Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán và nghiên cứu vi khuẩn lậu

Bộ giáo dục v đo tạo Bộ y tế
Trờng đại học y h nội


Lê văn hng


Chuyên đề 3
ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử
trong chẩn đoán v nghiên cứu vi khuẩn lậu



Chuyên đề sâu có liên quan đến nội dung luận án tiến sỹ chuyên ngành y
học: "Xác định vi khuẩn lậu v phát hiện đột biến gen
kháng Ciprofloxacin bằng kỹ thuật sinh học phân tử
tại Viện Da liễu Quốc gia từ năm 2005 - 2007"


Chuyên ngành Vi sinh vật
Mã số: 62.72.68.01







Hà Nội - 2008
Bộ giáo dục v đo tạo Bộ y tế
Trờng đại học y h nội

Lê văn hng


Chuyên đề 3
ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử
trong chẩn đoán v nghiên cứu vi khuẩn lậu



Chuyên đề sâu có liên quan đến nội dung luận án tiến sỹ chuyên ngành y
học: "Xác định vi khuẩn lậu v phát hiện đột biến gen
kháng Ciprofloxacin bằng kỹ thuật sinh học phân tử
tại Viện Da liễu Quốc gia từ năm 2005 - 2007"

Chuyên ngành Vi sinh vật
Mã số: Mã số: 62.72.68.01



Ngời hớng dẫn khoa học: PGS. TS Lê Văn Phủng




Hà Nội - 2008
Mục lục

Trang

1. Tầm quan trọng của Y sinh học phân tử
hiện nay
1
2. Tình hình ứng dụng sinh học phân tử
trong lĩnh vực y họ
5
2.1. Trên thế giới
5
2.2. Trong nớc
8
3. Một số kỹ thuật sinh học phân tử thờng
dùng
8
3.1. PCR
8
3.2. Tách, tạo dòng gen
20
3.2.1. Chọn và xử lý vector
20
3.2.2. Xử lý ADN cần tạo dòng
20
3.2.3. Tạo vector tái tổ hợp
20
3.2.4. Chuyển vetor tái tổ hợp vào tế bào chủ
21
3.3. Thao tác gen
21
3.3.1. Cắt
21
3.3.2. Gắn

23
3.3.3. Biến nạp
24
3.3.4. Tiếp hợp
24
3.4. Biểu hiện gen
26
3.4.1. Quá trình sao mã (phiên mã)
27
3.4.2. Phân khúc
27
3.4.3. Dịch mã
27
3.5. Giải trình tự gen
28
3.5.1. Tổng quan
28
3.5.2. Tại sao phải xác định trình tự ADN
28
3.6. Tinh sạch protein
30
3.7. Thông tin sinh học
31
4. ứng dụng sinh học phân tử trong xác định
v nghiên cứu N.gonorrhoeae
33
4.1. Kỹ thuật lai
35
4.2. Kỹ thuật khuếch đại ADN
37

4.3. Một số kỹ thuật sinh học phân tử khác đ 42
và đang đợc sử dụng rộng ri trong xác
định và nghiên cứu N.gonorrhoeae
5. Kết luận 43

Chữ viết tắt

AAGAP Ala-Ala-Glu-Ala-Pro
ADN
Acid deoxyribonucleic
ARN
Acid ribonucleic
BAC Bacterium artificial chromosomes
BSA
Bovine Serum Abumin
cat chloramphenicol acetyltransferase
CDC Centers for Disease Control and Prevention
CMRNG
Chromosomally mediated resistant N. gonorrhoeae: N.
gonorhoeae kháng thuốc qua trung gian nhiễm sắc thể
CSWs Commercial sex workers: gái mại dâm
DGI Disseminated gonococcal infection: nhiễm vi khuẩn lậu lan tỏa
DMSO
Dimethyl sulfoxide
Fbp Ferric binding protein: protein gắn sắt
FDA Food and Drug Administration: Cơ quan quản lý thực phẩm và
dợc phẩm
FrpB Fe-regulated protein B: protein điều hòa sắt
Frps Ferric-repressible proteins: Các protein ức chế sắt
GASP Gonococcal Antimicrobial Surveillance Programme: chơng

trình giám sát toàn cầu về độ nhạy cảm của vi khuẩn lậu với
kháng sinh
HAM Homosexually active male: đồng tính luyến ái nam
Hb Hemoglobin
KDO Ketodeoxy deoxy octanoic acid
LCR Ligase chain reaction: phản ứng chuỗi ligase
LF Lactoferrin
LOS lipo-oligosaccharide
LPS Lipopolysacharide
LTQĐTD Lây truyền qua đờng tình dục
Met Methionin
MIC Minimum inhibitory concentration: nồng độ ức chế tối thiểu
mM Mili mole
NAG
Nonagglutination: Không ngng kết
PBPs Penicillin-binding proteins: protein gắn Penicillin
PCR Polymerase Chain Reaction: Phản ứng chuỗi polymerase
PFGE Pulsed field gel electrophoresis: điện di trờng xung
Por Protein porin
PPNG
Penicillinase-producing Neisseria gonorrhoeae: vi khuẩn lậu
sản sinh men Penicillinase.
QRNG
Quinolone-resistant Neisseria gonorrhoeae: vi khuẩn lậu kháng
Quinolone
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism: kỹ thuật đa hình
chiều dài đoạn cắt giới hạn
Rmp Reduction modifiable protein: protein có thể biến đổi khử
RT-PCR
Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis: điện
di trên gel polyacrylamid
STD
Sexually Transmitted Disease: bệnh lây truyền qua đờng tình
dục
TEM Transfer Electronic Microscopy: Kính hiển vi điện tử dẫn truyền
TF Transferin
Tm
Melting temperature: nhiệt độ biến tính
TMA Transcription-mediated amplification: khuếch đại qua trung gian
bản sao
TRNG
Tetracycline-resistant Neisseria gonorrhoeae: vi khuẩn lậu
kháng tetracycline
WHO World Health Organization: tổ chức Y tế thế giới

ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn
đoán v nghiên cứu vi khuẩn lậu

1. Tầm quan trọng của Y sinh học phân tử hiện nay
Sinh học phân tử là một ngành của sinh học. Nó nghiên cứu các vấn đề về
hình dạng, cấu trúc và chức năng của các đại phân tử có vai trò quan trọng
với sự sống nh các acid nucleic, protein đặc biệt là vai trò của chúng trong
sự nhân lên của tế bào cũng nh sự truyền lại các thông tin di truyền.
Cơ sở của sinh học phân tử là sinh lý y học, di truyền và hóa sinh.
- Đối với các bệnh nhiễm trùng: Chẩn đoán nhanh, đặc hiệu, cơ chế gây
bệnh, đột biến, kháng thuốc, các bệnh mới xuất hiện.
Sinh học phân tử ngày càng đóng vai trò quan trọng và là một phơng tiện
hữu dụng trong chẩn đoán các vi sinh vật gây nhiễm trùng. Cho tới nay, việc
xác định các căn nguyên gây nhiễm trùng thờng dựa vào các phơng pháp

xác định trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua việc xác định hình thể, tính chất
bắt màu, tính chất sinh vật hoá học, tính chất ly giải bởi phage, gây bệnh
thực nghiệm, hoặc sự xuất hiện của các kháng thể đặc hiệu trong máu. Các
kỹ thuật này nói chung là mất nhiều thời gian, trong nhiều trờng hợp cũng
khá tốn kém và đặc biệt là có độ nhạy và độ đặc hiệu không cao. Ngoài ra,
một yêu cầu thiết yếu đối với các kỹ thụât này là cần một lợng vi sinh vật
đủ lớn trong bệnh phẩm để có thể phát hiện đợc dới kính hiển vi hoặc vi
sinh vật mọc đợc trên những môi trờng nhân tạo. Tuy nhiên, trong nhiều
trờng hợp, do số lợng bệnh phẩm ít, hoặc bản thân vi khuẩn bị chết, hoặc
mọc rất chậm thì việc xác định bằng các kỹ thuật này gặp rất nhiều khó
khăn, thậm chí là không thể xác định đợc vi sinh vật. Trong khi đó, nếu áp
dụng các kỹ thuật sinh học phân tử, kết quả xác định căn nguyên vi sinh vật
sẽ nhanh hơn, nhiều trờng hợp đỡ tốn kém hơn. Đặc biệt, các kỹ thuật này

1
cho các kết quả có độ nhạy, độ đặc hiệu rất cao, gần 100%. Song song với
việc xác định nhanh căn nguyên vi sinh vật với độ chính xác cao, các kỹ
thuật sinh học phân tử còn có thể cho biết một số cơ chế gây bệnh của vi sinh
vật. Ví dụ, bằng việc sử dụng những cặp mồi đặc hiệu cho các gien qui định
các yếu tố độc lực của các E. coli gây tiêu chảy, ngoài việc phát hiện sự có
mặt của các loại E. coli này, ngời ta còn xác định sự có mặt của các gien
qui định yếu tố độc lực trên và gián tiếp nói lên cơ chế gây bệnh của chúng
[33]. Hay trong trờng hợp xác định độc tố ruột của Staphylococcus aureus
cũng vậy [10, 29]. Việc xác định S. aureus và sự có mặt của một hoặc một
vài độc tố ruột có thể đợc phát hiện cùng một lúc bằng kỹ thuật Phản ứng
chuỗi trùng hợp (PCR). PCR cũng cho phép xác định sự có mặt của một hoặc
một gien liên quan đến sự kháng thuốc của vi sinh vậ. Ngoài ra, sử dụng một
số cặp mồi đặc biệt có khả năng khuếch đại một vùng gien đặc trng của một
loại vi sinh vật nào đó nh nấm, vi khuẩn, virus ngời ta có thể xác định
căn nguyên gây bệnh trong một loại bệnh phẩm nào đó. Trong một số trờng

hợp, bằng việc giải trình tự một đoạn nucleotide, sau đó so sánh trình tự này
với các trình tự sẵn có trên ngân hàng gien, ngời ta có thể biết rằng đoàn
nucleotide đó là của một vi sinh vật đã đợc nghiên cứu hoặc là một vi sinh
vật mà cha đợc biết.
- Đối với bệnh ung thu: Chẩn đoán, cơ chế, can thiệp
Hiện nay, ung th là một trong những bệnh có tỷ lệ mắc khá cao. Vì sao ung
th khó chẩn đoán và điều trị? Nó là bệnh có tỷ lệ tử vong cao nhất ở các
nớc đang phát triển. Vấn đề là ở chỗ, ung th là một bệnh có cơ chế,
nguyên nhân tiến triển rất phức tạp. Dới sự phát triển của khoa học công
nghệ, đặc biệt là các kỹ thuật sinh học phân tử, ngời ta đã tìm thấy nhiều
yếu tố về mặt di truyền liên quan đến cơ chế phát sinh và tiến triển của ung
th. Cho tới nay, ứng dụng của sinh học phân tử trong lĩnh vực ung th tập
trung ở ba khía cạnh chính:

2
+ Xác định các bệnh nhân có những yếu tố thuận lợi về mặt di truyền
để phát sinh ung th (ví dụ nh phát hiện các đột biến của các tế bào sinh
dục ở bệnh nhân trong gia đình có tần xuất ung th cao) và phát hiện các
thay đổi về mặt di truyền ở các tế bào sinh dỡng có nguy cơ bị tổn thơng
và dẫn đến ung th.
+ Phát hiện sớm: Biện pháp tốt nhất để chống lại ung th là phát hiện
sớm. Việc xác định sớm ung th sẽ mang lại hiệu quả điều trị cao. Nếu phát
hiện muộn, việc điều trị thờng khó khăn và tiên lợng xấu.
+ Các kỹ thuật sinh học phân tử mới cũng đang đợc phát triển nhằm
vào các tế bào ung th hoặc môi trờng của khối u. Ngời ta đã áp dụng
nhiều kỹ thuật sinh học phân tử để chẩn đoán, điều trị cũng nh nghiên cứu
nhiều dạng ung th nh ung th tuyến giáp, ung th tiền liệt tuyến, ung th
dạ dày ruột, ung th phổi, ung th vú.Ví dụ, sự có mặt của một số yếu tố
di truyền nh sự thiếu hụt gien gây bệnh thiếu máu Fanconi BRCA2 và sự
nhạy cảm với mitomycin C liên quan đến ung th [5, 27, 32]. Những gien có

khả năng gây ung th (H-ras, erbB-2, EGFR, MDM2, C-MYC, CCND1),
hoặc những gien có vai trò trong sự ức chế các khối u (p53, Rb, p21,
p27/KIP1, p16, PTEN, STK15, FHIT, FEZ1/LZTS1, bc10), đã đợc nghiên
cứu rất nhiều trong ung th bàng quang và một số dạng ung thu khác [3, 19,
45]. Trong ung th tuyến giáp, ngời ta thấy có sự thay đổi kiểu RET/PTC
và các đột biến điểm của các gien BRAF và RAS [24, 46]. Việc nghiên cứu,
phát hiện các gien này đều đợc thực hiện nhờ các kỹ thuật sinh học phân tử.
Các kỹ thuật này ngày càng cung cấp các thông tin và những hiểu biết mới
về cơ sở di truyền, cơ chế phát sinh, gâybệnh, chẩn đoán, tiên lợng và cả
điều trị ung th.
- Đối với bệnh di truyền: Chẩn đoán (đặc biệt là chẩn đoán trớc sinh), co
chế, đột biến, can thiệp, t vấn di truyền

3
Hiện nay, các bệnh lý di truyền đang là một vấn đề đợc các nhà sản khoa,
nhi khoa rất quan tâm. Gien là đơn vị cấu trúc cơ bản của vật liệu di truyền.
Protein là sản phẩm của các gien. Mỗi protein có một vai trò nhất định trong
tế bào, từ đó, tạo ra các chức năng của mô và cơ quan. Sự khiếm khuyết của
gien và chức năng không toàn vẹn của protein có thể dẫn đến những rối loạn
cấu trúc, chức năng của cơ thể. Trong nhiều trờng hợp, sẽ có biểu hiện bệnh
lý. Những biểu hiện bệnh lý trên lâm sàng hoặc cận lâm sàng xuất hiện khi
đứa trẻ sinh ra gọi là các bênh lý di truyền. Ví dụ nh bệnh McArdle hay là
bệnh rối loạn chuyển hoá Glycogen týp V. Đây là một bệnh rối loạn chuyển
hoá di truyền theo tính trạng lặn. Bệnh do thiếu hụt glycogen phosphorylase
dạng iso ở cơ. Đây là một enzyme ở cơ xơng có vai trò trong việc phân huỷ
glycogen. Lần đầu tiên, Brian McArdle đã mô tả các triệu chứng lâm sàng
của bệnh này voà năm 1951. Gần đây, ngời ta đã nghiên cứu các cơ chế di
truyền phân tử của bệnh này. Kết quả cho thấy, bệnh xuất hiện là do có các
đột biến trên gien PYGM (tới 65 đột biến) [2]. Vì các rối loạn liên quan đến
vật liệu di truyền có thể xuất hiện trong tế bào ngay từ khi đa trẻ cha ra

đời. Do vậy, nếu có thể phát hiện sớm các rối loạn di truyền này, ngời ta có
thể có hớng xử lý thích hợp tuỳ từng trờng hợp. Ngoài ra, nếu những rối
loạn di truyền có liên quan đến cả ngời bố và mẹ, bằng các kỹ thuật sinh
học phân tử, ngời ta có thể xác định các thay đổi di truyền này và các thông
tin nh vậy có thể dùng để t vấn trớc sinh.
- Đối với sản xuất thuốc và các chế phẩm sinh học, protein tái tổ hợp
(insulin, yếu tố VIII), vacxin (viêm gan B, HPV, các vacxin ADN), chế
phẩm điều trị
Trong giai đoạn hiện nay, do sự bùng nổ của khoa học công nghệ, các kỹ
thuật sinh học phân tử không chỉ đợc áp dụng trong lĩnhvực chẩn đoán, điều
trị, mà nó còn đợc áp dụng rộng rãi trong công nghệ dợc nhằm sản xuất ra
các loại dợc phẩm mới, hay trong việc sản xQất `a cc ciế phẩm 3inh học.

4
Mộp tr.ng .hữne ch ph@m s)nh học đang đợc sử dụng rộng rãi hiện nay là
insulin. Ban đầu, insulin đợc sản xuất từ tuỵ của bò, lợn, ngựa, cả cá. Nhng
sau này nhờ công nghệ tái tổ hợp, ngời ta có thể tạo ra insulin nhân tạo
hoàn toàn trong phòng thí nghiệm. Insulin đợc sản xuất bằng công nghệ di
truyền đã đợc sử dụng rộng rãi trên lâm sàng. Để làm đợc việc này, ngời
ta đã đa đoạn gien chịu trách nhiệm sản xuất insulin của ngời vào bộ gien
của một loài vi khuẩn, virut nào đó, E. coli chẳng hạn. Khi vi khuẩn nhân
lên, đoạn gien chèn vào cũng đợc nhân lên, sao mã, dịch mã và tổng hợp ra
protein tơng ứng [1, 7, 48]. Ngoài insulin, nhiều chế phẩm khác nh
vaccine cũng đợc sản xuất bằng công nghệ di truyền. Một số vaccine đã và
đang đợc nghiên cứu bằng công nghệ tái tổ hợp nh vaxcin phòng virus
viêm gan B, vaxcin phòng viêm não Nhật Bản, vaxcin phòng Tả[21, 22,
42, 49]. Việc áp dụng các kỹ thuật di truyền, sinh học phân tử đã và đang tạo
ra một xu hớng mới trong y sinh học.

2. Tình hình ứng dụng sinh học phân tử trong lĩnh vực y học

- Trên thế giới
Các kỹ thuật sinh học phân tử đã đợc áp dụng rộng rãi trên thếgiới từ nhiều
năm nay. Đặc biệt, kể từ sau khi kỹ thụât PCR ra đời (nửa đầu những năm
1980), sinh học phân tử đã có những bớc tiến vợt bậc. Ngời ta đã có thể
thao tác với các vật liệu di truyền nh ADN, ARN, proteintrong phòng thí
nghiệm [15, 28, 35]. Thêm nữa, việc tổng hợp ra các vật liệu di truyền trên
với số lợng lớn đã không còn là một vấn đề khó khăn. Nhiều dự án giải
trình tự bộ gien của nhiều động vật, thực vật, và vi sinh vật đã và đang đợc
tiến hành [18, 30, 47]. Những thành tựu của khoa học công nghệ, đặc biệt là
sinh học phân tử đã góp phần quan trọng vào sự hiểu biết của con ngời với
thế giới xung quanh.
- Trong nớc

5
ở Việt Nam, việc áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong các lĩnh vực
khoa học nói chung và y sinh học nói riêng cũng mới đợc triển khai trong
vòng hơn 20 năm. Mặc dù vậy, hiện nay nhiều phòng thí nghiệm cũng đã
đợc trang bị các thiết bị nh máy PCR, Realtime PCR, máy giải trình tự
nucleotide, protein Nhiều đề tài và dự án nghiên cứu đã và đang đợc triển
khai nhằm áp dụng các tiến bộ của khoa học vào nghiên cứu, sản xuất, chẩn
đoán và điều trị [11, 16, 26, 31, 38, 43]. Nhiều kết quả của các công trình
nghiên cứu đã đợc áp dụng vào trong thực tế nhằm xác định các căn nguyên
vi sinh vật (vi khuẩn, virut, ký sinh trùng) gây bệnh. Nhiều nghiên cứu sản
xuất thuốc, chế phẩm sinh học, vaxine đã và đang đợc triển khai. Tuy
nhiên, việc nghiên cứu và áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử ở Việt Nam
còn nhiều hạn chế do thiếu kinh phí để mua trang thiết bị hoặc đầu t cho
các công trình nghiên cứu có khả năng áp dụng cao.

3. Một số kỹ thuật sinh học phân tử thờng dùng
3.1. PCR

Nguyên lý chung
Năm 1985, nhà khoa học ngời Mỹ, Kary B. Mullis đã phát triển phản ứng
chuỗi trùng hợp gọi là Polymerase Chain Reaction. Kỹ thuật này cho phép
nhân bất kỳ một đoạn vật liệu di truyền nào (ADN hoặc ARN) lên hàng tỉ
lần trong một thời gian ngắn [12, 13, 16, 20, 23, 34, 37].
Nguyên lý của phản ứng PCR hoàn toàn dựa theo sự sao chép của ADN
trong tế bào, trong đó, ADN đợc nhân lên theo cơ chế bán bảo tồn. Từ một
phân tử ADN chuỗi kép ban đầu, chúng đợc tách ra làm hai chuỗi đơn, mỗi
chuỗi đơn này sẽ làm khuôn mẫu cho việc tổng hợp sợi ADN mới. Kỹ thuật
PCR đợc thực hiện với một cặp mồi đặc hiệu (mồi này có khả năng bắt cặp,
bổ sung vào hai đầu của hai sợi ADN khuôn theo chiều 5 đến 3 dới tác

6
dụng của enzym Taq ADN polymerase. Đoạn mồi sẽ đợc kéo dài về phía
đầu 3 của mồi để hình thành mạch ADN mới với các nucleotide bổ sung với
các nuclotide trên sợi ADN khuôn. Qua các chu kỳ nhiệt, số lợng đoạn
ADN cần tổng hợp sẽ tăng gấp đôi. Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn:
- Giai đoạn biến tính
ở nhiệt độ 94
0
-95
0
C, đoạn ADN duỗi xoắn và tách hoàn toàn thành hai sợi
đơn.
- Giai đoạn gắn mồi
Nhiệt độ đợc hạ xuống 54
0
-55
0
C các nucleotide trên mỗi đoạn mồi xuôi

và mồi ngợc sẽ gắn bổ sung với các nucleotide ở hai đầu (trên hai sợi) của
đoạn gien cần tổng hợp.
- Giai đoạn kéo dài mồi
Nhờ hoạt động của enzyme Taq ADN polymerase, các dNTPs đợc gắn
vào đầu 3 của đoạn mồi theo trình tự bổ sung với các nucleotide trên sợi
ADN khuôn mẫu. Giai đoạn này đợc thực hiện ở 72
0
C.
Các loại PCR
Có rất nhiều cách phân loại PCR. Trong đó, phân loại theo đoạn vật liệu di
truyền làm đích và số lợng primer rất hay đợc dùng.
+ Theo vật liệu di truyền
Thông thờng, đoạn ADN đợc tổng hợp dựa trên khuôn mẫu là một đoạn
ADN khác. Tuy nhiên, trong một số trờng hợp, ngời ta có thể dùng PCR
để tổng hợp một đoạn ADN cần quan tâm từ đoạn ARN làm khuôn mẫu. Kỹ
thuật này gọi là RT-PCR.
+ Theo số lợng primer dùng trong phản ứng
PCR đơn mồi chỉ sử dụng một cặp mồi đặc hiệu cho một đoạn vật liệu di
truyền cần quan tâm. PCR đa mồi sử dùng trên 2 cặp mồi gắn đặc hiệu vào
hai vị trí trên sợi ADN làm khuôn mẫu.

7
Các thành phần tham gia phản ứng PCR
- Mồi (primer)
Việc thiết kế một mồi để PCR là một khâu quan trọng. Mồi phải đạt đợc
các yêu cầu sau:
Chiều dài từ 18 đến 24 nucleotide
Tỷ lệ G+C/A+T rất quan trọng
Tránh sự lặp lại trật tự các nucleotide trong chuỗi
Tránh sự lặp lại hai hoặc 3 nucleotide theo nguyên tắc bổ sung tại đầu 3

Tránh đầu 3 bắt đầu với A hoặc T
Nhiệt độ dùng để gắn mồi khác nhau ở mỗi loại mồi và đợc tính theo
công thức:
Tm = (G+C) x4
0
C + (A+T) x 2
0
C
Hai mồi của một khuôn phải có Tm xấp xỉ bằng nhau.
- ADN polymerase
Có hai loại: ADN polymerase phụ thuộc ADN và ADN polymerase phụ
thuộc RNA.
ADN polymerase lúc đầu sử dụng cho PCR đợc chiết xuất từ các tế bào
bình thờng do đó không có khả năng chịu nhiệt và bị phá huỷ ở giai đoạn
biến tính. Ngời ta phải cho thêm ADN polymerase sau giai đoạn biến tính
của mỗi chu kỳ. Ngày nay, enzym này đợc chiết xuất từ các vi khuẩn sống
ở suối nớc nóng có khả năng chịu nhiệt cao làm cho phản ứng PCR đơn
giản hơn rất nhiều.
- Vật liệu di truyền làm khuôn cho PCR
Có rất nhiều loại khuôn nh ADN hoặc ARN bao gồm: genomic ADN,
mRNA, cADN, plasmid, phage, cosmid
Lợng khuôn cho mỗi phản ứng PCR cũng khác nhau:
1 g genomic ADN ngời

8
10 ng genomic ADN nấm
1 ng genomic ADN E. coli hoặc vi khuẩn nói chung
1-2 pg plasmid
20 pg Bacteriophage ADN
- 4 loại dNTP

- Dung dịch đệm chứa các loại muối khác nhau đặc biệt là MgCl
2

Máy PCR hoạt động dựa trên nguyên lý thay dổi nhiệt độ nóng và lạnh
một cách nhanh chóng.
Các yếu tố ảnh hởng đến PCR
- Các thành phần tham gia phản ứng
- Nhiệt độ gắn mồi
- Nhiệt độ kéo dài mồi
- Nồng độ MgCl
2
ứng dụng của PCR trong sinh học phân tử
Trong sinh học phân tử: tách dòng gien, phân tích đột biến gien, biểu hiện
gien, phân tích bộ gien
Đối với Y học: PCR đợc dùng trong chẩn đoán bệnh nhiễm trùng, phát
hiện gien độc lực, chẩn đoán và theo dõi quá trình điều trị nhiễm virut, chẩn
đoán trớc sinh nh xác định giới tính thai nhi, bệnh di truyền , ứng dụng
trong pháp y.
Trong vi sinh vt, PCR (Polymerase Chain Reaction) c ng dng rt sm
v ngy cng rng rói chn oỏn cn nguyờn ca cỏc bnh nhim trựng,
tỡm hiu sõu hn v c ch gõy bnh ca chỳng v phõn loi chỳng
mt cỏch chi tit v chớnh xỏc hn. Cú th k túm tt mt s ng dng chớnh
ca PCR trong Vi sinh vt hc nh sau:
a. Xỏc nh cn nguyờn ca cỏc bnh nhim trựng

9
Cǎn cứ vào các đặc điểm (tính trạng) thường gặp nhất của các vi sinh vật
được quan tâm, người ta tìm đến các gen quyết định các tính trạng đó, thiết
kế một bộ gen mồi (primer) phù hợp nhằm để khuyếch đại một vùng ổn định
nào đó trên bộ gen nói trên. Sản phẩm của quá trình khuyếch đại sau này, vì

vậy, đã được xác định (cả về độ dài và trình tự các nucleotide) ngay từ giai
đoạn này.
Khi đưa bộ gen mồi nói trên vào một hỗn hợp ADN đã được tách chiết từ vi
sinh vật, nếu ADN này có chứa các đoạn gen có trình tự các nucleotide bổ
sung với trình tự của gen mồi thì chúng sẽ cặp đôi với nhau và, sau đó, gen
mồi được kéo dài về phía đầu 3' của nó nhờ ADN polymerase. Đoạn ADN
đó, nhờ vậy, sẽ được nhân lên một cách đặc hiệu rất nhiều lần; sau quá trình
nhân lên, người ta sẽ tìm đoạn ADN này, thông thường nhất, bằng điện di
trên gel agarose và nhuộm bằng ethidium bromide. Như vậy, sau khi điện di,
nếu có bǎng ADN chạy giống như bǎng chuẩn thì điều đó có nghĩa là có vi
sinh vật cần tìm trong bệnh phẩm; ngược lại, nếu không thấy bǎng nào xuất
hiện hoặc có những bǎng không giống với bǎng chuẩn thì có nghĩa là không
có tác nhân gây bệnh cần tìm trong bệnh phẩm.
Dựa trên nguyên tắc này, hiện nay, hầu như tất cả các vi sinh vật gây bệnh
đều có thể tìm được nhờ PCR. Sau đây là một số ứng dụng điển hình:
• Dùng PCR cho những vi sinh vật chưa nuôi cấy nhân tạo được hoặc nuôi
cấy rất khó khǎn:
. Các xoắn khuẩn: tất cả các xoắn khuẩn đều khó nuôi cấy.
Tác nhân gây bệnh giang mai (Treponema pallidum), hiện nay vẫn chưa
nuôi cấy nhân tạo được. Người ta có thể dùng nước ối từ mẹ làm bệnh phẩm
cho PCR (1). Nhờ vậy, giang mai bẩm sinh có thể được chẩn đoán rất sớm.

10
Người ta cũng đã dùng PCR để tìm gen mã hoá cho protein màng ngoài (2)
hoặc một đoạn 419-bp (3) của gen mã hoá protein lông của các tác nhân gây
bệnh Lyme (Borrelia burgdorferi). Bằng cách đó, bệnh Lyme có thể được
chẩn đoán sớm và chính xác.
. Các tác nhân gây bệnh đường sinh dục: Tác nhân gây bệnh lậu và các viêm
niệu đạo sau lậu để khó nuôi cấy.
Neisseria gonorrhoeae (4) và các tác nhân thường gây viêm niệu đạo sau lậu

(Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum và Mycoplasma
genitalium) đã có thể đồng thời tìm được trong một ống PCR duy nhất với
bệnh phẩm là nước tiểu (5). Điều này không những mang lại lợi ích thiết
thực cho bệnh nhân mà còn góp phần đắc lực cho nghiên cứu, tìm hiểu, đánh
giá tình hình bệnh một cách sát thực hơn, do trước đây không có điều kiện
nuôi cấy tìm cǎn nguyên gây bệnh.
. Vi khuẩn lao:
Mycobacterium tuberculosis không phải là quá khó nuôi cấy; tuy vậy, chúng
mọc rất chậm (thời gian nhân đôi từ 14 - 15 giờ, so với E. coli, khoảng 20
phút). Khoảng 2 tháng sau khi nuôi cấy mới nhìn thấy khuẩn lạc lao. Vì vậy,
giá trị phục vụ lâm sàng của phương pháp nuôi cấy bị hạn chế rất nhiều.
Phương pháp nhuộm soi từ bệnh phẩm thì có độ nhạy rất kém (phải có trên
105 vi khuẩn/ml đờm mới cho kết quả dương tính).
PCR đã góp phần đắc lực giải quyết việc này. Nó có thể cho kết quả trong
vòng 1 - 2 ngày với độ nhạy gấp khoảng 10.000 lần so với các phương pháp
cổ điển. Vì vậy, có thể chứng minh được sự có mặt của vi khuẩn lao trong
dịch não tuỷ, nước tiểu và các loại bệnh phẩm chứa ít vi khuẩn mà trước đây
chẩn đoán rất khó khǎn.

11
Ngày nay, người ta còn dùng PCR để xác định các đột biến kháng Rifamicin
(dấu hiệu rất có giá trị để coi một M. tuberculosis là đa đề kháng) ở gen
rpoB. Nhờ vậy, những biện pháp điều trị phù hợp được áp dụng một cách
kịp thời; điều đó mang lại lợi ích không nhỏ cho bệnh nhân và cộng đồng, vì
rằng những chủng vi khuẩn lao đa đề kháng đã được hạn chế tung ra môi
trường bên ngoài.
Helicobacter pylori (HP): HP hiện đang là một trong những vấn đề thời sự
của Y học thế giới vì vai trò quan trọng của nó trong các bệnh lý viêm, loét
và ung thư dạ dày.
Tuy vậy, nuôi cấy HP rất khó. PCR đã được dùng để tìm HP trực tiếp từ

mảnh sinh thiết dạ dày, hoặc tìm các gen (VacA, CagA) liên quan tới độc
tính của nó. Nhờ PCR, người ta còn biết được sự phân bố của các chủng HP
khác nhau trên các vùng địa lý khác nhau hoặc các chủng HP đặc biệt liên
quan mật thiết đến những tình trạng bệnh lý nhất định.
. Các vi khuẩn khác như Coxiella burnetti với mảnh 438-bp của gen mã hoá
cho một protein 27kDa của màng ngoài; Salmonella typhi với mảnh 343-bp
mã hoá cho protein lông và 599-bp mã hoá cho kháng nguyên Vi;
Pseudomonas pseudomallei (nay là Burkholderia pseudomallei) với mảnh
517-bp của 16S ARNr cũng đã được khuyếch đại thành công bằng PCR.
Amíp:
Dùng PCR để tìm đoạn gen mã hoá cho một protein 30.000 Mdal liên quan
tới độc tính của Entamoeba histolytica, người ta có thể phân biệt được amíp
gây bệnh và amíp không gây bệnh (6).

12
Vi rút: Vi rút viêm gan B (7,8), HIV, vi rút thuỷ đậu, vi rút Herpes simplex,
Papillomavirus, Cytomegavirus và Enterovirus đã được chẩn đoán thành
công bằng PCR.
Đối với HIV, những tài liệu đã dẫn cho thấy, PCR cho kết quả dương tính
sớm hơn các dấu hiệu biến đổi về miễn dịch từ 3 - 6 tháng; đặc biệt là nó cho
phép chẩn đoán HIV ở trẻ sơ sinh, khi mà các kháng thể kháng HIV ở trẻ lúc
này, có thể, chỉ đơn thuần là do từ mẹ truyền sang.
• Xác định độc tố của vi sinh vật:
Tiểu đơn vị A của độc tố ruột không chịu nhiệt của Escherichia coli, và gần
đây, các gen elta và elfB của E.coli sinh độc tố ruột (enterofoxigenic
Escherichia coli, ETEC); vt1 và vt2 của E. coli gây chảy máu đường ruột
(enterohemorrhagic Escherichia coli; EHEC); eaeA và bfpA của E. côli gây
bệnh đường ruột (enteropathogenic Escherichia coli; EPEC); ial của E. coli
xâm nhập đường ruột (enteroinvasive Escherichia coli; EIEC) và Shigella đã
được khuyếch đại bằng PCR nhằm chẩn đoán phân biệt giữa các loại

Escherichia coli gây tiêu chảy.
PCR khuyếch đại các gen nói trên đã thay thế hoặc bổ sung cho các thử
nghiệm kinh điển có độ nhậy và độ đặc hiệu kém hơn hoặc là thay thế cho
các kỹ thuật phức tạp hơn.
Độc tố ruột của vi khuẩn tả (CT), (CT, cholera toxin) đóng vai trò chủ đạo
trong cơ chế gây bệnh của chúng. PCR đã được dùng khuyếch đại đoạn gen
mã hoá cho CT; nhờ đó, có thể phân biệt một cách chắc chắn Vibrio
cholerae gây bệnh tả thực sự với các Vibrio cholerae khác, thuộc các nhóm
huyết thanh không gây bệnh tả (trước đây gọi là các Vibrio không ngưng
kết; nonagglutination, NAG).

13
Clostridium difficile đã được định loại thông qua xác định các loại độc tố
riêng biệt của chúng bằng PCR.
• Xác định vi khuẩn ngoài môi trường:
Các vi khuẩn khó nuôi cấy và/hoặc thường có mặt ngoài môi trường có thể
được tìm trực tiếp bằng PCR, ví dụ như các Legionella, Salmonella, Shigella
và Vibrio cholerae.
Nói tóm lại, dùng PCR để tìm tác nhân gây bệnh đã được áp dụng rất rộng
rãi. PCR có lợi thế lớn là nhanh (thời gian cần thiết cho chẩn đoán tính bằng
"giờ" so với các kỹ thuật kinh điển phải tính bằng "ngày"), nhạy (độ nhạy rất
cao, chỉ cần từ 10 - 1000 tế bào vi khuẩn, tuỳ theo kỹ thuật, là đủ) và độ đặc
hiệu cũng rất cao. Nhờ vậy, bệnh được chẩn đoán nhanh hơn và chính xác
hơn.
Giá trị chẩn đoán bệnh của PCR đặc biệt trong những trường hợp vi sinh vật
không nuôi cấy được hoặc nuôi cấy rất khó khǎn, tốn kém; hoặc kết quả nuôi
cấy rất chậm, hoặc ở những bệnh nhân đã dùng kháng sinh trước khi vào
viện, vì rằng PCR không nhất thiết đòi hỏi phải có vi sinh vật sống.
Tuy vậy,cho đến nay, do những điểm hạn chế của nó (như đòi hỏi phải có
trang thiết bị và nguyên vật liệu riêng, đắt tiền; cán bộ kỹ thuật phải có trình

độ nhất định; kỹ thuật thực hiện còn phức tạp), PCR chỉ bổ sung chứ không
thay thế hẳn được phương pháp chẩn đoán kinh điển khác.
b. Định loại vi khuẩn
Sau khi phân lập được vi khuẩn, PCR góp phần quan trọng trong định loại
chúng.
Đối với từng vi khuẩn cụ thể, qui trình cho PCR với bệnh phẩm từ lâm sàng
thường giống với bệnh phẩm là vi khuẩn thuần. Tuy vậy, việc chuẩn bị ADN

14
mu (template) t vi khun thun cho PCR rt n gin: ch cn un sụi
cỏch thu huyn dch vi khun trong 10 phỳt ri thu ly dch ni sau ly tõm
loi b t bo l .
c. Phõn loi vi khun
Nh khuych i nhng on gen ph trỏch ARNr 16S, ngi ta cú th so
sỏnh mi quan h gn gi hay xa nhau gia cỏc vi khun, gúp phn phõn loi
vi khun chi tit hn v chớnh xỏc hn.
3.2. Tách, tạo dòng gien
Mục đích của việc tạo dòng là là nhằm thu đợc một lợng lớn bản sao của
một trình tự ADN xác định. Chính xác hơn, tạo dòng chính là chọn lọc trong
một th việnk gien dòng vi khuẩn tái tổ hợp cần tìm-tức tập hợp vi khuẩn
cùng bắt nguồn từ một tế bào vi khuẩn ban đầu có mang vector tái tổ hợp cần
tìm.
Các bớc cơ bản của phơng pháp tạo dòng :
Tùy thuộc vào loại th viện gien cần thiết lập, các nhân tố tham gia vào quá
trình tạo dòng (nh vector, té bào chủ, kỹ thuật chuyển vector tái tổ hợp vào
tế bào chủ) có thể thay đổi, nhng tiến trình thực hiện đều bao gồm các
bớc sau :
a. Chọn và xử lý vector
Việc chọn vector phụ thuộc nhiều yếu tố : Kích thớc các đoạn ADN muốn
tạo dòn, mục đích tạo dòng Trớc hết, vector đợc cắt ở một vị trí xác định

bằng một enzyme giới hạn. Sau dó, hai đầu chỗ mối cắt đợc xử lý để chúng
không thể nối lại ; vector chỉ có thể trở lại dạng vòng ban đầu khi hai chỗ
mối cắt đợc nối với một trình tự DNA lạ. Điều này nhằm tránh sự hình
thành các dòng vi khuẩn mang vector không tái tổ hợp.
b. Xử lý ADN cần tạo dòng

15
Trớc hết, cần chọc lọc sơ bộ các đoạn ADN có kích thớc gần nhau và
tơng ứng với loại vector đã chọn. Sau đó, hai đầu của các ADN này cần
đợc xử lý cho phù hợp với hai đầu chô mối cắt của vector (bằng cách cắt
bằng cùng một enzyme giới hạn để tạo các đầu so le tơng hợp chẳng
hạn).
c. Tạo vector tái tổ hợp
Vector và ADN cần tạo dòng đã đợc xử lý sẽ đợc trộn chung theo một tỷ
lệ nhất định với sự hiện diện của ligase. Ligase xúc tác phản ứng nối vetor
với insert tạo thành vector tái tổ hợp. Vector tái tổ hợp sau đó sẽ đợc tinh
sạch qua tách chiết và tủa.
Vộct tỏch dũng (vector cloning) l mt phõn t cú kớch thc nh cho phộp
ci gn mt on DNA ngoi lai vo nhm mc ớch nhõn on DNA ngoi
lai lờn vi s lng ln.
Cỏc c im cn cú ca mt vộct tỏch dũng:
Cú kh ci gn cỏc on DNA ngoi lai
Cú kớch thc nh xõm nhp t bo ch
Cú th tỏi bn c lp khụng ph thuc vo b gen ca t bo ch.
Cú cha cỏc gen ch th, chn lc (gen khỏng khỏng sinh, gen ch th
mu )

Cỏc loi vect tỏch dũng thng dựng: Plasmid, Cosmid, Phage, BAC
(Bacterium artificial chromosomes).
d. Chuyển vetor tái tổ hợp vào tế bào chủ

Công đoạn này nhằm mục đích sử dụng bộ máy của tế bào chủ để sao chép
vector tái tổ hợp thành một số lợng lớn bản sao. Tùy thuộc loại tế bào chủ

16
thông dụng một kỹ thuật chuyển thích hợp. Hai loại tế bào chủ thông dụng
nhất là (i) tế bào vi khuẩn, thờng là E. coli, rất thông dụng vì thao tác dễ
dàng và không tốn kém lại sinh sản nhanh; (ii) tế bào eucaryote (tế bào động
thực vật nuôi cấy hay tế bào nấm men), loại tế bào chủ này chỉ đợc sử dụng
vào những mục đích cụ thể, ví dụ nh khi ngời ta cần nghiên cứu in vivo sự
điều hòa biểu hiện các gien eucaryote hay khi protein cần sản xuất phải đợc
tổng hợp và biến đổi nhờ các phản ứng đặc trng cho tế bào eucaryote
e. Phát hiện dòng cần tìm trong th viện gien
Để phát hiện dòng cần tìm, ngời ta sử dụng một mẫu dò, mẫu dò có thể là
một kháng thể đặc trng cho protein mã hóa bởi gien cần tìm hoặc một trình
tự ADN bổ xung cho gien cần tìm
Do bản chất của ADN cần tạo dòn, ngời ta phân biệt hai loại th viện gien:
th viện bộ gien và th viện cDNA.
3.3. Thao tác gien
Cắt, gắn, biến nạp, tiếp hợp
Các thao tác gien đợc sử dụng rất phổ biến trong công nghiệ sinh học nói
chung và y sinh học phân tử nói riêng là cắt, gắn, biến nạp, tiếp hợp
a. Cắt
Nhờ có các enzyme đặc biệt gọi là Enzyme giới hạn, ngời ta có thể cắt các
gien thành các đoạn dài, ngắn khác nhau. Việc sử dụng các enzyme giới hạn
có ý nghĩa quyết định trong sự phát triển của sinh học phân tử. Chúng cho
phép cắt nhỏ bộ gien khổng lồ của các vi sinh vật. Các enzyme hạn chế chủ
yếu đợc sử dụng trong phơng pháp tạo dòng với mục đích thu nhận một
trình tự xác định với số lợng lớn. Ngoài ra, chúng còn đợc dùng vào việc
lập bản đồ giới hạn, vào việc phân tích so sánh bộ gien ở các loài khác nhau
thông qua kỹ thuật RFLP-tính đa hình kích thớc của các trình tự giới hạn.

Các enzyme giới hạn

17
Các thực khuẩn thể-phage xâm nhiễm tế bào vi khuẩn và sinh sôi nhờ bộ
máy sinh tổng hợp của vi khuẩn. Khi số lợng phage tăng lên đến hàng triệu
bản sao, chúng sẽ phá vỡ tế bào vi khuẩn. Nhng trong một số trờng hợp, tế
bào vi khuẩn vẫn nguyên vẹn mà phae cũng không sinh sôi. Hiện tợng này
có thể do một trong hai nguyên nhân (i) ADN của phage gắn xen vào bộ gien
của vi khuẩn dới dạng không hoạt động trong một thời gian dài hay ngắn;
(ii) ADN của phage bị một hệ thống bảo vệ của vi khuẩn tiêu diệt khi vừa
mới xâm nhập, hệ thống bảo vệ này gọi là các Enzyme giới hạn. Đây chính
là hiện tợng giới hạn. Khi nghiên cứu ADN của phage bằng phơng pháp
Southern, ngời ta thấy rằng, ADN của phage tách từ vi khuẩn bị phá vỡ có
kích thớc nguyên vẹn trong khi ADN phage trích từ vi khuẩn không bị phá
vỡ lại bị cắt thành những đoạn nhỏ có kích thớc xác định.
Tuy vậy, ngay trên những chủng kháng phage, vẫn có mộ số vi khuẩn bị phá
hủy. Các phage do số ít vi khuẩn nàyphóng thích có khả năng phân hủy
chủng vi khuẩn trớc kia cọn gọi là kháng phage.
Tên gọi của các enzyme hạn chế
Tên gọi của các enzyme hạn chế đợc qui định nh sau:
+ Chữ đầu viết hoa là chữ đầu tiên của giống vi khuẩn mà từ đó, enzyme này
đợc ly trích.
+ Hai chữ kế không viết hoa tơng với hai chữ đầu của tên loài của vi khuẩn
này.
+ Tiếp theo là một chữ số La mã chỉ thứ tự của enzyme hạn chế đợc phát
hiện (trong trờng hợp nhiều enzyme hạn chế cùng tìm thấy ở một loài vi
khuẩn).
+ Đôi khi trong tên của enzyme hạn chế còn có một chữ viết hoa để chỉ
chủng vi khuẩn đã đợc dùng để sản xuất ra enzyme.
Ví dụ:

Escherichia coli Ry13

18
Giống loài Chủng
EcoRI: enzyme đầu tiên đợc tìm thấy ở E. coli
EcoRV: enzyme thứ năm đợc tìm thấy ở E. coli
Các loại enzyme giới hạn:
Enzyme giới hạn là các endonuclease có khả năng phân giải ADN mạch đôi
một cách lặp lại ở những vị trí có trình tự nhất định.
Do đặc tính cơ bản của các enzyme hạn chế là khả năng nhận biết và cắt một
trình tự xác định trên phân tử ADN nên dựa vào khả năng này, ngời ta chia
làm ba loại:
- Loại 1: Khi enzyme nhận biết đợc trình tự, nó sẽ di chuyển trên phân tử
ADN đến cách đó khoảng 1000-5000 nuleotide và giải phóng độ vài chục
nucleotide.
- Loại 2: Enzyme nhận biết trình tự và cắt ngay vị trí đó.
- Loại 3: Enzyme nhận biết một trình tự và cắt ADN ở vị trí cách đó khoảng
20 nucleotide.
b. Gắn
Gắn có nghĩa là nối hai đoạn với nhau. Trong sinh học phân tử, khái niệm
gắn đoạn ADN có nghĩa nối hai đoạn ADN sợi kép với nhau. Gắn là một
quá trình tự nhiên xảy ra trong cơ chế sửa chữa và nhân lên của ADN trong
tế bào. Tuy nhiên, trong phòng thí nghiệm, nhờ công nghệ sinh học, ngời ta
có thể tạo ra các điều kiện để gắn hai đoạn ADN với nhau trong ống nghiệm.
Kỹ thụât này có ứng dụng rất to lớn trong các thực nghiệm tái tổ hợp ADN
và các ứng dụng khác. Ví dụ, bằng cách sử dụng kỹ thuật gắn các đoạn ADN
với nhau, ngời ta có thể sử dụng một hỗn hợp các plasmids bị cắt và các
đoạn gien ADN tự do có các đầu có khả năng gắn bổ xung vào các đầu của
các đoạn plasmid. Ngời ta cho thêm vào hỗn hợp một enzyme gắn. Nhờ
hoạt tính của enzyme này, các đầu bổ xung của plasmid và các đoạn ADN tự

19
do sẽ đợc gắn với nhau. Điều cốt yếu của quá trình gắn là duy trì một nhiệt
độ tối u cho quá trình gắn. Nhiệt độ này có thể thay đổi tuỳ từng thực
nghiệm, phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố khác nhau. Nhiệt độ quá cao sẽ làm
gãy các liên kết hydro trong khi nhiệt độ quá thấp sẽ làm cho quá trình thuỷ
phân không xảy ra đợc. Các đoạn ADN ngắn cần nhiệt độ thấp hơn nhiều
các đoạn ADN dài. Các enzyme gắn ban đầu đợc tìm thấy trong E. coli và
nhiều vi khuẩn khác.
c. Biến nạp
Biến nạp là kỹ thuật đợc sử dụng để chuyển ADN trần vào tế bào, các
phơng pháp này có thao tác tơng đối đơn giản nhng lại không kiểm soát
đợc nhiều chỉ tiêu nh số lợng bản sao của đoạn ADN đợc đa vào , biểu
hiện của nó sẽ bền vững (nếu nó đợc tích hợp vào bộ gien của vật chủ) hay
chỉ tạm thời (nếu nó tồn tại dới dạng plasmid và dần dần bị tế bào chủ loại
bỏ).
Các kỹ thuật biến nạp:
- Kỹ thuật sử dụng hóa chất phosphate canxi: Nguyên lý của kỹ thuật này
dựa vào sự hinh thành một phức hợp ADN và canxi dễ đợc tế bào thu
nhận qua cơ chế thực bào.
- Cơ chế điện biến nạp: Một dòng điện có điện thế áp cao có khả năng tạo
các lỗ thủng trên màng tế bào khiến ADN từ môi trờng dễ xâm nhập
vào bên trong.
- Kỹ thuật tiêm: ADN có thể đợc bắn vào tế bào dới dạng bọc quanh
những Viên đạn cực nhỏ, hoặc có thể đợc tiêm thẳng vào tế bào, đối
với tế bào cơ.
d. Tiếp hợp

20