Nghiên cứu giải trình tự một phần bộ gen và xây dựng cơ sở dữ liệu genome tôm sú (P.monodon)

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC






BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU GIẢI TRÌNH TỰ MỘT PHẦN BỘ GEN VÀ
XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU GENOME TÔM SÚ
(P.MONODON)


CNĐT : NÔNG VĂN HẢI
KIM THỊ PHƯƠNG OANH









9287


HÀ NỘI – 2012

i

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT IV
DANH MỤC CÁC HÌNH V
DANH MỤC CÁC BẢNG IX
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1. NGHIÊN CỨU TẠO NGÂN HÀNG CDNA/EST VÀ GIẢI MÃ MỘT PHẦN
TRÌNH TỰ CDNA/EST CỦA GENOME TÔM SÚ VIỆT NAM. 7

1.1. GIỚI THIỆU 7
1.2. NGUYÊN LIỆU 8
1.2.1. Thu thập mẫu 8
1.2.2. Hóa chất 9
1.2.3. Thiết bị 10
1.3. PHƯƠNG PHÁP 10
1.3.1. Tách chiết RNA tôm sú 10
1.3.2. Tinh sạch mRNA 12
1.3.3. Tạo thư viện cDNA tôm sú từ các mô sử dụng phage lambda vector 14
1.3.4. Tạo thư viện cDNA tôm sú từ các mô sử dụng plasmid vector với các vị trí tái tổ hợp
đặc hiệu 24

1.3.5. Xác định trình tự cDNA 35
1.3.6. Phương pháp phân tích dữ liệu trình tự 36
1.4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37
1.4.1. Các quy trình tạo ngân hàng cDNA tôm sú từ các mô, cơ quan, và thời gian khác nhau
37

1.4.2. Tách chiết RNA tổng số tôm sú 40
1.4.3. Các dòng tế bào vi khuẩn tái tổ hợp 41
1.4.4. Kiểm tra thư viện cDNA bằng phản ứng cắt enzyme giới hạn 42
1.4.5. Số liệu thống kê các thư viện cDNA/EST tôm sú đã tạo lập 45
1.4.6. Giải mã các cDNA/EST từ các thư viện đã tạo lập 47
1.5. KẾT LUẬN 60
CHƯƠNG 2. NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ GEN CHỌN LỌC CỦA GENOME TÔM
SÚ VIỆT NAM 61

2.1. GIỚI THIỆU 61
2.1.1. Một số loại “housekeeping gene”: β-Actin và Elongation factor 63
2.1.2. Cyclin B 63
2.1.3. Các peptide kháng khuẩn (Antimicrobial peptides - AMPs) 64
2.1.4. Antivirus 64
2.1.5. Rab 7 65
2.1.6. Caspase 65
2.1.7. Protein sốc nhiệt Hsp90 66
2.1.8. Lysozyme 67
2.1.9. Syntenin 67
2.1.10. Hemocyanin 68
2.1.11. Ran protein 69
2.1.12. Rho protein 70
2.2. NGUYÊN LIỆU 71
2.2.1. Thu thập mẫu 71
2.2.2. Hóa chất 71
2.2.3. Thiết bị 72
2.3. PHƯƠNG PHÁP 73
ii

2.3.1. Tách chiết RNA tổng số 73

2.3.2. Tinh sạch mRNA 73
2.3.3. Tổng hợp cDNA 73
2.3.4. Thiết kế mồi nhằm phân lập một số gen (cDNA) mong muốn 76
2.3.5. Khuếch đại gen bằng phản ứng PCR 80
2.3.6. Tinh sạch sản phẩm PCR 81
2.3.7. Đưa sản phẩm PCR vào vector tách dòng 81
2.3.8. Biến nạp vector vào tế bào vi khuẩn 83
2.3.9. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng phản ứng cắt enzyme giới hạn 84
2.3.10. Xác định trình tự gen (cDNA) 85
2.4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 86
2.4.1. Quy trình tạo ngân hàng cDNA tôm sú từ các mô, cơ quan, và thời gian khác nhau 86
2.4.2. Phân lập gen mã hóa beta-actin 88
2.4.3. Phân lập gen mã hóa Elongation Factor 2 (EF2) 90
2.4.4. Phân lập gen mã hóa cynclin B 94
2.4.5. Phân lập gen mã hóa Anti-lipopolysaccharide factor (ALF) 96
2.4.6. Phân lập gen mã hóa Crustin-like antimicrobial peptide 100
2.4.7. Phân lập gen mã hóa Antivirus 102
2.4.8. Phân lập gen rab7 104
2.4.9. Phân lập gen mã hóa caspase 107
2.4.10. Phân lập gen mã hóa protein sốc nhiệt Hsp90 110
2.4.11. Phân lập gen mã hóa lysozyme 113
2.4.12. Phân lập gen mã hóa syntenin 115
2.4.13. Phân lập gen mã hóa hemocyanin 122
2.4.14. Phân lập gen mã hóa Ran protein 130
2.4.15. Phân lập gen mã hóa Rho 132
2.5. KẾT LUẬN 134
CHƯƠNG 3. NGHIÊN CỨU TẠO NGÂN HÀNG VÀ GIẢI MÃ MỘT PHẦN TRÌNH TỰ
DNA GENOME TY THỂ CỦA TÔM SÚ VIỆT NAM 135

3.1. GIỚI THIỆU 135
3.2. NGUYÊN LIỆU 137
3.2.1. Thu thập mẫu 137
3.2.2. Hóa chất 137
3.2.3. Thiết bị 138
3.3. PHƯƠNG PHÁP 138
3.3.1. Tách chiết DNA tổng số từ mô cơ tôm sú 138
3.3.2. Thiết kế mồi nhân các đoạn mtDNA mong muốn 140
3.3.3. Khuếch đại các đoạn mtDNA bằng phản ứng PCR 141
3.3.4. Tinh sạch sản phẩm PCR 142
3.3.5. Đưa sản phẩm PCR vào vector tách dòng 143
3.3.6. Biến nạp vector vào tế bào vi khuẩn 143
3.3.7. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng phản ứng cắt enzyme giới hạn 144
3.3.8. Xác định và phân tích trình tự nucleotide của các đoạn mtDNA 145
3.3.9. Phương pháp phân tích đa hình đoạn D-loop 146
3.4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 147
3.4.1. Quy trình tạo ngân hàng dữ liệu mtDNA 147
3.4.2. Tách chiết DNA tổng số 149
3.4.3. Phân lập các gen/ đoạn trình tự ty thể 149
3.4.4. Xác định trình tự một số gen/ đoạn mtDNA 151
3.4.5. Phân tích các nhóm đơn bội (Haplotype group) và sự đa dạng di truyền trong quần thể
tôm sú Việt Nam dựa trên đoạn trình tự D-loop 159

3.5. KẾT LUẬN 164
CHƯƠNG 4. PHÁT TRIỂN CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRÊN CƠ SỞ CÁC GEN ĐÃ ĐƯỢC GIẢI
MÃ PHỤC VỤ CHỌN GIỐNG 166

iii

4.1.
GIỚI THIỆU 166
4.2. NGUYÊN LIỆU 168
4.2.1. Thu thập mẫu 168
4.2.2. Hóa chất thiết bị 168
4.3. PHƯƠNG PHÁP 169
4.3.1. Tách chiết DNA tổng số 169
4.3.2. Thiết kế mồi 170
4.3.3. Phản ứng PCR 172
4.4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 172
4.4.1. Tách chiết DNA 172
4.4.2. Khảo sát microsatellite marker với mẫu tôm sinh trưởng tốt và tôm sinh trưởng kém173
4.4.3. Khảo sát microsatellite marker với mẫu tôm thường và tôm nhiễm bệnh đốm trắng . 182
4.5. KẾT LUẬN 188
CHƯƠNG 5. XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU EST/CDNA VÀ GDNA/MTDNA GENOME
TÔM SÚ VIỆT NAM 189

5.1. GIỚI THIỆU 189
5.2. HỆ THỐNG VÀ CẤU TRÚC CƠ SỞ DỮ LIỆU 190
5.2.1. Môi trường và nền tảng phát triển cơ sở dữ liệu 190
5.2.2. Kiến trúc hệ thống cơ sở dữ liệu 191
5.2.3. Cơ sở dữ liệu (CSDL) 192
5.3. THIẾT KẾ CÁC CHỨC NĂNG PHẦN MỀM ỨNG DỤNG 194
5.3.1. Mô hình chức năng 194
5.3.2. Chức năng BLAST 196
5.3.3. Chức năng tra cứu thông tin từ CSDL Gene Ontology (GO) 197
5.4. HƯỚNG DẪN SỬ DỤNG CSDL 197
5.4.1. Tra cứu thông tin chung 197
5.4.2. Tra cứu thông tin nội bộ 199
5.4.3. Sử dụng chức năng BLAST 200

5.4.4. Sử dụng cơ sở dữ liệu Gene Ontology 201
5.5. KẾT LUẬN 202
CHƯƠNG 6. KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC…………………………………………… ……… 203
6.1. CÁC SẢN PHẨM DẠNG 1 203
6.2. CÁC SẢN PHẨM DẠNG 2, 3 205
6.3. CÁC SẢN PHẨM DẠNG 4 205
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 208
KẾT LUẬN 208
KIẾN NGHỊ 210
TÀI LIỆU THAM KHẢO 212

iv

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

aa amino acid
AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism (Đa hình chiều dài
đoạn DNA)
ALF Anti-lipopolisaccharide factor
AMP Antimicrobial peptide (peptid kháng khuẩn)
CSDL Cơ sở dữ liệu
DNA Deoxyribonucleic acid
dNTPs Deoxyribonucleoside triphosphate (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
ddNTPs Dideoxyribonucleoside triphosphate (ddATP, ddCTP, ddGTP,
ddTTP)
DEPC Diethyl pyrocarbonate
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
EF Elongation factor (nhân tố kéo dài chuỗi trong quá trình sinh
tổng hợp protein)
EST Expressed sequence tag (Đoạn trình tự gen biểu hiện)

GSP Gene specific primer (Mồi đặc hiệu gen)
Hsp Heat shock protein (protein sốc nhiệt)
MCS Multiple cloning site (Vùng cắt gắn đa vị trên vector)
mtDNA Mitochondrial DNA (DNA ty thể)
OD Optical Density (Mật độ quang học)
ORF Open Reading Frame (Khung đọc mở )
PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)
RACE Rapid Amplification of cDNA Ends (khuếch đại các đầ
u 5‘ và
3‘ của cDNA)
RAPD Random Amplification of Polymorphic DNA (Đa hình đoạn
DNA được nhân ngẫu nhiên)
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa hình chiều dài
đoạn DNA cắt bằng enzyme giới hạn)
RNA Ribonucleic acid
RT-PCR Reverse transcriptase-PCR (PCR bằng enzyme phiên mã ngược)
SNP Single-nucleotide polymorphism (Đa hình các nucleotide đơn)
UPM Universal primer mix (mồi thiết kế chung)
WSSV White spot syndrome virus (virus gây bệnh đốm trắng)
YHV Yellow head virus (virus gây bệnh đầu vàng)
v

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Dụng cụ nghiền mẫu (Homogenizer) 11
Hình 1.2. Sơ đồ nguyên lý quá trình tinh sạch mRNA từ RNA tổng số 12
Hình 1.3. Sơ đồ nguyên lý của quá trình tổng hợp cDNA 15
Hình 1.4. Cấu tạo cột lọc phân đoạn cDNA 19
Hình 1.5. Bản đồ Lambda ZAP II vector 21
Hình 1.6. Sơ đồ nguyên lý của quá trình tổng hợp cDNA 24
Hình 1.7. Đánh dấu đĩa thạch agarose 1% dùng để xác định nồng độ cDNA 29

Hình 1.8. Bản đồ vector pDONR222 30
Hình 1.9. Nguyên lý của quá trình đưa cDNA vào vector pDONR222 31
Hình 1.10. Sơ đồ phân tích dữ liệu trình tự nucleotide cDNA/EST 36
Hình 1.11. Sơ đồ quy trình tạo ngân hàng cDNA tôm sú sử dụng phage
lambda vector 38

Hình 1.12. Sơ đồ quy trình tạo ngân hàng cDNA tôm sử dụng plasmid vector
với các vị trí tái tổ hợp đặc hiệu 39

Hình 1.13. Điện di đồ các mẫu RNA tổng số tách chiết từ các mô khác nhau
của tôm sú 40

Hình 1.14. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn 42
Hình 1.15. Master plate 42
Hình 1.16. Một số hình ảnh điện di kiểm tra plasmid tái tổ hợp tác từ các dòng
tế bào trong thư viện cDNA/EST tôm sú 43

Hình 1.17. Điện di đồ kiểm tra kích thước cDNA đã được đưa vào vector
pDONR
TM
222 44
Hình 1.18. Thống kê thành phần và phân loại các trình tự cDNA/EST 59
Hình 2.1. Sơ đồ nguyên lý của quá trình tổng hợp cDNA 74
Hình 2.2. Sơ đồ thiết kế mồi từ gen đã biết trình tự 77
Hình 2.3. Sơ đồ thiết kế mồi từ gen đã biết một phần trình tự đầu 3’ 77
Hình 2.4. Sơ đồ thiết kế mồi khi gen biết một phần trình tự đầu 5’ 78
Hình 2.5. Sơ đồ thiết kế mồi để phân lập gen hoàn toàn mới ở tôm sú 79
Hình 2.6. Vector pJET1.2 (Fermentas) 82
Hình 2.7. Vector pCR2.1 (Invitrogen) 82
Hình 2.8. Sơ đồ quy trình tạo ngân hàng cDNA tôm sú sử dụng kỹ thuật PCR

87

Hình 2.9. Tách dòng gen beta actin 88
Hình 2.10. Trình tự gen và amino acid suy diễn của beta actin 90
Hình 2.11.Tách dòng gen EF2. 91
Hình 2.12. Trình tự gen và amino acid suy diễn của EF2 94
Hình 2.13. Tách dòng gen cynclin B 94
Hình 2.14. Trình tự gen và amino acid suy diễn của Cyclin B 96
Hình 2.15. Tách dòng gen anti-lipopolysaccharide. 97
Hình 2.16. So sánh (alignment) trình tự nucleotide gen ALFPm của tôm sú
Việt Nam với trình tự đã công bố 98

vi

Hình 2.17. So sánh (alignment) trình tự nucleotide gen ALFPm3 của tôm sú
Việt Nam với trình tự đã công bố 99

Hình 2.18. Tách dòng gen crustin-like antimicrobial peptide 101
Hình 2.19. Trình tự gen và amino acid suy diễn của crustin-like antimicrobial
peptide 102

Hình 2.20. Tách dòng gen antivirus. 103
Hình 2.21. Trình tự gen và amino acid suy diễn của antivirus 104
Hình 2.22. Tách dòng gen Rab7. 105
Hình 2.23. So sánh (alignment) trình tự nucleotide gen Rab7 của tôm sú Việt
Nam với trình tự đã công bố 106

Hình 2.24. Tách dòng gen caspase 107
Hình 2.25. So sánh (alignment) trình tự nucleotide gen caspase của tôm sú Việt
Nam với trình tự đã công bố 109


Hình 2.26. Tách dòng gen hsp90 110
Hình 2.27. Trình tự gen và amino acid suy diễn của hsp90 113
Hình 2.28. Tách dòng gen lysozyme 114
Hình 2.29. Trình tự gen và amino acid suy diễn của Lysozyme 115
Hình 2.30. Sơ đồ thiết kế mồi phân lập gen syntenin 116
Hình 2.31. Tách dòng đoạn 5’-syntenin 116
Hình 2.32. Trình tự nucleotide và amino acid suy diễn của đoạn 5’-syntenin.
118

Hình 2.33. Tách dòng gen syntenin 119
Hình 2.34. So sánh (alignment) trình tự amino acid của syntenin giữa các loài
khác nhau 121

Hình 2.35. Sơ đồ thiết kế mồi phân lập gen hemocyanin 123
Hình 2.36. Sản phẩm nhân đoạn 5’-hemocyanin bằng kỹ thuật 5’RACE 123
Hình 2.37. Kiểm tra sự có mặt của sản phẩm 5’RACE trong vector tái tổ hợp
124

Hình 2.38. Trình tự nucleotide và amino acid suy diễn của đoạn 5’-
hemocyanin 125

Hình 2.39. Sản phẩm nhân gen hemocyanin bằng kỹ thuật RT-PCR 126
Hình 2.40. Kiểm tra sự có mặt của sản phẩm RT-PCR trong vector 127
Hình 2.41. So sánh (alignment) trình tự amino acid của hemocyanin giữa các
loài khác nhau 129

Hình 2.42. Tách dòng gen Ran. 130
Hình 2.43. Trình tự nucleotide và amino acid suy diễn đoạn gen Ran của tôm
sú Việt Nam 131


Hình 2.44. Tách dòng gen Rho 132
Hình 2.45. Trình tự nucleotide và amino acid suy diễn đoạn gen Rho của tôm
sú Việt Nam 133

Hình 3.1. Thông tin về vị trí các cặp mồi được sử dụng khếch đại các vùng
quan tâm của hệ gen ty thể 140

Hình 3.2. Vector pJET1.2 (Fermentas) 143
vii

Hình 3.3. Sơ đồ quy trình tạo ngân hàng mtDNA từ mô của tôm sú 148
Hình 3.4. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tách DNA tổng số 149
Hình 3.5. Khuyếch đại đoạn Cox2 bằng kỹ thuật PCR 150
Hình 3.6. Khuyếch đại đoạn D-loop; ATP6; và Nad2 bằng kỹ thuật PCR 150
Hình 3.7. Kiểm tra sự có mặt của đoạn Cox2 trong vector tái tổ hợp 150
Hình 3.8. Kiểm tra sự có mặt của đoạn ATP6, D-loop, Nad2 trong vector tái
tổ hợp 150

Hình 3.9. Kết quả so sánh trình tự gen nad2 với trình tự trên Genbank 152
Hình 3.10. Kết quả so sánh trình tự amino acid suy diễn của gen nad2 với
trình tự công bố trên Genbank 153

Hình 3.11. Kết quả so sánh trình tự gen cox2 với trình tự trên Genbank 154
Hình 3.12. Kết quả so sánh trình tự amino acid suy diễn của gen cox2 với
trình tự công bố trên Genbank 155

Hình 3.13. Kết quả so sánh trình tự gen ATP6 với trình tự trên Genbank 156
Hình 3.14. Kết quả so sánh trình tự amino acid suy diễn của gen ATP6 với
trình tự công bố trên Genbank 157


Hình 3.15. Kết quả so sánh trình tự đoạn D-loop với trình tự trên Genbank158
Hình 3.16. Cây phát sinh mô phỏng mối quan hệ giữa các nhóm đơn bội
(Haplotype group) sử dụng toàn bộ dữ liệu ở Bảng 3.2 160

Hình 3.17. Cây phát sinh mô phỏng mối quan hệ giữa các nhóm đơn bội
(Haplotype group) đã loại bỏ nhóm Ấn Độ ra khỏi bộ dữ liệu 161

Hình 3.18. So sánh sự phân bố của các nhóm đơn bội trong các quần thể tôm
sú. 163

Hình 4.1. Điện di kiểm tra sản phẩm tách DNA từ mô cơ tôm sú 173
Hình 4.2. Khảo sát chỉ thị microsatellite ở các mẫu tôm sinh trưởng tốt và tôm
sinh trưởng kém với cặp mồi TUZX2-41 174

Hình 4.3. Khảo sát chỉ thị microsatellite ở các mẫu tôm sinh trưởng tốt và tôm
sinh trưởng kém với cặp mồi TUZX4-1 174

Hình 4.4. Khảo sát chỉ thị microsatellite ở các mẫu tôm sinh trưởng tốt và tôm
sinh trưởng kém với cặp mồi TUZX4-6 175

Hình 4.5. Khảo sát chỉ thị microsatellite ở các mẫu tôm sinh trưởng tốt và tôm
sinh trưởng kém với cặp mồi TUZX4-7 176

Hình 4.6. Khảo sát chỉ thị microsatellite ở các mẫu tôm sinh trưởng tốt và tôm
sinh trưởng kém với cặp mồi TUZX4-9 176

Hình 4.7. Khảo sát chỉ thị microsatellite ở các mẫu tôm sinh trưởng tốt và tôm
sinh trưởng kém với cặp mồi TUZX4-36 177


Hình 4.8. Khảo sát chỉ thị microsatellite ở các mẫu tôm sinh trưởng tốt và tôm
sinh trưởng kém với cặp mồi TUZX4-38 178

Hình 4.9. Khảo sát chỉ thị microsatellite ở các mẫu tôm sinh trưởng tốt và tôm
sinh trưởng kém với cặp mồi TUZX4-45 179

Hình 4.10. Khảo sát chỉ thị microsatellite ở các mẫu tôm sinh trưởng tốt và
tôm sinh trưởng kém với cặp mồi TUZX4-53 179

viii

Hình 4.11. Khảo sát chỉ thị microsatellite ở các mẫu tôm sinh trưởng tốt và
tôm sinh trưởng kém với cặp mồi TUZX4-55 180

Hình 4.12. Khảo sát chỉ thị microsatellite ở các mẫu tôm sinh trưởng tốt và
tôm sinh trưởng kém với cặp mồi TUZX4-82 181

Hình 4.13. Khảo sát chỉ thị microsatellite ở các mẫu tôm sinh trưởng tốt và
tôm sinh trưởng kém với cặp mồi TUZX4-85 182

Hình 4.14. Khảo sát chỉ thị microsatellite ở các mẫu tôm sú thường và nhiễm
bệnh với 3 cặp mồi TUZX2-41, TUZX4-1 và TUZX4-6 183

Hình 4.15. Khảo sát chỉ thị microsatellite ở các mẫu tôm sú thường và nhiễm
bệnh với 2 cặp mồi TUZX4-7 và TUZX4-9 184

Hình 4.16. Khảo sát chỉ thị microsatellite ở các mẫu tôm sú thường và nhiễm
bệnh với 2 cặp mồi TUZX4-36 và TUZX4-38 185

Hình 4.17. Khảo sát chỉ thị microsatellite ở các mẫu tôm sú thường và nhiễm

bệnh với 3 cặp mồi TUZX4-45, TUZX4-53 và TUZX4-55 186

Hình 4.18. Khảo sát chỉ thị microsatellite ở các mẫu tôm sú thường và nhiễm
bệnh với 2 cặp mồi TUZX4-82 và TUZX4-85 187

Hình 5.1. Mô hình kiến trúc tổng thể của hệ thống CSDL genome tôm sú 192
Hình 5.2. Mô hình dữ liệu 193
Hình 5.3. Mô hình tạo CSDL BLAST 196
Hình 5.4. Mô hình tạo CSDL Gene Ontology 197
Hình 5.5. Giao diện tra cứu thông thường 198
Hình 5.6. Giao diện tra cứu nâng cao (Advanced search) 198
Hình 5.7. Kết quả hiển thị sau khi thực hiện lệnh tra cứu 199
Hình 5.8. Giao diện cho người sử dụng tra cứu thông tin nội bộ 200
Hình 5.9. Giao diện thực hiện chức năng BLAST 201
Hình 5.10. Giao diện kết quả tìm kiếm 201
Hình 5.11. Quá trình liên kết với cơ sở dữ liệu Gene Ontology (GO) 202
ix

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Cặp mồi thiết kế dành cho sequencing đối với vector tái tổ hợp
Lambda ZAP II 21

Bảng 1.2. Các mẫu mô tôm sú sử dụng trong nghiên cứu 40
Bảng 1.3. Kết quả kiểm tra nồng độ một số mẫu RNA tổng số bằng phương
pháp đo quang phổ (độ pha loãng 100 lần) 41

Bảng 1.4. Tổng kết số lượng dòng tế bào phân tích từ các thư viện cDNA/
EST 45


Bảng 1.5. Bảng thống kê kết quả phân tích các thư viện cDNA/EST từ mẫu
tôm sú thường 46

Bảng 1.6. Bảng thống kê kết quả phân tích các thư viện cDNA/EST từ mẫu
tôm sú bệnh 46

Bảng 1.7. Bảng thống kê kết quả phân tích các thư viện cDNA/EST từ mẫu
tôm sú bố mẹ 46

Bảng 1.8 Bảng phân tích kết quả tìm kiếm trình tự tương đồng của các protein
suy diễn (Kết quả BLASTP) 48

Bảng 1.9 Bảng phân tích kết quả tìm kiếm trình tự tương đồng của các các
trình tự EST (Kết quả BLASTN) 53

Bảng 1.10 Chú giải chức năng các protein theo GO 56
Bảng 2.1. Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu 79
Bảng 3.1. Danh sách và trình tự các mồi được sử dụng trong nghiên cứu 141
Bảng 3.2. Trình tự D-loop sử dụng trong phân tích đa dạng di truyền ở các
quần thể tôm sú 146

Bảng 3.3. Thành phần nhóm đơn bội và số lượng kiểu đơn bội của tôm sú
Việt Nam 163

Bảng 4.1. Thông tin về một số microsatellite của tôm sú được sử dụng trong
nghiên cứu 170

Bảng 4.2. Thiết kế các cặp mồi nhân các đoạn microsatellite 171
1

MỞ ĐẦU
Giới thiệu chung
Tôm sú (Penaeus monodon) thuộc giống Penaeus, họ Penaeidae. Về đặc
điểm sinh học, tôm sú là loài sống ở nơi chất đáy là bùn pha cát với độ sâu từ
ven bờ đến 40 m nước và độ mặn từ 5 ÷ 34
0
/
00
. Tôm sú có đặc điểm thường
sinh trưởng nhanh, trong 3 - 4 tháng có thể đạt cỡ trung bình 40 - 50 g. Tôm
trưởng thành tối đa đối với con cái có chiều dài từ 220 -250 mm, trọng lượng
đạt từ 100 - 300g, con đực dài từ 160 - 200 mm, trọng lượng đạt từ 80 -200 g.
Tôm có tính ăn tạp, thức ăn ưa thích là thịt các loài nhuyễn thể, giun nhiều tơ
và giáp xác. Về mặt phân bố, ở nước ta tôm phân bố từ Bắc vào Nam, từ ven
bờ đến vùng có độ sâu 40 m, vùng phân bố
chính là vùng biển các tỉnh Trung
bộ.
Tôm sú (P. monodon) là loài thủy sản được khai thác tự nhiên cũng như
nuôi, mang lại lợi nhuận rất lớn nhờ xuất khẩu tại nhiều nước trên thế giới,
trong đó có các nước châu Á như Thái Lan, Việt Nam, Hàn Quốc, Đài Loan,
Malaysia, Indonesia, Ấn Độ (Rosenberry, 2004). Nghề nuôi tôm sú có ưu thế
rất lớn đối với các nước này vì đây là nguồn tài nguyên bản địa có thể nuôi và
khai thác lâu dài, có đóng góp hết sứ
c quan trọng vào vấn đề an toàn lương
thực, xoá đói giảm nghèo và phát triển kinh tế xã hội của mỗi nước. Vì vậy,
nghề nuôi trồng thuỷ sản của các nước này đã và đang nhận được sự quan tâm
hết sức đặc biệt của chính phủ, lãnh đạo các cấp các ngành cũng như các
doanh nghiệp thuộc khu vực tư nhân. Chiến lược phát triển của toàn khu vực
là làm sao để có được ngành sản xuấ
t tôm sú bền vững, hạn chế được tối thiểu

các tác động tiêu cực đến môi trường, sinh thái. Nền tảng cho chiến lược phát
triển này là phát triển nguồn tôm bản địa với các chương trình nhân giống
khoa học để nâng cao tỷ lệ sống và sự tăng trưởng. Một trong những vấn đề
cấp thiết và có ý nghĩa cực kỳ quan trọng đối với công tác giống tôm là thông
tin về đặc điể
m cấu trúc phân tử của bộ gen (genome) của tôm.

2

Tình hình nghiên cứu genome tôm sú trên thế giới
Nghiên cứu genome sẽ cung cấp những thông tin chính xác nhất cho việc
xác định các tính trạng quan trọng, như: tính kháng bệnh, tính chống chịu đối
với điều kiện môi trường, các tính trạng liên quan đến năng suất, chất lượng
sản phẩm của tôm. Do kích thước genome tôm sú là rất lớn (khoảng trên 2 tỉ
cặp base= 2/3 bộ gene người), nên việc giải mã toàn bộ genome tôm sú đòi
hỏi thời gian nhiều nă
m và chi phí ước tính hàng chục triệu đô la. Vì vậy,
người ta tiếp cận vấn đề giải mã và lập bản đồ gene tôm sú và các loài tôm
kinh tế quan trọng khác, như tôm he/thẻ chân trắng, bằng việc giải mã từng
phần. Chẳng hạn, người ta đã phân tích trình tự đầy đủ genome ty thể
(mtDNA) của tôm sú, với kích thước 15,984 bp, trong đó có 13 gene mã hóa
cho 13 protein, 22 tRNA, 2 rRNA và vùng điều khiển là khoảng 1 kb (Wilson
et al., 2000).
Cho đến nay, những hiểu bi
ết cơ bản về sinh học tôm, đặc biệt quan tâm
đến sự điều khiển sinh trưởng, sinh sản và hệ thống miễn dịch còn rất hạn chế
do thiếu những thông tin về genome của chúng. Một trong các hướng đi quan
trọng của nghiên cứu genome tôm sú là phát triển và ứng dụng các chỉ thị
phân tử DNA để lập bản đồ gene, phục vụ công tác chọn giống và nuôi. Bằng
phương pháp AFLP, năm 2002, Wilson và các cộ

ng sự đã công bố bản đồ di
truyền liên kết genome tôm sú. Tuy nhiên, bản đồ này có mật độ thấp, chỉ bao
gồm 20 nhóm liên kết với tổng khoảng cách là 1,412 cM (Wilson et al., 2002).
Năm 2005, nhóm tác giả Thái Lan gồm Wuthisuthimethavee & cộng sự đã lập
bản đồ liên kết di truyền dựa trên các chỉ thị DNA vệ tinh (microsatellite
marker). Bản đồ này bao gồm 9 nhóm liên kết với tổng khoảng cách là 103,6
cM (Wuthisuthimethavee et al., 2005). Nghiên cứu gần đây nhất của nhóm
tác giả Đài Loan đã xây dựng bản đồ di truyền dựa trên 256 microsatellite và
85 AFLP marker. Kết quả đã phát hiện ra 43 nhóm liên kết ở tôm đực và 46
nhóm liên kết ở tôm cái. Bản đồ di truyền của tôm đực gồm 176 microsatellite
và 49 AFLP marker cách nhau ~11,2 cM với tổng chiều dài genome là 2033,4
3

cM. Bản đồ di truyền của tôm cái gồm 171 microsatellite và 36 AFLP marker
cách nhau ~13,8 cM với tổng chiều dài genome là 2182 cM (You et al., 2010).
Các microsattelite marker tiếp tục được nghiên cứu, phát triển để lập bản đồ
di truyền liên kết và ứng dụng trong chọn giống tôm sú.
Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của các phương pháp
sinh học phân tử hiện đại, nhiều nghiên cứu về gen và gennome tôm, đặc biệt
là những phân tích các đoạn trình tự gene bi
ểu hiện (Express Sequence Tag,
EST) đã đạt được nhiều kết quả góp phần làm sáng tỏ một số cơ chế phân tử
liên quan đến sinh trưởng, sức sinh sản và khả năng kháng bệnh. Một trong
những dự án giải mã genome tôm sú lớn nhất cho đến nay là dự án giải mã
EST/cDNA genome tôm sú (P. monodon) của Thái Lan do Trung tâm Công
nghệ Sinh học (BIOTEC, Thái Lan) thực hiện trong 5 năm (từ năm 2003 đến
2008) với kinh phí đầu tư ban đầu là 60 triệu Baht, tươ
ng đương 1,5 triệu
USD (the Nation, Mar 14, 2003). Dự án này dự kiến tạo ra khoảng 30.000
dòng EST từ các loại mô khác nhau dưới các điều kiện bình thường và điều

kiện ngoại cảnh bất lợi khác nhau. Cơ sở dữ liệu EST của tôm sú sẽ tạo ra một
nguồn thông tin di truyền quan trọng để xác định các marker phân tử như:
microsattelite và SNP để lập bản đồ di truyền liên kết phục vụ cho mục đích
chọ
n tạo giống tôm. Kết quả của dự án này cho đến nay đã thiết lập được
10.000 dòng EST từ 15 thư viện cDNA từ các loại mô khác nhau của tôm sú
trong các điều kiện bình thường và bất lợi để xác định các gene đặc hiệu mô
và các gene đáp ứng với các điều kiện ngoại cảnh bất lợi (bị nhiễm bệnh, tác
động của các yếu tố nhiệt độ, môi trường ). Trong đó, họ
cũng đã xác định
được 997 EST có chứa các microsattelite marker của tôm sú, trong đó 74
locus đã được xác định nằm trong vùng các gene đã biết chức năng
(Tassanakajon et al., 2006).
Tại Hội nghị của các nước Châu Á-Thái Bình Dương đã nhóm họp nhiều
lần để bàn về xây dựng dự án genome tôm sú. Hội nghị gần đây nhất họp tại
Bangkok, Thái Lan (2-3, tháng 10 năm 2004) đã đưa ra nghị quyết: 1) Các
4

nước (bao gồm Australia, Trung Quốc, Nhật Bản, Malaysia, Philippines,
Singapore, Thái Lan, Đài Loan, Việt Nam và Hoa Kỳ) sẽ cùng tham gia vào
đề án giải mã genome tôm sú; 2) Dự án sẽ nhận được sự tài trợ của các nhà tài
trợ như: Ngân hàng Phát triển Châu Á (ADB), Ngân hàng Thế giới (WB), Tổ
chức Nông Lương của Liên Hợp Quốc (FAO), Mạng lưới các Trung Tâm
Nuôi trồng Thủy sản Châu Á Thái Bình Dương (NACA) v.v với số tiền dự
kiến xin tài trợ khoảng 20-30 triệu USD. Một nhà khoa học của Việt Nam,
công tác t
ại Viện Công nghệ sinh học là PGS. TS. Đinh Duy Kháng, cũng đã
được mời và tham dự Hội nghị này. Hội nghị đã hoan nghênh mọi đối tác,
trong đó có Việt Nam, tham gia vào dự án quốc tế cực kỳ quan trọng này. Tuy
nhiên, điều hết sức quan trọng là: phụ thuộc vào năng lực của mỗi đối tác

(nguồn nhân lực, trang thiết bị, các công việc trong nước đã vã đang được
thực hiện liên quan tớ
i giải mã genome tôm sú ) thì mức tài trợ cho mỗi đối
tác tham gia dự án quốc tế giải mã genome tôm sú sẽ được xem xét.

Tình hình nghiên cứu tôm sú trong nước
Nước ta có diện tích mặt nước ngọt, lợ và biển khá lớn, bao gồm các
sông, suối, ao hồ và gần 2000 km bờ biển với thành phần giống loài thủy sản
phóng phú là tiềm năng to lớn để phát triển nuôi trồng thủy sản. Tôm sú là đối
tượng nuôi phổ biến ở các vùng nước lợ
, mặn trên toàn quốc. Nghề nuôi tôm
ở nước ta là một thế mạnh của thuỷ sản. Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất
khẩu thủy sản Việt Nam (VASEP), năm 2010 lần đầu tiên xuất khẩu tôm của
Việt Nam vượt con số 2 tỷ USD, với 241.000 tấn, tăng 13,4% về khối lượng
và 24,4% về giá trị so với 209.567 tấn và 1,675 tỷ USD của năm 2009. Các
chuyên gia ngành thủy sản đánh giá, tôm sú vẫn là đối t
ượng chủ lực quyết
định thành công của nghề nuôi tôm Việt Nam. Năm 2010, diện tích nuôi tôm
sú cả nước đạt 613.718 ha, giá trị xuất khẩu tôm sú ước đạt 1,45 tỷ USD. Việt
Nam đã trở thành một trong 5 quốc gia xuất khẩu tôm lớn nhất thế giới. Tôm
sú Việt Nam đã được xuất khẩu sang hơn 80 nước và vùng lãnh thổ. Duy trì
5

sự ổn định của nghề nuôi tôm phụ thuộc rất nhiều vào nguồn tôm khỏe mạnh
và sự kiểm soát dịch bệnh hiệu quả. Một trong những vấn đề mà nghề nuôi
tôm sú ở Việt Nam cũng như các nước khác trên thế giới đang phải đối mặt là
nguồn tôm giống. Cho đến nay, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành nhưng
gia hóa tôm sú vẫn còn nhiều khó khăn, nguồn tôm giống ch
ủ yếu là đánh bắt
tự nhiên. Hàng năm, ước tính có khoảng hơn 10 tỷ tôm sú giống giai đoạn

PL15 được sản xuất từ hàng nghìn trại sản xuất tôm giống. Tôm bố mẹ cung
cấp cho các trại sản xuất tôm giống hiện nay hầu như hoàn toàn phụ thuộc vào
nguồn tôm bố mẹ tự nhiên và nhập nội (Nguyễn Văn Hảo et al., 2007). Sử
dụng nguồn tôm bố mẹ còn mang tính th
ụ động, tự nhiên, cộng với những yếu
tố khác do chính điều kiện sản xuất kinh doanh tại các trại sản xuất tôm giống
chi phối thường dẫn đến chất lượng tôm sú giống sản xuất không được đảm
bảo, có dấu hiệu suy giảm sinh trưởng, mang mầm bệnh, tiềm ẩn nhiều rủi ro
lớn cho người nuôi tôm.
Trong những năm gần đây, ở nước ta
đã bước đầu chú ý đến các nghiên
cứu nhằm nâng cao chất lượng di truyền và kiểm soát dịch bệnh ở một số
giống thủy sản. Các nghiên cứu mới bước đầu đánh giá tính đa hình trong
quần đàn tôm sú (Nguyễn Thị Thảo et al., 2004, Quyền Đình Thi et al.,
2003); phát hiện bệnh tôm (Lê Thị Hội et al., 2001, Phan Thị Phượng Trang
et al., 2003). Đây là những hướng nghiên cứu phù hợp và có triển vọng,
đặt
cơ sở khoa học, kỹ thuật cho phép có thể thực hiện các nghiên cứu nâng cao
chất lượng của giống thủy sản có giá trị kinh tế cao này. Tuy nhiên, cho đến
nay ở nước ta chưa có công trình nào nghiên cứu sâu về genome tôm sú.
Để tạo tiền đề cho các nghiên cứu và ứng dụng về genome tôm sú, tiếp
cận với trình độ khu vực và quốc tế, góp phần cho công tác nghiên cứu và ứng
dụng công nghệ sinh học trong thủy sản, chúng tôi xây dựng
đề tài nghiên
cứu: “Nghiên cứu giải trình tự một phần bộ gen và xây dựng cơ sở dữ liệu
genome tôm sú (P. monodon)” thuộc Chương trình Công nghệ sinh học thủy
sản của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Việt Nam. Đề tài được tiến
6

hành trong 3 năm (2008-2010), với tổng kinh phí là 2200 triệu đồng. Đề tài có

sự phối hợp giữa Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản I, là một trong những
cơ sở nghiên cứu hàng đầu về nuôi trồng thủy sản, kết hợp với Viện Công
nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam với trang thiết bị hiện
đại và đồng bộ của Nhà nước cho Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ

Gene và đội ngũ cán bộ khoa học trình độ cao.

Mục tiêu của đề tài
Mục tiêu chung của đề tài là giải mã được một phần bộ gene và xây dựng
cơ sở dữ liệu genome tôm sú (P. monodon) phục vụ cho mục đích nghiên cứu
và phát triển nuôi trồng thuỷ sản. Do genome tôm sú rất lớn (trên 2 tỷ bp)
bằng 2/3 bộ gene người, đề tài không đủ kinh phí và điều kiện để giải mã
hoàn toàn nên chỉ có thể ti
ếp cận với một bộ phận các gene được biểu hiện,
thông qua ngân hàng EST/cDNA. Phân tích các dòng EST/cDNA trước hết
cũng chỉ tập trung vào một bộ phận các gene liên quan đến hệ miễn dịch và
các tính trạng sinh trưởng. Đồng thời đề tài tiếp cận với một phần nhỏ của
genomic DNA thông qua các mtDNA và các chỉ thị phân tử SSR để có thể
định hướng cho các ứng dụng trong chọn tạo giống. Đề tài đặt ra mục tiêu cụ

thể là: Tạo ra được 2 ngân hàng gene (EST/cDNA và gDNA/mtDNA) của
tôm sú tự nhiên/nuôi tại Việt Nam với khoảng 2000 - 3000 dòng tế bào mang
các trình tự nucleotide; Xây dựng được cơ sở dữ liệu genome tôm sú; Định
hướng ứng dụng một số kết quả giải mã genome phục vụ công tác chọn, tạo
giống tôm sú; Góp phần đào tạo cán bộ và tăng cường hợp tác quốc tế về
CNSH tôm sú. Đây là công trình nghiên cứu đầu tiên về genome tôm sú ở
Vi
ệt Nam.

7

CHƯƠNG 1. NGHIÊN CỨU TẠO NGÂN HÀNG cDNA/EST
VÀ GIẢI MÃ MỘT PHẦN TRÌNH TỰ cDNA/EST CỦA
GENOME TÔM SÚ VIỆT NAM

1.1. GIỚI THIỆU
Phương pháp phân lập và phân tích các đoạn trình tự gene biểu hiện
(Expressed Sequence Tag, EST/ cDNA) là một trong các phương pháp sinh
học phân tử hiện đại nhằm tập chung nghiên cứu các gen chức năng. Trong
những năm gần đây, các nghiên cứu về cDNA/EST của genome tôm sú đã đạt
được một số kết quả góp phần làm sáng tỏ một số cơ chế phân tử liên quan
đến sinh trưởng, sức sinh sản và khả năng kháng bệnh. Từ nă
m 1999, Lehnert
và các tác giả khác đã thiết lập thư viện EST từ các bộ phận đầu ngực, cuống
mắt và chân bơi của tôm sú và xác định được 60 gen mới (Lehnert et al.,
1999). Sau đó, hàng loạt gen liên quan đến miễn dịch của tôm sú cũng được
phân lập và xác định trình tự bằng phương pháp phân tích cDNA/EST
(Supungul et al., 2002, Supungul et al., 2004). Dự án giải mã cDNA/EST của
các nhóm nghiên cứu ở Thái Lan đã tạo ra hơn 10,000 dòng EST từ 15 thư
viện cDNA từ các mô khác nhau củ
a tôm sú thường và tôm sú bị gây nhiễm
virus (Tassanakajon et al., 2006). Thái Lan đã thiết lập ngân hàng dữ liệu
cDNA/EST của tôm sú riêng (
), số lượng EST
được lưu giữ ở đây hiện nay đã tăng đáng kể và nhiều hơn con số được công
bố ở ngân hàng Genbank/EMBL/DDBJ, tuy nhiên cơ sở dữ liệu này chỉ được
khai thác nội bộ trong các nhóm nghiên cứu của Thái Lan và các nhóm có hợp
tác. Tuy vậy, các gen mã hóa các protein vẫn chưa được phân tích nhiều và số
lượng những gen này còn khá ít ỏi so với kích thước bộ gen 2,5 Gb của tôm
sú.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành thiết lậ
p thư viện cDNA/EST
được từ các mô khác nhau của tôm sú Việt Nam nhằm giải mã các trình tự
8

cDNA/EST và xây dựng cơ sở dữ liệu genome nhằm cung cấp thông tin di
truyền hữu ích để nghiên cứu các gen chức năng, các marker phân tử như
microsatellite và đa hình các nucleotide đơn (SNP) phục vụ cho việc chọn
giống. Trước hết, nhằm xây dựng các phương pháp thực hiện nội dung của đề
tài, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu thiết lập các quy trình tạo ngân hàng
cDNA tôm sú từ các mô khác nhau. Cho đến nay, đã có rất nhiều phương
pháp để tạo thư vi
ện cDNA/EST. Các phương pháp này khác nhau ở phương
pháp tổng hợp cDNA, cấu trúc của các vector tái tổ hợp và các dòng tế bào
chủ thích hợp (Meissner et al., 1987, Ohara et al., 2001). Chúng tôi nghiên
cứu khảo sát các phương pháp khác nhau nhằm tìm ra quy trình hiệu quả nhất
để phục vụ mục đích của đề tài giải mã một phần bộ gen tôm sú Việt Nam.


1.2. NGUYÊN LIỆU
1.2.1. Thu thập mẫu
Chúng tôi đã tiến hành thu thập mẫu tại Trạm Nghiên cứu thủy sản nước lợ
thuộc Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản I, km10 đường cao tốc Hải
Phòng - Đồ Sơn và các đầm nuôi tư nhân vùng lân cận. Các mẫu tôm thu thập
bao gồm:
- Tôm sú 2-4 tháng tuổi, (khoảng 15-25 g): 15 kg;
- Tôm sú trưởng thành không bị bệnh (80 – 200 g): 15 kg;
- Tôm sú bị bệnh đốm trắng (80 – 200 g): 15 kg;
- Tôm sú bị bệnh đầu vàng (80 – 200 g): 15 kg
- Tôm bố mẹ: 100 con

Ngay sau khi nh
ận tôm nguyên con, các mô khác nhau (cơ, mắt, gan-tụy…)
đã được tách riêng và chia vào các ống giữ mẫu. Các mẫu được bảo quản
trong dung dịch nitơ lỏng.


9

1.2.2. Hóa chất
Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu này được nhập khẩu từ các hãng
Fermentas, Sigma Aldrich, Promega… Các hóa chất này gồm có:
- Hóa chất tách chiết RNA tổng số: TRIzol (Invitrogen), Chloroform,
Isopropyl alcohol, Ethanol.
- Tinh sạch mRNA: PolyAtract mRNA Isolation System III Kit
(Promega).
- Tổng hợp cDNA và tạo thư viện cDNA/EST:
+ CloneMiner cDNA Library Construction Kit (Invitrogen)
+ Lambda ZAP II library Kit (Stratagene)
+ Gigapack III Gold packaging extract Kit (Stratagene)
- Hóa chất chạy điện di:
+ Agarose
+ Dung dịch đệm TAE (Tris-acetate-EDTA) 1X
+ Dung dịch đệm tra mẫu: Glycerol 20%; Tris-Cl 0,1 M (pH = 8);
EDTA 0,01 M (pH = 8); bromophenol blue 0,25%.
+ Thang DNA chuẩn
+ Dung dịch nhuộm gel ethidium bromide (EtBr)
- Hóa chất tách plasmid: Sol I (50mM Glucose, 25 mM Tris-HCl,
10mM EDTA), Sol II (0,2N NaOH, 1% SDS), Sol III (3M CH
3
COOK),

Phenol, Chroloform, Isoamyl alchohol, Ethanol, Natri acetate.
- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: LB, SOC
- Kháng sinh: Kanamycine, Tetracycline, Ampicillin
- Xác định trình tự: BigDye

Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit
của hãng Applied BioSystems (ABI, Mỹ).




10

1.2.3. Thiết bị
Các thiết bị được sử dụng thuộc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công
nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam,
bao gồm:
- Pipetman các loại (Gilson, Pháp).
- Bể điện di PowerPac 300 (Bio-Rad, Mỹ)
- Bể ổn nhiệt (Tempette Junior Techne).
- Máy khuấy trộn Vortex (OSI Rotolab).
- Cân phân tích (Mettler Toledo, Thụy Sỹ).
- Lò vi sóng (Sharp, Nhật Bản).
- Máy chụp ảnh (Bio-Rad, Mỹ).
- Máy làm khô chân không (Automatic Environmental Speed-Vac
System, AES 1010, Savant, Mỹ).
- Máy ly tâm lạnh (Biofuge, Sorvall).
- Máy li tâm Eppendorf 5415C (Eppendorf, CHLB Đứ
c).
- Tủ lạnh sâu -20

o
C, -80C (Sanyo, Nhật Bản).
- Máy PCR PTC-100 (MJ Research, Inc., Mỹ), GeneAmp

PCR System
9700 (ABI, Mỹ).
- Máy xác định trình tự tự động ABI PRISM
TM
3100 Genetic Analyzer
(ABI, Mỹ).

1.3. PHƯƠNG PHÁP
1.3.1. Tách chiết RNA tôm sú
- Chuẩn bị: dụng cụ nghiền mẫu (Hình 1.1) được ngâm rửa trong dung dịch
nước chứa 0.1% DEPC. Sau đó, dụng cụ được khử trùng 20 phút ở nhiệt độ
120
o
C và áp suất cao.
- Mẫu mô tôm sú được giữ trong nitơ lỏng, được chuyển nhanh sang dụng cụ
nghiền mẫu. Bổ sung dung dịch TRIzol (Invitrogen) vào dụng cụ nghiền mẫu
với tỷ lệ 100 mg mẫu: 1 ml TRIzol.
11

- Đặt dụng cụ nghiền lên một hộp xốp
đựng nước đá và thực hiện thao tác
nghiền mẫu cho đến khi mẫu mô tôm sú
nhuyễn mịn trong dung dịch TRIzol.
- Sau khi nghiền mẫu xong, chuyển hỗn
hợp TRIzol từ dụng cụ nghiền mẫu sang
các ống Eppendorf 1,5 ml với thể tích

khoảng 1 ml/ 1 ống (mỗi ống Eppendorff
tương đương với 1ml TRIzol bổ sung ban
đầu).

Hình 1.1. Dụng cụ nghiền mẫu
(Homogenizer)
- Ủ mẫu ở nhiệt độ phòng 10 phút.
- Bổ sung 0,2 ml Chloroform vào mỗi ống (theo tỉ lệ 0, 2ml Chloroform /1 ml
TRIzol bổ sung ban đầu). Lắc mạnh ống bằng tay hoặc vortex trong 15-20
giây sau đó chuyển sang máy ly tâm, ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở
4
o
C.
- Sau khi ly tâm xong, hút dịch ở pha trên một cách cẩn thận chuyển sang ống
Eppendorf 1,5 ml sạch. (Pha trên là pha nước có chứa RNA tổng số)
- Bổ sung 0,5 ml Isopropyl alcohol (2-propanol) vào mỗi ống (theo tỉ lệ 0,5
ml Isopropyl alcohol /1ml TRIzol bổ sung ban đầu). Ủ mẫu ở nhiệt độ phòng
trong 30 phút để tủa RNA tổng số.
- Ly tâm 12000 vòng/ phút trong 15 phút ở 4
o
C. Loại bỏ dịch và thu lấy tủa
RNA.
- Bổ sung 1ml Ethanol 70% vào mỗi ống để rửa tủa RNA. Ly tâm 12000
vòng/ phút trong 15 phút ở 4
o
C và loại bỏ dịch. Lặp lại bước rửa thêm một lần
nữa.
- Làm khô tủa RNA tự nhiên ở nhiệt độ phòng trong khoảng 15 phút .
- Hòa tan RNA tổng số trong 200 µl nước hoặc dung dịch TE đã được xử lý
DEPC.

12

- Kiểm tra RNA tổng số bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% và đo
quang phổ ở bước sóng 260nm.
- Bảo quản RNA tổng số ở -80
o
C.

1.3.2. Tinh sạch mRNA
1.3.2.1. Nguyên lý
mRNA (có đuôi PolyA
+
ở đầu 3’) được tinh sạch bằng cách sử dụng bộ kit
“ PolyAtract
®
mRNA Isolation Systems III” (Promega). Nguyên lý của quá
trình tinh sạch được thể hiện ở Hình 1.2

Hình 1.2. Sơ đồ nguyên lý quá trình tinh sạch mRNA từ RNA tổng số

13

1.3.2.2. Tiến hành:
- Chuẩn bị lượng RNA tổng số (khoảng 0,1 – 1 mg) chứa trong ống
Eppendorf 1,5 ml. Bổ sung thêm nước cất đã khử bằng RNAse tới thể tích
500 µl.
- Ủ mẫu ở 65
o
C trong 10 phút.
- Bổ sung 3 µl mẫu dò Biotinylated_Oligo(dT) Probe và 13 µl dung dịch 20X

SSC vào mẫu, trộn nhẹ rồi đem ủ ở nhiệt độ phòng đến khi nhiệt độ hỗn hợp
hạ xuống (khoảng 10 phút).
- Trong khi chờ nhiệt độ hạ xuống: chuẩn bị dung dịch 0,5 X SSC và 0,1 X
SSC.
 Pha 1,2 ml dung dịch 0,5 X SSC bằng cách bổ sung 30 µl dịch 20X
SSC vào 1,170 ml nước cất đã khử RNAse
 Pha 1,4 ml dung dịch 0,1X SSC bằng cách bổ sung 7 µl dịch 20X SSC
vào 1,393 ml nước cất đã khử
RNAse
- Sau khi chuẩn bị xong 2 dung dịch 0,5 X SSC và 0,1 X SSC, tiến hành bước
rửa hạt sắt từ Streptavidin-Paramagnetic Particles (SA-PMPs). Các hạt sắt từ
SA-PMPs cần được giữ ổn định trong dung dịch đệm chứa BSA, dung dịch
này cần được loại bỏ trước khi làm các bước thực hiện tiếp theo. Bước rửa hạt
sắt từ được thực hiện như sau: Đầu tiên, búng nhẹ ống hạt sắt từ để các h
ạt
phân tán đều trong dung dịch tiếp đó chuyển ống hạt sắt từ lên trên cột nam
châm. Sau khoảng 5 giây các hạt sắt từ sẽ bị hút về phía thanh nam châm.
Dùng pipette để hút loại bỏ toàn bộ dung dịch trong ống. Tiếp đến, chuyển
ống ra khỏi cột trộn, bổ sung 300 µl dung dịch 0,5X SSC, trộn đều nhẹ nhàng
để rửa hạt, sau đó lại chuyển ống chứa các hạt sắt từ lên cột nam châm rồi hút
loại bỏ dịch rửa. Lặp lại bước rửa này 2 lần nữa để chắc chắn toàn bộ dịch
đệm bảo quản đã được loại bỏ. Cuối cùng, bổ sung 100 µl dung dịch 0,5X
SSC và trộn đều nhẹ để các hạt khuếch tán đều trong dung dịch.
- Bổ sung 500 µl RNA tổng số vào trong 100 µl dung dịch chứa hạt sắt từ đã
qua xử lý. Hạt sắt từ bọc Streptavidin sẽ tươ
ng tác với Biotin đã gắn với mẫu
14

dò Oligo(dT). Ủ hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 10 phút búng nhẹ
mỗi 1-2 phút/lần.

- Tiếp đến chuyển ống dung dịch lai lên cột nam châm để loại bỏ dịch. Ở
bước này, mRNA đã được gắn vào bề mặt hạt sắt từ.
- Rửa hạt sắt từ đã gắn mRNA bằng dung dịch 0,1X SSC như sau: bổ sung
300 µl dung dịch 0,1X SSC, trộn đều nhẹ nhàng, sau đó chuyển ố
ng chứa các
hạt sắt từ lên cột nam châm rồi hút loại bỏ dịch rửa. Lặp lại bước rửa này 2
lần với các thao tác tương tự.
- Bổ sung 100 µl nước cất đã khử RNAse, trộn đều nhẹ nhàng để các hạt sắt
từ khuếch tán đều trong dung dịch. Với bước này, mRNA được hòa tan lại
trong nước. Tiếp theo, đưa ống mẫu chứa các hạt sắt từ lên cột nam châm. Sau
khi các h
ạt sắt từ đã bị hút hoàn toàn về một phía, tiến hành hút toàn bộ phần
dung dịch chứa mRNA chuyển sang ống ống Eppendorf 1,5 ml mới, giữ mẫu
tạm thời trên đá. Tiếp tục bổ sung 150 µl nước nước cất đã khử RNAse vào
ống chứa các hạt sắt từ vừa rồi và lại tiếp tục lặp lại bước trên để thu lấy dung
dịch chứa mRNA còn lại rồi chuyển toàn b
ộ dịch thu được vào 100 µl dịch
trước đó (tổng thể tích 250 µl).

1.3.3. Tạo thư viện cDNA tôm sú từ các mô sử dụng phage lambda vector
1.3.3.1. Tổng hợp cDNA có chứa điểm cắt enzyme giới hạn EcoRI và
XhoI ở hai đầu
Nguyên lý
Tổng hợp cDNA được tiến hành bằng cách sử dụng bộ kit “ Lambda ZAP II
library” (Stratagene). Nguyên lý của quá trình tổng hợp cDNA được thể hiện
ở Hình 1.3
15


Hình 1.3. Sơ đồ nguyên lý của quá trình tổng hợp cDNA

Các bước thực hiện
* Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất
- Chuẩn bị thành phần phản ứng tổng hợp sợi đơn cDNA thứ nhất như sau:
5 µl 10X First-Strand Buffer
3 µl First-Strand Methyl Nucleotide Mix
2 µl Linker-Primer (1,4 µg/ µl)
1 µl RNAse Block Ribonuclease Inhibitor (40 U/ µl)
5 µg PolyA RNA (mRNA)
Bổ sung nước đã khử DEPC sao cho tổng thể tích là 47 µl.
- Trộn đều thành phần phản ứng sau đó ly tâm nhẹ để toàn bộ phần dịch tập
trung ở phần đáy ống, để ở nhiệt
độ phòng trong khoảng 10 phút để thực hiện
phẩn ứng gắn mồi.
- Bổ sung 3 µl enzyme reverse transcriptase (AccuScript RT) vào ống mẫu
nghiên cứu trộn đều sau đó ly tâm nhẹ. Lúc này tổng thể tích của phản ứng là
50 µl.
- Ủ mẫu ở 42
o
C trong 1 giờ. Sau 1 giờ ủ, mẫu phản ứng thứ nhất được giữ
trên đá để chuẩn bị cho các thí nghiệm tiếp theo.