.9.
Kiểm tra tác nhân ngoại lai trên chuột lang thí nghiệm
93
3.10.

Kiểm tra tác nhân ngoại lai trên chuột nhắt trắng
thí nghiệm
93
3.11.
Kiểm tra an toàn trên chuột ổ thí nghiệm
94
3.12.
Hiệu giá kháng thể trung hòa kháng nguyên EV71/C4
95
3.13.
Hiệu giá kháng thể trung hòa kháng nguyên EV71/C5
95
3.14.
Hiệu giá kháng thể trung hòa kháng nguyên EV71/B5
96
3.15.
Kết quả nuôi cấy tế bào Vero trong môi trường MEM
với các nồng độ huyết thanh bào thai bê (FBS)

100


3.16.
Kết quả gây nhiễm EV71 ở nồng độ virút 1; 0.1; 0.01;
0.001 MOI tại các thời điểm gặt 24; 36; 48; 60h
104
3.17.
Kết quả nuôi cấy EV7 theo thời điểm thay môi trường
và không thay môi trường nuôi cấy
106

3.18.
Kết quả nuôi cấy EV71trên các dạng chai nuôi cấy khác
nhau
107
3.19.
Kết quả tinh sạch hỗn dịch EV71 sử dụng các loại màng
lọc
108
3.20.
Kết quả bất hoạt formalin 1:2000 ở nhiệt độ 2°C-8°C và
nhiệt độ 36,5 °C ± 0,5°C
109
3.21.
Hiệu giá kháng nguyên trước và sau 14 ngày bất hoạt ở
nhiệt độ 2°C-8°C và nhiệt độ 36,5 ± 0,5°C
110
3.22.
Kết quả cô đặc hỗn dịch EV71 sử dụng các loại màng
siêu lọc khác nhau
111
3.23.
Hàm lượng ADN tế bào Vero tại các điều kiện phản
ứng của enzym khác nhau
113
3.24.
Hiệu giá kháng thể trung hòa sau khi tiêm cho chuột
các liều khác nhau
117
3.25.
Kết quả so sánh tính sinh miễn dịch của văcxin có và

không có chất hấp phụ nhôm
118
3.26.
Kết quả nuôi cấy tế bào Vero của các loạt sản xuất thử
nghiệm
119
3.27.
Kết quả gây nhiễm EV71 của các loạt sản xuất thử
nghiệm
120


3.28.
Kết quả thu hoạch và tinh sạch hỗn dịch virút của các
loạt sản xuất thử nghiệm
120
3.29.
Kết quả bất hoạt virút của các loạt sản xuất thử nghiệm
121
3.30.
Kết quả cô đặc hỗn dịch virút của các loạt sản xuất thử
nghiệm
121
3.31.
Kết quả tinh chế virút của các loạt sản xuất thử nghiệm
122
3.32.
Kết quả pha bán thành phẩm và sản xuất vắcxin thành
phẩm của các loạt sản xuất thử nghiệm
122

3.33.
Kết quả kiểm tra chất lượng vắcxin thành phẩm tại cơ
sở của các loạt sản xuất thử nghiệm vắcxin EV71 trên
nuôi cấy tế bào Vero
123
3.34.
Tiêu chuẩn cơ sở cho vắcxin EV71 trên nuôi cấy tế bào
Vero
125
3.35.
Kết quả an toàn chung của vắcxin EV71 trên động vật
thí nghiệm
126
3.36.
Kết quả kiểm tra chất gây sốt của vắcxin EV71
126
3.37.
Kết quả kiểm tra tính sinh miễn dịch
127



DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ


Hình số
Tên hình
Trang
1.1.
Hình ảnh virút đường ruột typ 71 dưới kính hiển vi điện

tử
3
1.2.
Cấu trúc virút đường ruột
5
1.3.
Cấu trúc di truyền virút đường ruột và các sản phẩm
6
1.4.
Phân bố số mắc, tử vong do bệnh tay chân miệng năm
2011-2012 theo tháng
18
2.1.
Sơ đồ phiển phản ứng trung hòa vi lượng
72
3.1.
Quy trình sản xuất chủng EV71 giống gốc
86
3.2.
Quy trình sản xuất chủng EV71 giống sản xuất
87
3.3.
Hình ảnh virút đường ruột typ 71. Hỗn hợp miễn dịch
kháng thể đơn dòng kháng VP1-EV71 gắn các hạt vàng
bao quanh hạt EV71
89
3.4.
Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR sau tinh sạch được
tổng hợp từ cặp mồi đặc hiệu vùng VP1 - EV71
89

3.5.
Sự tương đồng về trình tự axít amin của các chủng
EV71 gốc, MSV, WSV và chủng vắcxin
90
3.6.
Tóm tắt quy trình công nghệ sản xuất vắcxin phòng
bệnh tay chân miệng EV71 ở quy mô phòng thí nghiệm
98
3.7.
Đồ thị tăng trưởng của tế bào nuôi cấy trong môi trường
MEM 5% FBS và MEM 10% FBS
101


3.8.
Hiệu giá virút ở các môi trường DMEM, MEM, LH3E,
M199 ở nhiệt độ nuôi cấy 35°C và 37°C
103
3.9.
Xác định hàm lượng ADN tồn dư trong mẫu trước và
sau tinh chế của loạt sản xuất thử nghiệm
113
3.10.
Kết quả siêu ly tâm tinh chế EV71
115
3.11.
Hình ảnh điện di trên gel SDS-PAGE
115
3.12.
Hình ảnh hiển vi điện tử các hạt EV71 sau tinh chế

116



1


MỞ ĐẦU

Vi rút đường ruột typ 71 (EV71) là một trong những căn nguyên gây ra
các vụ dịch tay chân miệng trên toàn thế giới. Khác với Coxsakie A16 thường
chỉ gây các bệnh cảnh lâm sàng nhẹ của bệnh tay chân miệng như sốt, ban
ngoài da, nổi mụn phỏng loét trợt ở miệng, tay, chân, EV71 thường gây thêm
các bệnh cảnh về thần kinh cấp tính bao gồm liệt mềm giống với bại liệt, viêm
não, viêm màng não vô khuẩn, phù phổi. Các bệnh do EV71 gây ra thường để
lại các di chứng về thần kinh nghiêm trọng và có tỷ lệ tử vong cao.
Những năm gần đây các vụ dịch tay chân miệng nghiêm trọng bùng
phát trên quy mô lớn với nhiều trường hợp biến chứng thần kinh và tử vong
thường xảy ra tại Việt Nam và các nước trong khu vực châu Á - Thái Bình
Dương. Số ca mắc và tử vong do EV71 tăng nhanh và diễn biến bệnh ngày
càng phức tạp tại Việt Nam đang là vấn đề y tế nổi trội gây ảnh hưởng đến
sức khỏe và tổn thất về kinh tế. Bệnh xẩy ra quanh năm và lưu hành ở hầu
khắp các địa phương trên cả nước. Đến nay chưa có thuốc kháng virút hay
vắcxin hiệu quả nào được sử dụng để điều trị và phòng bệnh tay chân miệng
EV71. Một số các vắcxin EV71 dự tuyển trên thế giới đang trong giai đoạn
thử nghiệm lâm sàng tuy nhiên hiện vẫn chưa vắcxin nào được cấp phép lưu
hành, do đó việc phát triển vắcxin EV71 tại Việt Nam được ưu tiên hàng đầu
để có thể giảm giá thành, chủ động trong công tác phòng chống dịch bệnh và
bảo vệ sức khỏe cộng đồng

2

Do tính trầm trọng của bệnh và khả năng bùng phát dịch lớn của virút
EV71do tính cấp thiết về sản xuất vắcxin phòng bệnh tay chân miệng EV71,
chúng tôi tiến hành đề tài với 3 mục tiêu:
1. Xây dựng được hệ thống chủng giống cho sản xuất vắcxin phòng
bệnh tay chân miệng EV71 tại Việt Nam.
2. Xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất vắcxin phòng bệnh
tay chân miệng EV71 trên nuôi cấy tế bào Vero ở qui mô phòng thí nghiệm.
3. Đánh giá một số đặc tính về mặt an toàn và đáp ứng miễn dịch của
vắcxin phòng bệnh tay chân miệng EV71 trên động vật thí nghiệm.





3

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN

1.1. VIRÚT ĐƯỜNG RUỘT TYP 71
Virút đường ruột typ 71 (EV71) được phát hiện lần đầu tiên tại
California, Mỹ vào năm 1969 sau đó được xác định có liên quan đến bệnh tay
chân miệng vào năm 1974. Chủng virút được phân lập từ não của một bé trai
năm tuổi tử vong do viêm não [1].


Hình 1.1: Hình ảnh virút đường ruột typ 71 dưới kính hiển vi điện tử.

1.1.1. Phân loại
Virút đường ruột typ 71 thuộc nhóm vi rút đường ruột typ huyết thanh
A, là thành viên thuộc chi các virút đường ruột, họ Picornaviridae.
Họ Picornaviridae được chia thành 12 chi: Enterovirus, Cardiovirus,
Aphthovirus, Hepatovirus, Parechovirus, Erbovirus, Koburirus, Teschovirus,
Sapelovirus, Senecavirus, Tremovirus, Avihepatovirus.
Chi Enterovirus bao gồm 10 loài [25].
4

Bảng 1.1: Các loài thuộc chi Enterovirus [25].
TT
Loài (Tên cũ)
Loài (Tên mới)
1
Human enterovirus A
Enterovirus A
2
Human enterovirus B
Enterovirus B
3
Human enterovirus C
Enterovirus C
4
Human enterovirus D
Enterovirus D
5
Bovine enterovirus
Enterovirus E
6
Porcine enterovirus B

Enterovirus G
7
Simian enterovirus A
Enterovirus H
8
Human rhinovirus A
Rhinovirus A
9
Human rhinovirus B
Rhinovirus B
10
Human rhinovirus C
Rhinovirus C
Enterovirus A bao gồm 22 typ huyết thanh: coxsackievirus A2 (CV-
A2), CV-A3, CV-A4, CV-A5, CV-A6, CV-A7, CV-A8, CV-A10, CV-A12,
CV-A14, CV-A16, enterovirus A71 (EV-A71), EV-A76, EV-A89, EV-A90,
EV-A91, EV-114 và simian enteroviruses EV-A92, SV19, SV43, SV46 và
A13.
1.1.2. Hình thái học
Điển hình của một loại virút Picornaviridae, EV71 là một virút nhỏ
không có vỏ ngoài, đường kính khoảng 27 - 28nm, tốc độ lắng 156S , tỉ trọng
của virút là 1,33g/cm
3
trong CsCl.
Cấu trúc đặc trưng của virút trong nhóm này có 20 mặt, tuy nhiên virút
có hình cầu ở độ phóng đại thấp hơn. Bao bọc xung quanh ARN là vỏ capsit,
có tác dụng bảo vệ genom chứa mã di truyền.
Capsit bao gồm 60 tiểu thể được cấu tạo từ VP1, VP2, VP3 và VP4
(Hình 2). Mỗi protein VP1, VP2, VP3 gồm khoảng 270 axit amin, cấu trúc
bậc hai của chuỗi axít amin này sắp xếp theo kiểu bản  8 chuỗi phản song

5

song với liên kết jelly-roll tạo thành protein bề mặt của virút [18]. VP4 chỉ
gồm khoảng 70 axit amin và nằm sâu phía trong vỏ capsit [5].
Protein bề mặt VP1, VP2, VP3 quyết định khả năng hấp phụ của virút
lên bề mặt tế bào thông qua các thụ thể đặc hiệu [19]. Sự liên kết của các
protein trên capsit tạo ra hình dạng không gian 3 chiều đặc trưng rất quan
trọng cho khả năng sinh miễn dịch.
Một protomer gồm có 3 protein VP0, VP1, VP3 được sắp xếp cùng
nhau và năm protomer tạo thành một pentamer. Mười hai pentamer tạo thành
một procapsit. Hạt virút lây nhiễm VP0 tách thành VP4 và VP2.


Hình 1.2: Cấu trúc virút đường ruột [40].


6

1.1.3. Axít nucleic và protein của virút
Giống như các virút đường ruột, vật liệu di truyền của EV71 là ARN
đơn, dương, bao gồm khoảng 7500 nucleotit không kể đuôi poly A.

Hình 1.3: Cấu trúc di truyền virút đường ruột và các sản phẩm.
Vùng không mã hóa nằm ở đầu 5’, protein VPg gắn với đầu 5’ bằng
liên kết đồng hóa trị. Cấu trúc bậc hai của vùng không mã hóa đầu 5’ rất quan
trọng tạo thành điểm vào bên trong ribosom (IRES) điều khiển dịch mã
polyprotein virút. Vùng không mã hóa nằm ở đầu 3’ gắn với chuỗi poly A.
Vùng mã hóa là khung đọc mở lớn duy nhất chịu trách nhiệm mã hóa
7

polyprotein virút gồm khoảng hơn 2000 axit amin. Polyprotein có thể chia
thành 3 vùng (P1, P2, P3); mỗi vùng được phân cắt thành các protein nhỏ hơn
(như 1A, 1B, 1C và 1D). Protein capsit VP1 (1D), VP2 (1B), VP3 (1C), (và
có lẽ VP4 , 1A), được vùng P1 mã hóa. Các protein không cấu trúc được mã
hóa bởi vùng P2 và P3. Các protein này gồm một nucleosit triphosphataza
(2C) có hoạt tính helicaza; VPg (3A) có thể giữ vai trò tổng hợp ARN mới;
một proteaza đặc hiệu virút (3C); một ARN polymeraza phụ thuộc ARN (3D).
Sự phân giải của lypoprotein được điều khiển hoàn toàn bởi 3C [35].
Lipit
Virút đường ruột typ 71 là loại virút trần không có vỏ lipit. Do đó nó
không bị tác động bởi trichlorotrifluoroethane, dicholorodifluoromethane,
chloroform, cồn, ether 20% [19].
1.1.4. Tính chất hóa học
EV71 cũng như các virút đường ruột ổn định ở 4C và bị bất hoạt ở
nhiệt độ trên 56C. EV71 tăng tính chịu nhiệt khi có mặt MgCl
2
1M. Virút có
thể giữ ở nhiệt độ từ - 20C; - 80C; nitơ lỏng (-196C) trong nhiều năm và
vẫn còn hoạt tính sau khi đông khô ít nhất 1 tháng độ ẩm 42%. Do không có
vỏ lipit nên các enterovirus đều ổn định trong môi trường của ký chủ như khi
tiếp xúc với dịch axit dạ dày, bền vững với pH 3-10 và virút có thể tồn tại
nhiều ngày trong nhiệt độ phòng. EV71 và các enterovirus đều được tìm thấy
trong nước kể cả nước ngầm và suối nước nóng [11], [22]. Các virút đề kháng
với các chất hòa tan hữu cơ như ether và chloroform, cồn. EV71 bị bất hoạt
khi sấy ướt (121C, 20 phút); tia cực tím (197 W/cm
2
); formalin (tỉ lệ
1:4000) [19]. Một nghiên cứu cho thấy EV71 cũng bị tác động bởi chất khử
virút [9].
8

1.1.5. Kháng nguyên
Tính kháng nguyên của EV71 cũng như của virút Polio phụ thuộc vào
cấu hình của nó. Hạt virút có tính kháng nguyên cao, nhưng nếu hạt virút bị
phân tách thì tính kháng nguyên của nó trở nên thấp. Tính kháng nguyên
trung hòa của polypeptit tạo thành hạt virút cũng thấp. Tính kháng nguyên của
hạt virút toàn vẹn bằng tính kháng nguyên của một hạt rỗng.
Việc cấy truyền liên tục virút qua các môi trường nuôi cấy tế bào có
kháng thể đơn dòng trung hòa sẽ tạo ra một virút đột biến kháng lại sự trung
hòa này. Sự thay thế không đồng nhất trong chuỗi bazơ của gen P1 trong biến
dị kháng trung hòa được gọi là vị trí kháng nguyên trung hòa. Các vị trí như
vậy đã được tìm thấy ở VP1và VP2. Hai péptit tổng hợp SP55 và SP70 có chứa
các axit amin 163-177 và 208-222 nằm trong vùng VP1 được gây miễn dịch trên chuột
đã tạo được kháng thể đơn dòng 22A12 có hoạt tính trung hòa EV71 [19],
[26].
1.1.6. Sự nhân lên của EV71
Giống như các virút đường ruột khác, chu trình nhân lên của EV71
cũng tương tự như chu trình nhân lên của virút Polio [15]. Sự xâm nhập của
virút vào tế bào cảm thụ phụ thuộc vào các thụ thể đặc hiệu. Một số thụ thể
đặc hiệu của EV71 đã được phát hiện trên tế bào bạch cầu, tế bào hệ tiêu hóa,
hệ hô hấp và tế bào đuôi gai [33], [53], [54], [57].
Khi virút đường ruột gắn vào thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào, một
loạt các thay đổi cấu trúc xảy ra trên vỏ capsit của virút và tạo thành một lỗ
trên màng tế bào. ARN của virút thoát khỏi vỏ capsit xâm nhập vào tế bào
chất của tế bào vật chủ. Do vật liệu di truyền là ARN đơn dương nên ARN
của virút mẹ được dùng trực tiếp làm ARN thông tin để dịch mã thành một
tiền polypeptit lớn. Sau đó, proteaza 2A và 3C phân cắt tiền polypeptit thành
11 protein cấu trúc và không cấu trúc. Các protein này sẽ tham gia vào quá
trình sao chép ARN của virút. Virút sao chép nhờ emzym ARN- polymeraza
9

phụ thuộc ARN, emzym này hoạt động không chính xác như polymeraza phụ
thuộc ADN và không có khả năng đọc sửa nên có tần số đột biến rất cao.
Vùng gen VP là yếu tố quan trọng quyết định đặc tính kháng nguyên nên bất
kỳ sự thay đổi nào trên vùng VP1 cũng làm thay đổi độc lực của virút [27],
[43].
Quá trình tổng hợp, protein của tế bào vật chủ bị ức chế do tác động
của enzym Proteaza 2A trong khi tổng hợp protein của virút vẫn không bị ảnh
hưởng. Quá trình lắp ghép genom với protein để tạo thành hạt virút mới xảy
ra trong tế bào chất của tế bào. Đầu tiên là tạo protomer gồm VP0, VP1 và
VP3. Năm protomer tạo thành một pentamer, mười hai pentamer tạo thành
một procapsit, chứa 60 protomer. ARN kết hợp với vỏ capsit tạo provirion
(tiền hạt virút). Khi VP0 phân cắt thành VP2 và VP4 thì provirion trở thành
hạt virút hoàn chỉnh. Các hạt virút mới phá vỡ tế bào vật chủ và thoát ra
ngoài, tiếp tục lây nhiễm vào các tế bào khác.
Quá trình dịch mã phụ thuộc vào IRES, phối hợp cùng với vùng không
mã hóa đầu 3’(3’ UTR) kiểm soát chu kỳ nhân lên của virút. IRES là yếu tố
tác động đến sự hình thành cấu trúc bậc hai và bậc ba của ARN. IRES có thể
gắn kết trực tiếp các ribosome và đưa vào các vị trí bên trong ARN thông tin,
bắt đầu sự dịch mã không cần mũ. Việc khôi phục các tiểu đơn vị 40S cũng
không cần đến các tiểu đơn vị 4E của yếu tố khởi đầu trong tế bào Eukaryote
(eIF4E).
Gần đây, các nhà khoa học chứng minh các protein xuyên màng của
người là glyprotein P-selectin ligand-1 (PSGL-1), scavenger receptor class B
tuýp 2 (SCARB2) và liên kết polisacarit - axit sialic hoạt động như các thụ thể
đặc hiệu cho EV71. Đây là các yếu tố tham gia vào giai đoạn đầu của quá
trình nhiễm virút EV71 ở người. PSGL-1 là thụ thể đặc hiệu trên tế bào bạch
cầu, liên kết với selectin trên lớp nội mạc, gây nhiễm trùng bạch cầu.
SCARB2 lại là thụ thể của nhiều loại tế bào khác nhau, bao gồm cả các tế bào