ĐỀ CƯƠNG BÀI GIẢNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC (TÀI LIỆU DÙNG CHO SINH VIÊN NGÀNH CHĂN NUÔI THÚ Y)

ĐỀ CƯƠNG BÀI GIẢNG
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
(TÀI LIỆU DÙNG CHO SINH VIÊN NGÀNH CHĂN NUÔI THÚ Y)
Mã số môn học: CN2210
Số tín chỉ: 02
Lý thuyết: 28 tiết
Thảo luận: 2 tiết
1
CHƯƠNG 1
Tổng quan về công nghệ sinh học
Số tiết: 02 tiết (Lý thuyết: 02 tiết; bài tập, thảo luận: 0 tiết)
*) Mục tiêu
- Về kiến thức
+ Khái niệm, lịch sử phát triển của công nghệ sinh học.
+ Phân loại của công nghệ sinh học, thành tựu của công nghệ sinh học.
+ Triển vọng ứng dụng công nghệ sinh học lâm nghiệp.
- Về kĩ năng
+ Khái quát hóa, triển khai vấn đề.
+ Phân tích hình ảnh, bảng biểu, sơ đồ minh họa.
+ Liên hệ, vận dụng thực tiễn trong đời sống.
- Về thái độ
+ Sinh viên có thái độ nghiêm túc, tích cực chủ động, sáng tạo trong quá trình học tập và nghiên cứu,
tư duy khoa học biện chứng.
+ Có hứng thú và say mê nghiên cứu khoa học.
1.1. Khái niệm công nghệ sinh học
- Công nghệ sinh học có thể hiểu theo hai nghĩa rộng và hẹp.
+ Theo nghĩa rộng thì Công nghệ sinh học bao gồm cả những thành tựu, những ứng dụng
sinh học trong thực tiễn đời sống con người xuất hiện từ hàng trăm thế kỷ nay.
+ Công nghệ sinh học hiểu theo nghĩa hẹp liên quan đến các kĩ thuật hiện đại mang tính
công nghệ như Công nghệ di truyền và các kĩ thuật hiện đại
- Khái niệm biotechnology - công nghệ sinh học (CNSH) đã được đề xuất năm 1917 bởi một

kĩ sư người Hungari tên là Karl Ereky.
- Trước năm 1970, Công nghệ sinh học cũng được hiểu là công nghệ lên men.
- Đầu những năm 1970, Công nghệ sinh học đã chuyển sang giai đoạn mới cao hơn hẳn nhờ
kĩ thuật di truyền ra đời.
- Thuật ngữ CNSH gồm 2 vế công nghệ (technology) và sinh học (bio):
- Do UNESCO (1985) định nghĩa: Công nghệ sinh học là công nghệ sử dụng một bộ phận
hay tế bào riêng rẽ của cơ thể sinh vật vào việc khai thác sản phẩm của chúng.
=> Như vậy có thể khái quát chung khái niệm về công nghệ sinh học như sau: "Công
nghệ sinh học là các quá trình sản xuất ở quy mô công nghiệp có sự tham gia của các tác
nhân sinh học (ở mức độ cơ thể, tế bào hoặc dưới tế bào) dựa trên các thành tựu tổng hợp
2
của nhiều bộ môn khoa học, phục vụ cho việc tăng của cải vật chất của xã hội và bảo vệ lợi
ích của con người".
1.2. Phân loại công nghệ sinh học
* CNSH phân loại theo các đối tượng:
- Công nghệ sinh học phân tử (Molecular biotechnology): gồm công nghệ gen và các ứng
dụng kĩ thuật di truyền.
- Công nghệ sinh học Protein và enzym.
- Cảm biến sinh học (biosensor).
- Công nghệ sinh học vi sinh vật (Microbial Biotechnology).
- Công nghệ sinh học thực vật (Plant Biotechnology).
- Công nghệ sinh học động vật (Animal Biotechnology).
* CNSH phân loại theo các lĩnh vực kinh tế - xã hội:
- Công nghệ sinh học nông nghiệp (biotechnology in agriculture).
- Công nghệ sinh học y dược (medicine - pharmaceutics).
- Công nghệ sinh học môi trường (environmental biotechnology).
- Công nghệ sinh học năng lượng (biotechnology in energy production).
- Công nghệ sinh học vật liệu (material biotechnology).
- Công nghệ sinh học chế biến thực phẩm (biotechnology in food processing)
- Công nghệ sinh học hoá học (biotechnology in chemical production)…

Ngoài những lĩnh vực này, nhiều hướng nghiên cứu chuyên sâu về nhiều vấn đề đã hình
thành như CNSH hương liệu, CNSH khoáng chất,
1.3. Lịch sử phát triển của công nghệ sinh học
Sự phát triển của công nghệ sinh học có thể chia làm 3 giai đoạn:
* Giai đoạn 1: Giai đoạn trước năm 1900
Con người đã sử dụng các tác nhân sinh học đặc biệt là các vi sinh vật vào việc bảo quản
và chế biến thực phẩm. Các sản phẩm nhờ áp dụng sinh học chỉ được áp dụng qua thực nghiệm,
kinh nghiệm, sản xuất thủ công với quy mô nhỏ
* Giai đoạn 2: Giai đoạn từ 1900 đến 1970
- Sử dụng vi sinh vật trong sản xuất sinh khối, các hoạt chất thứ cấp.
- Vào đầu những năm 1900, người ta đã sử dụng các qui trình lên men vào công nghiệp
hoá học ở qui mô lớn để sản xuất axeton, butanol, ethanol.
- Trong Đại chiến thế giới lần thứ II: sản xuất được một khối lượng lớn penicillin,
steptomycin và các chất kháng sinh khác.
- Sau chiến tranh, với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ vi sinh vật
3
* Giai đoạn 3: Giai đoạn từ những năm 1970 trở lại đây (Giai đoạn phát triển công nghệ
sinh học hiện đại)
- Đặc điểm của giai đoạn này là sự phát triển mạnh của CNSH (các kĩ thuật, phương pháp
như: sinh học phân tử, kĩ thuật gene, công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật, động vật, công nghệ
enzym, công nghệ lên men ) và khả năng ứng dụng rộng rãi trên nhiều ngành của CNSH ở quy
mô lớn.
- Vào những năm đầu thập kỷ 1980 kĩ thuật ADN tái tổ hợp ra đời
- Khác với các CNSH kinh điển, CNSH hiện đại được tiến hành chủ yếu nhờ kĩ thuật di truyền.
1.4. Thành tựu và xu thế phát triển của công nghệ sinh học
+ Hoàn thành giải mã bộ gen người và nhiều sinh vật khác (lúa, chuột, Arabidopsis ).
+ Sự phát triển mạnh mẽ của cây trồng chuyển gen
+ Động vật nhân bản : Năm 1997, J. Wilmus và cộng sự Viện Roslin đã tạo ra chú cừu
Dolly, động vật nhân bản đầu tiên từ nhân tế bào tuyến vú của một con cừu trưởng thành.
+ Nuôi cấy tế bào gốc (stem cell-tế bào mầm): Tế bào gốc là các tế bào có khả năng phân

chia liên tục trong nuôi cấy và phát triển thành các tế bào chuyên hóa. Hiện nay hướng sử dụng
tế bào gốc trong nghiên cứu và ứng dụng để chữa bệnh bằng liệu pháp thay thế tế bào đang mở
ra triển vọng vô cùng to lớn cho nghành y tế.
+ Protein tái tổ hợp : Trong thập kỷ qua, tốc độ phát triển protein tái tổ hợp đã phát triển
vượt bậc với nhiều thành tựu đáng kể. Hiện có khoảng 50 loại sản phẩm khác nhau đã được sử
dụng ở Mĩ và châu Âu. Hiện nay, hàng trăm loại protein mới đang được thử nghiệm lâm sàng.
Những protein tái tổ hợp này được sản xuất và sử dụng chủ yếu trong điều trị bệnh nan y.
+ Công nghệ nano sinh học (Bio-nanotechnology) : Đây là lĩnh vực mới được đề cập và
nghiên cứu nhưng đã mở ra các triển vọng rất to lớn. Quy mô nghiên cứu và tác động của công
nghệ này ở kích thước rất nhỏ (nm). Kết hợp công nghệ nano với công nghệ sinh học phân tử
cho phép khai thác tối đa các thuộc tính của phân tử sinh học và các quá trình tế bào. Các ứng
dụng bao gồm :
- Tăng tốc độ chẩn đoán bệnh ;
- Tạo ra các cấu trúc sinh học có kích thước nano nhằm chuyển các phân tử chức
năng vào trong tế bào ;
- Cải thiện độ chính xác và đặc thù của dược liệu ;
- Giảm thiểu tối đa các cảm biến sinh học (biosensor) bằng cách kết hợp các thành
phần sinh học và điện tử thành một cấu trúc duy nhất ;
- Kích thích sự phát triển của các công nghệ sản xuất xanh (green manufacturing
practices).
4
1.5. Triển vọng ứng dụng công nghệ sinh học trong sản xuất nông - lâm nghiệp
* Công nghệ sinh học trong nông nghiệp
- Giống cây trồng và vật nuôi nhân vô tính và chuyển gen mang những đặc điểm nông -
sinh quý giá.
- Các chế phẩm sinh học dùng trong bảo vệ cây trồng vật nuôi, như : vaccine, thuốc trừ
sâu bệnh và phân bón vi sinh.
- Công nghệ bảo quản và chế biến nông sản bằng các chế phẩm vi sinh và enzym. Giá trị
nông sản được nâng lên nhiều lần.
- Công nghệ sinh học chế biến thực phẩm : Các enzym (amylaza, rennin, ß-

galactosidaza, gluco-isomeraza, pectinaza), các chất phụ gia thực phẩm.
- Các loại thức ăn bổ sung cho chăn nuôi (kháng sinh mới ).
- Các loại thuốc trừ sâu, diệt cỏ với tính đặc hiệu tăng lên (các sản phẩm Bt, các
Baculovirut, tuyến trùng ký sinh ).
- Các hoocmon sinh trưởng thực vật (các cytokinin, auxin, ).
- Các hóa chất chẩn đoán bệnh cho động- thực vật.
* Công nghệ sinh học trong lâm nghiệp:
- Công nghệ gen: Trong lâm nghiệp đã nghiên cứu sử dụng isozyme và chỉ thị phân tử
trong chọn giống keo, bạch đàn và lát hoa.
- Nuôi cấy mô – tế bào: Hiện tại chúng ta đã làm chủ và tạo công nghệ nhân in vitro cho
nhiều loại cây lâm nghiệp.
- Công nghệ vi sinh , sử dụng vi sinh vật để làm phân bón.
- Chế phẩm diệt sâu hại trên một số loài cây.
- Trong lĩnh vực xử lý môi trường: bioga .
- Công nghệ enzym.
*) Tài liệu học tập
1. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh (2005), Công nghệ sinh học trong nông nghiệp, NXB Nông
nghiệp.
2. Nguyễn Như Hiền (2006), Công nghệ sinh học, tập 1, NXB Giáo dục Hà Nội.
3. Nguyễn Mộng Hùng (2004), Công nghệ phôi và tế bào động vật , NXB Đại học Quốc gia.
4. Nguyễn Mộng Hùng (2002), Tế bào gốc, Tạp chí những vấn đề sinh học ngày nay.
5. Nguyễn Hoàng Lộc (2007), Giáo trình nhập môn Công nghệ sinh học, NXB Đại học Huế.
6. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học trong cải thiện giống, NXB Nông
nghiệp.
5
7. Nguyễn Văn Uyển, Nguyễn Tiến Thắng (1996), Những kiến thức cơ bản về Công nghệ sinh học, NXB
Giáo dục.
8. http://www .Congnghesinhhocvietnam
9. http://www . Nhasinh họctre
*) Câu hỏi ôn tập chương 1:

1. CNSH khác gì so với các môn khoa học cụ thể khác (Toán học, Vật lí, Hóa học ), quan niệm
chính xác về CNSH hiện đại ?
2. Khái niệm Công nghệ sinh học? Phân loại của Công nghệ sinh học?
3. Lịch sử phát triển của công nghệ sinh học?
4. Thành tựu và xu thế phát triển của Công nghệ sinh học ?
5. Triển vọng ứng dụng công nghệ sinh học trong sản xuất nông - lâm nghiệp?
6. Tại sao nói thế kỉ 21 là thế kỉ của công nghệ sinh học?
6
CHƯƠNG 2
Các kỹ thuật nền của công nghệ sinh học hiện đại
Số tiết: 07 tiết (Lý thuyết: 07 tiết; bài tập, thảo luận: 0 tiết)
*) Mục tiêu
- Về kiến thức:
+ Các kĩ thuật chính sử dụng trong tạo ADN tái tổ hợp
+ Các kĩ thuật chính trong phân tích ADN
- Về kĩ năng
+ Khái quát hóa, triển khai vấn đề.
+ Phân tích hình ảnh, bảng biểu, sơ đồ minh họa
+ Thiết lập được các bước của một quy trình công nghệ.
+ Liên hệ, vận dụng thực tiễn trong đời sống.
- Về thái độ
+ Sinh viên có thái độ nghiêm túc, tích cực chủ động, sáng tạo trong quá trình học tập và nghiên cứu,
hình thành tư duy khoa học duy vật biện chứng.
+ Có hứng thú và say mê nghiên cứu khoa học.
2.1. Các kỹ thuật chính sử dụng trong tạo ADN tái tổ hợp
2.1.1. Khái niệm
ADN tái tổ hợp là phân tử ADN được tạo thành ít nhất hai đoạn ADN có nguồn gốc khác
nhau thông qua vi thao tác của con người.
2.1.2. Các enzym chủ yếu sử dụng trong kĩ thuật ADN tái tổ hợp
+ Các enzym giới hạn

+ Các enzym nối
+ Các polymerase
+ Các nuclease
+ Các enzym sửa đổi
2.1.2.1. Các enzym giới hạn (Restriction enzym - RE)
- Khái niệm enzym giới hạn.
- Enzym giới hạn không mang tính đặc hiệu loài.
- Có 3 loại enzym giới hạn, trong đó enzym giới hạn loại II là được sử dụng chủ yếu.
- Các kiểu cắt của RE: + Cắt tạo đầu bằng
+ Cắt tạo đầu sole: tạo đầu sole 5’, tạo đầu sole 3’.
7
2.1.2.2. Các ligase
Các ligase có vai trò xúc tác sự hình thành liên kết phosphodieste giữa hai chuỗi ADN.
Enzym nối được sử dụng phổ biến nhất là các T4 ADN ligase.
2.1.2.3. Các polymerase.
Nhóm enzym polymerase bao gồm các enzym xúc tác quá trình tái bản ADN, tổng hợp
ARN trong quá trình phiên mã.
- ADN polymerase I: Xúc tác sự tổng hợp một mạch đơn ADN mới, đồng thời enzym
này còn có chức năng như một exonuclease.
- Taq polymerase: Là enzym của vi khuẩn chịu nhiệt sử dụng trong nhân bản ADN bằng
kĩ thuật PCR.
- ARN polymerase: Xúc tác quá trình phiên mã trên khuôn mẫu ADN.
2.1.2.4. Các nuclease
Là các enzym thủy phân những liên kết giữa các nucleotide của một acid nucleic. Thường
có 2 nhóm:
- Exonuclease (Enzym cắt ngoài): Cắt ADN từ các đầu của phân tử
- Endonuclease (Enzym cắt trong): Cắt ADN ở các vị trí bên trong.
2.1.2.5. Các enzym sửa đổi ADN.
2.1.3. Các vectơ nhân dòng sử dụng trong công nghệ ADN tái tổ hợp
2.1.3.1. Các vectơ plasmid

Do đặc tính tự nhiên là có thể tự nhân bản các nhân tố di truyền, các plasmid được sử
dụng như một vectơ nhân dòng trong tế bào vi khuẩn (thường là tế bào vi khuẩn E. Coli).
Thế hệ đ\u tiên: Là các plasmid tự nhiên đến nay hầu như không còn sử dụng nữa.
Thế hệ thứ hai: Là các plasmid được cấu tạo phức tạp hơn. Một trong những plasmid
thường được sử dụng là pBR 322.
Thế hệ thứ ba: Để tiện cho việc sử dụng nhiều loại RE khác nhau, nhiều trình tự nhận
biết của chúng được xếp nối tiếp nhau thành multiple cloning sites – MCS (các vị trí tạo dòng).
Có 3 nhóm plasmid thông dụng hiện đang được bán rộng rãi trên thị trường như:
- Nhóm các plasmid pUC
- Nhóm các plasmid pGEM.
- Nhóm các plasmid pBluescript.
2.1.3.2. Vectơ phage
Các vectơ phage có ưu điểm so với vectơ plasmid là cho phép đoạn ADN chèn vào có kích
thước lớn hơn (15 - 20kb) và hiệu quả chuyển nạp vào tế bào chủ là cao hơn.
Hiện nay, một số loại phage được sử dụng làm vectơ như phage T4, λ.
8
2.1.3.3. Vectơ cosmid.
Loại vectơ này kết hợp thuộc tính của phage và plasmid: chúng chứa vị trí cos (đầu dính)
của phage đồng thời chúng lại có gốc tái bản của plasmid. Vì vậy vectơ cosmid sẽ không tự nhân
lên được như phage nhưng vẫn duy trì khả năng xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn và tự tái bản
trong vi khuẩn.
Vectơ cosmid cho phép nhân dòng những đoạn ADN lớn (khoảng 40 - 45 kb).
2.1.3.4. Các Vectơ khác: YAC (nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men), BAC (nhiễm sắc thể nhân
tạo của vi khuẩn), MAC (nhiễm sắc thể nhân tạo của động vật có vú).
Là các vectơ được thiết kế để nhân dòng các đoạn ADN lớn (đến 1000kb)
2.1.4. Nhân dòng gen (gene cloning)
Mục đích của việc nhân dòng gen là nhằm thu được một lượng lớn bản sao của một trình
tự ADN xác định. Các bước cơ bản của phương pháp nhân dòng gen:
2.1.4.1. Chọn và xử lí vectơ
- Việc chọn vectơ phụ thuộc vào nhiều yếu tố: kích thước các đoạn ADN muốn nhân

dòng, mục đích tạo dòng,…
- Trước hết, vectơ được cắt ở một vị trí xác định bằng một enzym giới hạn. Sau đó, hai
đầu chỗ mối cắt được xử lí để chúng không nối trở lại, vectơ chỉ có thể trở lại dạng vòng ban đầu
khi hai đầu chỗ mối cắt được nối với một trình tự ADN lạ.
2.1.4.2. Xử lí ADN c\n nhân dòng
- Trước hết cần chọn lọc sơ khởi các đoạn ADN có kích thước gần nhau và tương ứng với
loại vectơ đã chọn.
- Sau đó, hai đầu của các ADN này cần được xử lí cho phù hợp với hai đầu chỗ mối cắt
của vectơ.
2.1.4.3. Tạo vectơ tái tổ hợp
Vectơ và ADN cần tạo dòng đã được xử lí sẽ được trộn chung theo một tỷ lệ nhất định
với sự hiện diện của ligase để tạo thành vectơ ADN tái tổ hợp. Vectơ tái tổ hợp sau đó sẽ được
tinh sạch qua tách chiết và tủa.
2.1.4.4. Chuyển vectơ tái tổ hợp vào tế bào chủ
- Công đoạn này nhằm mục đích sử dụng bộ máy của tế bào chủ để sao chép vectơ tái tổ
hợp thành một số lượng lớn của bản sao.
- Tùy thuộc loại tế bào chủ, người ta sử dụng một kĩ thuật chuyển thích hợp.
2.1.4.5. Chọn lọc, tập hợp các đoạn gắn thành từng dòng riêng hình thành thư viện mẫu đã nhân
dòng. Từ đây có thể chọn lọc các trình tự c\n quan tâm
2.2. Các kĩ thuật chính sử dụng trong phân tích ADN
9
2.2.1. Phương pháp tách chiết ADN
2.2.1.1. Tách chiết ADN genom
Nguyên lí
Trong tế bào sinh vật có những loại acid nucleic sau đây: ADN genom, ARN tổng số,
ADN plasmid. Do vậy muốn tách được một trong các loại nucleotide đó, bước đầu tiên ta cần
phải có tế bào sinh vật, tiếp theo tiến hành phá vỡ tế bào nhưng không được làm hư hại mẫu acid
nucleic cần tách chiết. Sau đó, tiến hành loại bỏ các thành phần không mong muốn ra khỏi dịch
tế bào để thu được ADN genom, tiếp theo là tinh sạch và đánh giá kết quả.
Các bước tiến hành.

- Bước 1: Phá vỡ màng tế bào và màng nhân:
Lấy mẫu sinh học, phá vỡ cấu trúc tế bào bằng cách nghiền mô, tế bào trong nitơ lỏng -
196
0
C hoặc xử lí mẫu với các chất tẩy mạnh như SDS (sodium dodecyl sulfat), sarcosyl và
proteinase K; hoặc dùng enzym lysozyme. Hỗn hợp này sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân,
giải phóng ADN ra môi trường đồng thời phân hủy các protein liên kết với ADN.
- Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các protein:
Mẫu được bổ sung hỗn hợp dung dịch phenol: chloroform:isoamine theo tỷ lệ 25:24:1.
Hỗn hợp này có tác dụng làm biến tính protein.
Sau li tâm cao tốc, hỗn hợp dung dịch chia làm 3 pha: pha trên cùng là pha nước chứa ADN,
ARN; pha giữa chứa protein và các chất thứ cấp bị kết tủa; pha dưới là dung dịch (phenol, chloroform,
isoamine). Thu pha nước chứa axit nucleic.
- Bước 3: Tủa axit nucleic:
Lợi ích của việc tủa axit nucleic: Thu nhận axit nucleic dưới dạng cô đặc và bảo vệ khỏi sự phá
hủy của các enzym nuclease.
+ Tủa trong ethanol, việc tủa này được thực hiện trong môi trường có nồng độ muối cao và
nồng độ ion cao (2,5 V
ethanol
:1 V
mẫu
) và nhiệt độ thấp tạo thuận lợi cho việc tủa. Hầu như toàn bộ axit
nucleic đều tủa trong các điều kiện trên.
+ Tủa trong isopropanol, điểm khác biệt so với phương pháp trên là không cần sự hiện
diện của muối, 1V
isopropanol
:1 V
mẫu
. Các ADN có trọng lượng phân tử thấp không bị tủa.
Trong cả hai phương pháp, axit nucleic sẽ được thu nhận lại bằng li tâm.

- Bước 4: Loại bỏ ARN thu ADN genom:
+ Hòa tan cặn tủa chứa acid nucleic và xử lí loại bỏ ARN bằng enzym RNase. Sau đó kết
tủa trở lại thu ADN genom.
2.2.1.2. Tách chiết ADN plasmid
10
Plasmid là nhân tố di truyền ngoài nhân và sao chép độc lập với nhiễm sắc thể. Plasmid
được tìm thấy hầu hết ở các vi khuẩn và một số ít các vi sinh vật nhân thực bậc thấp như nấm
men.
Nguyên lí.
Tế bào vi khuẩn có chứa ADN genom, ADN plasmid và các thành phần khác. Do vậy, muốn
thu được ADN plamid trước hết cần thu một lượng lớn tế bào vi khuẩn sau đó tiến hành phá vỡ tế
bào vi khuẩn và loại bỏ các thành phần không mong muốn. Kết quả thu được phân tử ADN palsmid.
Kiểm tra độ tinh sạch.
Các bước tiến hành.
- Bước 1: Thu sinh khối tế bào vi khuẩn
Chuẩn bị dịch nuôi cấy vi khuẩn thích hợp. Li tâm thu sinh khối.
- Bước 2: Phá vỡ tế bào vi khuẩn
Tế bào vi khuẩn được phá vỡ bằng hóa chất hoặc siêu âm.
Sử dụng enzym Lysozyme để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn.
- Bước 3: Loại bỏ các thành phần không mong muốn, chủ yếu là protein và ADN genom.
Xử lí natri acetat và li tâm. Sau li tâm, ADN bộ gen và protein kết tủa ở đáy ống, lớp dịch nổi phía
trên chứa ADN plasmid. Thu lớp dịch nổi chứa plasmid chuyển sang ống khác.
- Bước 4: Tủa ADN plasmid
+ Lớp dịch chứa plasmid được bổ sung thêm ethanol 100% (hoặc isopropanol) lạnh để
kết tủa ADN plasmid.
+ Li tâm thu tủa ADN plasmid.
+ Hòa tủa trong nước khử ion hoặc dung dịch TE. Sau đó kiểm tra độ tinh sạch bằng điện
di hoặc quang phổ kế.
2.2.2. Các kĩ thuật lai axit nucleic
Các phương pháp lai phân tử rất đa dạng, tạm thời có thể chia chúng làm 3 nhóm lớn: Lai

trên pha lỏng, lai trên pha rắn, lai tại chỗ.
2.2.2.1. Lai trên pha lỏng
Nguyên tắc
Các trình tự bổ sung (các mạch đơn) nằm trong môi trường lỏng là một dung dịch đệm.
Phân tích định lượng các phân tử lai:
Ba phương pháp thường được sử dụng là:
- Phương pháp dùng quang phổ kế
- Phương pháp sử dụng nuclease S1
- Phương pháp sắc kí trên hydroxylapatite
11
Các ứng dụng của phương pháp lai trên pha lỏng
- Tính tỉ lệ % các trình tự giống nhau ở hai loài gần nhau.
- Phân tích các trình tự lặp lại
- Ứng dụng trong việc so sánh kích thước các bộ gen không chứa trình tự lặp lại
2.2.2.2. Lai trên pha rắn
Nguyên tắc
Điểm đặc biệt ở đây là một trong hai trình tự bổ sung thường là trình tự đích (trình tự cần
tìm) được cố định trên một giá thể rắn.
Các yếu tố kĩ thuật quan trọng trong các phương pháp lai trên pha rắn
Giá thể rắn dùng cố định nucleic acid là các màng lai. Có hai loại màng lai: màng lai
bằng nitrocellulose và màng lai bằng nilon. Trong đó màng lai bằng nilon được sử dụng phổ biến
hơn do có độ bền cơ học cao và cho phép lai nhiều lần với nhiều mẫu dò khác nhau.
Ứng dụng của phương pháp lai trên pha rắn
Trong rất nhiều ứng dụng của các phương pháp lai trên pha rắn, nổi bật lên các phương
pháp lai Southern blot, Northern blot, Western blot và dot (slot) blot.
a. Southern blot
Cơ sở của phương pháp là kĩ thuật chuyển ADN từ gel lên màng lai do Southern mô tả năm
1975.
* Phương pháp Southern blot gồm các bước sau:
+ ADN bộ gen được cắt thành những đoạn có kích thước khác nhau bởi một hay nhiều

enzym giới hạn, các đoạn này được phân tách dựa vào kich thước khi điện di trên gel agarose.
+ ADN được làm biến tính ngay trên gel rồi được chuyển lên một màng lai.
+ ADN cố định trên màng được đem lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ. Sau quá trình
lai, người ta rửa màng lai để loại bỏ các mẫu dò không bắt cặp chuyên biệt.
+ Cuối cùng, người ta dùng kĩ thuật phóng xạ tự ghi để định vị các phân tử lai.
* Các ứng dụng quan trọng của Southern blot
+ Lập bản đồ giới hạn của một gen
+ Phát hiện các đa dạng trình tự của cùng một gen.
+ Phát hiện các đột biến mất đoạn, đột biến điểm hay tái tổ hợp trên một gen
b. Northern blot
Là phương pháp lai ARN của tế bào với mẫu dò ADN.
Phương pháp này được sử dụng để xác định kích thước và hàm lượng của một mARN
đặc trưng trong một hỗn hợp ARN.
Phương pháp này bao gồm một số bước sau:
12
+ ARN đã được làm biến tính sẽ được phân tách theo kích thước nhờ điện di trên gel
agarose có chứa chất làm biến tính.
+ Sau đó ARN được chuyển lên màng lai
+ ARN cố định trên màng lai được đem lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ.
+ Các phân tử lai được phát hiện nhờ kĩ thuật phóng xạ tự ghi.
c. Western blot:
Lai Western blot được thực hiện giữa các protein với nhau dựa trên nguyên tắc phản ứng
miễn dịch giữa kháng nguyên và kháng thể.
d. Dot và slot blot
+ Phương pháp này cho phép định lượng tương đối một ARN đặc trưng trong một hỗn hợp
ARN mà không cần phải phân tách chúng ra. Phương pháp này có thể sử dụng cho ADN.
+ Trong phương pháp này người ta đặt trực tiếp một lượng mẫu nhỏ lên màng lai. Quá trình
lai và phát hiện phân tử lai giống như đề cập ở phần trên. Bản phóng xạ tự ghi sau đó được phân tích
bằng kĩ thuật mật độ kế cho phép ước lượng số lượng các phân tử lai có trong mẫu.
2.2.2.3. Lai tại chỗ (in situ hybridization):

- Lai trên nhiễm sắc thể
- Lai trên tế bào và mô
2.2.3. Các phương pháp giải trình tự gen
2.2.3.1. Phương pháp Maxam và Gilbert
Phương pháp này dựa vào sự thủy giải đặc trưng phân tử ADN cần xác định trình tự bằng
phương pháp hóa học.
- Trước hết các phân tử ADN được đánh dấu bằng
32
P ở một đầu.
- Sau đó, chúng được chia làm năm phân đoạn, mỗi phân đoạn chịu một xử lí hóa học
chuyên biệt làm biến đổi đặc trưng một loại nucleotide và cắt phân tử ADN ngay nucleotide ấy.
Năm nhóm nucleotide bị tác động là: G, A, C, G+A, T+C.
Kết quả là sự hình thành nên năm tập hợp oligonucleotide, các oligonucleotide trong một tập hợp
đều chấm dứt tại cùng một loại nucleotide.
- Cuối cùng năm phân đoạn trên được đem phân tách trên gel polyacrylamide. Kết quả
được đọc trên bản phóng xạ tự ghi.
2.2.3.2. Phương pháp enzym học thông qua việc sử dụng các dideoxynucleotide của Sanger
- Phương pháp này dựa vào sự tổng hợp nhờ enzym ADN polymerase mạch bổ sung cho
trình tự ADN mạch đơn cần xác định. Đặc trưng của phương pháp này là ngoài bốn loại
nucleotide thông thường còn sử dụng thêm bốn loại dideoxynucleotide.
13
- Phản ứng tổng hợp được tiến hành trong bốn phân đoạn riêng. Người ta lần lượt cho
vào mỗi phân đoạn một trong bốn loại dideoxynucleotide với hàm lượng rất nhỏ. Do hàm lượng
thấp nên thỉnh thoảng mới có một dideoxynucleotide được sử dụng vào phản ứng tổng hợp một
oligonucleotide khi đó lập tức sự tổng hợp oligonucleotide đó ngừng lại.
Sau đó, bốn phản ứng tổng hợp sẽ được phân tách trên gel polyacrylamide và kết quả
được đọc trên bản phóng xạ tự ghi.
2.2.3.3. Các phương pháp cải biên từ phương pháp của Sanger
Xác định trình tự bằng máy tự động
Trong kĩ thuật này, người ta không đánh dấu bằng các đồng vị phóng xạ mà bằng hóa

chất – các fluochrome. Mỗi loại dideoxynucleotide được đánh dấu bằng một flouchrome có màu
khác nhau. Như vậy, tất cả các oligonucleotie cùng chấm dứt tại một loại dideoxynucleotide sẽ
có cùng một màu. Sau khi điện di trên gel polyacrylamide, kết quả sẽ được đọc qua một hệ thống
vi tính.
Phương pháp PCR dùng trong xác định trình tự axit nucleotide
Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên sự phối hợp giữa phương pháp PCR và
phương pháp sử dụng các dideoxynucleotide.
Phương pháp chỉ sử dụng được khi vùng cần xác định trình tự đã biết trước, và ứng dụng
chủ yếu là nhằm phát hiện nhanh một đột biến điểm.
2.2.4. Kĩ thuật PCR
2.2.4.1. Khái niệm về phản ứng PCR (phản ứng chuỗi trùng hợp)
Vào năm 1985, K. Mullis đã phát minh ra phương pháp đơn giản để khuếch đại nhanh
nhiều bản sao (amplification) của các đoạn ADN mà không cần sự có mặt của tế bào. Kĩ thuật
này được gọi là Polymerase Chain Reaction, viết tắt là PCR.
Thực chất của kĩ thuật PCR là phương pháp tạo dòng (nhân bản) ADN trong phòng thí
nghiệm.
2.2.4.2. Nguyên tắc của phản ứng PCR
- Tính chất biến tính;
- Hồi tính của ADN;
- Tổng hợp ADN.
2.2.4.3. Thành ph\n của phản ứng PCR
- ADN mẫu (ADN cần khuếch đại): không cần độ tinh sạch cao.
- Các mồi (primer): Gồm mồi xuôi và mồi ngược.
- Enzym Taq ADN Polymerase chịu nhiệt.
- dNTP: các loại nucleotit triphosphate như: dATP, dTTP, dCTP, dGTP.
14
- Dung dịch đệm (buffer) thích hợp và MgCl
2
.
- Nước cất hai lần.

2.2.4.4. Chu kỳ của phản ứng PCR
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu kì gồm ba bước:
Bước 1: Giai đoạn biến tính (denaturing)
Phân tử ADN được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là ở 94
0
C -
95
0
C trong vòng 30 giây đến 1 phút.
Bước 2: Giai đoạn lai hay gắn mồi (Annealing)
Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) cho phép mồi bắt cặp với khuôn.
Trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40
0
C - 70
0
C, tùy thuộc vào Tm của các
mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây - 1 phút.
Bước 3: Giai đoạn tổng hợp hay giai đoạn kéo dài (elongation)
Nhiệt độ được tăng lên đến 72
0
C. Thời gian phụ thuộc độ dài trình tự ADN cần khuếch
đại, kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.
Một chu kì bao gồm nhiều bước như trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, mỗi lần lại làm
tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước. Thường số lượng chu kì <40.
2.2.4.5. Một số kĩ thuật phát triển trên nền kĩ thuật PCR
Real-time PCR
Phương pháp real-time PCR cho phép phát hiện và định lượng sản phẩm khuếch đại khi tiến
trình phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở phản ứng huỳnh quang.
Real-time PCR có ưu điểm chính so với PCR truyền thống là cho phép chúng ta định
lượng số copy khởi đầu của khuôn mẫu với độ chính xác và độ nhạy cao

PCR đảo ngược (inverse PCR)
Được dùng để khuếch đại các đoạn phân tử kế cận với đoạn có trình tự DNA đã biết
trước, phân tử DNA này được cắt hạn chế và nối lại nhờ enzyme DNA ligase để tạo thành một
vòng tròn có tính chất monomer, sau đó đoạn ADN được khuếch đại nhờ hai primer tương đồng
với đầu của trình tự đã biết trước
Kĩ thuật RT-PCR
Phản ứng RT-PCR là phản ứng khuếch đại một đoạn khuôn mẫu ARN theo nguyên lý
của PCR, bao gồm hai giai đoạn: Giai đoạn thứ nhất (phiên mã ngược khuôn mẫu ARN thành sợi
ADN thứ nhất, sau đó dùng sợi này làm khuôn mẫu để tổng hợp sợi ADN thứ hai) và giai đoạn
thứ hai (dùng ADN sợi đôi làm khuôn mẫu để thực hiện phản ứng PCR).
2.2.4.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến PCR
ADN mẫu
15
- Phản ứng PCR tối ưu khi ADN thật tinh sạch. Tuy nhiên nhiều kĩ thuật chẩn đoán bằng
PCR vẫn đạt kết quả đối với ADN thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào hoặc ngay cả mẫu ADN
không được bảo quản tốt.
- Phản ứng PCR tối ưu cũng lệ thuộc vào lượng bản mẫu.
Enzym
- Enzym được sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của ADN polymerase I.
- Enzym Taq - polymerase chịu nhiệt được phát hiện và sử dụng.
- Ngày nay nhiều polymerase chịu nhiệt khác đã được đưa ra thị trường với nhiều chức
năng chuyên biệt hay hoàn thiện hơn.
Mồi (primer) và nhiệt độ lai
- Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu quả cao.
+ Không thể có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi xuôi (sense) và mồi ngược (antisense) và
cũng không có những cấu trúc “kẹp tóc”.
+ Tm của mồi xuôi và mồi ngược không quá cách biệt nhau.
+ Thành phần nucleotide của các mồi phải cân bằng, tránh lặp lại nhiều lần các cặp GC.
+ Các mồi được chọn phải đặc trưng cho trình tự ADN cần khuếch đại, không trùng với
các trình tự lặp lại trên gene.

+ Trình tự nằm giữa hai mồi xuôi và ngược không quá lớn
- Nhiệt độ của phản ứng PCR thay đổi ít nhiều phụ thuộc vào điều kiện cụ thể. Nhiệt độ
Tm đã được tính toán cho các loại mẫu ADN khác nhau.
Dung dịch đệm (buffer)
- Nồng độ ion Mg
2+
cũng là một nhân tố ảnh hưởng mạnh đến quá trình PCR.
+ Nồng độ Mg
2+
quá thấp (<0,5mM) làm giảm phản ứng kéo dài mạch.
+ Nồng độ Mg
2+
quá thừa làm ổn định sự bắt cặp sai của mồi với khuôn.
- Độ pH của dung dịch đệm.
pH của dung dịch đệm ảnh hưởng rất nhiều đến sản phẩm PCR: pH dung dịch đệm dao
động khoảng 8,3 - 9,0 ở 20
0
C.
Hàm lượng các dNTP (Deoxynucleotide triphosphate)
Bốn loại nucleotid (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) thường được sử dụng ở nồng độ là 20 -
200µM/mỗi nucleotide cho kết quả ổn định trung thực và chuyên tính.
Số chu kỳ của phản ứng PCR
Trong thực tế, số lượng chu kỳ của phản ứng PCR không vượt quá 40.
Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng PCR
16
Mỗi kiểu thiết bị có đặc điểm “khuếch đại ” riêng nên mọi thí nghiệm của một nghiên
cứu cần được tiến hành trên cùng một loại thiết bị.
Hơn nữa, ống nghiệm dùng cho các phản ứng của cùng một nghiên cứu phải thuộc cùng
một kiểu.
2.2.4.7. Ưu điểm - nhược điểm của phản ứng PCR

Ưu điểm của phản ứng PCR
- Tính đặc hiệu của phản ứng PCR cao: Việc nhân bản ADN bằng PCR có tính đặc hiệu
rất cao, vì việc nhân ADN chỉ được tiến hành sau khi hai mồi bắt cặp với ADN khuôn.
- Thời gian thực hiện cực nhanh, chỉ cần mất vài phút.
- Đơn giản và ít tốn kém: Nó được thực hiện trong ống nghiệm plastic nhỏ gồm các thành
phần tối thiểu và được sử dụng đồng thời.
- Độ tinh sạch của mẫu không cần cao:
PCR có thể thực hiện với các mẫu nucleic acid thô, ngay cả khi mẫu này đã bị phân hủy một
phần.
Nhược điểm
- Trong thực nghiệm, kích thước của trình tự cần khuếch đại là giới hạn đầu tiên: Trừ vài
trường hợp rất cá biệt, phương pháp PCR không hoạt động được với những đoạn ADN lớn hơn 3kb.
Việc sử dụng PCR đối với các độ dài dưới 1,5kb cho kết quả tốt.
- Sự ngoại nhiễm là vấn đề lớn nhất đặt ra đối với PCR, gắn liền với khả năng khuếch đại
bản sao của phương pháp này. Nguồn ngoại nhiễm lớn nhất thường là các sản phẩm khuếch đại
của những lần thao tác trước.
Có thể khắc phục một vấn đề này bằng một số biện pháp sau:
+ Các công đoạn thao tác khác nhau như thiết lập phản ứng PCR và phân tách các sản
phẩm khuếch đại phải được tiến hành ở những địa điểm cách xa nhau.
+ Dụng cụ dùng để thiết lập phản ứng không sử dụng vào các thao tác khác.
+ Dùng tia tử ngoại để loại bỏ các phân tử còn lại từ các lần khuếch đại trước.
+ Tất cả mọi thành phần của phản ứng đều được chia thành những lượng nhỏ, tính toán
sao cho đủ với 1, 2 lần thao tác.
- Các sai sót gây ra do Taq polymerase: Sự sao chép bởi Taq polymerase cho tỷ lệ sai sót
khá cao 10
-4
.
2.2.4.8. Ứng dụng của phản ứng PCR
- Sử dụng PCR trong tách dòng gen, xây dựng các ngân hàng gen, lập các loại bản đồ gen
và giải trình tự gen, bộ gen.

- PCR được ứng dụng trong các nghiên cứu chẩn đoán sớm các bệnh.
17
- PCR được sử dụng trong tạo đột biến in vitro và trong một số kĩ thuật chuyển gen nhằm
tạo ra các giống vật nuôi cây trồng và vi sinh vật mới.
- PCR được sử dụng trong các kĩ thuật xác định tính đa hình.
2.2.5. Kỹ thuật điện di
2.2.5.1. Nguyên lí chung
Phương pháp điện di là kĩ thuật thí nghiệm được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu cấu
trúc và đặc điểm sinh học của các phân tử mang điện tích (ADN, protein và enzyme ).
Nguyên tắc của phương pháp điện di dựa vào đặc tính cấu trúc của các axit nucleic. Đó là
các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác dụng của điện trường,
chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường.
Tính linh động của phân tử trong bản gel dưới tác dụng của một điện trường được tính
theo công thức:
Log u = Log u
0
- K
r
C
Trong đó, Log u
0
: Tính linh động của phân tử trong môi trường lỏng
K
r
: Hằng số làm chậm do cấu trúc gel, khối lượng phân tử axit nucleic
C: Nồng độ của gen
Qua đó, ta thấy rằng tính linh động của phân tử phụ thuộc vào hai chỉ tiêu: Khối lượng phân tử
và nồng độ các chất cấu thành gel.
- Thiết bị điện di gồm nguồn điện, buồng điện di, hệ đệm thích hợp và các bản gel khác
nhau (agarose, polyacrylamid, tinh bột )

Kĩ thuật điện di được sử dụng nhiều trong nghiên cứu độ tinh sạch ADN, kích thước các
đoạn ADN bị cắt bởi enzyme giới hạn hoặc kiểm tra kết quả tách dòng gen
2.2.5.2. Các kĩ thuật điện di chủ yếu
Các kĩ thuật điện di được sử dụng chủ yếu gồm:
- Điện di trên gel agarrose : Là kĩ thuật điện đi để kiểm tra ADN sử dụng agarose từ 0,3
% - 2,0 % làm bản gel. Thường dùng để phân tách những đoạn ADN có kích thước trong khoảng
0,5 - 20,0 kb. Nếu kích thước đoạn ADN nhỏ dưới 1kb, hàm lượng agarose sử dụng khoảng 1 - 2
%, trong các phòng thí nghiệm thường sử dụng hàm lượng agarose khoảng 0,7 - 0,8%.
- Điện di trên gel polyacrylamid : Là kĩ thuật điện đi để kiểm tra ADN hoặc protein, sử
dụng bản polyacrylamid với nồng độ khoảng 3,5% - 20% làm bản gel, tùy theo kích thước đoạn
ADN hoặc trọng lượng phân tử protein. Đối với ADN, thường áp dụng cho các đoạn có kích
thước nhỏ tức là dưới 1000 cặp base. Đoạn gel có kích thước càng nhỏ, protein có khối lượng
phân tử càng nhỏ thì hàm lượng polyacrylamid sử dụng càng lớn, và ngược lại.
18
Thao tác với gel polyacrylamide phức tạp hơn với gel agarose. Do đó, gel này chỉ được
sử dụng cho những mục đích đặc hiệu:
+ Tinh sạch các oligonucleotide tổng hợp.
+ Xác định trình tự ADN.
+ Phân tách các đoạn có kích thước nhỏ, dưới 1000 cặp bazơ
- Điện di trên giấy : Là kĩ thuật điện di sử dụng giấy thấm Whatman 3 MM làm cầu nối
giữa hai điện cực của buồng điện di, các đại phân tử tích điện dịch chuyển trên giấy với tốc độ
khác nhau tùy theo kích thước và trọng lượng phân tử. Trước đây, phương pháp điện di trên giấy
thường được sử dụng trong nghiên cứu đa hình di truyền protein, izoenzyme
- Điện di trên gel tinh bột:
Tinh bột biến tính được sử dụng làm bản gel dùng trong điện di trong các nghiên cứu
protein, enzyme, izoenzyme
Ngoài ra, tùy thuộc thiết kế vị trí các cực của buồng điện di, có thể chia làm hai nhóm
phương pháp là diện di nằm ngang và điện di đứng. Phương pháp điện di nằm ngang có buồng
điện di với các cực trên cùng một mặt phẳng, còn phương pháp điện di đứng với buồng điện di
có cực âm (-) thường ở phía trên, cực dương (+) thường ở phía dưới.

2.2.5.3. Các bước thực hiện kĩ thuật điện di
- Bước 1: Chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel
+ Dung dịch đệm thường sử dụng trong điện di agarose và polyacrylamid là TBE (Tris -
Boric acid - EDTA) và TAE (Tris - Acetic acid - EDTA).
+ Bản gel được chuẩn bị bằng dung dịch đệm 1x TBE (1x TAE) hòa tan với hàm lượng
agarose (polyacrylamid) với hàm lượng cần thiết, đặt trong lò vi sóng hoặc đun nóng đến khi hòa
tan hoàn toàn, đổ vào khuôn có các lược cài sẵn để tạo bản gel với số giếng nạp mẫu cần thiết.
+ Khi bản gel đã đông cứng, đặt bản gel vào buồng điện di và đổ dung dịch đệm ngập
bản gel khoảng 1 - 2 mm.
- Bước 2: Nạp mẫu
Mẫu ADN đã tách chiết và xử lí enzyme giới hạn cắt thành các đoạn có kích thước nhỏ,
được trộn đều vào đệm nạp mẫu có thêm chất màu tạo thành hỗn hợp có màu xanh, giúp dễ quan
sát vịt trí di chuyển của các vệt mẫu trong quá trình điện di. Để kiểm tra kích thước các đoạn
ADN, thường chạy đồng thời cùng với mẫu ADN chuẩn (thang ADN)
[Thang ADN: Đó là một tập hợp nhiều trình tự ADN có kích thước đã biết (thang ADN - ADN
ladder), thông thường người ta sử dụng thang ADN là thực khuẩn thể lamda được thủy giải bởi
enzyme giới hạn Hind III].
- Bước 3: Chạy điện di
19
Nguồn điện trong điện di thường sử dụng điện thế khoảng 100V, cường độ 100mA. Thời
gian chạy điện di trong khoảng 40 phút đến 1 - 2 giờ tùy theo chiều dài bản gel và mức độ yêu
cầu tách các phân tử (có thể đựa vào vị trí các vạch màu, khi các vạch màu chạy được khoảng ¾
chiều dài bản gel có thể kết thúc điện di).
- Bước 4: Nhuộm bản gel và soi gel
+ Kết thúc điện di, bản gel được lấy ra nhuộm ethyldium bromid (EtBr), hoặc các phương
pháp nhuộm khác (nhuộm bạc, nhuộm SYBR green ).
+ Bản gel sau khi nhuộm EtBr được đặt vào thiết bị hiện hình có tia UV, để quan sát kết
quả điện di. Vị trí các đoạn điện di theo kích thước khác nhau quan sát được những vệt xám màu
da cam trên bản gel, hoặc đặt bản gel vào các thiết bị chụp ảnh chuyên dụng để chụp ảnh ,
trường hợp nhuộm bạc hoặc nhuộm SYBR green có thể xác định kết quả bằng mắt thường.

Phổ điện di là băng gọn, rõ, chứng tỏ ADN không bị đứt gãy và không lẫn tạp.
2.2.6. Các kỹ thuật xác định tính đa hình ADN dựa trên PCR
2.2.6.1. Phương pháp phân tích RAPD (Randomly amplified Polymorphism ADN - đa hình các
đoạn ADN được khuếch đại ngẫu nhiên)
Phương pháp RAPD được William phát minh vào năm 1990, Welsh và cộng sự hoàn
thiện 1991.
Nguyên lý
Kỹ thuật RAPD (còn gọi là RAPD - PCR) sử dụng cùng một số cặp mồi ngẫu nhiên nhất
định (thường sử dụng 10 - 40 cặp mồi) để thực hiện phản ứng PCR, nhằm nhân các đoạn ADN
đặc trưng của mẫu nghiên cứu.
Nếu các mẫu nghiên cứu có bộ gen giống nhau, sản phẩm PCR ở điều kiện như nhau là
như nhau.
Các bước tiến hành
Các bước tiến hành kỹ thuật RAPD gồm các bước cơ bản như phản ứng PCR bao gồm
các bước chính sau.
- Bước 1: Tách chiết, tinh sạch ADN hệ gen.
- Bước 2: Thực hiện phản ứng PCR với mồi ngẫu nhiên.
Có thể sử dụng các loại mồi ngẫu nhiên khác nhau để nghiên cứu một loại mẫu, hoặc
dùng 1 loại mồi nhưng với các loại mẫu khác nhau để so sánh.
- Bước 3: Điện di sản phẩm PCR.
Sản phẩm PCR được tiến hành điện di trên agarose, hoặc gel polyacrylamid, sau đó được
nhuộm bằng ethidium bromid. Soi gel dưới ánh sáng tử ngoại, phát hiện băng ADN. Chụp ảnh
băng ADN.
20
- Bước 4: Phân tích và đánh giá kết quả.
Dựa vào kết quả băng ADN trên gel để xác định tính đồng dạng di truyền bằng các phần
mềm thông dụng hoặc tính theo các biểu thức khác nhau để lập sơ đồ hình cây biểu hiện mối
quan hệ tương đồng di truyền giữa các mẫu nghiên cứu.
Có thể tính hệ số tương đồng di truyền được tính theo công thức của Nei M. và Li.W.H. (1979).
Trong đó: S là hệ số tương đồng di truyền .

N
AB
là số băng ADN có cả ở mẫu A và B.
N
A
là số băng ADN có ở mẫu A.
N
B
là số băng ADN có ở mẫu B.
Ưu điểm của kỹ thuật RAPD
Phương pháp này có ưu điểm:
- Kỹ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành công do không cần biết trước trình tự bộ gene
của đối tượng cần nghiên cứu.
- Phát hiện tính đa dạng đáng tin
- Bộ mồi có thể sử dụng cho các loài khác nhau.
- Chất lượng ADN khuôn không cần độ tinh sạch cao
- Phương pháp tiến hành đơn giản hơn so với RFLP
- Phù hợp cho phân tích đa dạng di truyền và lập bản đồ gen
- Chi phí thực hiện thấp, ít tốn kém.
Nhược điểm của kỹ thuật
- Kỹ thuật RAPD có độ chính xác không cao, kết quả phân tích không ổn định.
- Phương pháp rất nhạy cảm với các yếu tố tham gia phản ứng.
- Không chắc chắn các đoạn có cùng kích thước từ hai mẫu khác nhau thực sự tạo ra từ
cùng một vị trí trên hệ gen.
Ứng dụng kỹ thuật RAPD
- Đánh giá đa dạng di truyền:
- Nhận diện chỉ thị phân tử
- Xây dựng bản đồ gene.
2.2.6.2. Kỹ thuật AFLP ( Amplified Fragment Length Polymorphism) - Sự đa hình chiều dài của
các phân đoạn ADN được nhân bản chọn lọc

21
AFLP thực chất là sự khuếch đại các đoạn ADN được cắt bằng enzym hạn chế. Bởi vậy
có thể coi AFLP là sự cải tiến phương pháp RFLP nhờ phản ứng PCR hay phương pháp RAPD cải
tiến với sự tham gia của các enzym hạn chế và cặp mồi đặc hiệu.
Nguyên tắc của AFLP
Kỹ thuật AFLP dựa trên nguyên tắc là sử dụng kỹ thuật PCR với các cặp mồi đặc hiệu để
nhân bản các đoạn ADN đã bị cắt bởi enzym giới hạn.
Mồi đặc hiệu gồm có hai phần: Phần bổ sung với adaptor và phần bổ sung với những
nucleotide tùy ý (thường 1 - 3 nucleotide).
Quy trình của AFLP
- Bước 1: Tách chiết, tinh sạch ADN
- Bước 2: Cắt các phân tử ADN bằng các enzym giới hạn.
- Bước 3: Nối các đoạn ADN đã cắt với các adaptor.
- Bước 4: Sử dụng kỹ thuật PCR nhân các đoạn ADN với các cặp mồi đặc hiệu. Các hỗn
hợp ADN (đã được gắn adapter ) và primer được đưa vào phản ứng PCR.
- Bước 5: Phân tích kết quả sản phẩm PCR bằng điện di và xử lý kết quả bằng phần mềm
thông dụng để đánh giá sự khác biệt di truyền và đa dạng sinh học của các mẫu nghiên cứu.
Những ưu, nhược điểm của kỹ thuật AFLP
- Ưu điểm:
Kỹ thuật AFLP có tiềm năng to lớn trong kỹ thuật phân tích đa dạng di truyền:
+ Kỹ thuật AFLP có thể phân tích với bất kỳ hệ gen nào từ đơn giản đến phức tạp.
+ Phân tích sự đa dạng di truyền, đánh dấu các gen và ứng dụng để lập bản đồ gen.
+ Có thể nhân bản chọn lọc nhiều đoạn giới hạn trong một phản ứng AFLP.
- Nhược điểm:
+ Đối với hệ genom lớn, phức tạp thì số phân đoạn ADN là quá lớn, khó phân tích, do vậy cần
tìm biện pháp hạn chế số phân đoạn chỉ đủ để phân tích.
+ Kỹ thuật tiến hành qua nhiều bước, phức tạp.
Ứng dụng của AFLP
- Phát hiện tính đa hình (phân lập giống).
- Xây dựng bản đồ các bản đồ ADN marker có hiệu quả so với các ADN marker khác.

- Phát hiện những vùng ADN nhân dòng của genom.
- Xác định các đoạn ADN được chuyển trong các vectơ chuyển gen.
2.2.6.3. Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeats): Đa hình trình tự lặp lại đơn giản
22
Hệ gen sinh vật Eucaryote có mặt các trình tự nucleotide lặp lại, có kích thước khác nhau
đặc trưng cho loài. SSR gồm 2 – 5 nucleotide lặp lại nhiều lần: (TG)
n
hoặc (AAT). Các đoạn
ADN lặp lại này được sử dụng để thiết kế mồi cho PCR.
Kỹ thuật SSR đơn giản, không tốn kém, là chỉ thị đồng trội nên được sử dụng để phát
hiện cá thể dị hợp tử.
Các bước tiến hành:
+ Tách chiết, tinh sạch ADN nghiên cứu.
+ Thực hiện PCR với mồi đặc trưng cho các đoạn lặp
+ Điện di sản phẩm PCR, tính toán số liệu, so sánh sự sai khác, giống nhau của băng.
+ Xử lí số liệu bằng các phần mềm chuyên dụng.
2.2.6.4. Kỹ thuật STS (Sequence Tagged Site): Điểm trình tự được đánh dấu
Kỹ thuật này do Olson và cộng sự đề xuất năm 1989. STS là một đoạn ADN ngắn gồm
khoảng 60 – 1000 cặp bazo có thể phát hiện bằng kỹ thuật PCR. Kỹ thuật STS cho phép xác định
những vị trí cần biết bằng các trình tự ADN biết trước.
2.2.7. cADN- ngân hàng cADN (Thư viện cADN)
cADN là các phân tử ADN được tổng hợp từ khuôn mARN qua quá trình sao chép ngược.
cADN được lưu giữ trong các ngân hàng cADN.
Thư viện cADN là tập hợp các bản sao cADN từ tất cả các mARN của một tế bào. Thư
viện cADN mang tính đặc trưng tế bào rất cao.
Thư viện cADN được thiết lập chủ yếu nhằm mục đích nghiên cứu sự biểu hiện của một
gen xác định cùng với những vấn đề liên quan như sự điều hòa biểu hiện gen, mối tương tác giữa
các gen trong một quá tình sống,…
Thư viện cADN được hình thành theo những bước sau:
- Việc chọn vectơ tương đối dễ dàng do kích thước của các cADN ít khi lớn hơn 9 kb.

- Bên cạnh đó, mARN được tách chiết từ tế bào và được chuyển thành cADN nhờ enzym
phiên mã ngược. Vectơ tái tổ hợp được hình thành do sự kết hợp giữa plasmid và cADN.
- Sau đó, vectơ tái tổ hợp được đưa vào trong tế bào vi khuẩn bằng phương pháp biến nạp. Sau
khi tế bào vi khuẩn đã nhận các vectơ tái tổ hợp, nuôi chúng trong môi trường lỏng một thời gian ngắn
trước khi đem trải chúng trên môi trường đặc. Các dòng vi khuẩn sẽ hình thành nên các khuẩn lạc trên
mặt thạch.
2.2.8. Chọn lọc các gen có ý nghĩa
2.2.8.1. Phương pháp lai ADN (lai Southern): đã học trong lai trên pha rắn.
2.2.8.2. Phương pháp nhận biết qua protein
23
Theo lí thuyết, một gen trong đoạn ADN cần tìm mã hóa cho một protein đặc hiệu, hoạt
động của gen trong tế bào đó sẽ sản sinh ra một protein đặc trưng.
Người ta sử dụng mẫu dò là các protein kháng thể đã đánh dấu phóng xạ để phát hiện ra
protein cần tìm. Từ đó suy ra dòng nào đã sản sinh ra protein có phản ứng với mẫu dò.
2.2.9. Kỹ thuật Microarray
Microarray là một kỹ thuật mới rất hiện đai, cho phép cùng một lúc xác định được sự
hiện diện và biểu hiện của các gen ở những mô, tế bào đặc trưng.
- Tiến hành phản ứng lai hỗn hợp mARN với gen (sợi đơn) trên đĩa microarray. Dựa vào kết
quả phản ứng lai ta biết được mARN của gen nào đã được xuất hiện trong các điều kiện thí nghiệm.
=> Kết quả sẽ phát hiện được gen nào hoạt động, gen nào không hoạt động.
- Phương pháp tiến hành:
+ Gắn gen trên đĩa microarray, có lớp phủ polylysine để gắn chặt gen.
+ Tách ARN thông tin ở các mẫu nghiên cứu khác nhau. Đánh dấu chất phát màu riêng
cho ARN thông tin ở từng loại mẫu (cùng mẫu cùng một loại màu).
+ Trộn chung mARN của hai loại mẫu và cho tiến hành lai trên đĩa.
Phát hiện phản ứng phát quang màu trong tối được ghi lại qua hình ảnh. Sử dụng chương trình
máy tính chuyên dụng để xác định tình trạng biểu hiện gen ở các máy phân tích.
- Khả năng ứng dụng: Microarray là một công cụ cực kì hữu hiệu phục vụ lĩnh vực genom
học, nghiên cứu và xác định chức năng của các gen trong hệ gen, biết tính trạng quan tâm do những
gen nào kiểm soát, chức năng của các gen đó.

2.2.10. Các phương pháp chuyển nạp gen ở động vật
* Khái niệm kĩ thuật chuyển gen:
Kĩ thuật chuyển gen là kĩ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được thiết kế ở dạng ADN
tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và các sinh vật nói chung (vsv, đv,,,,) làm cho
gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmid tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ,
các gen này hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trưng dẫn tới việc xuất hiện các đặc tính mới
của cơ thể chuyển gen.
* Các phương pháp chuyển nạp gen ở động vật:
- Phương pháp chuyển nhiễm
- Phương pháp lipofection
- Phương pháp xung điện
- Phương pháp vi tiêm
- Phương pháp dùng súng bắn gen
- Phương pháp dùng các vectơ virut
24
*) Tài liệu học tập
1. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh (2005), Công nghệ sinh học trong nông nghiệp, NXB Nông
nghiệp.
2. Nguyễn Như Hiền (2006), Công nghệ sinh học, tập 1, NXB Giáo dục Hà Nội.
3. Nguyễn Mộng Hùng (2004), Công nghệ phôi và tế bào động vật , NXB Đại học Quốc gia.
4. Nguyễn Mộng Hùng (2002), Tế bào gốc, Tạp chí những vấn đề sinh học ngày nay.
5. Nguyễn Hoàng Lộc (2007), Giáo trình nhập môn Công nghệ sinh học, NXB Đại học Huế.
6. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học trong cải thiện giống, NXB Nông
nghiệp.
7. Nguyễn Văn Uyển, Nguyễn Tiến Thắng (1996), Những kiến thức cơ bản về Công nghệ sinh học, NXB
Giáo dục.
8. http://www .Congnghesinhhocvietnam
9. http://www . Nhasinh họctre
*) Câu hỏi ôn tập chương 2
1. Khái niệm ADN tái tổ hợp?

2. Các enzym chủ yếu sử dụng trong kỹ thuật ADN tái tổ hợp?
3. Các vectơ nhân dòng sử dụng trong công nghệ ADN tái tổ hợp?
4. Nhân dòng gen? Các bước cơ bản của phương pháp nhân dòng?
5. Phương pháp chiết tách ADN genome và ADN plasmid?
6. Các kỹ thuật lai axit nucleic? Nguyên tắc? Ứng dụng?
7. Các phương pháp giải trình tự gen?
8. Kỹ thuật PCR: Khái niệm, nguyên tắc, thành phần, chu kì, các yếu tố ảnh hưởng, ưu - nhược điểm?
9. Cho biết nguyên lí và các bước thực hiện kỹ thuật điện di?
10. Các kỹ thuật xác định tính đa hình ADN dựa trên PCR: Phương pháp phân tích RAPD ? Phương pháp phân
tích AFLP? Kỹ thuật SSR?
11. cADN- ngân hàng cADN ?
12. Chọn lọc các gen có ý nghĩa?
13. Kỹ thuật Microarray? Phương pháp tiến hành? Khả năng ứng dụng?
14. Trình bày các phương pháp chuyển gen ở động vật?
25