Axit Amin và phương pháp phân tích

Phân tích thực phẩm Acid amin
MỤC LỤC
I. Giới thiệu về acid amin 1
1) Thành phần và cấu tạo 1
2) Màu sắc, mùi vị 1
3) Tính tan 1
4) Tính quang học 1
5) Tính lưỡng tính 3
II. Thu nhận acid amin 3
A. Tinh sạch protein trước khi thu nhận 3
B. Các phương pháp thu nhận protein 6
III.Định lượng acid amin bằng phương pháp sắc ký 7
1) Sắc ký giấy 7
2) Sắc ký lớp mỏng 8
3) Sắc ký khí 8
IV. Một vài phương pháp cụ thể 8
A. Phương pháp sắc ký lỏng cao áp sau phản ứng tạo dẫn xuất với 1-fluoro-
2,4-dinitrophenyl-5-L-alanine amide (thuốc thử Marfey) 8
B. Xác định hàm lượng acid amin trong thực phẩm bằng phương pháp đảo
pha trong phân tích sắc ký với dẫn xuất mới butylthiocarbamyl và
benzylthiocarbamyl 13
V. Tài liệu tham khảo 34
Page 1
Phân tích thực phẩm Acid amin
I. Giới thiệu về acid amin:
1. Thành phần và cấu tạo:
Protein là polymer của các amio acid nối với nhau bằng các liên kết cộng hoá trị là
liên kết peptide. Protein có thể bị thuỷ phân tạo thành các acid amin tự do bằng nhiều phương
pháp khác nhau. Người ta đã xác định protein được cấu trúc từ 20 loại acid amin khác nhau.
Acid amin là chất hữu cơ mà phân tử chứa ít nhất một nhóm carboxyl (-COOH) và ít
nhất một nhóm amino (NH

2
), trừ prolin chỉ có nhóm NH (thực chất là một acid imin). Trong
phân tử acid amin đều có các nhóm COOH và NH
2
gắn với carbon ở vị trí α. Hầu hết các acid
amin thu nhận được khi thuỷ phân protein đều ở dạng L-α acid amin. Như vậy các protein chỉ
khác nhau ở mạch nhánh, hay còn gọi là chuỗi bên (thường được ký hiệu: R).
2. Màu sắc và mùi vị:
Các acid amin thường không màu, nhiều loại có vị ngọt kiểu đường như glycine,
alanine, valine, serine histidine, triptophan; một số loại có vị đắng như isoleucine, arginine
hoặc không có vị như leucine. Bột ngọt hay còn gọi là mì chính là muối của natri với acid
glutamic (monosodium glutamate).
3. Tính tan:
Các acid amin thường dễ tan trong nước, khó tan trong alcohol và ether (trừ proline và
hydrogenxyproline). Chúng cũng dễ hoà tan trong acid và kiềm loãng (trừ tyrosine).
4. Tính quang học:
Các acid amin trong phân tử protein đều có ít nhất một carbon bất đối (trừ glycine) vì
thế nó đều có biểu hiện hoạt tính quang học, nghĩa là có thể làm quay mặt phẳng của ánh
sáng phân cực sang phải hoặc sang trái. Quay phải được ký hiệu bằng dấu (+), quay trái được
ký hiệu bằng dấu (-). Góc quay đặc hiệu của acid amin phụ thuộc vào pH của môi trường.
Tuỳ theo sự sắp xếp trong cấu trúc phân tử của các nhóm liên kết với carbon bất đối
mà các acid amin có cấu trúc dạng D hay L (hình 1) gọi là đồng phân lập thể. Số đồng phân
lập thể được tính theo 2
n
(n là số carbon bất đối)
Page 2
Phân tích thực phẩm Acid amin

Hình 1: Đồng phân lập thể của alanine
Hầu hết các acid amin khác hấp thụ tia cực tím ở bước sóng (λ) khoảng từ 220 -280

nm. Đặc biệt cùng nồng độ 10
-3
M, trong bước sóng khoảng 280 nm tryptophan hấp thụ ánh
sáng cực tím mạnh nhất, gấp 4 lần khả năng hấp thụ của tyrosine (hình 2.8) và phenylalanine
là yếu nhất. Phần lớn các protein đều chứa tyrosine nên người ta sử dụng tính chất này để
định lượng protein.
Hình 2: Phổ hấp thụ ánh sáng cực tím của tryptophan và tyrosine
Page 3
Phân tích thực phẩm Acid amin
5. Tính lưỡng tính:
Trong phân tử acid amin có nhóm carboxyl -COOH nên có khả năng nhường proton
(H
+
) thể hiện tính acid, mặt khác có nhóm amin-NH
2
nên có khả năng nhận proton nên thể
hiện tính base. Vì vậy acid amin có tính chất lưỡng tính.
Trong môi trường acid, acid amin ở dạng cation (tích điện dương), nếu tăng dần pH
acid amin lần lượt nhường proton thứ nhất chuyển qua dạng lưỡng cực (trung hoà về điện),
và tiếp tục tăng pH acid amin sẽ nhường proton thứ hai chuyển thành dang anion (tích điện
âm). Vì vậy đôi khi người ta coi nó như một di-acid.
II. Thu nhận acid amin:
A. Tinh sạch protein trước khi thu nhận acid amin:
1. Giới thiệu:
Phân tích acid amin của protein là một trong những phương pháp tốt nhất và chính
xác nhất để định lượng protein. Sự cần thiết của việc thu nhận mẫu ở nồng độ cao và không
bị nhiễm là một vấn đề cần giải quyết để xác định cấu tạo protein. Nhiều phương pháp hiện
có để loại bỏ chất đệm, muối ra khỏi protein như phương pháp kết tủa hoặc sắc ký lỏng cao
áp đảo pha (RP-HPLC) gây thất thoát protein nhiều, làm việc đánh giá nồng độ thực trở nên
khó khăn. Sau đây là hai phương pháp thường dùng để thu hồi protein từ chất đệm: phương

pháp lọc gel, cột vi xoáy tốc độ cao, và sự hấp thu vào màng poly vinylidene difluoride
(PVDF) trong hộp chuẩn bị mẫu ProSorb.
2. Nguyên liệu:
2.1 Thiết bị:
1. Cột vi xoáy tốc độ cao (Việc lựa chọn kích cỡ thích hợp của cột vi xoáy quan trọng
cho thể tích mẫu. Mẫu thể tích càng nhỏ thì nên chọn cột nhỏ)
2. Hộp chuẩn bị mẫu ProSorb.
Page 4
Phân tích thực phẩm Acid amin
3. Màng vận chuyển Immobilon-PSQ.
4. Ống thủy phân mẫu (toàn bộ vật dụng thủy tinh dùng cho thủy phân nên được làm
sạch kỹ và đun đến 500
o
C)
5. Lọ phản ứng.
2.2 Chất phản ứng:
1. Nước HPLC (luôn dùng chất phản ứng và nước có chất lượng tốt nhất)
2. Trifluoroacetic acid (TFA)
3. Methanol
4. Acid clohiric (HCl)
5. Phenol
Cụ thể:
1. 20% methanol, 0.1 N HCl
2. 6N HCl + 0.1% phenol
3. 0.1% TFA
3. Phương pháp:
3.1 Chuẩn bị cột macrospin (mẫu 50-150 µL)
1. Cột macrospin cần được chuẩn bị cơ bản theo đề nghị của nhà sản xuất. Lắp cột nhẹ
nhàng để thu hồi gel ở đáy cột. Hydrate hóa gel với 500 µL nước HPLC trong 15 phút ở nhiệt
độ phòng (phần trăm mẫu thu hồi được tăng khi thời gian hydrate hóa tăng cột vi xoáy), sau

đó ly tâm cột trong 4 phút ở 2000g để làm cân bằng cột.
2. Rửa cột 3 lần với 500 µL nước để bảo đảm sự cân bằng.
3. Thấm khô phần ngoài cột để loại ẩm và đặt nó vào một ống mới. Đối với cột
macrospin, thêm 50-150 µL mẫu vào đỉnh, cẩn thận đặt mẫu vào giữa cột.
4. Ly tâm ống 4 phút ở 2000g, rửa cột với ít nhất 200 µL nước.
5. Lấy mẫu đã tinh sạch ra và r ú t chân không ở tốc độ cao đến khô trước khi thủy
phân. (Khi mẫu chứa nồng độ protein hoặc peptide cao với thể tích thích hợp, không cần tinh
sạch mẫu thêm, chỉ cần pha loãng mẫu với nước HPLC đến một dung dịch muối không ảnh
hưởng đến quá trình phân tích.)
3.2 Cột vi xoáy (mẫu 5-25 µL)
1. Giống như đối với cột macro, rút gel khô đến đáy thùng. Làm ướt với 50 µL nước và
ly tâm 3 phút, ở 1000g để cân bằng cột. Để có kết quả tốt nhất, rửa cột 3 lần với 200µL nước.
Để ly tâm những cột này, đặt chúng trực tiếp vào một máy ly tâm vi mô hoặc dùng một ống
ly tâm rỗng 1.7 mL.
Page 5
Phân tích thực phẩm Acid amin
2. Sau khi cột đã cân bằng, thấm khô để loại bỏ ẩm bám bên ngoài cột.
3. Thêm 5-25 µL mẫu vào đỉnh cột, cẩn thận đặt mẫu vào giữa cột.
4. Đặt cột vào một ống mới, xoay ống 3 phút ở 1000g. Sau khi ly tâm, mẫu đã tinh sạch
ở trong ống và sẵn sàng để sử dụng.
3.3 Chuẩn bị hộp mẫu ProSorb
1. Đảm bảo rằng mẫu đựng trong dung dịch 0.1% TFA để đạt kết quả tốt nhất
(Acetonitrile (ACN) với nồng độ hơn 15% cản trở mẫu dính vào PVDF, vì vậy những phần
của HPLC nên pha loãng với nước cất hoặc 0,1% TFA để giảm nồng độ của ACN xuống nhỏ
hơn 15%). Nếu thể tích ít hơn 100 µL, pha loãng mẫu thành 100 µL với 0.1% TFA. Nếu mẫu
có chất tẩy, pha loãng để nồng độ chất tẩy thấp hơn giá trị trong bảng 1 vì chất tẩy có thể ảnh
hưởng sâu sắc đến sự kết dính protein vào màng PVDF. Bảng 1 tóm tắt nồng độ của chất tẩy
có thể chứa trong mẫu trước khi kết dính vào màng. Ngoài ra, nếu mẫu chứa lượng chất tẩy
lớn hơn lượng tối đa trong bảng 1, có thể thêm một lượng nhỏ methanol vào mẫu trước khi
cho mẫu vào hộp mẫu ProSorb)

Bảng 1: Hàm lượng chất tẩy tối đa
Chất tẩy Nồng độ tối đa (v/v hoặc w/v)
Triton X-100 0.01
Tween-20 0.01
SDS 0.02
Octyl glucoside 0.25
Brij 35 0.02
2. Đặt thiết bị ProSorb vào một giá ống nghiệm thích hợp.
3. Làm ướt màng PVDF trong hồ nhỏ với 10 µL methanol (hộp mẫu ProSorb nên được
chuẩn bị kỹ như chỉ dẫn của nhà sản xuất, dùng nước MilliQ cho mọi bước làm sạch để giảm
lượng acid amin còn sót lại.)
4. Cho mẫu vào hồ nhỏ (100 đến 400 µL thể tích), để cho mẫu chảy qua màng. (Thao tác
với mẫu nên cẩn thận vì protein và peptide có thể dính vào ống thủy tinh hoặc nhựa. Nếu mẫu
nhỏ, có thể giảm thiểu tổn thất ở cartridge bằng cách cho 100 µL dung dịch đệm vào màng
ướt trước khi cho mẫu vào. Mẫu có thể thêm trực tiếp vào dung dịch đệm.)
5. Đảm bảo rằng mẫu hồ nhỏ tiếp xúc hoàn toàn với chất hấp thụ và sự chuyển chất lỏng
bắt đầu.
6. Thêm những mẫu thử thể tích nhỏ, nếu cần (đổi chất hấp thụ sau mỗi 750 µL)
Page 6
Phân tích thực phẩm Acid amin
7. Rửa màng với 100 µL 0.1% TFA 2 lần.
8. Lấy mẫu và làm khô màng PVDF.
3.4 Thu nhận mẫu đã thủy phân trên màng PVDF
1. Đặt màng PVDF vào đáy của ống thủy phân.
2. Thủy phân như bình thường. Sau khi acid đã được làm khô từ mẫu thủy phân, thêm 10
µg methanol. Chiết 2 lần với 50 µL dung dịch gồm 20% MeOH, 0,1N HCl và chuyển đến
ống Eppendorf 0,5mL.
3. Đặt ống Eppendorf vào thùng PICOTAG và làm khô nó.
4. Pha loãng với dung dịch đệm loãng và lọc, dùng một cột vi xoáy. Mẫu đã sẵn sàng để
phân tích acid amin.

B. Thu nhận acid amin bằng thủy phân protein:
1. Thủy phân bằng acid:
Để thu nhận acid amin, phương pháp thường được dùng nhất là thủy phân bằng dung
dịch HCl 6N dư ở nhiệt độ 100-120
o
C trong 24 giờ. Sản phẩm thu được chủ yếu là các acid
amin dưới dạng tự do dưới dạng hydrogenclorate. Một số acid amin như serine và threonine
bị phá hủy một phần, tryptophan bị phá hủy hoàn toàn, glutamine và asparagines bị phân hủy
thành acid glutamic, acid aspartic và NH
4
+
.
2. Thủy phân bằng kiềm:
Người ta còn có thể thu nhận acid amin bằng phương pháp thủy phân với dung dịch
NaOH, bằng cách đun nóng trong nhiều giờ. Sản phẩm thu được hầu hết là các acid amin
nhưng đều bị racemic hóa, các acid amin cysteine, serine, threonine bị phá hủy nhưng
tryptophan không bị phá hủy. Vì vậy, phương pháp thủy phân bằng kiềm thường chỉ dùng để
xác định tryptophan.
3. Thủy phân bằng enzyme:
Để thu nhận chế phẩm acid amin, ngày nay việc thủy phân bằng enzyme được ứng
dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học khác nhau do việc sử dụng enzyme có nhiều ưu
điểm.
Các enzyme thủy phân protein thành các acid amin hay các peptide có phân tử lượng
thấp được gọi chung là peptidhydrogenlase. Có nhiều loại peptidhydrogenlase, chúng được
phân biệt nhờ tính đặc hiệu khác nhau với liên kết peptid. Một số loại cắt đứt liên kết peptide
ở đầu tận cùng của chuỗi polypeptide được gọi là exopeptidase như carboxypeptidase phân
giải liên kết peptide đầu C tận cùng, aminopeptidase phân giải liên kết peptide đầu N tận
Page 7
Phân tích thực phẩm Acid amin
cùng. Một số khác chỉ cắt đứt ở giữa chuỗi polypeptide được gọi là các endopeptidase như

pepsin, tripsin…
III. Định lượng acid amin bằng phương pháp sắc ký:
Người ta có thể dùng nhiều phương pháp sắc ký khác nhau, ở đây chỉ giới thiệu
nguyên tắc của một số phương pháp thông dụng để phân tích acid amin.
1) Sắc ký giấy
Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự phân bố giữa hai pha dung môi: dung
môi cố định và dung môi di động. Dung môi cố định thường là nước giữ ở giấy sắc ký (trong
điều kiện bảo hoà hơi nước, giấy có thể giữ 15-22% nước tính theo trọng lượng giấy). Dung
môi di động thường là một dung môi hữu cơ bảo hoà nước di chuyển trên tờ giấy theo mao
dẫn kéo theo các chất trong dung dịch. Tốc độ di chuyển của từng chất không giống nhau và
mỗi chất được đặc trưng bởi một trị số nhất định gọi là Rf.
Trong đó: - a là khoảng cách chuyển dịch của chất phân tích
Page 8
Phân tích thực phẩm Acid amin
- b là khoảng cách chuyển dịch của dung môi
Có nhiều kiểu sắc ký giấy khác nhau, đó là sắc ký một chiều đi lên, sắc ký một
chiều đi xuống, sắc ký vòng nằm ngang và sắc ký hai chiều. Loại giấy thường dùng là
Whatman số 1 và Schleicher-Schull 2044 a và b, dung môi gồm các chất như 4 Butanol:1
Acetic acid: 5 Nước (dùng cho chiều thư nhất); 3 Phenol: 1 Nước (dùng cho chiều thứ
hai).
2 ) Sắc ký lớp mỏng
Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên lý thuyết của sắc ký giấy, nghĩa là cũng
dựa trên sự phân bố các chất giữa hai pha: chất hấp phụ được tráng rộng trên một phiến kính
tạo thành một lớp mỏng và pha di động là dung môi thích hợp. Dung môi di chuyển làm dịch
chuyển các chất trong mẫu thử. Các chất hấp phụ thường dùng là silicagel, alumin oxyt,
sephadex ,v.v được kết hợp với thạch cao (gypse) để dán vào phiến kính
3) Sắc ký khí
Nguyên tắc của phương pháp này là lợi dụng tính chất khó bay hơi của các acid
amin nên có thể sử dụng chương trình nhiệt để chuyển chúng thành các dẫn xuất (thường là
N-acetyl-amin). Cho tác dụng acid amin với cồn amylic và HBr khan, sau đó cho tác dụng

hỗn hợp này với anhydrid acetic. Cột thường dùng là loại Chromosorb W (60-80 mesh) có
một lớp polyetylenglycol 1% (carbowax 1564 hoặc 6000). Chương trình nhiệt giữa 125
o
C và
155
o
C, tốc độ chảy 60-240 mL/phút.
IV. Một vài phương pháp cụ thể
A. Phân tích acid amin bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp sau phản ứng
tạo dẫn xuất với 1-fluoro-2,4-dinitrophenyl-5-L-alanine amide (thuốc thử Marfey)
1. Giới thiệu
Việc tạo dẫn xuất của acid amin kèm theo việc phân tích sắc ký lỏng cao áp có đảo
pha (RP-HPLC) được xem là phương pháp thích hợp nhất để phân tích acid amin. Các bước
tạo dẫn xuất không chỉ cần thiết cho sự tương tác với pha không phân cực và ổn định, mà còn
cần cho việc đo quang.
Thuốc thử Marfey 1-fluoro-2,4-dinitrophenyl-5-L-alanine amide hoặc (S)-2-[(5-
fluoro-2,4-dinitrophenyl)-amino]propanamide được sử dụng để tách và xác định cấu hình
acid amin. Thuốc thử phản ứng hóa học với nhóm amino của đối hình acid amin để tạo ra dẫn
xuất ổn định mà có thể tách bằng phương pháp RP-HPLC (hình 1). Dinitronphenyl alanine
amid hấp thu mạnh bước sóng 340 nm (ε = 30000 M
-1
cm
-1
), điều này cho phép đầu dò xác
định được ở phạm vi subnmol.
Page 9
Phân tích thực phẩm Acid amin
Việc tạo dẫn xuất với thuốc thử Marfey cũng được dùng để định lượng 19 L-acid
amin thường gặp. Ưu điểm của thuốc thử Marfey là:
1. Có khả năng tạo sắc phổ trên bất kỳ thiết bị phân tích HPLC nào mà không cần

phải tăng nhiệt độ cột phản ứng.
2. Những dung môi không tinh khiết khác khó dò được bước sóng 340 nm.
3. Phát hiện cả sự có mặt của proline khi chạy cột sắc ký đơn.
4. Tạo dẫn xuất acid amin ổn định.
Kỹ thuật đo đơn giản này đem lại cho những nhà phân tích acid amin một phương
pháp hiệu quả và rẻ tiền. Việc tạo dẫn xuất với thuốc thử Marfey còn có những ứng dụng
trong các lĩnh vực hóa sinh, trong đó có việc xác định cơ chất và sản phẩm trong những phản
ứng enzyme của acid amin.
Hình 3: Thuốc
thử Marfey
(I) và L,L-
dẫn xuất từ
L-acid amin
và thuốc
thử (II)
2. Nguyên liệu-Thiết bị:
2.1 Thủy phân protein
• Ống nghiệm bằng thủy tinh chịu nhiệt kích thước 25-50 x 5 mm
• Ống nghiệm thủy tinh có nắp khoen siết chặt
• Dung dịch HCl 6N
2.2 Phản ứng thu nhận dẫn xuất
• dd acid amin chuẩn
• Bộ kit thử L-acid amin chuẩn LAA21
• Thuốc thử Marfey. Lưu ý: thuốc thử Marfey là dẫn xuất của 1-fluoro-2,4-
trinitrobenzene, chất nghi ngờ là có khả năng gây ung thư nên cần thận trọng khi sử
dụng.
• HPLC grade triethylamine, methanol, acetone và dimethyl sulfoxide (DMSO)
Page 10
Phân tích thực phẩm Acid amin
2.3 Phân tích sắc ký:

• Hệ thống vận chuyển dung môi: bất kỳ thiết bị phân tích bằng sắc ký lỏng cao
áp nào cũng có thể sử dụng để thu nhận dẫn xuất của acid amin.
• Cột sắc ký: cột silicat C
8
chuyển đổi pha, ví dụ như: LiChrospher 100 RP 8
(250 x 4.6 mm; 5 μm from Macherey-Nagel), Aquapore RP 300 (220 x 4.6
mm; 7 μm from Perkin-Elmer), Nucleosil 100-C8 (250 x 4.6 mm; 5 μm from
Macherey-Nagel), or Vydac C8 (250 x 4.6 mm; 5 μm from The Separations
group).
• Đầu dò UV/vis kèm theo ô chứa chất lỏng dài 0.5-1 cm, thể tích 3-5 µL. Dẫn
xuất của acid amin được phát hiện ở 340 nm.
• Tổng hợp peak: các phần mềm máy tính được dùng để tổng hợp và định lượng
peak của acid amin
• Dung môi: phải được chuẩn bị với HPLC grade và phải được loại khí
 Dung môi A: 13 mM trifluoroacetic acid (TFA) cùng với 4% (v/v)
tetrahydrofuran trong nước.
 Dung môi B: Acetonitrile (50% v/v) trong dung môi A.
3. Phương pháp:
3.1 Thủy phân protein:
 Lấy vào lọ thủy tinh nhỏ 50-500 pmol mẫu protein hoặc 20 μL dung dịch acid
amin chuẩn chứa 2.5 μmol/mL mỗi 17 acid amin, sau đó làm khô dưới áp suất nhẹ
trong thiết bị cô đặc SpeedVac.
 Đặt những lọ thủy tinh mẫu trên vào lọ thủy tinh có nút khoen chặt chứa 200
μL dung dịch HCl 6N.
 Sục khí argon vào những lọ trên trong 5-15 phút rồi đậy nắp kín và không cho
không khí lọt vào.
 Ủ những lọ thủy tinh ở 110
o
C trong 24 giờ hoặc 150
o

C trong 2 giờ trong tủ ấm
khô.
 Chờ một thời gian cho quá trình thủy phân xảy ra xong, lấy những lọ thủy tinh
khỏi tủ ấm, làm nguội về nhiệt độ phòng và mở nắp từ từ.
 Lấy lọ thủy tinh nhỏ ở trong ra, lau khô bề mặt ngoài bằng giấy mềm rồi làm
khô ở áp suất nhỏ.
3.2 Phản ứng thu nhận dẫn xuất:
Page 11
Phân tích thực phẩm Acid amin
 Thêm 50 μL hỗn hợp theo tỉ lệ triethylamine : methanol : nước = 1 : 1 : 2 vào
lọ đã làm khô rồi trộn vortex thật đều, sau đó đem làm khô.
 Chuẩn bị dung dịch thuốc thử cho phản ứng tạo dẫn xuất (18.4mM) bằng cách
cho 5 mg thuốc thử Marfey vào 1 mL dung dịch acetone.
 Cho hỗn hợp acid amin đã làm khô hoặc mẫu protein đã thủy phân vào 100 μL
triethylamine 25% v/v, rồi thêm vào 100 μL dung dịch thuốc thử Marfey và trộn
vortex thật đều.
 Ủ lọ thủy tinh đó ở 40
o
C trong 60 phút trong điều kiện khuấy trộn nhẹ và tránh
ánh sáng để phản ứng tạo dẫn xuất xảy ra.
 Sau khi ủ, thêm vào hỗn hợp 20 μL dung dịch HCl 2N. Khi này phản ứng kết
thúc. Làm khô hỗn hợp dưới áp suất nhỏ.
 Bảo quản hỗn hợp ở -20
o
C trong bóng tối cho đến khi sử dụng.
 Thêm vào mẫu đã làm khô 1mL dung dịch dimethyl sulfoxide (DMSO) 50%
v/v.
3.3 Phân tích sắc ký:
 Thêm dung môi A và dung môi B vào hệ thống phân tích sắc ký lỏng cao áp
theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

 Cân bằng cột chạy sắc ký và đầu dò với 90% dung môi A và 10% dung môi B.
 Đem mẫu đi phân tích ở nhiệt độ phòng; nếu cần có thể pha loãng với dung
môi A bằng cách thêm vào cột 20 μL (50-1000 pmol).
 Rửa giải cột với hàm lượng dung môi A và B như bảng 2. Việc phân tích dẫn
xuất 2,4-dinitrophenyl-5-L-alanine amide của 18 L-acid amin thường gặp và acid
cysteic thu được kết quả trong 120 phút (hình 4).
Bảng 2: Chương trình HPLC cho sự phân giải dẫn xuất acid amin với thuốc thử
Marfey.
Thời gian (phút) % Dung môi A % Dung môi B
0 90 10
15 90 10
15,1 90 10
115 50 50
165 0 100
170 0 100
Page 12
Phân tích thực phẩm Acid amin
 Xác định những yếu tố ảnh hưởng đối với mỗi acid amin từ khu vực đỉnh của
biểu đồ sắc phổ ở những hàm lượng 100, 250, 500 và 1000 pmol.
 Khi quá trình phân tích sắc ký kết thúc, rửa cột và bơm vào methanol đã loại
khí 20% v/v để bảo quản. Trước khi sử dụng lại, làm sạch với 100% methanol.
Hình 4: Sự tách dẫn xuất 2,4-dinitrophenyl-5-L-alanine amid của L-acid amin bằng phương
pháp HPLC. Thuốc thử Marfey tạo dẫn xuất từ lượng 20 μL hỗn hợp acid amin chuẩn.
Thiết bị: cột LiChrospher 100 RP 8 (250 x 4.6 mm; 5 μm from Macherey-Nagel); mẫu
chứa 100 pmol dẫn xuất của 18 L-acid amin; dung môi A chứa 13mM acid
trifluoroacetic cùng tetrahydrofuran 4% v/v trong nước; dung môi B chứa acetonitrile
50% v/v trong dung môi A; tốc độ chảy 1mL/phút; đầu dò bước sóng 340 nm; cột rửa
giải với lượng dung môi B trong dung môi A phù hợp. Dẫn xuất acid amin được biểu thị
bằng những chữ cái, ví dụ acid cysteic được ký hiệu là CYA, còn cysteine là Cs. FFDA
đặc trưng cho đỉnh của thuốc thử; đỉnh không có ký hiệu tượng trưng cho thuốc thử phụ

có liên quan, như được chỉ trong quá trình chạy sắc phổ riêng lẻ trong thuốc thử riêng.
4. Chú ý:
 Để phân tích acid amin khi acid này đóng vai trò là cơ chất hay sản phẩm
trong phản ứng enzyme, việc tách protein từ acid nucleic là cần thiết. Thêm dung dịch
acid perchloric 4M vào dịch cô đặc cuối cùng nồng độ 1M và ủ trên đá trong ít nhất
15 phút. Khi thêm cùng một thể tích dung dịch KOH 2M ở trạng thái lạnh, acid
Page 13
Phân tích thực phẩm Acid amin
perchloric chuyển thành muối KClO
4
. Sau khi ly tâm 15 phút ở 4
o
C, ta thu chất nổi
trên bề mặt, đem làm khô rồi sử dụng cho quá trình tạo dẫn xuất.
 Việc tách hoàn toàn dung dịch HCl ra khỏi hỗn hợp là rất quan trọng cho phản
ứng giữa các acid amin và thuốc thử Marfey.
 Tỉ lệ giữa thuốc thử Marfey và tổng lượng acid amin không nên vượt quá tỉ lệ
3:1
 Trong suốt quá trình thu nhận dẫn xuất, màu của hỗn hợp phản ứng chuyển từ
vàng sang cam rồi đỏ.
 Trong quá trình acid hóa, màu của hỗn hợp chuyển sang vàng.
 Hỗn hợp acid amin sẽ giữ được tính chất ổn định trong hơn 1 tháng khi bảo
quản ở -20
o
C trong bóng tối. Trong dung dịch DMSO 50% v/v, dẫn xuất thu được sẽ
ổn định trong 72 giờ ở -4
o
C và hơn 6 tuần nếu bảo quản ở -20
o
C.

 Để quá trình đạt hiệu suất cao nên sử dụng thiết bị phun HPLC tự động.
 Cột phản ứng silicat C
8
từ những nhà sản xuất khác nhau sẽ cho kết quả của 19
dẫn xuất acid amin, tuy nhiên, khu vực dốc gradient của dung môi B nên tương tự cho
mỗi cột. Nếu tính thêm acid S-carboxymethyl-L-cysteine và tryptophan thì 2 acid này
tách riêng biệt trong sắc phổ riêng lẻ.
 Việc xác định mỗi đỉnh trên biểu đồ sắc phổ được thiết lập bằng việc thêm
lượng dư acid amin gấp 3 lần. Ô thuốc thử nên được chạy theo từng mẻ với thuốc thử
Marfey để xác định peak liên quan. Thuốc thử dư sẽ gây cản trở cho việc tách riêng
peak của arginine và glycine. Lysine và tyrosine được tách riêng như những dẫn xuất
không thể thay thế.
B. Xác định hàm lượng acid amin trong thực phẩm bằng phương pháp đảo
pha trong phân tích sắc kí với chất dẫn xuất mới butylthiocarbamyl và
benzylthiocarbamyl
1. Giới thiệu:
Phân tích acid amin với phương pháp phân tích sắc ký lỏng đảo pha và chiếu UV
thường được sử dụng đối với những dụng cụ có độ nhạy cao và nhanh hơn nhiều so với
phương pháp phân tích acid amin bằng phương pháp trao đổi ion chuyên dụng. Dẫn xuất acid
amin phenylthiocarbanyl (PTC) được sử dụng trong phân tích acid amin bằng phương pháp
RP HPLC. Đây là phương pháp tốt nhất cho phân tích những dẫn xuất acid amin bậc 2
proline và hydroxy proline. Tuy nhiên, nhược điểm chính của nó là đòi hỏi 1 hệ thống hút
Page 14
Phân tích thực phẩm Acid amin
chân không và tốn thời gian để loại những sản phẩm phụ được sinh ra trong quá trình và loại
thuốc thử dư để tránh nhiễu đối với đỉnh phân tích.
Mặc dù có những tiến bộ trong việc tìm thuốc thử cho thu nhận dẫn xuất vì những dẫn
xuất vẫn còn khuyết điểm, các nhà khoa học vẫn cần thuốc thử với những đặc điểm: đơn
giản, nhạy, ổn định, có khả năng vay hơi cho phương pháp phân tích acid amin với RP HPLC
và đầu dò UV. Dẫn xuất sử dụng trong phương pháp phân tích này rất đa dạng, ngoài phương

pháp PTC còn có OPA (dansyl, dabsyl, 4- nitro phenyl thiocarbonyl (NPTC)). Với những dẫn
xuất OPA, những sản phẩm acid amin bậc 2 proline, hydro proline không thể phát hiện bởi
vì OPA không phản ứng với acid amin bậc 2 khi có mặt những tác nhân oxi hóa. Hơn nữa,
dẫn xuất Dansyl được hình trong bóng tối và không bền khi thời gian phản ứng kéo dài, dưới
tác dụng của dung môi, ánh sáng và bị nhiễu bởi những đỉnh song vì những sản phẩm phụ
trong suốt quá trình dẫn xuất hóa. Dẫn xuất dansyl, theo báo cáo thấy rằng nó liên kết với
những hợp chất hóa học để tiêu diệt vi khuẩn rất chặt chẽ. Nhược điểm của dẫn xuất này là sự
vượt mức hàm lượng ure, muối photphat, NH
4
NO
3
sẽ thay đổi pH đệm của phản ứng và gây
cản trở cho quá trình.
Dẫn xuất hóa với 4- nitro phenyl thiocarbonyl (NPITC) tạo nên sự ổn định của dẫn
xuất NPITC – 1 chất rất phù hợp cho phân tích RP-HPLC và đầu dò UV ở 254- 340 nm.
Nhược điểm của NPITC là sự là sự vượt mức thuốc thử không dễ bị loại bỏ dưới áp lực chân
không. Trong trường hợp này người ta thường dùng dung môi là toluene để trích ly nó. 1
thuốc thử dễ bay hơi hơn trong phương pháp này là BITC, nó là dẫn xuất của 22 acid amin
tiêu chuẩn. BTC_acid amin được phân tích bằng RP-HPLC và đầu dò UV phát hiện ở bước
song 250nm. Thuốc thử này cũng rất phù hợp trong phân tích acid amin trong thực phẩm.
Ưu điểm của BITC: dễ bay hơi, do đó giảm thời gian phân tích (vì những sản phẩm
phụ và thuốc thử dư dễ loại bỏ); khả năng tách dẫn xuất với cystine, cystein, PTC không có
khả năng này, những dẫn xuất acid amin bậc 2, proline, hydroxyproline cũng được dò thấy
với độ nhạy cảm rất cao. Nhưng asparagines và serine thì không thấy rõ và khả năng bền của
dẫn xuất BTC ở nhiệt độ phòng chỉ khoảng 8h.
BZTC có dạng tương tự BTC (ngoại trừ NPITC) được thu nhận dẫn xuất từ 22 acid
amin đối với BZTC thành công và những dẫn xuất này được tách ra hoàn toàn trong pha đảo
của cột Nova. Thuốc thử BZITC kém bay hơi hơn so với BITC nhưng khả năng bay hơi
tương tự PITC. Ưu điểm của dẫn xuất BZTC là đạt hiệu quả cao hơn trong phương pháp đảo
pha so với dẫn xuất PTC trong cùng điều kiện thí nghiệm.

2. Nguyên liệu-Thiết bị:
Page 15
Phân tích thực phẩm Acid amin
2.1 Thiết bị:
1. Máy hút chân không
2. Hệ thống phân phối dung môi Spectra-Physics 8800 cùng với hệ thống bài khí và
ổn định dung môi
3. Đầu dò bước song UV Spectra 200
4. Nova Pak C18
5. Thiết bị đun nóng dạng cột Eppendorf CH-30
2.2 Thuốc thử:
1. BITC, BZITC, PITC (bảo quản ở 0-5
o
C)
2. Bolvine serum albumin (BSA), acid amin chuẩn, norleucine. Acid amin chuẩn bảo
quản ở nhiệt độ phòng còn BSA được giữ ở 2-8
o
C.
3. HPLC – grade acetonitrile, CH
3
OH, tetra hydrofuran (giữ ở nhiệt độ phòng)
4. Những thuốc thử khác
5. Mẫu thực phẩm
2.3 Dung dịch chuẩn:
1. Dung dịch acid amin chuẩn: Trộn hỗn hợp acid amin chuẩn, ngoại trừ glutamine,
cystine, cysteine, được chuẩn bị ở nồng độ 2.5 µmol/mL trong dd HCl 0.01M.
Dung dịch chuẩn của glutamine và cysteine được chuẩn bị với nước.
2. Chuẩn bị dung dịch đệm: gồm hỗn hợp acetonitrile-methanol-triethylamine với tỉ
lệ 10:5:2 chứa L-norleucine (nồng độ 2.5 µmol/mL) với vai trò như chất chuẩn
bên trong, được bảo quản ở 0-5

o
C và phải chuẩn bị lại sau khoảng thời gian rất
ngắn.
3. Phương pháp:
3.1 Quá trình thủy phân BSA và mẫu thực phẩm:
1. Cho BSA (4mg) và bột đậu nành đã nghiền hoặc mẫu trứng đã đồng hóa (0,2g)
lần lượt vào ống nghiệm 5ml và 25ml với nắp vặn có lỗ và màng ngăn.
2. Thêm 0,5ml và 15ml HCl 6M chứa 0,1% phenol vào ống nghiệm 5ml và 25ml,
theo thứ tự.
3. Sau khi vặn nắp chặt, đâm 2 kim tiêm bằng thép không rỉ qua màng ngăn.
4. Nối 1 kim ngập trong dung dịch với nitơ khô cung cấp, kim còn lại nối vào bơm
chân không.
5. Rút chân không bằng bơm chân không trong 5 phút, đồng thời sục khí nitơ vào.
6. Tháo kim nối với bơm chân không trước khi tháo kim nối với nitơ.
Page 16
Phân tích thực phẩm Acid amin
7. Cẩn thận tháo nắp có lỗ, thay bằng nắp không có lỗ vì những lỗ nhỏ có thể tạo
thành khi áp suất cao.
8. Thủy phân ở 145
o
C trong 4 giờ.
9. Làm khô bã BSA với nitơ ở 50
o
C, hòa tan với 5ml HCl 0,01M. Mẫu đã sẵn sàng
cho quá trình tạo dẫn xuất.
10. Lọc bã đậu nành và trứng, sấy với thiết bị sấy thùng quay. Hòa tan và điều chỉnh
tới 50ml HCl 0.01M.
11. Dùng sắc ký trao đổi cation để làm sạch dung dịch thủy phân đậu nành và trứng.
12. Cho 5ml dung dịch thủy phân đi qua cột trao đổi cation 100 x 13 mm (Dowex 5 x
8) với vận tốc 6 giọt/phút để giữ lại acid amin ở nhựa trao đổi ion.

13. Rửa cột nhiều lần với 20ml nước.
14. Tách rửa acid amin trên cột trao đổi cation với 40ml dung dịch ammonia 4M, tốc
độ 6 giọt/phút.
15. Làm khô dung dịch đã tách rửa trong thiết bị sấy thùng quay ở 50
o
C, hòa tan bằng
dung dịch HCl 0,01M và điều chỉnh thể tích đến 50ml. Mẫu đã sẵn sàng cho quá
trình tạo dẫn xuất.
Page 17
Phân tích thực phẩm Acid amin
3.2 Quá trình tạo dẫn xuất:
1. Cho 20µl hỗn hợp dung dịch acid amin chuẩn, 50µl dung dịch cystine chuẩn, và
mẫu thủy phân (BSA; 100µl, đậu nành; 500µl, trứng; 500µl) vào từng lọ nhỏ hình
nón 2ml với 1 nắp đậy vặn có lỗ và một màng ngăn.
2. Làm khô dung dịch hoàn toàn với khí nitơ ở 50
o
C
3. Thêm vào một lượng thích hợp acetonitrile vào mỗi lọ và làm khô lần nữa.
4. Hòa tan bã trong 50µl dung dịch đệm.
5. Thêm vào 3ml BITC, BZITC, PITC vào mỗi dung dịch hòa tan trên để tạo dẫn
xuất BITC, BZITC, PTC.
6. Sau khi vặn nắp chặt, quá trình tạo dẫn xuất được thực hiện ở 40
o
C trong 30 phút
để tạo dẫn xuất BTC và PTC, ở 50
o
C trong 30 phút để tạo dẫn xuất BZTC.
7. Sau khi tạo dẫn xuất, dùng 2 kim tiêm bằng thép không rỉ đâm xuyên qua màng
ngăn vào lọ. Nối một kim với nitơ cung cấp và 1 kim với bơm chân không.
8. Sục nitơ vào lọ, đồng thời rút chân không để hoàn thành quá trình làm khô ở nhiệt

độ phòng trong khoảng 10 phút đối với dẫn xuất BTC và khoảng 40 phút đối với
dẫn xuất BZTC và PTC.
9. Thêm 100µl acetonitrile vào lọ và làm khô dung dịch trong 5 phút với dẫn xuất
BTC và 30 phút với dẫn xuất BZTC và PTC.
10. Hòa tan bã của dẫn xuất BTC trong 1ml ammonium acetate 0,02M.
11. Hòa tan bã của dẫn xuất BZTC và PTC trong 1ml Na2HPO4 chứa 5% methanol
và 1,5% tetrahydrofuran (pH 6,8, điều chỉnh với acid phosphoric.)
12. Lọc dung dịch bằng màng membrane 0,25µm.
Page 18
Phân tích thực phẩm Acid amin
13. Cho lần lượt từng 10µl dung dịch vào HPLC.
3.3 Phép sắc ký:
Hệ thống HPLC Spectra-Physics 8800 hệ thống 3 dung dịch
Detector Detector bước sóng cực tím phổ 200 có thể lập trình
Bước sóng 240 nm cho dẫn xuất BTC
để phát hiện 246 nm cho dẫn xuất BZTC
254 nm cho dẫn xuất PTC
Cột Nova-Pak C
18
(300 x 3,9 id, 4µm dimethyloctadecylsilyl silica vô định
hình, nước). Nhiệt độ cho mọi cột dẫn xuất là 40
o
C với cột gia nhiệt
Eppendorf CH-30.
Page 19
Phân tích thực phẩm Acid amin
Dung môi Cho dẫn xuất BTC:
Dung dịch A: ammonium acetate 0,05M (pH 6,7, điều chỉnh với acid
phosphoric.)
Dung dịch B: dung dịch natri phosphate 0,02M dibase chứa 5%

methanol và 1.5% tetrahydrofuran-acetonitrile (50:50).
Dung dịch C: acetonitrile : nước = 70:30
Tỉ lệ dung môi:

A B C Tốc độ chảy
0.0 phút 100% 0% 0% 1ml/phút
5.0 phút 85 15 0 1ml/phút
14.0 phút 70 20 10 1ml/phút
20.0 phút 60 20 20 1ml/phút
25.0 phút 30 20 50 1ml/phút
30.0 phút 10 20 70 1ml/phút
Cho dẫn xuất BZTC và PTC:
Dung môi A: Na
2
HPO
4
0,02M chứa 5% methanol và 1.5%
tetrahydrofuran (pH 6,8, chỉnh với acid phosphoric.)
Dung môi B: dung môi A và acetonitrile (50:50)
Dung môi C: acetonitrile và nước (70:30)
Tỉ lệ dung môi
A B C Tốc độ chảy
0.0 phút 100% 0% 0% 1,2ml/phút
15.0 phút 76 20 4 1,2ml/phút
20.0 phút 70 20 10 1,2ml/phút
30.0 phút 50 30 20 1,2ml/phút
40.0 phút 30 35 35 1,2ml/phút
Sau đó thực hiện một bước rửa trong 20 phút với dung môi C để bảo vệ
cột không bị hỏng. Cả 2 loại tỉ lệ dung môi trên đều thích hợp cho mẫu
dẫn xuất acid amin và dẫn xuất acid amin chuẩn.

3.4 Độ nhạy của các dẫn xuất BTC, BZTC VÀ PTC:
 Độ nhạy của các chất dẫn xuất BTC, BZTC và PTC có thể phát hiện ở 0.05 aufs,
đây là mức giới hạn cho ranh giới bền vững với lượng nhỏ nhất.
 Cũng có thể xác định mối quan hệ tuyến tính bằng phép phân tích định lượng.
Page 20
Phân tích thực phẩm Acid amin
3.5 Độ bền của các dẫn xuất BTC và BZTC:
Sự biến thiên của các đỉnh trong vùng phản ứng của các chất dẫn xuất BTC và BZTC
với nhiệt độ phòng trong thời gian lưu trữ có thể xác định được độ bền của các chất dẫn xuất
BTC và BZTC.
3.6 Phép phân tích thống kê:
 Để xác định được khả năng tái sản xuất, tất cả các thí nghiệm đều phải được lập
lại từ 3 lần trở lên.
 Độ lệch tương đối tiêu chuẩn ( RSDs) trên kết quả phân tử gam tương đối (RMR)
có thể được tính toán để so sánh về độ chính xác của các chất dẫn xuất .Sự tuyến tính
của các đồ thị định cỡ trong các dãy thích hợp cũng có thể được phát hiện bởi sự định
rõ các yếu tố thống kê quan trọng của hệ số tương quan (γ) của đồ thị định cỡ.
 Khả năng tái sản xuất và sự chính xác trên BSA và các mẫu thực phẩm cũng có
thể được so sánh với phương pháp dùng phép ghi sắc trao đổi ion và các dữ liệu từ
những tài liệu khác
4. Chú ý:
1. Nếu sử dụng một bơm chân không mà không dùng nước, phải lắp đặt thiết
bị để hấp thu những chất phản ứng còn dư thừa bay hơi và những sản phẩm phụ
sinh ra trong suốt quá trình chuyển hóa bởi vì bơm chân không sẽ trở nên vô dụng
khi có mặt các vật chất bay hơi.
2. Những chất phản ứng này dường như rất bền trong nhiều năm nếu không bị
mở ra , nhưng khi nắp của chúng được mở ra nhiều lần ,những chất phản ứng này
chỉ được sử dụng trong 6 lần cho dù chúng được bảo quản ở -20ºC. Tất cả các chất
phản ứng này đều rất độc và có hại.
3. Những dung dịch chuẩn của glutamine và cysteine thường được chuẩn bị

với nước bởi vì trong quá trình lưu trữ kéo dài các acid amin này trong dung dịch
HCl, sẽ xảy ra sự biến đổi thành pyroglutamic acid và cystine theo thứ tự lần lượt
như trên.
4. Đối với chất dẫn xuất BZTC dành cho tiêu chuẩn bên trong của mẫu, L-
norleucine không nên sử dụng.
5. Khi cung cấp khí nitơ khô, phải kết nối ống để hấp thu tất cả các hơi ẩm
như được chỉ ra trong hình 2. Ống chứa muối Na
2
SO
4
khan phải được thay đổi
định kỳ từ 1 đến 2 lần.
Page 21
Phân tích thực phẩm Acid amin
6. Khi nắp có 1 lỗ trở thành nắp không còn lỗ, thì bạn phải cẩn thận vì vách
ngăn không thể tháo ra được.
7. Phải thật cẩn thận, không để mẫu, dung dịch rửa và dung dịch tách rửa rơi
vào bề mặt chất dẻo dung để trao đổi cation trong cột.
8. Tốc độ của các giọt dung dịch rửa trong suốt quá trình rửa không quan
trọng.
9. Khi phân tích với sắc ký trao đổi ion và phương pháp chuyển hóa ninhydrin,
phải làm khô dung dịch mẫu trong các máy bay hơi quay. Hòa tan lại lần nữa
trong chất đệm citrate Na 0.2 M (pH = 2.2) và đưa vào máy phân tích mino acid tự
động.( LKB 4150 alpha , cột trao đổi cation Ultrapac 11)
10. Do tác động đồng thời của acetonitrile bốc hơi ,phần còn lại của nước sẽ
được làm khô hoàn toàn .
11. Các phản ứng hóa học của các chất dẫn xuất BTC và BZTC diễn ra như sau:
12. Quang phổ UV của hỗn hợp acid amin BTC và BITC, sự hợp lại của 2 chất
phản ứng được chỉ ra trong hình 5. λmax của acid amin BTC vào khoảng 234
nm, nhưng bước sóng có tác dụng mạnh nhất vào khoảng 250 nm, nó có thể tránh

được sự hấp thu phổ của các tạp chất và chất điện phân, ammonium acetate trong
dung môi (16)
13. Phổ UV của hỗn hợp acid amin BZTC và hỗn hợp acid amin TC khi hoà tan
trong dung dịch NaH
2
PO
4
0.02 M được chỉ ra trong hình 6. Những bước sóng cho
khả năng hấp thu mạnh nhất là 220 nm và 238 nm trong dẫn xuất BZTC; 215 nm
và 270 nm trong dẫn xuất PTC.Nhưng bước sóng có tác dụng mạnh nhất là 246
Page 22
Phân tích thực phẩm Acid amin
nm trong dẫn xuất BZTC và 254 nm trong dẫn xuất PTC, để tránh được sự nhiễu
của phổ hấp thu các tạp chất, chất điện phân và có thể thấy được một ranh giới
bền vững.
14. Sắc phổ acid amin chuẩn của các chất dẫn xuất BTC và BZTC khi so sánh
với chất dẫn xuất PTC được tách riêng trong cột Nova Pak C
18
được chỉ rõ trong
hình 7.Tất cả 22 acid amin chuẩn được chuyển hóa với các chất dẫn xuất BTC,
BZTC và PTC và được phân giải trong cột lưu trữ C
18
.
15. Trong những chất dẫn xuất BTC, asparagines và serine đều hoàn toàn
không tách được nhưng BTC- cysteine và cystine thì được tách rửa từng cái một
mặc dù đỉnh của nó được chuyển thành đỉnh cuối. trong những chất dẫn xuất
PTC , đỉnh của cysteine và cystine xuất hiện ở cùng vị trí ,từ đó có thể cho rằng
cysteine có thể được chyển hoàn toàn thành cystine trong suốt quá trình chuyển
hóa bởi vì sự thật là cysteine có thể bị oxy hóa (20) .Những tư liệu khác cũng cho
rằng cysteine và cystine được tách rửa ở cùng vị trí (2,4,7)

Hình 5: Phổ UV (trục x là nm) của hỗn hợp BTC acid amin và thuốc thử BITC.
Độ hấp thu của dung môi ở 250nm = 0
Page 23
Phân tích thực phẩm Acid amin
Hình 6: Phổ tia UV của hỗn hợp acid amin BZTC và acid amin PTC. Dung dịch
NaH
2
PO
4
0.05 M. Sự hấp thu của dung dịch ở 254 nm = 0.
Page 24
Phân tích thực phẩm Acid amin
Hình 7 : Sắc phổ của các chất dẫn xuất protein acid amin chuẩn khi phân tích trên
cột Nova – pak ( 30 cm x 3.9 mm) C18 .I.S. = norleucine .Lượng thêm vào là
0.625 nmol .
(A) : acid amin BTC
(B) : acid amin BZTC
(C) : acid amin PTC
Cyt: Cystine, Cys: Cysteine

Page 25