Hợp tác nghiên cứu quy trình sản xuất một số chế phẩm sinh học từ tế bào gốc màng ối người

2

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ QUỐC PHÒNG

NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ
VỀ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THEO NGHỊ ĐỊNH THƯ


BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI
HỢP TÁC NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH
SẢN XUẤT MỘT SỐ CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ
TẾ BÀO GỐC MÀNG ỐI

Chủ nhiệm đề tài Cơ quan chủ trì đề tài



TS.BS. Phạm Văn Trân GS.TS. Hoàng Văn Lương
Ban chủ nhiệm chương trình Bộ Khoa học và Công nghệ






Hà Nội - 2012
3

MỤC LỤC
MỤC LỤC 1
BẢNG CHỮ VIẾT TẮT 7
DANH MỤC CÁC HÌNH 8

DANH MỤC CÁC BẢNG 11
MỞ ĐẦU 12
Luận cứ, cách tiếp cận để đạt được mục tiêu 20
NỘI DUNG KHOA HỌC ĐÃ THỰC HIỆN 22
PHẦN I: 22CƠ SỞ LÝ THUYẾT
1. Đặc điểm sinh học của màng ối người Việt Nam liên quan đến việc lựa
chọn và phân lập tế bào gốc.
22
2. Phân lập, nuôi cấy và bảo quản các tế bào gốc màng ối 27
3. Biệt hóa tế bào gốc màng ối người thành tế bào biểu bì và tế bào be ta tụy
đảo.
36
4. Xây dựng qui trình sản xuất tấm tế bào gốc màng ối 40
5. Đánh giá hiệu quả sử dụng tấm tế bào gốc màng ối trong điều trị vết
thương, vết bỏng trên động vật thực nghiệm
45
6. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở đánh giá sản phẩm sinh học tấm tế bào gốc
màng ối:
49
PHẦN II : 51ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Đặc điểm sinh học của màng ối người Việt Nam liên quan đến việc lựa
chọn và phân lập tế bào gốc.
51
2. Phân lập, nuôi cấy và bảo quản các tế bào gốc màng ối 51
3. Biệt hóa tế bào gốc màng ối người thành tế bào biểu bì và tế bào be ta tụy
đảo.
56
4. Xây dựng qui trình sản xuất tấm tế bào gốc màng ối 57
4.1. Chuẩn bị các tấm màng ối đông khô 58
4.2. Sản xuất tấm tế bào gốc màng ối 59

4

5. Đánh giá hiệu quả sử dụng tấm tế bào gốc màng ối trong điều trị vết
thương, vết bỏng trên động vật thực nghiệm
61
6. Các kỹ thuật khác. 65
6.1. Kỹ thuật RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) 65
6.2. Kỹ thuật hóa miễn dịch tế bào 66
6.3. Kỹ thuật Western blot. 67
6.4. Nhuộm Trypan blue xác định tỷ lệ tế bào sống 67
6.5. Đo sự tăng sinh của tế bào 68
PHẦN III: 70KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐÃ ĐẠT ĐƯỢC
1. Đặc điểm sinh học của màng ối người Việt Nam liên quan đến việc lựa
chọn và phân lập tế bào gốc.
70
1.1. Xác định cấu trúc biểu mô màng ối, màng nền và màng vô mạch trên
tiêu bản nhuộm HE
70
1.2. Xác định quần thể tế bào biểu mô, tế bào gốc màng ối 71
2. Kết quả phân lập, nuôi cấy và bảo quản tế bào gốc màng ối 74
2.1. Phân lập. 74
2.2. Nuôi cấy tăng sinh 75
2.3. Bảo quản và phục hồi thành công tế bào gốc màng ối 81
3. Biệt hóa tế bào gốc màng ối người thành tế bào biểu bì và tế bào beta tụy
đảo.
85
3.1. Kết quả biệt hóa tế bào gốc màng ối thành tế bào biểu bì (keratinocytes).
85
3.1.1. Kết quả nhuộm hóa miễn dịch tế bào 85
3.1.2. Kết quả RT-PCR 86

3.1.3. Kết quả western blot 87
3.2. Kết quả biệt hóa tế bào gốc màng ối thành tế bào beta 88
3.2.1. Biểu hiện của OCT-4 - dấu ấn của tế bào gốc. 90
3.2.2. Biểu hiện của Insulin - Dấu ấn tế bào gốc biệt hóa thành tế bào beta.92
5

4. Xây dựng qui trình sản xuất tấm tế bào gốc màng ối 95
4.1. Kết quả thu nhận màng ối tươi 95
4.2. Kết quả xử lý đông khô tấm màng ối 96
4.3. Kết quả thu được tấm màng ối đông khô sau xử lý bằng tia phóng xạ .97
4.4. Kết quả kiểm tra cấu trúc của màng ối đông khô 98
4.5. Lựa chọn giá đỡ phù hợp để nuôi cấy tế bào gốc màng ối. 100
4.6. Đánh giá khả năng tồn tại và phát triển của tế bào gốc trên giá đỡ bằng
hình thái, số lượng tế bào.
101
5. Đánh giá hiệu quả sử dụng tấm tế bào gốc màng ối trong điều trị vết
thương, vết bỏng trên động vật thực nghiệm
102
5.1. Diễn biến lâm sàng thỏ thực nghiệm và vết thương được ghép tấm tế bào
gốc màng ối.
102
5.1.1. Diễn biến toàn thân 103
5.1.2. Thay đổi một số chỉ số máu ngoại vi của thỏ bị bỏng trong quá trình
điều trị.
104
5.2. Diễn biến tấm tế bào gốc màng ối trên vết thương, đánh giá khả năng
tồn tại của tấm tế bào gốc màng ối.
107
5.2.1. Tình trạng vết bỏng những ngày đầu sau bỏng 107
5.2.2. Tổn thương tại chỗ vết bỏng ngày thứ 3 đến ngày thứ 7 109

5.2.3. Tổn thương tại chỗ vết bỏng ngày thứ 10-15 111
5.2.4. Tổn thương tại chỗ vết bỏng ngày thứ 16-24 113
5.2.5. Tổn thương tại chỗ vết bỏng ngày thứ 28. 115
5.2.6. Tốc độ thu hẹp diện tích vết bỏng sau điều trị ở các nhóm 118
5.4. Hình thái cấu trúc mô vùng vết thương che phủ bằng tấm tế bào gốc
màng ối.
120
5.5. Thay đổi vi khuẩn học tại vết thương ghép tấm tế bào gốc màng
ối…………… 127
5.5.1. Nhiễm khuẩn tại vết bỏng ngày thứ 3 sau điều trị 127
6

5.5.2. Nhiễm khuẩn tại vết bỏng ngày thứ 7 sau điều trị 128
5.5.3. Nhiễm khuẩn tại vết bỏng ngày thứ 14 sau điều trị 128
5.6. Tính an toàn của tấm tế bào gốc màng ối khi ghép trên vết bỏng thực
nghiệm.
129
5.6.1. Ảnh hưởng của điều trị che phủ tấm TBG màng ối vết thương bỏng
trên chỉ tiêu hóa sinh chức năng gan, thận.
129
5.6.2. Tính an toàn của tấm TBG màng ối đông khô 130
6. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở đánh giá sản phẩm sinh học tấm tế bào gốc
màng ối:
131
6.1. Yêu cầu chất lượng 131
6.1.1. Công thức: 131
6.1.2. Tiêu chuẩn nguyên liệu: 132
6.1.3. Chất lượng thành phẩm 132
6.2. Đóng gói, ghi nhãn, bảo quản. 134
KẾT LUẬN 135

KIẾN NGHỊ 137
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG ANH… ……………………….135
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 149









7

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT


AFP Alpha Feto Proteine
BMP Bone Morphogenetic Protein
CK Cytokeratin
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s medium
DMSO Dimethyl sulfoxide
FBS Fetal Bovine Serum: Huyết thanh bào thai bê
GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
HAE Human Amniotic Epithelial Cells
HAM Human Amniotic Mesenchymal Stem Cells
HLA Human Leukocyte Antigen
HNF-4 Hepatocyte Nuclear Factor -4
ICAM Intercellular Adhesion Molecule-1, CD54
MO Màng ối

NCAM Neural Cell Adhesion Molecule
Nhuộm HE Phương pháp nhuộm Hematoxilyn/Eosin
NMSL Nước muối sinh lý
Oct Octamer-binding transcription factor-4
PBS Phosphate Buffered Salin
PCAM Platelet-endothelial cell adhesion molecule
PL Plastic
RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction
SCF Stem Cell Factor
SGOT Serum Glutamat Oxaloacetat Transaminase
SGPT Serum Glutamat Pyruvat Transaminase
SMA Smooth Muscle Actin
SSEA-4 Stage-Specific Embryonic Antigen
TBG Tế bào gốc
VCAM Vascular cell adhesion molecule




8

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Sơ đồ nhau thai và vị trí màng ối 22
Hình 1.2. Sơ đồ cấu trúc màng ối . 23
Hình 1.3. Đặc tính của tế bào gốc màng ối 32
Hình 1.4. Nhuộm hóa miễn dịch tế bào gốc màng ối. 33
Hình 1.5. Hình thái và sự tăng sinh của tế bào gốc màng ối. 34
Hình 1.6. Khả năng biệt hóa của tế bào gốc màng ối. 36
Hình 2.1. Sơ đồ ly tâm với Percoll. 53

Hình 2.2. Quy trình phân lập tế bào gốc từ màng ối 56
Hình 2.3. Hệ thống máy làm đông khô các màng sinh học 58
Hình 2.4. Sơ đồ hệ thống xử lý màng ối đông khô bằng phóng xạ 59
Hình 3.1: Cấu trúc màng ối trên tiêu bản nhuộm HE. 70
Hình 3.2: Nhuộm hóa mô miễn dịch màng ối 73
Hình 3.3. Hình ảnh tế bào chụp trực tiếp trên đĩa nuôi cấy qua kính hiển
vi đối pha
76
Hình 3.4. Khả năng tăng sinh của tế bào gốc màng ối 77
Hình 3.5. Xác định đặc tính của tế bào gốc màng ối bằng kỹ thuật hóa
miễn dịch huỳnh quang.
80
Hình 3.6. Nhuộm Trypan blue xác định tỷ lệ tế bào sống 82
Hình 3.7. Hình ảnh tế bào gốc sau 24 giờ nuôi cấy 84
Hình 3.8. Hình ảnh nhuộm hóa miễn dịch OCT-4, vimentin, CK-14,
CK-19.
85
Hình 3.9: Biểu hiện ARNtt của CK-14 và CK-19. 86
Hình 3.10. Kết quả Western blot OCT-4 và CK-14. 87
Hình 3.11. Hình ảnh tế bào gốc màng ối người sau 7 ngày nuôi cấy 92
Hình 3.12: Biểu hiện ARNtt và protein của Insulin. 93
Hình 3.13. Màng ối tươi được tách từ bánh rau 96
9

Hình 3.14. Các tấm màng ối thu được sau khi xử lý qua hệ thống làm
đông khô.
97
Hình 3.15. Cấu trúc mô học của tấm màng ối 99
Hình 3.16. Hình ảnh tế bào gốc nuôi cấy trên tấm màng ối đông khô
được “làm ướt”.

101
Hình 3.17. Tốc độ tăng sinh của tế bào gốc màng ối 102
Hình 3.18. Tổn thương bỏng thực nghiệm sau khi gây bỏng. 108
Hình 3.19. Tổn thương vi thể vết bỏng ở vùng rìa tổn thương, ngày thứ
nhất sau bỏng.
109
Hình 3.20. Tổn thương bỏng ngày thứ 3 sau bỏng trên thỏ được đắp
bằng tấm tế bào gốc màng ối.
110
Hình 3.21. Tổn thương bỏng ngày thứ 3 sau bỏng trên thỏ được đắp
bằng silverin.
111
Hình 3.22. Tổn thương bỏng ngày thứ 3 sau bỏng trên thỏ được đắp
bằng nước muối sinh lý.
111
Hình 3.23. Vết bỏng ngày thứ 10 sau gây bỏng 113
Hình 3.24. Vết bỏng được ghép tấm TBG quan sát ở ngày thứ 24 sau
gây bỏng.
113
Hình 3.25. Vết bỏng được điều trị bằng silverin quan sát ở ngày thứ 24
sau gây bỏng.
114
Hình 3.26. Vết bỏng được rửa bằng NMSL quan sát ở ngày thứ 24 sau
gây bỏng.
115
Hình 3.27. Vết bỏng được điều trị ghép tấm tế bào gốc quan sát ở ngày
thứ 28 sau bỏng.
116
Hình 3.28. Vết bỏng được điều trị bằng Silverin quan sát ở ngày thứ 28
sau bỏng.

117
Hình 3.29. Vết bỏng được rửa bằng NMSL quan sát ở ngày thứ 28 sau
bỏng.
118
10

Hình 3.30. Tốc độ thu hẹp diện tích vết bỏng ngày thứ 28 sau bỏng. 119
Hình 3.31. Tổn thương vi thể vết bỏng ở vùng rìa tổn thương, ngày thứ
3 sau bỏng
122
Hình 3.32. Tổn thương vi thể vết bỏng ở vùng rìa tổn thương, ngày thứ
7 sau bỏng
124
Hình 3.33. Hình ảnh mô học tại chỗ tổn thương bỏng ngày thứ 14 sau
bỏng
127
Hình 3.34. Hình ảnh mô học mô gan và mô thận 130

11

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Khả năng sử dụng giá đỡ trong công nghệ mô 44
Bảng 2.1: Trình tự của các cặp mồi (primers) sử dụng trong đề tài nghiên
cứu
65
Bảng 3.1. Thời gian tác dụng của enzym phân cắt mô. 75
Bảng 3.2. Thay đổi trọng lượng thỏ tại các thời điểm nghiên cứu 103
Bảng 3.3. Thay đổi thân nhiệt thỏ tại các thời điểm nghiên cứu, 104
Bảng 3.4. Thay đổi số lượng hồng cầu máu ngoại vi của thỏ bỏng tại các thời
điểm nghiên cứu
104
Bảng 3.5. Thay đổi nồng độ hemoglobin trong máu ngoại vi của thỏ bỏng ở
các nhóm nghiên cứu
105
Bảng 3.6. Thay đổi số lượng bạch cầu máu ngoại vi của thỏ bỏng tại các thời
điểm nghiên cứu
106
Bảng 3.7. Tốc độ thu hẹp vết bỏng của thỏ ở các nhóm nghiên cứu 118
Bảng 3.8. Tỷ lệ nhiễm các loại vi khuẩn tại vết bỏng thỏ ngày thứ ba sau
điều trị
127
Bảng 3.9. Tỷ lệ nhiễm các loại vi khuẩn tại vết bỏng thỏ ngày thứ 7 sau điều

trị
128
Bảng 3.10. Tỷ lệ nhiễm các loại vi khuẩn tại vết bỏng thỏ ngày thứ 14 sau
điều trị
128






12

MỞ ĐẦU

Tế bào gốc là tế bào nền móng của tất cả các tế bào, mô và cơ quan
trong cơ thể, đây là những tế bào chưa biệt hoá nhưng có khả năng trở thành
các tế bào chuyên biệt và có chức năng mới tương ứng [1]. Dựa vào nguồn
gốc, các tế bào gốc được phân chia thành 4 loại đó là: Tế bào gốc phôi
(Embryonic stem cells) và tế bào mầm phôi (Embryonic germ cells), tế bào
gốc thai (Foetal stem cells), tế bào gốc trưở
ng thành (Adult stem
cells/Somatic stem cells) [2]. Dựa vào đặc tính hay mức độ biệt hoá, tế
bào gốc được chia thành : Tế bào gốc toàn năng hay tế bào gốc thủy tổ
(totipotent stem cells), tế bào gốc vạn năng (pluripotent stem cells), tế bào
gốc đa năng (multipotent stem cells), tế bào gốc đơn năng
(mono/unipotential progenitor cells) [3].
Do tế bào gốc có khả năng biệt hóa thành các tế bào chức năng khác
nhau nên đã mở ra triển vọng dùng tế bào gốc để tái tạo lại các mô, nghiên
cứu phát triển thu

ốc cũng như ứng dụng vào điều trị trên lâm sàng. Tiềm
năng ứng dụng quan trọng nhất của tế bào gốc là trị liệu tế bào gốc (stem cell
therapy). Từ tế bào gốc có thể tạo ra các loại tế bào mới, mô mới để bổ sung
hoặc thay thế cho các tế bào và mô cơ quan bị tổn thương hay mất chức
năng. Cho tới nay biện pháp hữu hiệu nhất để đ
iều trị những trường hợp này
là ghép mô, cơ quan - nhưng nhu cầu ghép mô và tạng lại cao hơn rất nhiều
so với nguồn cung cấp. Từ một loại tế bào gốc có thể biệt hoá thành nhiều
loại tế bào chuyên biệt để điều trị cho các bệnh có thoái hoá hoặc chấn
thương mất tế bào như các bệnh Alzheimer [4], chấn thương tuỷ sống, đột
quỵ não [5, 6], nhồi máu cơ tim [7, 8], tiể
u đường tuỵ và các tổn thương mô
do bệnh tiểu đường [9] bỏng và nhiều bệnh khác [10, 11]. Tuy nhiên nguồn
tế bào gốc có khó khăn về số lượng và qui trình thu thập tế bào.
13

Màng ối là một sản phẩm thường bỏ đi trong quá trình sinh nở là một
nguồn cung cấp tế bào gốc lý tưởng. Sử dụng tế bào gốc màng ối không gặp
phải những vấn đề về đạo đức, xã hội. Các tế bào gốc phân lập từ màng ối có
tính sinh miễn dịch thấp, không có khả năng ung thư hóa và có khả năng biệt
hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau [12]. Từ tháng 1 năm 2010, chúng tôi
nghiên cứu đề tài nghị định thư hợp tác với Nhật bản “Hợp tác nghiên cứu
qui trình sản xuất một số chế phẩm sinh học từ tế bào gốc màng ối người”
với mục tiêu chung và mục tiêu cụ thể sau:
1. Mục tiêu chung
- Xây dựng thành công quy trình phân lập, nuôi cấy, bảo quản và biệt
hóa tế bào gốc màng ối thành tế bào giống tế bào biểu bì da và giống tế bào
beta tụy đảo.
- Chế tạo một số sản phẩm sinh học từ tế bào gốc màng ối và bước đầu
ứng dụng trong điều trị thử nghiệm trên động vật.

2. Mục tiêu cụ thể
2.1. Xây dựng qui trình phân lập, nuôi cấy và bảo quản tế bào gốc từ
màng ối người.
2.2. Nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc màng ối người thành tế bào biểu bì
và tế bào beta tụy đảo.
2.3. Xây dựng quy trình k
ỹ thuật chế tạo một số chế phẩm sinh học từ
màng ối người: tế bào gốc màng ối và tấm tế bào gốc màng ối.
2.4. Nghiên cứu điều trị trên động vật thực nghiệm và đánh giá hiệu quả
của chế phẩm sinh học từ tế bào gốc màng ối trong điều trị bỏng da.
Tình hình nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc màng ối hiệ
n nay trên
thế giới:
Gần đây, bổ sung các phương thức trị liệu hiện nay như điều trị nội
khoa, phẫu thuật, ghép tạng và các phương tiện hỗ trợ cơ học thì y học tái tạo
14

đang được tập trung vào những thay thế tiềm năng đối với ghép các mô/tạng
phức tạp. Y học tái tạo là một lĩnh vực mới dựa trên sử dụng các tế bào gốc
để thay thế các mô và cơ quan bị tổn thương.
Các tế bào gốc màng ối đã được ứng dụng để điều trị hàng loạt bệnh lý
ở các cơ quan khác nhau như nhồi máu cơ tim, Parkinson [12-14]… Các
nghiên cứu m
ới đây trên mô hình động vật và một số thử nghiệm lâm sàng
cho thấy có thể dùng tế bào gốc màng ối để tái tạo lại mô cơ bị tổn thương
[12-14] . Các nghiên cứu theo hướng này dựa vào tính “uyển chuyển”
(plasticity) của tế bào gốc màng ối và mở ra triển vọng mới ứng dụng tế bào
gốc màng ối trong điều trị.
Cấy ghép mô cần cung cấp một số lượng lớn mô ng
ười trưởng thành.

Có thể phân lập tế bào gốc từ màng ối và biệt hóa tạo thành những mô
chuyên biệt. Như vậy từ một số lượng nhỏ tế bào có thể nuôi cấy tăng sinh
đủ để phục vụ cho cấy ghép.
Sử dụng tấm tế bào gốc màng ối người trong lĩnh vực kỹ thuật tái tạo
mô
Thông thường, cấy ghép tế bào được thực hiện bằng tiêm tế bào. Tuy
nhiên, trực tiếp tiêm tế bào phân tách khó kiểm soát kích thước của vị trí
ghép và chức năng của các tế bào biệt hóa, do đó nó không đủ để thay thế
khuyết tật bẩm sinh. Để khắc phục vấn đề này, các tấm tế bào đã được ứng
dụng. Một số tác giả sử dụng poly-N-iso - propylacrylamide (PNIPAM) như
một chất liệu che phủ bề mặt, tuy nhiên, tính độc tế bào của nó không thể
loại bỏ
hoàn toàn [15, 16]. Để phát triển tạo bề mặt môi trường mới không
độc, đáp ứng co dãn, đàn hồi theo nhiệt độ người ta có thể sử dụng protein
dạng như polymer, không bị vi khuẩn làm thối rữa [17]. Polymer có thể được
tiêm vào mô và biến mất trong vòng 2 tuần mà không để lại di chứng. Có tác
giả dùng Matrigel, một dạng sản phẩm nhân tạo tương tự như chất nền ngoại
15

bào trong tổ chức giúp cho tế bào HAE hoặc HAM có thể tồn tại, di chuyển
và tăng sinh nhanh chóng trên môi trường mới che phủ bề mặt mô ở 37
o
C
đồng thời khi giảm nhiệt độ đến 4°C, lớp phủ bề mặt của môi trường tan
chảy làm tế bào HAE hoặc HAM có thể tách ra từ bề mặt [18, 19]. Để hỗ trợ,
có tác giả sử dụng màng polyvinylidene difluoride (PVDF) [20, 21]. Các tế
bào trên tấm này có thể phục hồi được tăng sinh nhanh chóng trên bề mặt
môi trường. Trong hệ thống này, ngược lại với enzym thủy phân, chỉ có sự
tương tác giữa protein bám dính và bề mặt vậ
t liệu bị phá vỡ. Các tế bào này

như một tấm liên tục với màng protein và bám dính nguyên vẹn protein khi
nhiệt độ giảm xuống. Kỹ thuật mới về tạo tấm tế bào sẽ hữu ích trong kỹ
thuật mô cũng như trong cấy ghép tế bào.
Biệt hóa tế bào gốc màng ối thành tế bào tuyến tụy (Pancreatic β-
cells)
Đối với việc điều trị bệnh tiểu đường typ I hay cấy ghép tụ
y có thể kiểm
soát đường máu và tiến tới ngăn chặn biến chứng. Tuy nhiên, luôn bị giới
hạn bởi không đủ nguyên liệu dùng cho cấy ghép. Theo hướng khác, các tế
bào tuyến tụy được tạo ra bằng biệt hóa các tế bào gốc phôi thai. Các tế bào
ES chuột có thể biệt hóa thành tế bào sản xuất insulin, nhưng không thành tế
bào tuyến tụy trưởng thành. Kết quả của quá trình biệt hóa từ tế bào ES
thành tế bào sản xuất insulin là vi
ệc tăng biểu hiện của các dấu ấn TGF β2,
PDX-1 hoặc insulin [22, 23].
Để biệt hóa tế bào HAE thành tế bào sản xuất insulin môi trường nuôi
cấy được bổ sung nicotinamide 10 mM trong vòng 4 tuần. Khi kích thích với
nicotinamide, tế bào HAE biểu hiện ARNtt insulin in vitro, và ở mức độ in
vivo, nồng độ đường trong máu giảm về mức bình thường trên chuột gây
tiểu đường thực nghiệm bằng streptozotocin [24].
Biệt hóa tế bào gốc màng ối thành tế bào biểu bì da (keratinocytes)
16

Da động vật có vú là một tổ chức đặc biệt bao gồm những quần thể tế
bào gốc biểu bì. Chúng có khả năng tăng sinh mạnh trước khi biệt hóa thành
nhiều loại tế bào khác của biểu bì đồng thời luôn tồn tại một nhóm tế bào có
khả năng tăng sinh trên màng đáy.
Rất nhiều các sản phẩm da nhân tạo được ứng dụng trong điều trị vết
thương, vết bỏng nhưng nó vẫn không được đưa vào sử dụng thường quy vì
giá thành cao, hiệu quả điều trị thấp và đặc biệt không chứa các thành phần

phụ của da như nang lông, tuyến mồ hôi, tuyến bã Tế bào gốc dựa trên
những phát hiện của Ernest A.McCulloch và James E. Till [25], [26] là các tế
bào có khả năng tự làm mới và có thể biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác
nhau trong đó có tế bào biểu bì có thể giúp chế t
ạo da nhân tạo in vitro.
Nguồn tế bào gốc quan trọng được sử dụng trong y học tái tạo là các tế bào
gốc phôi, tế bào gốc trưởng thành và gần đây là các tế bào gốc màng ối.
Năm 1996, Bagutti và CS đã thành công trong việc biệt hóa tế bào gốc
phôi thành tế bào có biểu hiện marker của tế bào biểu bì [27]. Trên cơ sở đó,
một số tác giả đã thành công trong biệt hóa tế bào gốc màng ối thành tổ chức
giố
ng biểu bì [28].
Khả năng biệt hóa tế bào gốc màng ối thành tế bào biểu bì đem đến hy
vọng sản xuất các tế bào giống tế bào gốc da đa tiềm năng khu trú ở trung bì,
gốc lông và tuyến bã cho phép da tự làm mới lớp biểu mô phủ và các phần
phụ của chúng [29-31]. Những tế bào biểu bì có khả năng tự làm mới cao sẽ
có thể là nguốn tế bào phục vụ trong y học tái tạo đặ
c biệt trong lĩnh vực
điều trị bỏng [32, 33].
Biệt hóa tế bào gốc màng ối thành tế bào gan (Hepatocytes)
Để điều trị các bệnh gan nặng như viêm gan cấp tính và suy gan nặng
một số tác giả thực hiện cấy ghép tế bào gan. Tuy nhiên, vẫn có rất nhiều câu
hỏi về cách tiếp cận này, đặc biệt là liên quan đến người cho tế bào. Năm
17

2000, các tế bào gốc gan đã được tìm ra từ quá trình phát triển của gan chuột,
và tế bào gốc gan được đề xuất như là một nguồn tế bào cấy ghép. Các tế bào
không thuộc dòng tế bào gan có thể biệt hóa thành tế bào gan cũng đã được
đề xuất là tiềm năng có ích cho việc cấy ghép tế bào. Các nguồn tế bào từ tủy
xương cho thấy có thể biệt hóa thành tế bào gan cả ở in vivo và in vitro trên

chuột, cũng nh
ư các tế bào gốc phôi chuột [34, 35]. Ở người, tế bào gốc phôi
thai, các tế bào nguồn gốc tủy xương, và các tế bào máu dây rốn đã được thể
hiện là nguồn cho có thể cấy ghép [12]. Tuy nhiên, khả năng biệt hóa của các
tế bào gốc tủy xương thành tế bào gan thấp nên việc ứng dụng có nhiều hạn
chế.
Các tế bào HAE biểu hiện albumin, α1-antitrypsin (α1-AT), cytokeratin
18, phosphoenolpyruvate cacboxykinaza và đặc biệt là cytochrome P450.
Sau khi nuôi cấy HAE, tế
bào bắt đầu xuất hiện α-fetoprotein (α-FP),
transthyretin, tyrosine aminotransferase (TAT) và CYP-450 [12]. Ngoài ra,
albumin và glycogen được phát hiện bằng hóa miễn dịch ở hầu hết các tế bào
HAE nuôi cấy cũng phù hợp với các nghiên trước cho rằng sản xuất
albumin cũng đã được quan sát thấy trong một nửa các tế bào màng ối chuột.
Điều đó chứng tỏ rằng có thể dùng tế bào gốc màng ối để tái sinh gan.
Biệt hóa tế bào gốc màng ố
i thành tế bào sụn (Chondrocytes)
Cũng đã có nhiều công trình mô tả, phân tích tế bào gốc màng ối
HAM và tiềm năng cho việc sửa chữa sụn [36-43]. Tế bào HAM liên quan
đến gen, bao gồm Sox-9, Sox-5, Sox-6, protein bone morphogenetic (BMP) -
2 và -4, cũng như thụ thể BMP. Trong thí nghiệm in vitro, collagen loại II và
aggrecan được biểu hiện sau khi cho chất cảm ứng của chondrogenesis với
BMP-2. ở invitro, các tế bào HAM được cấy vào sụn mô của chuột với
BMP-2 hoặc cấy ghép với giá đỡ collagen vào vị trí bị khuyế
t tật, tạo ra
xương của chuột dựa vào thay đổi hình thái với sự lắng đọng của collagen
18

loại II. Những kết quả này cho thấy, tế bào HAM có tiềm năng biệt hóa
thành tế bào sụn trong in vitro và in vivo, có tiềm năng điều trị cho bệnh về

sụn hoặc sụn bị tổn thương [36].
Tình hình nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc ở Việt nam
Năm 1995, Bệnh viện Huyết Học-Truyền Máu Thành phố Hồ Chí Minh
lần đầu sử dụng tuỷ xương (thực chấ
t là liệu pháp tế bào gốc tạo máu) để
ghép điều trị cho 1 bệnh nhân 27 tuổi bị bệnh bạch cầu mạn dòng tuỷ
(CML) [153]. Tiếp đó, năm 1996 thực hiện ghép tế bào gốc máu ngoại vi tự
thân để điều trị bệnh lý ác tính về máu. Năm 2002 bệnh viện này tiến hành
ghép tế bào gốc tạo máu từ máu cuống rốn để điều trị bệnh bạch cầu c
ấp
dòng lympho (ALL) [153]. Sau đó Viện Huyết học truyền máu Trung ương
cũng bắt đầu tiến hành nghiên cứu ghép tuỷ xương để điều trị bệnh suy tuỷ,
một số bệnh lý máu ác tính. Từ năm 2004, Trung tâm Huyết học và Truyền
máu - Bệnh viện trung ương Huế cũng đã triển khai ghép tế bào gốc từ máu
ngoại vi để điều trị bệnh Lơ-xe-mi cấp [155]. Tại Bệnh vi
ện Trung ương
Quân đội 108, năm 2004 đã tiến hành các ca ghép tế bào máu từ máu tự thân
cho các bệnh nhân ung thư máu.
Năm 2007, Bệnh viện Việt Đức và Bệnh viện Trung ương Quân đội
108 tiến hành ghép tế bào gốc từ tủy xương điều trị tổn thương xương khó
lành hoặc khớp giả [156, 157]. Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh tiến hành
các nghiên cứu cơ bản về tế bào gốc, biệt hóa tế
bào gốc trung mô dây rốn
[158, 159] Năm 2009, Ngân hàng tế bào gốc dây rốn đầu tiên của Việt
Nam được thành lập để lưu trữ các tế bào gốc từ mẫu mô dây rốn. Hiện tại ở
Việt Nam đang có một số ngân hàng tế bào gốc được thành lập. Đó là ngân
hàng tế bào gốc của các đơn vị Công ty cổ phần Mekophar; Học viện quân y;
Viện Huyết học - Truyền máu thành phố Hồ Chí Minh.
Viện b
ỏng quốc gia, Học viện Quân y trong nhiều năm đã nghiên cứu

19

trị liệu tế bào trong điều trị vết thương, vết bỏng, các tấm da nuôi cấy đã
được chế tạp và sự dụng trong điều trị đạt kết quả tốt. Viện bỏng quốc gia
hiện nay đã nuôi cấy thành công nguyên bào sợi và tế bào biểu bì để điều trị
vết thương, vết bỏng.
Bên cạnh các nghiên cứu ứng dụng tế bào gố
c tạo máu được triển khai
ở các cơ sở nêu trên, các nghiên cứu tế bào gốc phôi chuột nhắt và tế bào gốc
phôi gà cũng đã được tiến hành tại hai trường Đại học khoa học tự nhiên
thuộc Đại học Quốc gia Hà nội và Thành phố Hồ Chí Minh. Một dự án
nghiên cứu tế bào gốc phôi người và tế bào gốc từ người trưởng thành cũng
đã được thông qua và bắt đầu triển khai tại Trườ
ng Đại học y Hà Nội và các
đơn vị phối hợp. Tuy nhiên các dự án và nghiên cứu kể trên chưa đề cập đến
việc lập ngân hàng bảo quản lâu dài và sử dụng tế bào gốc màng ối.
Ở nước ta, ước tính hàng năm riêng nhu cầu điều trị bệnh máu bằng
ghép tế bào gốc cũng đã khoảng 300 - 500 trường hợp. Nhu cầu điều trị các
khuyết hổng mô và suy chức năng tế
bào/cơ quan rất lớn mà triển vọng có
thể áp dụng trị liệu tế bào gốc càng là con số lớn hơn. Tuy nhiên, lĩnh vực
này vẫn còn biểu hiện nhiều hạn chế. Đó là nguồn tế bào gốc còn hạn chế
(mới chỉ dừng lại từ dây rốn, tủy xương) đặc biệt là các nghiên cứu áp dụng
tế bào gốc biệt hóa thành các dòng tế bào áp dụng điều trị còn ch
ưa đạt hiệu
quả cao. Thêm nữa, các hướng nghiên cứu về tế bào gốc ở trong nước còn
chưa đa dạng, chưa quan tâm nhiều đến những hướng tạo sinh tế bào gốc từ
nguồn các tế bào khác.
Ngày 4 tháng 6 năm 2009, Học viện quân y và đại học Toyama – Nhật
bản đã ký kết văn bản thỏa thuận hợp tác nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc

màng ối trong y học. Theo vă
n bản này, phía Nhật sẽ chuyển giao kỹ thuật
công nghệ đồng thời hỗ trợ một phần kinh phí để nghiên cứu. Số còn lại do
chính phủ Việt nam chi trả. Vì vậy đề tài này đã giúp chúng tôi tận dụng
20

được sự hợp tác quốc tế để tạo ra sản phẩm sinh học từ tế bào gốc màng ối.
Từ đó góp phần đào tạo đội ngũ nghiên cứu viên lành nghề và góp phần phát
triển nền khoa học nước nhà.
Luận cứ, cách tiếp cận để đạt được mục tiêu
Y học tái tạo là một lĩnh vực mới dựa trên sử dụng các tế gốc để
thay
thế hay cải thiện chức năng của mô, tái lập lại mô bị phá hủy với khả năng
biệt hóa và tăng sinh cao [12]. Một yếu tố quan trọng là tiềm năng thay thế
các tạng, mô phức tạp. Gần đây, tế bào từ màng ối được công bố là các tế
bào đa tiềm năng đã thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học. Màng ối có
những đặc điểm ưu việ
t: tế bào phân lập có thể biệt hóa thành nhiều loại tế
bào khác nhau; tính sinh miễn dịch yếu và không đòi hỏi phải lấy từ phôi
người để phân lập [36, 38, 44]. Vì vậy tránh được những tranh cãi liên quan
đến sử dụng tế bào gốc phôi thai người. Hơn nữa, Trường Đại học Toyama
đã phát triển được tấm tế bào có nguồn gốc từ màng ối sử dụng polymer nền
tảng là protein đàn hồi phản ứ
ng với nhiệt độ, không gây độc [13, 45-48].
Nhóm nghiên cứu do giáo sư Nikaido đứng đầu cũng đã tạo ra tấm màng ối
đông khô “hyper- dry-amnion”. Tấm màng ối này có rất nhiều ưu điểm và đã
bắt đầu sử dụng trên người mang lại kết quả tốt [13, 45-48]. Công trình này
đã được cấp patent của Nhật và Mỹ cho phép dùng trên người từ năm 2006 .
Trên cơ sở đó, đề tài này nhằm mục tiêu chuyển giao các kỹ thuậ
t mới

từ phía Nhật trong lĩnh vực phân lập, bảo quản, nuôi cấy tăng sinh cũng như
hiệu quả điều trị của tấm tế bào gốc màng ối. Vấn đề then chốt quyết định sự
thành công của đề tài là chúng tôi đã hoàn toàn làm chủ được từng giai đoạn
của quy trình công nghệ đặc biệt giai đoạn nghiên cứu cơ bản thuộc các
chuyên ngành y học cơ
sở. Dựa trên điều kiện về cơ sở vật chất và con
người, chúng tôi thiết kế, triển khai đề tài theo các bước sau:
Kết hợp với phía bạn, tổ chức tập huấn về kỹ thuật trước khi triển khai
21

đề tài đồng thời cử ngay cán bộ sang Nhật để nắm bắt lấy toàn bộ các quy
trình công nghệ sẵn có từ phía bạn.
Từ nguồn màng ối, tiến hành phân lập tế bào gốc theo phương pháp đã
được các nhà nghiên cứu của Nhật áp dụng thành công.
Duy trì và tăng sinh tế bào trong môi trường nuôi cấy (DMEM) có bổ
sung các yếu tố sinh trưởng.
Nghiên cứu môi trường gây biệt hóa tế bào gốc màng ối thành tế bào
biểu bì da và tế bào tụ
y đảo in vitro.
Chế tạo một số sản phẩm sinh học ứng dụng trong điều trị bao gồm tế
bào gốc màng ối đông lạnh và tấm tế bào gốc màng ối. Xây dựng tiêu chuẩn
đánh giá các sản phẩm này.
Đánh giá tác dụng điều trị của tấm tế bào gốc màng ối trên động vật
thực nghiệm.
Để thực hiện được toàn bộ quy trình công nghệ đề
ra, nhóm nghiên
cứu đã làm chủ được hoàn toàn các kỹ thuật cần thiết. Thêm vào đó là sự
giúp đỡ tạo điều kiện tối đa của các cơ quan chức năng bộ Khoa học - Công
nghệ, bộ Quốc phòng, Học viện quân y. Đồng thời nhóm nghiên cứu cũng có
được sự tư vấn, trợ giúp nhiệt tình vô tư của các nhà khoa học, các chuyên

gia Việt nam và Nhật bản. Điều này làm cho đề tài có được nh
ững kết quả có
ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao.






NỘI DUNG KHOA HỌC ĐÃ THỰC HIỆN
Đề tài bao gồm 6 nội dung khoa học công nghệ chính đã được thực hiện
như sau.
PHẦN I
CƠ SỞ LÝ THUYẾT
1. Đặc điểm sinh học của màng ối người Việt Nam liên quan đến việc lựa
chọn và phân lập tế bào gốc.
Màng ối được hình thành từ lá phôi ngoài có nguồn gốc từ khối nội bào
vào ngày thứ 8 sau thụ tinh. Sơ đồ sau sẽ minh họa việc có nguồn gốc từ lá
phôi ngoài chứng tỏ màng ối có nguồn gốc từ cả 3 lớp mầm (ngoại bì, trung
bì và nội bì).

Hình 1.1. Sơ đồ nhau thai và vị trí màng ối
Khoang ối, từ một khoang nhỏ nằm ở mặt lưng phôi (mặt ngoại bì) đến
cuối tháng thứ nhất khi phôi đã khép mình trở thành một khoang ngày càng
lớn chứa đựng toàn bộ phôi. Trong khoang ối, phôi tắm mình trong nước ối.
22

Màng ối được cấu tạo bởi 2 lớp: ngoại bì màng ối được lót ngoài bởi trung bì
màng ối, một phần của lá thành trung bì ngoài phôi. Khi phôi tiếp tục lớn
lên, khoang ối ngày càng to ra, nước ối ngày càng được tạo ra nhiều, màng ối

ngày càng giãn rộng ra tiến sát tới màng đệm. Phần lá thành trung bì ngoài
phôi phủ ngoại bì màng ối tới sát nhập vào màng đệm. Vì vậy, khoang ngoài
phôi ngày càng hẹp lại và cuối cùng biến mất.
Màng ối được cấu tạo bởi 3 màng chính: màng bi
ểu mô đơn (single
epithelial layer), màng nền dày (basement membrane) và màng vô mạch
(avascular mesenchyme) [44]. Không có thần kinh, mạch máu hay bạch
huyết trong màng ối (Hình 1.2.) . Nó nằm ngay sát khoang ối (amniotic
cavity) và các tế bào lá phôi (trophoblast cell). Nó có thể dễ dàng phân tách
khỏi màng đệm (chorion) nằm ngay dưới đó. Màng ối được nuôi dưỡng bởi
dinh dưỡng và oxy từ dịch ối bao xung quanh và mạch máu của thai.

Hình 1.2. Sơ đồ cấu trúc màng ối [49].
23

24

Màng ối đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát triển thai nhi và
chuyển dạ. Trong khởi điểm và duy trì co thắt tử cung, prostaglandin đóng
vai trò cốt yếu. Biểu mô màng ối không chỉ là một trong những nguồn cung
cấp prostaglandin, đặc biệt là prostaglandin E2 [49], mà nó còn tạo ra các
enzym sinh tổng hợp prostaglandin (prostaglandin-biosynthesis enzyme) ví
dụ như phospholipase, prostaglandin synthase, và cyclooxygenase. Hơn nữa,
các enzyme này được điều hòa bởi human chorionic gonadotropin (hCG),
các thụ cảm thể của chúng cũng tìm thấy trong màng biểu mô màng ối. Biểu
mô màng ố
i có mức độ hoạt động chuyển hóa cao trong quá trình thai nghén
và nó có chức năng điều hòa pH của dịch màng ối, giữ nó ở trạng thái hằng
định là khoảng 7,1.
Laminin là thành phần chính của màng nền tế bào gốc màng ối tham gia

vào quá trình biệt hóa tế bào, duy trì hình dạng và hoạt động tế bào, duy trì
kiểu cấu trúc mô đồng thời thúc đẩy sự tồn tại của các mô thông qua các thụ
cảm thể của tế bào như integrin và dystroglycan [50]. Vì vậy, xác định đặ
c
điểm các chuỗi dưới đơn vị của laminin ở màng ối người là rất quan trọng.
Laminin có nhiều đồng dạng khác nhau bao gồm các chuỗi α-, β-, và γ- mà
mỗi chuỗi này có nhiều dạng chuỗi dưới đơn vị : α1– 5, β1 – 3, γ1 – 3 [49].
Laminin được tạo ra và bài tiết từ ngay biểu mô nằm trên màng nền vì vậy
biểu hiện gen của các chuỗi dưới đơn vị laminin trong các tế bào biểu mô
màng ối (human amniotic epithelial cells - HAE) được phát hiện bằng phản
ứng reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Phân tích về
mặt mô học, màng ối gồm hai lớp biểu mô đơn và trung mô. Lớp biểu mô
đơn là một lớp tế bào biểu mô đơn hình trụ, một phần tự do và một phần tiếp
xúc với màng đáy. Nằm dưới màng đáy là lớp trung mô màng ối gồm các mô
liên kết được tạo bởi các tế bào giống nguyên bào sợi.
Màng ối trên bề mặt bánh rau r
ất dày. Bề mặt vùng này được bao phủ
biểu mô ba tầng gồm 3 – 4 hàng tế bào. Đây cũng là vùng có nhiều tế bào
25

gốc nhất khi phân lập. Tuy nhiên nếu sử dụng vùng này để sản xuất màng ối
đông khô thì màng ối sẽ dày và kém chun giãn.
Màng ối ở vùng rìa cách cuống rốn khoảng 10 cm được bao phủ 1 - 2
lớp biểu mô vuông đơn. Đây là vùng chứa ít tế bào gốc nhưng lại rất tốt khi
sử dụng để sản xuất tấm màng ối đông khô trong điều trị. Màng ối đông khô
lấy từ vùng này có độ
đàn hồi cao.
Chức năng màng ối: Nhờ nước ối chứa bên trong, màng ối và khoang
ối đảm nhiệm nhiều chức năng quan trọng.
Chức năng cơ học: Che chở cho phôi thai, chống những sốc phát sinh

từ môi trường bên ngoài; cho phép thai được cử động tự do và làm cho thai
không dính vào màng ối.
Chức năng giữ cân bằng lượng nước trong phôi thai: nước ối có quan
hệ trực tiếp với sự giữ cân b
ằng lượng nước trong phôi thai. Khi thai chứa
quá nhiều nước, lượng nước thừa được đào thải vào khoang ối, khi phôi thai
mất nước nó sẽ hấp thụ nước ối. Nước ối sẽ có tác dụng chống khô ráo cho
thai: phôi thai tắm mình trong nước ối nên không bị khô.
Cung cấp các chất dinh dưỡng: Các chất dinh dưỡng và oxy được cung
cấp bằng cách khuếch tán từ các lớp sâu của thành tử cung hoặc thông qua
dịch ối từ thai nhi. Một s
ố nghiên cứu đã chứng tỏ sự hiện diện của protein
vận chuyển glucose 1 và 3 chủ yếu ở bề mặt đỉnh của các tế bào biểu mô
màng ối [51].
Tổng hợp lipid nội ối: Các nghiên cứu về vi cấu trúc gần đây cho thấy
có quá trình sinh tổng hợp lipid nội ối, chứ không phải có nguồn gốc từ
những giọt lipid thoái hóa được tìm thấy trong màng ối. Các chất béo có
nguồn g
ốc từ tuần hoàn mẹ và đi vào nước ối sau khi thay đổi cấu trúc hóa
học.
26

Dự trữ glycogen: Sự hiện diện glycogen trong biểu mô màng ối ở giai
đoạn sớm thai kỳ có thể cung cấp một nguồn năng lượng là cần thiết bổ sung
cho các bào quan như ty thể và lưới nội chất và hoạt động ẩm bào
(pinocytotic) hạn chế của các tế bào HAE.
Sinh tổng hợp prostaglandin: Màng ối là một nguồn cung cấp
prostaglandin E2 (PGE2) duy nhất [52, 53], đóng vai trò quan trọng trong
việc khởi xướng và duy trì các cơ
n co thắt tử cung. Màng ối đóng một vai trò

quan trọng trong quá trình sinh đẻ, bởi vì vị trí giải phẫu đặc biệt, với mối
quan hệ chặt chẽ cơ tử cung, nước ối và cổ tử cung. Enzym tham gia vào quá
trình sinh tổng hợp prostaglandin đã được tìm thấy trong màng ối của con
người và bao gồm Phospholipases, enzym tổng hợp prostaglandin, và enzym
tổng hợp endoperoxidase prostaglandin (cyclooxygenase) [52-55].
Tổng hợp leukotriene: Màng ối cũng tổng hợp ra leukotrienes, một
nhóm cytokine có nguồn gố
c từ acid arachidonic [56]. Các cytokine này
ngoài chức năng là trung gian của phản ứng miễn dịch và giãn mạch còn có
ảnh hưởng đến co bóp tử cung.
Điều hòa pH: Biểu mô màng ối tham gia quá trình thủy phân carbonic,
trong quá trình chuyển hóa bicarbonate/CO
2
[57], điều này cho thấy rằng
biểu mô màng ối cũng đóng một vai trò quan trọng trong quá trình điều hòa
độ pH của nước ối [58, 59].
Chuyển hóa steroid: Hoạt động thủy phân 17 ß-hydroxysteroid
dehydrogenase cũng biểu hiện ở biểu mô màng ối của con người từ 7 đến 20
tuần của thai kỳ, điều này cho thấy rằng những tế bào có khả năng biến đổi
steroid [60-64]. So sánh màng ối ở giai đoạn
đầu với giai đoạn 3 tháng cuối
của thai kỳ cũng cho thấy có sự biến đổi phức tạp ở lớp biểu mô màng ối:
các liên kết ở khoảng gian bào trở nên phức tạp hơn với các liên kết giữa các