ĐỀ TÀI: THÍ NGHIỆM SINH HỌC PHÂN TỬ

Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan
1
BÀI MỞ ĐẦU: MÔ PHỎNG THÍ NGHIỆM

1. Mô phỏng điện di protein trên điện di đứng.
2. Mô phỏng điện di protein bằng phương pháp điện di 2 chiều.
3. Mô phỏng các phương pháp lai.

BÀI 1: CHIẾT TÁCH ADN TỪ TẾ BÀO LÁ NON

1. Vật liệu và hóa chất
1.1 Vật liệu sinh học
Lá non
1.2 Hóa chất
Dung dịch đệm 1.5 CTAB (Cetyltrimethyllammonium bromide)
1.5% CTAB
75mM Tris-HCL
15mM EDTA
1.05M NaCl
Đệm kết tủa CTAB
1% CTAB
50mM Tris-HCL
10mM EDTA
Đệm TE
10mM Tris-HCl
1mM EDTA
Đá khô
Nitơ lỏng
Chloroform: isoamylalcohol (24:1)
10mg/ml RNase
99.5% , 70% ethanol

1M NaCl
10% CTAB

Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan
2
2. Dụng cụ thiết bị
Máy xay
Máy li tâm
Eppendorf 1.5ml
Ống dùng để quay li tâm loại 50 ml
Micropipette 20, 200, 1000µl
Bình tam giác
3. Nguyên tắc
Để tiến hành tách ADN từ tế bào thì ta phải tiến hành phá bỏ màng tế bào
và màng nhân, sau đó biến tính protein để loại bỏ lượng protein chứa trong
dịch tách, loại bỏ RNA và sau cùng là kết tủa ADN bằng cồn. Tủa sau khi thu
được được hòa tan lại trong dung dịch đệm TE hoặc nước cất vô trùng tùy
theo mục đích nghiên cứu.
Khác với tách mô động v
ật, khi tách mô thực vật thì ta phải tiến hành loại
bỏ đường thành phần có nhiều trong mô thực vật. Ở đây ta dùng phương pháp
tách CTAB tức là dùng dung dịch đệm CTAB để tách ADN ra khỏi mô thực
vật. Chất này chỉ hòa tan ADN chứ không hòa tan được đường, nhờ vậy mà
có thể loại bỏ đường ra khỏi dịch chiết tách ADN.
3.1 Phá bỏ màng tế bào và màng nhân
Người ta có thể phá bỏ màng tế bào và màng nhân bằng phương pháp hóa
học hay cơ học.
Ở đây chúng ta dùng phương pháp cơ học, nghiền nát bằng
máy xay và dùng nitơ lỏng để phá bỏ tế bào lá lúa.
3.2 Chiết ADN và loại bỏ protein

Sau khi phá bỏ màng tế bào và nhân thì dùng dung dịch đệm CTAB để
hòa tan ADN. Nhưng trong dịch chiết có lẫn protein và ARN nên để thu nhận
được ADN tinh sạch ta phải tiến hành bước loại bỏ protein và ARN. Ở đây
thường dùng phenol, chloroform và isoamylalcohol. Phenol có tác dụng làm
biến tính protein và không hòa tan nucleic acid. Chloroform cũng có tác dụng
làm biến tính protein nhưng nó còn có tác dụng loại bỏ hoàn toàn phenol ra
khỏ
i phần dung dịch có chứa ADN. Isoamylalcohol có tác dụng ổn định giữa
hai pha nước và pha chloroform.

Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan
3
3.3 Kết tủa CTAB và ADN
Để loại bỏ CTAB thì cần phải kết tủa CTAB và ADN rồi sau đó hòa tan
ADN trong dung dịch NaCl mà tủa CTAB không tan trong dung dịch này.
3.4 Loại bỏ CTAB và làm sạch ADN
Sau khi loại bỏ CTAB bằng dung dịch HCl 1M, ta tiến hành kết tủa ADN
bằng etanol nguyên chất lạnh, để tăng khả năng kết tủa ta có thể pha thêm
dung dịch muối CH
3
COONa 3M (2 thể tích ethanol/thể tích dung dịch cần
tủa, 0.1 thể tích dung dịch muối/ thể tích dung dịch cần tủa. Ngoài ra còn có
thể tủa bằng isopropanol (0.8-1 thể tích Isopropanol/ thể tích dung dịch cần
tủa. Muối lẫn trong ADN sẽ ảnh hường đến kết quả các thí nghiệm sau này
nên người ta thường tiến hành rửa tủa ADN bằng dung dịch ethanol 70%.
4. Các bước tiến hành
4.1. Nghiền nhỏ mẫu thực vật
- Bỏ 10 g đá khô vào xay nhuy
ễn, sau đó cho 8 g lá lúa (được làm đông
lạnh trước khi dùng) xay cho đến khi thành bột mịn.

- Chuyển bột lá mía vào cốc đã được làm lạnh trên nitơ lỏng trước rồi
cho vào cốc 50 ml nitơ lỏng. Đặt ở -20 độ trong vòng 6 tiếng.
4.2. Sử dụng dung dịch đệm CTAB để tách ADN và loại bỏ protein
- Cho 20 ml dung dịch đệm đã được đun sôi vào mẫu lá lúa đã được xử
lí trên rồi tiến hành lắc nhẹ.
- Ngâm trong bể
nước nóng ở 56 độ trong vòng 20 phút.
- Cho 20 ml Chloroform: isoamylalcohol (24:1) vào rồi lắc đều ở nhiệt
độ phòng. Sau khi lắc chuyển dịch chiết tách trên qua ống dùng để
quay li tâm và tiến hành quay li tâm ở nhiệt độ phòng (2800 rpm, 20
phút)
- Chuyển lớp nước ở phía trên vào ống nghiệm mới sau đó cho 2 ml
dung dịch CTAB 10 % đã được hâm nóng ở 70 độ.Sau đó trộn đều.
- Cho 20 ml Chloroform: isoamylalcohol (24:1) vào rồi lắc đều ở nhiệt
độ phòng.Sau đó quay li tâm ở nhiệt độ phòng (2800 rpm, 20 phút).
Thu lớp nướ
c trên vào ống nghiệm mới.


Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan
4
4.3 Kết tủa CTAB và ADN
- Cho 30 ml (1.5 thể tích dung dịch thu được ở thí nghiệm trên) đệm kết tủa
CTAB sau đó trộn đều cho tới khi có một màng DNA màu trắng đục nổi
lên.
- Quay li tâm ở nhiệt độ phòng (3000rpm, 20 phút). Loại bỏ phần dịch lỏng
thu phần kết tủa.
4.4 Loại bỏ CTAB và làm sạch ADN
- Hòa tan kết tủa bằng 5ml dung dịch muối ở nhiệt độ 56
o

C NaCl 1M và
cho vào dung dịch 5µl enzyme RNase 10mg/ml để phân hủy RNA .
- Cho 10ml cồn lạnh nguyên chất và lắc đều để kết tủa ADN.
- Quay li tâm, lấy phần tủa.
- Cho 20ml cồn 70 %, quay li tâm, lấy phần tủa.
- Cho 20 ml cồn nguyên chất, quay li tâm lấy phần tủa.
- Quay phần tủa với nắp ống nghiệm được mở để làm khô ADN. Lúc này
ADN sẽ chuyến sang trong suốt không màu
- Hòa tan ADN thu được vào 2ml đệm TE, bảo quản ở -20
o
C cho thí
nghiệm tiếp theo.















Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan
5
BÀI 2: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VÀ ĐỘ TINH SẠCH CỦA ADN BẰNG

PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG PHỔ HẤP THỤ

1. Nguyên tắc
1.1 Đo hàm lượng ADN
Tùy vào cấu trúc của mỗi chất mà chúng có một đỉnh hấp thụ nhất định.
Đối với nucleic acid, do sự tương tác giữa các proton và các electron của vòng
purine và pyrimine mà nó có khả năng hấp thụ lớn nhất ở bước sóng 260 nm
trong vùng tử ngoại và hấp thụ cực tiểu ở bước sóng t
ừ 230 nm-240 nm và
không hấp thụ ở vùng có bước sóng lớn hơn 310 nm. Dựa vào tính chất này mà
người ta có thể xác định được hàm lượng các nucleic acid bằng phương pháp đo
quang phổ hấp thụ ở bước sóng 260 nm.
Độ hấp thụ này còn phụ thuộc vào các nhân tố như là: pH, nhiệt độ, cường
độ ion. Độ hấp thụ tăng lên khi ở trong môi trường acid hoặc kiềm. Trong thí
nghiệm này pha loãng ADN trong dung môi là nước và ở nhiệt độ phòng.
Công thức tính hàm lượ
ng và độ tinh sạch của ADN.
Hàm lượng ADN (ng/µl) =50×HSPL×OD
260
(1)
Công thức (1) được áp dụng tính hàm lượng của ADN sợi đôi. Đối với
ADN biến tính sợi đơn hay ARN, oligonucleotid thì độ hấp thụ ở bước sóng 260
nm tăng lên và được tính bởi công thức sau:
Hàm Lượng ARN hay ADN sợi đơn (ng/µl) = 40× HSPL×OD
260
(2)
Hàm lượng oligonucleotid (ng/µl) = 20× HSPL×OD
260
(3)
Trong đó

HSPL : hệ số pha loãng
OD
260
: chỉ số đo được ở bước sóng 260nm
OD
280
: chỉ số đo được ở bước sóng 260nm
1.2 Đo độ tinh sạch của ADN
Trong mẫu ADN thường có lẫn phenol và protein. Những tạp chất này làm
tăng độ hấp thụ ở bước sóng 280nm vùng tử ngoại. Vì vậy độ tinh sạch của
dung dịch nucleic acid được đánh giá bằng tỉ lệ giữa độ hấp thụ ánh sáng ở hai
bước sóng 260nm và 280nm.Được tính bằng công thức sau:

Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan
6
Độ sạch nucleic acid = OD260/OD280 (4)
Nếu tỉ lệ này nằm trong khoảng 1,8 đến 2 thì dung dịch ADN được xem là
tinh sạch. Tỉ lệ này thấp hơn 1,8 chứng tỏ mẫu có lẫn tạp chất. Đối với dung dịch
ADN sợi đôi, nếu tỉ lệ quá lớn thì chứng tỏ ADN có chứa trong mẫu bị biến tính
hay bị phân hủy.
1.3 Hiệu ứng siêu sắc (hyporchromic effect)
Hiệu ứng siêu sắc là độ hấp thụ
ở bước sóng của ADN tăng lên khi ADN
biến tính tức là hai sợi đơn tách rời khỏi nhau. ADN không bền đối với nhiệt.
Khi tăng nhiệt độ của ADN lên quá nhiệt độ Tm (Điểm nóng chảy) thì mạch đôi
sẽ tách ra do sự phá vỡ của các liên kết Hidro. Nểu để nhiệt độ giảm từ từ thì hai
sợi đơn lại bắt cặp với nhau nhưng chúng không có khả năng bắt cặp lạ
i khi làm
lạnh đột ngột sau khi biến tính.
2. Dụng cụ và hóa chất

Mẫu ADN: mẫu được tách ra từ lá mía ở bài trước
Nước cất tuyệt trùng
Đá lạnh
Eppendorf 1.5ml
Micropipette 20, 200, 1000µl
Máy soi màu
Máy lắc Vortex
Bếp
3. Các bước thí nghiệm
Biến tính ADN

- Hút 5µl ADN mẫu cho vào 2 eppendorf loại 1.5ml. Chú ý trước khi hút
mẫu cần phải vortex để trộn đều mẫu.
- Đun cách thủy mẫu ADN trong vòng 10 phút .
- Làm lạnh đột ngột một ống bằng cách đặt trên đá đang tan trong 10 phút.
Ống còn lại thì làm nguội ở nhiệt độ phòng.
Chuẩn bị mẫu

- Pha loãng 100 lần mẫu ADN bằng nước cất tuyệt trùng (5µl ADN + 495µl
nước cất tuyệt trùng).
- Pipetting hoặc Vortex chộn đều dung dịch pha
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan
7
Đo độ hấp thụ trên máy soi màu
- Rửa sạch cuvet thạch anh rồi tráng bằng nước cất để khô ráo.
- Nước cất tuyệt trùng (nước dùng pha loãng ADN) để làm chuẩn chuẩn
chỉnh cân bằng máy.
- Lắc đều dung dịch mẫu đo trước khi tiến hành đo mẫu.
- Đo ở bước sóng 260nm và 280nm.
4. Kết quả

Bảng 1 : Kết quả đo OD260 và OD280 của các mẫu ADN
Bước
sóng
ADN không biến
tính
ADN biến
tính
ADN phục hồi sau biến
tính
260 nm
280 nm

















Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan

8
BÀI 3: XÁC ĐịNH HÀM LƯỢNG ADN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI NGANG

1. Khái niệm về điện di
Điện di là một kĩ thuật được ứng dụng rộng rãi trong phòng thí nghiệm
sinh học, hóa học, đặc biệt là sinh học phân tử để tách các hạt tích điện như là
ADN, ARN, protein Như chúng ta đã biết các phân tử nucleic acid tích điện âm
và khi đặt chúng trong một điện trường thí các phần tử tích điện này s
ẽ di chuyển
từ cực âm sang cực dương. Khi tiến hành điện di trên bản gel (gel agarose hoặc
là gel polyacrylamid), các phần tử này sẽ dịch chuyển qua các lỗ gel để đến cực
dương. Các hạt có kích thước nhỏ dễ dàng di chuyển qua các lỗ gel, các hạt có
kích thước lớn thì di chuyển chậm hơn. Chính vì vậy mà có thể phân tách các hạt
tích điện này theo kích thước bằng cách điện di trên gel.
Thông thường người ta dùng hai loại gel là gel agarose và gel
polyacrylamid. Gel agarose cho phép phân tách các phân tử ADN sợ
i đôi có kích
thước từ 100 đến 10000 bp. Còn gel polyacrylamid cho phép phân tách các phân
tử ADN sợi đơn có kích thước nhỏ dưới 500 nucleotid và còn có thể tách riêng
từng phân tử ADN có kích thước khác nhau một nucleotid. Tùy theo kích thước
đối tượng ADN muốn tách mà ta có thể pha gel với các nồng độ khác nhau.

Nồng độ Agarose Kích thước phân tử ADN cần phân li
(bp)

0.6% 1000 - 20000
0.7% 800 - 10000
1% 500 - 7000
1,2% 400 - 6000

1,5% 200 - 3000
2,0% 100 - 2000

Trong điện di ADN thường sử dụng hai loại đệm đó là đệm TBE và đệm
TAE. Đệm TAE dùng để phân tách các phần tử ADN có kích thước lớn còn đệm
TAE thường dùng để phân tách các phần tử ADN có kích thước nhỏ. Nhưng
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan
9
λHinIII digest
bp
23130
9416
6557
2322
2027
564
125
trong trường hợp cần làm sạch ADN thì phải dùng đệm TAE vì đệm TBE có
chứa boric acid làm ảnh hưởng đến qúa trình làm sạch sau này.
Sau khi tiến hành điện di thì cần phải làm hiện hình các phân tử ADN trên
gel. Đối với gel Agarose thì người ta dùng thuốc nhuộm ethidium bromide. Chất
này sẽ gắn xen vào giữa các base của phân tử ADN và phát huỳnh quang khi
chiếu tia tử ngoại.Đối với gel polyacrylamid các phần tử được đánh dấu bằng
đồng vị phóng xạ và vị trí của chúng đượ
c phát hiện bằng kĩ thuật phóng xạ tự
ghi.

Máy điện di ngang HOEFER HE33
Máy HOEFER HE 33 là thiết bị điện di trên gel agarose loại nhỏ, có cấu
tạo dạng nằm ngang. Máy HE 33 được chế tạo dựa trên ý tưởng cần tiến hành

điện di nhanh với một lượng nhỏ ADN trên gel agarose. Thiết bị gồm có các bộ
phận chính sau:
- Nắp: là phần trên của thiết bị có thể tháo rời.
- Các dây dẫn: gồm hai dây dẫn màu đen và màu đỏ nối vào cực dương và
cực âm của bộ đi
ện di với nguồn điện.
- Điện cực: cắm trong gel gồm hai điện cực dương (có màu đỏ), âm (có màu
đen)
- Khuôn đổ gel: dùng để đổ gel chạy điện di. Khuôn gồm khay, giá đỡ, các
miếng gạc hút bọt và lược.
- Buồng điện di: dùng để chạy điện di, gồm buồng chạy
điện di, điện cực, buồng làm lạnh.

Thang ADN (maker)
Khi điện di thì người ta thường điện di với thang ADN
chuẩn hay còn gọi là maker để dựa vào đó mà ta có thể xác
định được mẫu ADN đem đi điện di. Trong bài thí nghiệm
này chúng ta sử dụng λ-HinIII, các phân tử ADN của phase λ
sau khi được cắt bởi enzyme cắt hạn chế HinIII. Kích thước
của các phần tử có trong thang được biểu diễn ở hình bên.

2. Dụng cụ và hóa chất
2.1 Vật liệu sinh học
ADN tách từ lá lúa ở bài 1
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan
10
Thang DNA (maker) : λHinIII
2.2 Hóa chất
+ Agarose (0.8%) : pha 4g agarose trong 50ml dung dịch đệm TAE
+ Đệm điện di TAE 1×

Tris base 0,4M 44,8g
Acetic acid 0,2M 11,4g
EDTA 0,01M 20,0ml
Định mức đến 1000ml
+ Đệm tải mẫu
Glycerol 30%
Brommophenol Blue 0,25%
Tris 200mM
Na2EDTA 20mM
+ Thuốc nhuộm ADN: dung dịch ethidiume bromide 10mg/ml

2.3 Dụng cụ
Máy li tâm
Eppendorf 1.5ml
Micropipette 20, 200, 1000µl
Máy điện di ngang HOEFER HE33
Bộ nguồn điện di điện thế từ 80 -150V
Bộ chụp ảnh trên đèn UV
Lò vi sóng
Bình tam giác
3 Các bước tiến hành thí nghiệm
3.1 Chuẩn bị gel
Trong bài thí nghiệm này tiến hành điện di ADN được chiết tách ra từ lá
mía ở bài 1 và điện di trên gel agarose 0.8% với đệm điện di là đệm TAE.
- Pha loãng 10 lần đệm 10×TAE bằng nước cất.
- Cân 0.8g agarose vào bình tam giác loạ
i 300ml, có cho lắc từ vào
- Cho 100ml đệm 1×TAE đã được chuẩn bị ở trên.
- Bao miệng hình tam giác bằng nilông rồi đun nóng trong lò vi sóng 30
giây, lắc cho gel tan hoàn toàn. Nếu chưa tan hoàn toàn thì lại làm tiếp như trên

Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan
11
cho đến khi gel tan hoàn toàn. Chú ý không để cho gel trào ra miệng bình ra
ngoài vì gel agarose nóng chảy gây bỏng rất nặng.
- Để nguội ở nhiệt độ phòng cho đến khoảng 60 - 50 độ (cho đến khi có thể
sờ tay vào thành bình trong vòng 1 phút, nếu nóng quá sẽ làm hỏng thiết bị điện
di còn nguội quá gel sẽ đông trước khi cho gel vào khuôn gel, hoặc gel đông
không đều)
- Cài lược và cho gel vào khuôn gel
- Chờ cho gel đông tụ hoàn toàn (khoảng 30 phút đến 1 tiếng) rồi sau đó đặt
gel vào buồng điện di rồ
i tháo lược.
- Sau khi gel đông tụ hoàn toàn, đổ đệm vào buồng điện di. Đổ cho đến khi
mức dung dịch đệm cao hơn mặt bản gel khoảng 1cm.

3.2 Chuẩn bị mẫu và điện di
- Cho vào ống eppendorf 1,5ml 2µl mẫu ADN và 1µl dung dịch tải mẫu,
7µl nước cất tuyệt trùng.
- Trộn đều bằng pipetman (pipetting). Nếu dung dịch pha mẫu dính trên
thành ống thì li tâm để mẫu rơi xuống hết đáy (spin down).
- Dùng pipetman nạp mẫu và nạp chuẩn (2µl) vào giếng gel.
- Đậy nắp buồng điện di, cắm điện cực
- Điện di vớ
i hiệu điện thế 90V-120V trong vòng 30 phút
3.3 Nhuộm và hiển thị trên gel.
- Sau khi điện di xong, rút điện mở nắp và lấy bản gel ra
- Cho bản gel vào chậu dung dịch nhuộm ethidium bromide ngâm trong
vòng 30 phút. Chú ý phải đeo bao tay khi tiếp xúc với ethidium bromide vì chất
này gây ung thư.
- Vớt bả gel ra và xem kết quả trên đèn UV, hoặc chụp hình kết quả

Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan
12
BÀI 4: ỨNG DỤNG PCR ĐỂ PHÁT HIỆN CHỦNG E. coli

1. Nguyên tắc
Phương pháp PCR thường được dùng để phát hiện các khuẩn mang mầm
mống bệnh hay các chủng vi sinh vật có trong môi trường. Đem nhân dòng bằng
phương pháp PCR một gen đặc hiệu của một chủng vi sinh vật nào đó, nếu đoạn
gen đó được nhân lên thì chứng tỏ chủng vi sinh vật đó có chứa trong mẫu cần
kiểm tra. Ở đây chúng ta sử
dụng đầu mồi của gen rnhA có trong chủng E. Coli
để kiểm tra sự hiện diện của chủng E.coli trong mẫu cần phân tích .
Một thí nghiệm để phát hiện khuẩn mang mầm mống bệnh gồm các bước
sau:
Tăng sinh: Tăng số lượng vi khuẩn có trong mẫu trước khi đem tiến hành
nhân dòng bằng cách nuôi cấy vi sinh vật trong dịch nuôi.
Xử lí mẫu: Thu vi sinh vật sau khi nuôi cấy và phá bỏ màng tế bào để thu
ADN
Phản ứng PCR: nhân dòng bằng phươ
ng pháp PCR
Phân tích sản phẩm sau khi nhân dòng bằng phương pháp điện di ADN
1.1 Nguyên tắc của phản ứng PCR
PCR là phương pháp khuếch đại tạo dòng trong ống nghiệm nhằm mục

đích thu một lượng lớn bản sao của một trình tự DNA xác định. Đầu tiên ADN
đích (target ADN) được làm biến tính để tách mạch đôi thành mạch đơn
(annealing) Nhiệt độ sau đó được hạ thấp cho phép mồi (primer) có thể bắt cặp
với sợ
i khuôn. Với sự có mặt của các dNTP, DNA polymerase và trong môi
trường phản ứng thích hợp đoạn mồisẽ được nối dài để tạo ra mạch ADN
mới.Chu trình trên được lặp đi lặp lại nhiều lần từ một lượng ADN nhỏ ta có thu
được hàng triệu bản sao.
1.2 Mồi (primer)
Mồi là đoạn ADN ngắn khoảng trên dưới 20 nucleotid có khả năng bắt cặp
bổ sung với một đầu mạ
ch khuôn ADN có mang một đầu 3'-OH tự do giúp ADN
polymerase khởi đầu sự tổng hợp một chuỗi mạch mới. Khi cung cấp hai mồi
chuyên biệt: mồi xuôi (sens primer) và mồi ngược (antisens primer) để bắt cặp
bổ xung với hai đầu của một trình tự ADN thì sau nhiều chu kì thì ta thu được
sản phẩm chủ yếu là đoạn ADN nằm giữa hai mồi. Kết quả phản ứng PCR phụ
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan
13
thuộc nhiều vào đoạn mồi được thiết kế. Mồi thiết kế phải tuân thủ theo các
nguyên tắc sau.
-Mồi thường khoảng trên dưới 20 nucleotid và có lượng GC vào khoảng
50-60%.
- Tm của mồi xuôi và ngược không khác nhau quá xa.
-Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự ADN cần khuếch đại, không
trùng với trình tự lặp lại trên gen.
-Trình tự của mồi được chọn sao cho không thể có sự bắt cặp bổ xung
giữ
a mồi xuôi và mồi ngược và cũng không có những cẩu trúc kẹp tóc do sự bắt
cặp bổ xung giữa các phần khác nhau của một mồi.
Muốn thực hiện được phản ứng PCR thì nhiệt độ annealing phải thấp hơn

nhiệt độ Tm của mồi.
Cách tính nhiệt độ Tm
Có nhiều cách tính nhưng ở đây người ta thường dùng cách tính đơn giản
sau
Tm= 4(G+C) + 2(A+T) + 35 - 2n
n: tổng số nucleotid
G, C, A, T: tổng lượng các nucleotid G, C, T, A
Cách tính này đúng v
ới các đoạn mồi từ 16 đến 35 nucleotid
1.3 Tag polymerase
Được chiết tách từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquticus sống ở suối nước
nóng. Enzyme Tag Polymerase không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính của các
acid nucleotid và có khả năng xúc tác phản ứng tổng hợp từ đầu đến cuối quá
trình.
2. Hóa chất và dụng cụ
2.1 Hỗn hợp Primer
Nồng độ 2.5 pmol/µl
Nhân dòng đoạn ADN dài 967bp có chứa gen rnhA
Trình tự Nucleotid:
5'-CCATGTACGCCAAAGAATTCCGGAT-3'
3'- CTCTCTTTGTTGAATTTTGAAGTGC-5'
2.2 Hóa Chất
Hỗn hợp dùng trong phản ứng PCR
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan
14
Tag polymerase 0,025 U/µl (1,25U/50µl)
Tris-HCl (pH 8.8 ) 75mM
( NH4)2SO4 20mM
Tween 20 0,01%
dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 200µM mỗi loại

MgCl2 1,5mM
Các hóa chất dùng cho điện di ADN
2.3 Dụng cụ
Máy li tâm
Eppendorf 1.5ml, 0.2ml, 0.5ml
Micropipette 20, 200, 1000µl
Máy PCR
Máy điện di ngang80 -150V
Bộ nguồn điện di điện thế từ
Bộ chụp ảnh trên đèn UV
Tủ ấm
Máy lắc Vortex
3. Các bước thí nghiệm
3.1 Xử lí mẫu
- Dùng đầu tăm chấm và lấy coloni được nuôi cấy trong thạch nuôi rắn. Chú
ý không để
thạch nuôi dính theo tăm vì trong gel có chứa các chất gây ảnh
hưởng đến phản ứng PCR.
- Cho coloni lấy được ở trên vào Eppendorf có chứa 100µl nước cất tuyệt
trùng.
- Đun sôi trong vòng 5 phút
- Tiến hành quay li tâm ở tốc độ10000rpm, trong vòng 5 phút, sau đó lấy
phần nước dịch lỏng có chứa ADN đem đi nhân dòng.
3.2 Phản ứng PCR
Thiết lập chương trình cho máy PCR

Step1. 94 độ 1min (Biến tính ADN)
Step2. 98 độ 20 sec (Tách ADN sợi đôi thành sợi đơn)
Step3. 60 độ 20 sec (Mồi bắt cặp với sợi khuôn)
Step4. 68 độ 1min (Phản ứng kéo dài)

Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan
15
Step5. lặp lại Step2 đến Step4 29 lần
Step6. 72 độ 10min ( Tổng hợp nốt các đoạn chưa được hoàn chỉnh)
Step7 4 độ ∞
Pha chế dung dịch phản ứng (Dung dịch phản ứng phải được pha chế trên
đá)
- Hút 45µ l hỗn hợp phản ứng PCR vào trong ống eppendof 0.2ml. Sau đó
cho 4µl dung dịch hỗn hợp primer. Cuối cùng cho 2µl dung dịch mẫu đã
được xử lí ở trên.
- Lắc nhè và quay li tâm cho dung dịch phản ứng chảy hết xuống đáy không
còn bám trên thánh ống ( Spin down)
- Đặt eppendof và máy PCR
- Khởi động chương trình (khoảng từ 1 đến 2 tiếng)
3.3 Điện di sản phẩm sau phản ứng-Điện di trên gel Agarose (0.8%)
- Gel pha trong dung dịch đệm
điện di 0.5×TBE rồi đun nóng bằng lò vi
sóng cho đến khi gel được nóng chảy hoàn toàn.
- Trong khi để cho gel nguội đến 50 độ, tiến hành lắp dụng cụ điện di. Sau
khi gel nguội đổ gel vào khuôn gel có cắm lược và chờ cho gel đông tụ
hoàn toàn.
- Sau khi gel đông tụ rút lược đổ đệm điện di ngập bản gel 1-2mm
- Pha 2µl ADN mẫu + 1µl thuốc nhuộm + 7µl nước cất tuyệt trùng. Dùng
pipetman tra hỗn hợp mẫu và 2
µl maker vào từng giếng gel.
- Chạy điện di với hiệu điện thế 80V trong vòng 30 phút.
- Nhuộm gel bằng dung dịch nhuộm trong vòng 30 phút.
- Soi gel trên đèn UV và chụp ảnh.

Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm

16

BÀI 1:
MỞ ĐẦU

1. CÁC THIẾT BỊ CƠ BẢN CỦA MỘT PHÒNG THÍ NGHIỆM
NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT
a. Phòng rửa và cất nước

- Máy cất nước 1 lần
- Máy cất nước 2 lần
b. Phòng hấp – sấy

- Autoclave
- Tủ sấy 60 – 200
0
C
c. Phòng chuẩn bị môi trường

- Cân phân tích (chính xác đến 0,0001 g)
- Cân kỹ thuật (chính xác đến 0,01 g)
- pH kế
- Máy khuấy từ
- Tủ lạnh
- Lò vi sóng (microwave)
d. Phòng thao tác nuôi cấy

- Tủ cấy vô trùng (laminar)

- Quạt thông gió
- Đèn tử ngoại treo tường
e. Phòng nuôi cây

- Các giàn kệ có gắn đèn huỳnh quang
- Máy điều hòa nhiệt độ
- Máy lắc nằm ngang
- Tủ ấm
f. Phòng thí nghiệm
:
(phòng này dùng để tiến hành các phân tích sinh hóa, phân tử và di truyền)
- Kính hiển vi 2 mắt (độ phóng đại 1000 lần)
- Kính lúp 2 mắt (độ phóng đại 75 lần)
- Microtome
- Máy ảnh kỹ thuật số
- Hệ thống đèn chiếu
- Quang phổ kế …
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm

17

2. CÁC NHÂN TỐ ĐẢM BẢO THÀNH CÔNG TRONG NUÔI CẤY
MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT
Có 3 nhân tố chính:
- Bảo đảm điều kiện vô trùng
- Chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trường đúng cách
- Chọn mô cấy và xử lý mô cấy thích hợp trước và sau khi cấy.
2.1. Ý nghĩa của vô trùng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật
Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có chứa đường, vitamin,
muối khoáng… rất thích hợp cho các loại nấm và vi khu

ẩn phát triển. Do tốc
độ phân bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với tế bào thực vật, nếu
trong môi trường nuôi cấy chỉ nhiễm một vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì chỉ
sau vài ngày đến một tuần, toàn bộ bề mặt môi trường và mô nuôi cấy sẽ phủ
đầy một hoặc nhiều loại nấm và vi khuẩn. Thí nghiệm phải bỏ đi vì trong điều
ki
ện này mô nuôi cấy sẽ không phát triển và chết dần.
2.2 Nguồn tạp nhiễm
Có 3 nguồn tạp nhiễm chính:
- Dụng cụ thuỷ tinh, môi trường nuôi cấy và nút đậy không được vô
trùng tuyệt đối
- Trên bề mặt hoặc bên trong mô cấy tồn tại các sợi nấm, bào tử nấm
hoặc vi khuẩn
- Trong quá trình thao tác làm rơi nấm hoặc vi khuẩn theo bụi lên bề
mặt môi trường
2.3 Kỹ thuật vô trùng
2.3.1 Vô trùng dụng c
ụ thuỷ tinh, nút đậy và môi trường
a. Dụng cụ thuỷ tinh
Thông thường các dụng cụ thuỷ tinh dùng trong các thí nghiệm thường
được xử lý bằng dung dịch sulfocromate một lần đầu trước khi đưa vào sử
dụng; về sau chỉ cần rửa sạch bằng xà phòng, tráng sạch bằng nước cất và để
thật ráo trước khi sử dụng.
Trong trường hợp các dụng cụ thuỷ tinh dùng trong các thí nghiệm nuôi
cấy mô và tế bào thự
c vật đòi hỏi vô trùng, có thể khử trùng trong tủ sấy ở
nhiệt độ cao trong nhiều phút hoặc nhiều giờ. Các dụng cụ này luôn được gói
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm

18

trong giấy nhôm hoặc hộp kim loại để tránh bị nhiễm trở lại sau khi đã khử
trùng.
Bảng 1.1: Thời gian khử trùng dụng cụ thuỷ tinh bằng nhiệt và nhiệt độ khử
trùng
Nhiệt độ (
o
C) Thời gian khử trùng
(phút)
160 45
170 18
180 7,5
190 1,5
b. Nút đậy
Thường dùng nhất là các nút đậy làm bằng bông gòn không thấm nước.
Nút phải tương đối chặt để đảm bảo bụi không đi qua được, đồng thời nước từ
môi trường không bị bốc hơi quá dễ dàng trong quá trình nuôi cấy. Bông
không thấm nước là loại nút đơn giản nhất nhưng có các nhược điểm sau:
- Nếu khi hấp nút bông bị ướt hoặc dính môi trường thì về sau sẽ rất
dễ b
ị nhiễm nấm, nhất là với những thí nghiệm tiến hành trong một thời
gian dài
- Thao tác làm nút bông chậm, không thuận tiện khi nuôi cấy trên qui
mô lớn
- Chỉ dùng được vài lần là phải bỏ
Hiện nay người ta sử dụng nhiều loại nắp đậy khác thay thế nút bông.
Các hãng sản xuất dụng cụ nuôi cấy mô cung cấp loại nắp ống nghiệm và
bình tam giác bằng nhựa chịu nhiệt có thể hấp vô trùng ở nhiệt độ
121
0

C mà
không bị biến dạng. Một số phòng thí nghiệm dùng nắp ống nghiệm bằng
inox hoặc cao su rất thuận tiện cho việc vô trùng khô hoặc ướt. Cũng có thể
sử dụng giấy nhôm để làm nắp đậy…
c. Môi trường
Môi trường nuôi cấy thường được hấp khử trùng trong nồi hấp
(autoclave), khử trùng bằng áp suất hơi nước bão hòa. Thời gian hấp từ 15-30
phút ở áp suất hơi nước bão hòa là 103,4 kPa (1atm) tươ
ng đương với nhiệt
độ 121
0
C. Ở nhiệt độ 121
0
C, hầu hết các sinh vật có trong môi trường đều bị
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm

19

tiêu diệt, kể cả ở dạng bào tử. Sau khi vô trùng cần phải làm khô nắp ống
nghiệm hoặc nút bông để tránh bị nhiễm trở lại.
Bảng 2: Thời gian khử trùng dung dịch và các môi trường lỏng bằng
nồi hấp (autoclave) ở 121
o
C tại 103,4 kPa
Thể tích môi trường (mL) Thời gian hấp khử trùng
(phút)
<50 15
75 20
250-500 25
1000 30

Việc hấp khử trùng bằng nồi hấp thì không thích hợp với nhiều hoá
chất nhạy cảm với nhiệt độ như: các acid amin, các vitamin, các hormon tăng
trưởng, và các chất kháng sinh. Các chất như vậy thường phải được khử trùng
bằng cách lọc vô trùng. Màng lọc được làm bằng màng polyethylen hoặc sợi
cellulose. Các lỗ trên màng siêu lọc này được thiết kế hiệu quả cho việc giữ
lại các vi sinh vật gây nhiễm.
d. Lọc vô trùng
Phươ
ng pháp đơn giản nhất là dùng các màng lọc Millipore hoặc dùng
các phểu lọc thủy tinh xốp số 5.


Một số loại màng lọc vô trùng của hàng
Millipore. Đây là loại màng lọc đã được
khử trùng bằng chiếu xạ và chỉ dùng 1
lần
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm

20

Phương pháp sử dụng màng lọc Millipore: hãng Millipore cung cấp
màng lọc và giá đỡ bằng nhựa chịu nhiệt. Dưới đây mô tả màng lọc loại
Millipore Swinex có đường kính 25mm. Bộ lọc gồm có giá đỡ bằng loại nhựa
chịu nhiệt gồm nắp và đế, vòng cao su và màng lọc. Đặt màng lọc (có kích
thước lỗ 0,25µm) trên đế, đặt vòng cao su lên và vặn chặt nắp vào đế. Gói
toàn bộ bộ lọc vào trong một tờ giấy nhôm và khử
trùng trong autoclave ở
121
0
C trong 15-20 phút. Đồng thời cũng hấp vô trùng một bình thuỷ tinh để

hứng dịch lọc. Dùng ống tiêm hút dịch lọc và bơm qua bộ lọc.
2.3.2 Khử trùng mô thực vật

Mô cấy có thể là hầu hết các bộ phận khác nhau của thực vật như hạt
giống, phôi, noãn, đế hoa, lá, đầu rễ, thân củ…tuỳ theo sự tiếp xúc với môi
trường bên ngoài, các bộ phận này chứa nhiều hay ít vi khuẩn và nấm. Đòng
lúa non khi còn trong bẹ, mô thịt bên trong quả… thường ít bị nhiễm vi sinh
vật; ngược lại, lá, thân đặc biệt ở các bộ phận nằm sâu trong đất như rễ, củ…
có l
ượng nấm, khuẩn tạp rất cao. Hầu như không thể vô trùng mô cấy được
nếu nấm, khuẩn nằm sâu ở các tế bào bên trong mô chứ không hạn chế ở bề
mặt. Lá khoai lang có thể vô trùng dễ dàng trong mùa khô nhưng không thể
làm được trong mùa mưa.
Phương pháp vô trùng mô cấy thông dụng nhất hiện nay là dùng các
chất hoá học có hoạt tính diệt nấm khuẩn. Hiệu lực diệt nấm khuẩn của các
chất này phụ thuộ
c vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của
chúng vào các kẽ ngách lồi lõm trên bề mặt mô cấy, khả năng đẩy hết các bọt
khí bám trên bề mặt mô cấy. Để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập
của chất diệt khuẩn, thông thường người ta xử lý mô cấy trong vòng 30s trong
rượu ethylic 70% sau đó mới xử lý dung dịch diệt khuẩn. Đồng thời người ta
thêm các chất giảm sứ
c căng bề mặt như Tween 80, Fotoflo, Teepol vào dung
dịch diệt nấm khuẩn. Để có khái niệm về nồng độ và thời gian sử dụng các
chất diệt nấm khuẩn để xử lý mô cấy, xin dẫn tài liệu nghiên cứu của Street
(1974) ở bảng sau:


Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm

21


Tác nhân vô
trùng
Nồng độ % Thời gian xử lý
( phút)
Hiệu quả
Calci hypochlorit
Natri hypochlorit
Hydro peroxid
Nước Brom
HgCl
2

Chất kháng sinh
9 – 10
2
10 – 12
1 – 2
0.1 - 1
4 – 50 mg/l
5 – 30
5 – 30
5 – 15
2 – 10
2 – 10
30 – 60
Rất tốt
Rất tốt

Tốt
Rất tốt
Trung bình
Khá tốt
Trong thời gian xử lý, mô cấy phải ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt
khuẩn. Đối với các bộ phận có nhiều bụi cát, trước khi xử lý nên rửa cẩn thận
bằng nước xà phòng bột và rửa sạch lại bằng nước máy. Khi xử lý xong, mô
cấy được rửa nhiều lần bằng nước cất vô trùng (tối thiểu là 3 lần). Những
phần trên mô cấy bị tác nhân vô trùng làm cho trắng ra cần phải được cắt b
ỏ
trước khi đặt mô cấy lên môi trường. Để tránh ảnh hưởng của tác nhân vô
trùng lên mô cấy, nên chú ý để lại một lớp bọc ngoài khi ngâm mô vào dung
dịch diệt khuẩn. Lớp ngoài cùng này sẽ được lột bỏ đi trước khi đặt mô cấy
lên môi trường.
Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay từ lần đầu
tiên. Tuy vậy, nếu kiên trì tìm được nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp
thì sau vài lần thử chắc chăn sẽ đạt kết qu
ả.
Có thể dùng kháng sinh để kiểm soát hoặc loại bỏ sự nhiễm nấm trên
mô cấy. Hầu hết các kháng sinh nhạy cảm với nhiệt do đó không thể hấp vô
trùng. Chúng hoà tan được trong nước hoặc dung môi thích hợp khác, lọc vô
trùng và thêm vào môi trường vô trùng khi môi trường này đã được làm nguội
còn 45-50
oC
. Không phải tất cả các kháng sinh đều thích hợp cho sử dụng
trong nuôi cấy mô thực vật. Các kháng sinh như Streptomycin, Kanamycin và
Neomycin thường độc cho mô thực vật và không hoạt động tốt trong một
phạm vi pH nhất định. Tetracylin cũng là độc tố thực vật, có khuynh hướng
ức chế sự tăng trưởng của mô thực vật sau khi bị xử lý trong một thời gian
dài. Chloramphenicol có phổ hoạt động rộng nhưng độc cho thực vật (và

người) ở nồng độ thấp. Các kháng sinh thường được dùng trong nuôi cấy mô
thực vật gồm Rifampicin (thường được dùng kết hợp với các kháng sinh
khác), các polymicin và vancomycin.

Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm

22

Các loại kháng sinh Khả năng hoạt động
Aminoglycoside
- Streptomycin
- Kanamycin
- Neomycin
Ức chế sự sinh tổng hợp
protein bằng cách tác động
lên các ribosome 30S hoặc
50S
Quinolone
- Nalidixic acid
- Ofloxacin
- Norfloxacin
Gây trở ngại cho quá trình
sao chép DNA bằng cách ức
chế enzym DNA gyrase
β-Lactam
- Penicillin
- Ampicillin
- Carbenicillin
Ức chế sự tổng hợp vách tế
bào vi khuẩn

Tetracyclin
Ức chế sinh tổng hợp protein
bằng cách tác động lên
ribosome 30S
Trimehtoprim và sulphonamide
Ức chế sự sinh tổng hợp
tetrahydrofolate
Chloramphenicol
Ức chế sự sinh tổng hợp
protein bằng cách tác động
lên Rbx 50S
Macrolide và lincosamide
- Erythromycin
- Lincomycin
Ức chế sự sinh tổng hợp
protein bằng cách tác động
lên Rbx 50S
Glycopeptide
- Vancomycin
Tác động lên sự sinh tổng
hợp vách tế bào vi khuẩn
Polymixin
- Polymixin B
- PolymicinE
Gắn lên màng tế bào làm
thay đổi dòng ion dẫn đến sự
phá vỡ tế bào
Rifampicin
Tác động lên RNA bằng cách
gắn vào RNA polymerase

2.3.3 Kỹ thuật cấy vô trùng
Để tránh bị nhiễm trong suốt thao tác cấy mô thực vật, các nhà khoa
học làm việc trong tủ cấy vô trùng (laminar). Đó là các tủ cấy có thiết bị thổi
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm

23

không khí đã lọc vô trùng vào chỗ thao tác cấy. Tủ cấy vô trùng loại trừ một
cách hiệu quả nguồn tạp nhiễm từ bên ngoài và tạo điều kiện thoải mái cho
người cấy, nên hiện nay được sử dụng rất phổ biếân trong các phòng thí
nghiệm. Không khí từ bên ngoài được quạt hút vào qua một màng lọc thô.
99% bụi trong không khí được giữ lại ở màng lọc thô. Sau đó không khí được
thổi qua màng lọc tinh và phân phối đều ra khắ
p bề mặt của tủ cấy, không tạo
những xoáy không khí đưa bụi vào chỗ cấy. Màng lọc tinh ngăn cản các phần
tử lớn hơn 0.3micron với hiệu quả 99,99% và do các hãng chuyên sản xuất
màng lọc cung cấp. Tuổi thọ của màng lọc thô tuỳ theo số lượng bụi nơi làm
việc, thường từ 6 tháng đến 1 năm và của màng lọc tinh từ 2 đến 3 năm. Khi
thấy hiệu quả vô trùng củ
a tủ cấy laminar kém đi thì cần phải thay màng lọc
mới. Để kéo dài tuổi thọ của bộ màng lọc trong tủ cấy laminar - thường rất đắt
tiền - nên bố trí tủ cấy trong các phòng riêng, càng ít bụi càng tốt.
2.3.4 Khử trùng nơi thao tác cấy và dụng cụ cấy
Nguồn nhiễm tạp quan trọng và thường xuyên nhất là bụi rơi vào dụng
cụ thuỷ tinh chứa môi trường trong khi mở nắp hoặc nút bông để thao tác cấ
y.
Người ta áp dụng nhiều biện pháp khác nhau để chống lại nguồn nhiễm tạp
này.
Phòng cấy thường là buồng có diện tích hẹp, rộng từ 10-15m

2
, có hai
lớp cửa để tránh không khí chuyển động từ bên ngoài trực tiếp đưa bụi vào.
Sàn và tường lát gạch men để có thể lau chùi thường xuyên. Trước khi đưa
vào sử dụng, phòng cấy cần được xử lý hơi formol bằng cách rót
formaldehyde (formalin) 4% ra một số nắp đĩa petri để rải rác vài nơi trong
phòng cho bốc hơi tự do. Đóng kín cửa phòng cấy trong 24h, sau đó bỏ
formaldehyde đi và khử hơi formaldehyde còn thừa bằng dung dịch NH
3
25%
cũng trong 24h.
Bề mặt nơi chuẩn bị cấy, bề mặt bên trong và ngoài tủ cấy phải được
khử trùng trước khi cấy bằng cách lau sạch các bề mặt này bằng cồn 90%. Tia
UV cũng có thể được sử dụng để khử trùng bề mặt phòng cấy và tủ cấy nhưng
nó ít hiệu quả hơn và nguy hiểm hơn là sử dụng cồn. Tia UV chỉ tiêu diệt
được các mầm vi sinh nằ
m trực tiếp ngay trên các bề mặt mà tia này chiếu
vào; nhưng nó không thể thấm qua các lớp bụi để tiêu diệt các vi sinh vật nằm
bên dưới các lớp bụi này. Tia UV còn gây hại cho mắt và gây ung thư da.
Các dụng cụ mang vào phòng cấy đều vô trùng trước: từ áo choàng, mủ
vải, khẩu trang của người cấy đến dao, kéo, kẹp (forceps), giấy lọc, bình đựng
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm

24

nước cất Trên bàn cấy thường xuyên có một đèn cồn để sử dụng trong khi
cấy và một cốc đựng cồn 90% để nhúng các dụng cụ làm việc.
Trước khi cấy, người cấy cần rửa tay bằng xà phòng và lau kỹ đến
khuỷu tay bằng cồn 90%. Để đảm bảo mức độ vô trùng cao trong phòng cấy
cần có một đèn tử ngoại 40W treo trần. Chỉ cho đèn này làm việc khi không

có người trong phòng cấ
y. Nên bật đèn tử ngoại 30 phút trước khi cấy. Cần
giảm sự chuyển động của không khí trong phòng cấy đến mức tối thiểu, vì
vậy tất cả các dụng cụ phục vụ cho việc cấy đều phải chuẩn bị đầy đủ để trong
thời gian cấy tránh đi lại ra vào phòng cấy quá nhiều.
Các dụng cụ bằng kim loại như kẹp cấy, dao mổ, que cấy vòng, kim
mũi nhọn có thể được khử trùng bằng cách đốt dưới ngọn lửa đèn cồn. Những
dụng cụ này trước hết phải được nhúng vào cồn tuyệt đối rồi mới đốt. Nhớ để
ráo đi các giọt cồn thừa rồi mới đưa vào ngọn lửa đèn cồn.
Khi mở nắp chai hoặc nắp ống nghiệm môi trường nuôi cấy, thì dùng
ngón tay kế út và ngón tay út cầm l
ấy nắp gòn, và không chạm tay vào bề mặt
bên trong của nắp gòn cũng như không thả nắp gòn xuống bất cứ bề mặt nào
cho đến khi gắn nó trở lại chai môi trường.

Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm

25

BÀI 2:
KỸ THUẬT PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG

1. VẤN ĐỀ LỰA CHỌN MÔI TRƯỜNG
Khi khởi sự nuôi cấy mô và tế bào đối với một số đối tượng nhất định,
vấn đề đặt ra là chọn môi trường nào và trên cơ sở nào để phối hợp tỷ lệ các
chất dinh dưỡng. Cách thường làm là qua các tài liệu đã xuất bản, các công
trình đã nghiên cứu về đối tượng đó hoặc cùng họ tương đương xem các tác
giả đ
ã sử dụng môi trường loại nào. Bước đầu có thể giữ nguyên môi trường
của tác giả đó hoặc trên cơ sở đó mà cải tiến cho phù hợp qua các thí nghiệm

thăm dò.
Trong hàng trăm môi trường do rất nhiều tác giả đề nghị cho nhiều loại
cây khác nhau, nhiều mục đích nuôi cấy khác nhau. Về cơ bản có thể chia ra
làm 3 loại:
- Môi trường nghèo chất dinh dưỡng: điển hình là môi truờng White,
Knop và Knudson C …
- Môi trường có hàm lượ
ng chất dinh dưỡng trung bình: điển hình là
môi trường B5 của Gamborg …
- Môi trường giàu dinh dưỡng: điển hình là môi trường MS
(Murashige-Skoog)…
Vì vậy khi bắt đầu nghiên cứu nuôi cấy mô một số đối tượng mới, chưa
có tài liệu trước thì nên thăm dò so sánh 3 loại môi trường trên xem đối tượng
nghiên cứu phù hợp với loại môi trường nào nhất.
Sau đó cần thử tìm tỉ lệ NO
3
-
/ NH
4
+
thích hợp. Các tác giả phương Tây
làm việc với cây trồng cạn thường không đưa NH
4
+
vào môi trường. Nhưng
đối với những cây dinh dưỡng NH
4
+
mạnh như cây lúa, việc thêm vào môi
trường nuôi cấy một tỉ lệ NH

4
+
thích hợp chắc chắn sẽ có lợi.
Việc sử dụng mang tính kinh nghiệm chủ nghĩa đối với một số môi
trường đã cản trở khá nhiều sự tiến bộ của công tác ở một số phòng thí
nghiệm nuôi cấy mô thực vật. Thuốc lá và carốt là 2 loại cây kinh điển của
nuôi cấy mô thực vật. Môi trường nuôi cấy 2 loại cây này đã được xây dựng
khá hoàn chỉnh. Tuy vậ
y, không thể dùng nguyên các môi trường đó để
nghiên cứu các cây hoà thảo hoặc các cây họ đậu mà không có sự cải tiến, sửa
đổi. Điều này giải thích sự tiến bộ chậm chạp của nuôi cấy mô một số cây
hoà thảo so với cây 2 lá mầm.