Nghiên cứu môi trường tối ưu để sản xuất sinh khối và các chất có hoạt tính sinh học của sâm ngọc linh (Panax Vietnamensis Ha et grushv.) bằng phương pháp nuôi cấy lỏng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC Tự NHIÊN
• • • •

ũ

BÁO CÁO TỔNG KÉT ĐÈ TÀI
TÊN ĐÈ TÀI:“NGHIÊN c ứ u MÔI TRƯỜNG TỐI ư u ĐẺ SẢN XUẤT
SINH KHỐI VÀ CÁC CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA SÂM
NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV.) BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY LỎNG”.
ĐÈ TÀI ĐẶC BIỆT CÁP ĐẠI HỌC QƯÓC GIA HÀ NỘI
MÃ SỔ: QG.06.14
CHỦ TRÌ ĐÈ TÀI:
TS. Nguyễn Trung Thành
CÁC CÁN B ộ THAM GIA:
ThS. Nguyễn Kim Thanh
CN Nguyễn Anh Đức
ThS. Hà Tuấn Anh
ThS. Ngô Đức Phương
ThS. Lê Thanh Sơn
TS. Nguyễn Văn Kết
GS.TS. Paek Kee Yoeup
TS. Yu Kee Won
HÀ NỘI - 6/2008
ĐAI HOC QUỐC GIA HÀ NỘỈ
TPUNG TẦM ĩHÓNG TIN THƯ VIỆN
O QClhílC M O ị/l
MỤC LỤC
Trang
Danh mục các từ viết tắt III

Báo cáo tóm tắt 1
Đặt vấn đề 7
Mục tiêu nghiên cứu 8
Nội dung nghiên cứu 9
Tổng quan tài liệu 10
Nguyên liệu và phương pháp 12
Nguyên liệu nghiên cứu 12
Phương pháp nghiên cứu 12
Kết quả và thảo luận 15
Thu thập mẫu vật nghiên cứu 15
Một số đặc điểm ở khu vực thu mẫu 15
Mô tả tóm tắt về hình thái của Sâm Ngọc Linh 15
Các thành phần hoạt chất chính có mặt trong rễ sâm Ngọc Linh 16
Tạo mô sẹo trên môi trường ran 19
Anh của nồng độ 2,4D đến sự hình thành mô sẹo 19
Ảnh hưởng của auxin đến sự hình thành rễ bất định 20
Nuôi cấy tế bào trên môi trường lỏng 23
Ảnh hưởng của nồng môi trường lên sự sinh trưởng của tế bào và 23
sự tích lũy hàm lượng ginsenoside
Ảnh hưởng của nồng độ NAA và IBA lên sự tăng trưởng sinh 24
khối và sản phẩm ginsenosides
Ảnh hưởng của nồng độ BA và kinetin kết hợp với IBA lên sự 26
tăng trưởng sinh khối và sản phẩm ginsenosides
I
Ảnh hường của nồng độ đường lên sự tăng trưởng sinh khối và 28
sản phẩm ginsenosides
Ảnh hưởng của nồng độ nitơ lên sự tăng trưởng sinh khối và sản 30
phẩm ginsenosides
Kết luận và kiến nghị 32
Tài liệu tham khảo 34

Phụ lục 39
Tóm tắt các công trình nghiên cứu khoa học của cá nhân 40
Phiếu đăng ký kết quả nghiên cứu khoa học công nghệ 43
II
DANH MỤC CÁC TỪ VIÉT TẮT
TT
Ký hiệu viết tắt
Tên viết đầy đủ
1.
2,4D
2,4 dichlorophenoxy acetic axit
2.
BA
Benzyladenine
3.
IBA
Indole 3 butyric axit
4.
NAA
Naphthalene acetic axit
5.
MS
Murashige & Skoog
6.
TL tươi
Trọng lượng tươi
7.
TL khô
Trọng lượng khô
III

BÁO CÁO TÓM TẮT
1. TÊN ĐÈ TÀI
“Nghiên cứu môi trường tối ưu để sản xuất sinh khối và các chất có
hoạt tính sinh học của Sâm Ngọc Linh {Panax vietnamensis Ha et Grushv.)
bằng phương pháp nuôi cấy lỏng”.
2. MÃ SỐ: QG.06.14
3. CHỦ TRỈ ĐÈ TÀI: TS. Nguyễn Trung Thành
4. CÁC CÁN Bộ THAM GIA
ThS. Nguyễn Kim Thanh
CN. Nguyễn Anh Đức
ThS. Hà Tuấn Anh
ThS. Ngô Đức Phương
ThS. Lê Thanh Sơn
TS. Nguyễn Văn Kết
GS.TS. Paek Kee Yoeup
TS. Yu Kee Won
5. MỤC TIỂU NGHIÊN c ứ u
- Áp dụng một phương pháp tạo sinh khối một loài cây thuốc quý
ngay trong phòng thí nghiệm mà hiện nay chưa được áp dụng ở Việt Nam.
- Xây dựng một hướng nghiên cứu mới để tạo ra sản phẩm hừu ích
nhằm ứng dụng rộng rãi phục vụ cho việc chăm sóc sức khỏe cộng đồng,
đồng thời để sử dụng bền vững nguồn gen quý của nước ta.
- Đe tài tập hợp các chuyên ngành khác nhau cùng tham gia nghiên
cứu, bao gồm (chuyên ngành thực vật học, sinh lý thực vật, hóa sinh, Dược
liệu).
6. NỘI DUNG NGHIÊN c ứ u
- Thu thập mẫu vật, phân lập, tuyển chọn một số chủng có hoạt tính
sinh học cao ở Việt Nam.
- Nghiên cứu môi trường tối ưu để sản xuất sinh khối và các chất có
hoạt tính sinh học.

- Bước đầu phân tích và đánh giá thành phần, định lượng nhóm các
chât có hoat tính sinh hoc.
7. CÁC KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC
Kết quả khoa học đã đạt được
1. Chất điều hòa sinh trường thực vật là nhân tố quan trọng trong nuôi
cấy tế bào và mô thực vật, ở đây auxin 2,4-D đã được sử dụng trong nghiên
cứu để tạo mô sẹo của Sâm Ngọc Linh (P. vietnamensis Ha Et Grush). Kêt
quả thu được khi bổ sung 2,4-D vào môi trường răn MS ở nông độ 1 mg/L,
mô sẹo của Sâm Ngọc Linh được hình thành và phát triên tôt sau 28 ngày
nuôi cấy.
2. Trong nuôi cấy lỏng trên môi trường cơ bản MS thích hợp cho sự
sinh trưởng và phát triên của tê bào cũng như sự tông hợp sản phâm thứ câp
ginsenoside ở nồng độ thấp 0,5 - 1.
3. Trong môi trường MS có bổ sung các loại auxin (IBA và NAA) kết
quả sau 4 tuần nuôi cấy cho thấy IBA là tối ưu cho sự sinh truởng và phát
triển của tế bào ở nồng độ 3 mg/L, sinh khối khô thu được 10.7 g/L và sản
phẩm ginsenosiđe (5.45 mg/g TL khô).
4. Cytokinin (BA và kinetin) đã được bổ sung khi kết hợp với 3 mg/L
IBA, kết quả cho thấy cytokinin đã ảnh hưởng không có nghĩa đến sự tăng
trưởng sinh khối khi tăng nồng độ từ 0,1 đến 1 mg/L, nhưng lại ảnh hưởng
đến sự tích lũy hàm lượng ginsenoside, hàm lượng ginsenside thu được ở
nồng độ 0,5 mg/L BA là 5.95 mg/g TL khô và ở nồng độ 0,5 mg/L kinetin
là 5.87 mg/g TL khô.
5. Nồng độ đường trong môi trường nuôi cấy tế bào cũng được thay
đổi, kết quả cho thấy 50 g/L là thích hợp cho sự tích luỹ sinh khối tế bào và
sự tổng hợp sản phẩm ginsenoside. Sinh khối khô tăng từ 5.4 đến 10.3 g/L
khi tăng nồng độ đường từ 0 đến 50 g/L. Tiếp tục tăng nồng độ đường sẽ
kìm hãm sự sinh trưởng tế bào cũng như sự tổng hợp ginsenoside.
6. Tương tự, ở nồng độ 30 mM nitrogen là tối ưu cho sự sinh trưởng tế
bào và sự tích lũy sản phẩm trao đổi chất thứ cấp ginsenoside.

Sổ bài báo khoa học đã và sắp được công
Đã công bổ 03 bài báo khoa học trên các tạp chí chuyên ngành
1. Nguyen Trung Thanh, Le Thanh Son and Paek Kee Yoeup. 2007.
Induction and proliferation of callus of Ngoe Linh ginseng (Panax
vietnamensis Ha et Grushv): Effects of plant growth regulators. J. Science,
Natural Sciences and Technology, Vietnam, 23 (IS): pp. 167 - 173.
2. Nguyen Trung Thanh, Le Van Can and Paek Kee Yoeup. 2007.
The adventitious root cultures of Ngoe Linh ginseng (Panax vietnamensis
2
Ha et Grushv.). Preceding of National Conference on Life Sciences 2007,
Science and Technical Publication House, Vietnam, pp. 828 - 831.
3. Nguyen Trung Thanh, Nguyen Van Ket, Paek Kee Yoeup. 2007.
Effecting of medium composition on biomass and ginsenoside production
in cell suspension culture of Panax vietnamensis Ha et Grushv. J. Science,
Natural Sciences and Technology, Vietnam, 23: pp. 269 - 274.
01 bài sắp đăng trên Tạp chí Khoa học, ĐHQGHN
4. Nguyen Trung Thanh, Ha Tuan Anh, Paek Kee Yoeup. 2008.
Effects of macro elements on biomass and ginsenoside production in cell
suspension culture of Ngoe Linh ginseng (.Panax vietnamensis Ha et
Grushv.).
8. TỈNH HÌNH KINH PHÍ CỦA ĐÈ TÀI
- Đề tài đã thực hiện đúng thời hạn đăng ký 24 tháng.
- Kinh phí được cấp tổng cộng trong 2 năm là 60.000.000 đồng, đến
nay đã nhận và thanh quyết toán đầy đủ với Phòng Ke hoạch - Tài vụ,
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQHN.
KHOA QUẢN LÝ CHỦ TRÌ ĐÈ TÀI
PGS.TS. Phan Tuấn Nghĩa
TS. Nguyễn Trung Thành
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC Tự NHIÊN
•M ổ MtỄu THƯỚNG

3
SUMMARY REPORT
1. TITLE OF THE RESEARCH PROJECT
“Study on the suitable medium to culture the biomass cell and
ginsenosides production of Ngoe Linh Ginseng (Panax vietnamensis Ha et
Grushv.) by cell suspension cultures”.
2. CODE OF THE RESEARCH PROJECT
QG.06.14
3. PRINCIPAL RESEARCHER
Dr. Nguyen Trung Thanh
4. MAIN COLLABORATORS TO RESEARCH PROJECT
MSc. Nguyen Kim Thanh
BC. Nguyen Anh Due
MSc. Ha Tuan Anh
MSc. Ngo Due Phuong
MSc. Le Thanh Son
Dr. Nguyen Van Ket
Prof. Dr. Paek Kee Yoeup
Dr. Yu Kee Won
5. RESEARCH PROJECT OBJECTIVES
- The new method application to produce the biomass and useful
metabolite production of the medicinal plant in laboratory.
- Design a reseach way to produce the useful production in order to
care community health and the gene resource conservation.
- The research way is combinated by other speciality to study
(Botany, plant physiology and biochemistry, phamaceutical).
6. SKETCHES OF RESEARCH CONTENT
- Collect, isolate and selection sample ginseng with high bioactive
compound.
- Determination suitable medium to produce the biomass and useful

metabolite production in ginseng.
- The first analyze on the ginsenoside content of Panax ginseng.
4
7. ACADEMIC RESEARCH OUTCOMES
1. Plant growth regulators in plant cell and tissue cultures are an
important factor affecting the plant physiology. In this work, the first callus
was induced from root explants of Panax vietnamensis cultured on MS
basal medium supplemented with lmg/L 2,4-D, while no plant growth
regulators were needed for callus maturation.
2. We established cell suspension culture on Panax vietnamensis and
some attempts have been made to increase ginsenoside yield of ginseng cell
culture through manipulation various culture factors and process variable.
Half and full strength MS medium were found to be equally suitable for
both biomass as well as ginsenoside production. The biomass production
and ginsenoside yield were obtained 9.8 g/L DW and 6.81 mg/g DW,
respectively.
3. The maximum biomass yields of cell culture of ginseng was
obtained in medium containing auxin IBA and NAA. However, ginsenoside
production was much higher in IBA or NAA containing medium and 3
mg/L IBA was found to be optimal for callus proliferaton (10.7 g/L DW)
and ginsenoside production (5.45 mg/g DW).
4. Addition of cytokinin (BA and kinetin) did not affect cell growth
but ginsenoside production was increased when the medium supplemented
with 0.5 mg/L BA (5.95 mg/g DW) or 0.5 mg/L kinetin (5.87 mg/g DW),
respectively.
5. The effect of initial sucrose concentrations were also investigated
in suspension cultures of p. vietnamensis for biomass and production of
ginseng saponin (secondary metabolite). The final dry cell weight was
increased from 5.4 to 10.3 g/L with an increase of initial sucrose
concentration from 0 to 50 g/L, but an even higher sucrose concentration of

60 g/L seemed to repress the cell growth, further increase of sucrose
concentration upto 70 g/L led to a decrease in ginsenoside accumulation
and biomass production.
6. The maximum growth and ginsenoside production was obtained for
nitrogen concentration of 30 mM.
- The scientific articles and reports published and will being
published
+ 03 scientific articles were published on specialist journals
1. Nguyen Trung Thanh, Le Thanh Son and Paek Kee Yoeup. 2007
Induction and proliferation of callus of Ngoe Linh ginseng (Panax
5
'JW
vietnamensis Ha et Grushv): Effects of plant growth regulators. J. Science,
Natural Sciences and Technology, Vietnam, 23 (IS): pp. 167 - 173.
2. Nguyen Trung Thanh, Le Van Can and Paek Kee Yoeup. 2007.
The adventitious root cultures of Ngoe Linh ginseng (Panax vietnamensis
Ha et Grushv.). Proceeding of National Conference on Life Sciences 2007,
Science and Technical Publication House, Vietnam, pp. 828 - 831.
3. Nguyen Trung Thanh, Nguyen Van Ket, Paek Kee Yoeup. 2007.
Effecting of medium composition on biomass and ginsenoside production
in cell suspension culture of Panax vieừiamensis Ha et Grushv. J. Science,
Natural Sciences and Technology, Vietnam, 23: pp. 269 - 274.
01 scientific report will being published on J. Science, VNU
4. Nguyen Trung Thanh, Ha Tuan Anh, Paek Kee Yoeup. 2008.
Effects of macro elements on biomass and ginsenoside production in cell
suspension culture of Ngoe Linh ginseng (Panax vietnamensis Ha et
Grushv.).
8. EXPENDITUDE AND SCHEDULE
- The project has been implemented on time (24 months).
- All budget (60.000.000 VND) have been fully received and

completed drawn the balance sheet at the Department of Account, Hanoi
University of Science, VNƯ.
FACULTY OF BIOLOGY
PRINCIPAL RESEARCHER
Assoc.Prof.Dr. Phan Tuan Nghia
Dr. Nguyen Trung Thanh
HANOI UNIVERSITY OF SCIENCE
6
ĐẢT VẤN ĐỀ
Các loài Sâm thuộc chi Panax: Panax ginseng, Panax notoginseng,
Panax japonicus, Panax quinquefolium, Panax vietnamensis, v.v, từ rất lâu
được coi là một trong số những cây thuốc có tác dụng đồng hóa các sản
phẩm trong tế bào, kích thích điều hòa cơ chế miễn dịch, tăng sức đề kháng
cho cơ thể, hệ thần kinh và chống một số bệnh ung thư, v.v. Thành phần
chính saponin đã được ghi nhận như là hợp chất có hoạt tính quan trọng
nhất trong rễ sâm. Mặt khác chúng còn chứa các thành phần khác nhau như
các chất chống ôxy hóa, peptides, polysaccharides, axit béo và vitamin (Lee
và Cộng sự, 1995).
Nhu cầu về sử dụng sâm và chiết xuất các hoạt chất của chúng đã
tăng nhanh theo thòi gian trên toàn thế giới. Nhưng để thu hoạch được rễ
sâm bằng phương pháp trồng trên đồng ruộng thì phải mất từ 4-6 năm và
nhân công lao động cũng đã làm cho giá thành tăng lên rất cao (Persons,
1995). Ngoài ra việc điều khiển các loại dịch bệnh, sự kháng các loại thuốc
trừ sâu cũng là một vấn đề nghiêm trọng (Yu và Ohh, 1995). Trong những
năm gần đây, việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật đã rất thành
công trong sản xuất các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp, bao gồm các
nguyên liệu thô trong dược phẩm, các sắc tố và các hóa chất khác (Choi,
1998 ; Zhong, 1998; Bourgaud, 2001). Sản phẩm ginsenosides cũng đã thu
được nhieu kêt quả thật đáng tự hào thông qua nuôi cấy tể bào thực vật
(Furuya và Cộng sự, 1983; Liu và Zhong, 1998; Akalezi và Cộng sự, 1999-

Paek và Cộng sự, 2001; Thành, 2005).
Sâm Ngọc Linh, còn gọi là Sâm K5 (Panax vỉetnamensis Ha et
Grushv) là loại Sâm đặc hữu ở Việt Nam đã được đoàn điều tra dược liệu
Ban Dân y Khu V phát hiện năm 1973 tại vùng núi Ngọc Linh thuộc hai
tỉnh Kon Turn và Quảng Nam ở độ cao 1.500 - 2.300m. Do dược tính quý
7
giá của cây Sâm nên giá thành lên tới hàng triệu đồng/củ trong những năm
gần đây. Trong nhiều năm qua người dân địa phương đã săn lùng khai thác
cây Sâm Ngọc Linh một cách ồ ạt vô tội vạ, không có kế hoạch bảo vệ, số
lượng ngày càng trở nên khan hiếm và đã đến mức báo động.
Trước tình hình như vậy, một dự án "Nghiên cứu hoàn thiện công
nghệ sản xuất giống, kỳ thuật và quy hoạch phát triển cây sâm K5 tại Kon
Tum" có sự hỗ trợ của 2 cơ quan: 1. Viện Dược liệu Bộ Y tế; 2. Trung tâm
Nghiên cứu Trồng chế biến Cây thuốc Hà Nội đã và đang được thực thi cho
đến nay. Ngoài ra, cho đến nay cũng đã có một số kết quả báo cáo về phân
tích thành phần saponin của cây Sâm Ngọc Linh (Tanaka 1989; Hường và
Cộng sự, 1996; Đức và Cộng sự, 1997; Konoshima và Cộng sự, 1998;
Yamasaki, 1999).
Như vậy có thể nói rằng, những hiểu biết về cây Sâm Ngọc Linh đến
nay là rất khiêm tốn, và đặc biệt là trong vấn đề sản xuất sinh khối ở quy
mô lớn là còn đang hạn chế. Do đó cần nhiều những nghiên cứu chi tiết
cũng như khả năng ứng dụng của cây dược liệu quý giá này. Chính vì vậy
chúng tôi đề xuất hướng nghiên cứu này với đề tài: “Nghiên cứu môi
trường tối ưu để sản xuất sinh khối và các chất có hoạt tính sinh học
của Sâm Ngọc Linh (Panax vỉetnamensis Ha et Grushv.) bằng phương
pháp nuôi cấy lỏng”.
• MỤC TIÊU NGHIÊN CỬU
- Áp dụng một phương pháp tạo sinh khối một loài cây thuốc quý
ngay trong phòng thí nghiệm mà hiện nay chưa được áp dụng ở Việt Nam.
- Xây dựng một hướng nghiên cứu mới để tạo ra sản phẩm hữu ích

nhăm ứng dụng rộng rãi phục vụ cho việc chăm sóc sức khỏe cộng đồng
đông thời đê sử dụng bền vững nguồn gen quý của nước ta.
8
- Đề tài tập hợp các chuyên ngành khác nhau cùng tham gia nghiên
cứu, bao gồm (chuyên ngành thực vật học, sinh lý thực vật, hóa sinh).
• NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Thu thập mẫu vật, phân lập, tuyển chọn một số chủng có hoạt tính
sinh học cao ở Việt Nam.
- Nghiên cứu môi trường tối ưu để sản xuất sinh khối và các chất có
hoạt tính sinh học.
- Bước đầu phân tích và đánh giá thành phần, định lượng nhóm các
chất có hoạt tính sinh học.
9
I. TỎNG QUAN TÀI LIỆU
Cây sâm Việt Nam (sâm Ngọc Linh, sâm K5, củ ngãi rọm con) thuộc
họ Nhân sâm (Araliaceae) đã được sử dụng trong dân gian như một vị thuốc
dấu của đồng bảo Xê Đăng. Năm 1973, đoàn điều tra dược liệu Ban dân y
khu 5 do dược sĩ Đào Kim Long và Nguyễn Châu Giang hướng dẫn, đã
phát hiện một loài Panax mọc hoang thành quần thể ở độ cao 1.800 m tại
Kon Tum. Bắt đầu từ năm 1974, loài sâm mới này được gọi với tên sâm K5
để đánh dấu bước phát hiện lịch sử tại vùng liên khu 5, (Đức và Cộng sự,
1996; Dong, 2003).
Đi cùng với thời gian cây sâm Ngọc Linh đã được biết về tác dụng
phòng chữa bệnh, tăng lực và sinh thích nghi (antistress), phục hồi sự suy
giảm chức năng giúp cho tình trạng của cơ thể trở lại bình thường mà khái
niệm của y học cổ truyền gọi là "hồi dương". Tác dụng chống lão hóa,
kháng các độc tố gây hại tế bào, giúp kéo dài sự sống của tế bào, tái tạo các
tế bào mới. Tác dụng kích thích điều hòa cơ chế miễn dịch, tăng sức đề
kháng của cơ thể, phòng và chống lại một số bệnh ung thư. Do dược tính
quý giá của cây sâm nên giá thành lên tới hàng triệu đồng/củ. Trong nhiều

năm qua người dân địa phương đã săn lùng khai thác một cách ồ ạt vô tội
vạ, không có ké hoạch bảo vệ, số lượng ngày càng trở nên khan hiếm và đã
đến mức báo động.
Nhu cầu về sử dụng sâm và chiết xuất các hoạt chất của chúng đã
tăng nhanh theo thời gian trên toàn thế giới. Nhưng để thu hoạch được rễ
sâm bằng phương pháp trồng trên đồng ruộng thì phải mất từ 4-6 năm và
nhân công lao động cũng đã làm cho giá thành tăng lên rất cao (Person
1995). Ngoài ra việc điều khiển các loại dịch bệnh, sự kháng các loại thuốc
trừ sâu cũng là một vấn đề nghiêm trọng (Yu and Ohh, 1995). Trong những
năm gần đây, việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật đã rất thành
10
công trong sản xuất các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp, bao gồm các
nguyên liệu thô trong dược phẩm, các sắc tố và các hợp chất khác
(Bourgand, 2001). Sản phẩm ginsenosides thu được nhiều kết quả thật đáng
tự hào thông qua nuôi cấy tế bào thực vật (Lee và Cộng sự, 1995; Person,
1995; Thanh và Cộng sự, 2005)
Chất điều hòa sinh truởng thực vật được coi là một trong những nhân
tố quan trọng và quyết định sự thành công trong sự sinh trưởng, biệt hóa và
tổng hợp sản phẩm trao đổi thứ cấp của tế bào trong nuôi cấy mô, tế bào
thực vật (Rokem và Goldberg, 1985). Nhiều bài báo nói về sự ảnh hưởng
của chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong nuôi cấy in vitro Panax
ginseng, từ nghiên cứu rất sớm (Kita va Sugii, 1969) đã chỉ ra trong nuôi
cấy mô Panax ginseng thì hooc môn 2,4D là nhân tố rất quan trọng.
Pisetskaya, (1970) đã tìm thấy vai trò của NAA và kinetin trong nuôi cấy
mô lá và rễ p. ginseng. Khi nghiên cửu ảnh hưởng của 2,4D và kinetin lên
sự tích lũy sản phẩm saponin trong nuôi cấy Panax ginseng (Kim và Cộng
sự, 1980) đã tìm thấy sự tổng hợp sản phẩm saponin tăng lên khi có sự kết
hợp của 2 chất điều hòa sinh trưởng thực vật (2,4D và kinetin). Aitsu và
Cộng sự, (1992) đã chứng minh rằng, khi bổ sung BA vào môi trường nuôi
cấy sẽ kích thích sự tổng hợp saponin.

11
II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
1. Nguyên liệu nghiên cứu
Rễ tươi Sâm Ngọc Linh (Panax vieừiamensỉs Ha et Grushv.) từ 4-5
năm tuổi được thu từ núi Ngọc Linh được sử dụng trong các nghiên cứu này
(Hình 1).
Hình 1. Củ sâm Ngọc Linh 5 năm tuổi (Panax vietnamensis)
2. Phương pháp nghiên cứu
2.1. Phương pháp phân lập và tạo mô sẹo
Rễ tươi Sâm Ngọc Linh tươi 4-5 năm tuổi thu tại núi Ngọc Linh, tỉnh
Quảng Nam (Hình 1), được rửa sạch bằng nước lã từ 3-5 phút, sau đó khử
trùng bằng cồn 70% trong 2 phút, cuối cùng khử trùng trong dung dịch
sodium hypochlorite 1 - 5% và sửa lại bàng nước lã vô trùng 3 lần. Mầu
được cắt thành từng miếng nhỏ có kích thước từ 0.2 - 0.5 cm và được nuôi
cấy trong môi trường MS cơ bản.
12
2.2. Điêu kiện nuoi cay
Điều kiện nuôi cấy trong bóng tối ở nhiệt độ 23 ± 2 °c, sau 4 tuân
nuôi cấy mô sẹo đã được hình thành trên môi trường rắn MS, bô sung 1
mg/L 2,4D.
2.3. Nuôi cấy tế bào lỏng
Mô sẹo đã phát triển ổn định trong thời gian 4 tuần sau đó được
chuyển vào môi trường MS lỏng để nuôi cấy. Te bào được duy trì trong môi
trường được bổ sung 3% đường sucrose, 1 mg/L 2,4D và 0,1 mg/L kinetin
để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo. Các thí nghiệm nuôi cấy lỏng được
tiến hành trong các bình tam giác có dung tích 300 ml chứa 50 ml môi
trường, đặt trên máy lắc với tốc độ 105 vòng/phút. Các thí đều được lặp lại
3 lần.
- Ảnh hưởng của nồng môi trường lên sự sinh trưởng của tế bào và sự
tích lũy hàm lượng ginsenoside.

- Ảnh hưởng của nồng độ NAA và IBA lên sự tăng trưởng sinh khối
và sản phẩm ginsenosides.
- Ảnh hưởng của nồng độ BA và kinetin kết hợp với IBA lên sự tăng
trưởng sinh khối và sản phẩm ginsenosides.
- Ảnh hưởng của nồng độ đường lên sự tăng trưởng sinh khối và sản
phẩm ginsenosides.
- Ảnh hưởng của nồng độ nitơ lên sự tăng trưởng sinh khối và sản
phẩm ginsenosides.
2.3. Nuôi cấy rễ bất định
Rễ bất định đã hình thành từ mô sẹo sau 6 tuần nuôi cấy trên môi
trường MS bô sung 30 g/L đường sucrose, 10 g/L agar (Công ty sản xuất đồ
hộp Quảng Ninh). Hai loại auxin được sử dụng trong thí nghiệm để tạo ra rễ
bất định IBA và NAA với nồng độ 0, 1, 2, 4, 6 mg/L.
13
2.4. Chiết xuất và xác định hàm lượng ginsenosides
Rễ bất định đã thu hoạch, sửa sạch và sấy khô ở nhiệt độ 60°c trong
7 giờ. Quá trình chiết suất, xác định hàm lượng ginsenosides có trong rễ
sâm đã tiến hành theo mô tả (Furuya và cộng sự, 1983; Thành và cộng sự
2005). Các bước được thể hiện qua (Hình 2).
Material (1-2 g dry wt.)
ị extract 2 times with 50 mL of 75% MeOH
Ginseng extract
ị
evaporate the methanol and dissolve
in 50 mL water
Water so:
ution
partitioning twice with ethyl ether
Ether layer Aqueous layer
extract 3 times using

spur-buthanol
Spur-butanol layer Aqueous layer
wash twice with water and
evaporate in vacuum at 50"C
Crude ginsenoside
dissolve in 5 mL of methanol (w/v dry wt.) and
filtrate with 0.45 àl PTEF membrane filter
V
HPLC analysis
H'mh 2. Quy trình chiết suất, xác định hàm lượng ginsenosỉdes để phân tích HPLC
14
m . KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1. THU THẬP MẪU NGHIÊN c ử u
1.1. Môt số đăc điểm ở khu vưc thu mẫu
Xã vùng cao Trà Linh ở phía Tây Nam huyện miền núi Trà My, tỉnh
Quảng Nam, có núi cao từ 800m trở lên, trong đó có đỉnh Ngọc Linh cao
nhất miền Nam Việt Nam (2.598m). Khu vực thu mẫu có độ cao từ 1600-
2300m, địa thế hơi dốc, bề mặt lớp đất vàng đỏ trên đá granitnai dày trơn
50cm, đặc biệt đất ở vùng thấp có độ mùn cao, tơi xốp, rừng nguyên sinh
cây lá rộng, rất thích hợp cho sự phát triển của cây sâm Ngọc Linh. Khí hậu
thuộc á nhiệt đới núi cao. Nhiệt độ trung năm là 20°c. Mùa nóng từ tháng 5
đến tháng 11, nhiệt độ tối đa 20-25°C, nhiệt độ ban đêm tối thiểu 4-6°C.
Mùa lạnh từ tháng 11 đến tháng 4, nhiệt độ tối đa 17-20°c, nhiệt độ tối
thiểu l-2°c. Lượng mưa trung bình hàng năm là 3.286 mm, cao nhất là
4.168mm, thấp nhất là 2,049mm, các tháng khô là tháng 3, 4, 5, 6. Độ ẩm
trung bình năm là 86-95%, nhiều tháng trong năm có độ ẩm cao 98%. số
giờ nắng trung bình trong ngày 4 giờ/ngày. Từ tháng 11 đến tháng 5 thường
xuyên có sương mù kéo dài khoảng 15 ngày/tháng.
1.2. Mô tả tóm tắt về hình thái của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamesis
Ha et Grashv.)

Cây thảo sống nhiều năm có thể cao 0,6 - lm, có thân rễ phát triển.
Thân rễ nạc đường kính 2-3cm (3,5cm), không có rễ phụ dày dữ trữ, đôi khi
cuối thân rễ có rễ củ to hình cầu, hình cong đường kính 5cm. Trên thân rễ
mang nhiều vết sẹo tròn, dấu vết thân khí sinh của các mùa sinh trưởng để
lại. Thân khí sinh nhẵn cao 40-60cm (lm ). Lá kép hình chân vịt mọc vòng,
thường có từ 3-4 lá kép (ít khi 5, 6): mồi lá kép thường có 5 lá chét. Lá chét
có hình trứng ngược hay hình mũi mác, mép lá có răng cưa, có lông cứng ở
cả hai mặt (3mm). Cụm hoa: thường là tán đon dài 15-25cm (dài gấp 1 5-2
15
lần chiều dài cuống lá kép). Tán hoa có đường kính 2,5-4cm có thể mang từ
50-120 hoa. Cuống hoa dài l-l,5cm. Hoa màu lục nhạt, đường kính khi hoa
nở 3-4mm, gồm 5 lá đài hợp thành hình chuông trên chia thành 5 răng nhỏ
hình tam giác cao l-l,5mm, năm cánh hoa màu lục nhạt; chỉ nhị trắng,
mảnh dài l,5-2mm. Bao phấn xoan, dính lưng. Đế hoa hơi lồi. Bầu 1 ô, từ
1-2 vòi.
Quả mọng khi chín có màu đỏ tươi, thường có chấm đen không đều ở
đỉnh quả, quả có từ 1-2 hạt có hình thận hoặc cầu dẹt. Hạt có màu trắng hay
vàng nhạt, bề mặt hạt ráp, có nhiều chỗ lồi lõm.
Chu kỳ sinh sản, phụ thuộc vào điều kiện thời tiết và địa hình khác
nhau. Nên có thể xác định chu kỳ sinh trưởng hàng năm như sau.
- Từ tháng 10 đến thàng 12: thân khí sinh của năm trước bắt đầu tàn
lụi, chồi mầm các bộ phận trên mặt đất bắt đầu hình thành.
- Từ tháng 1 đến tháng 3: xuất hiện và phát triển thân khí sinh và tán
hoa.
- Từ tháng 4 đến tháng 6: cây ra hoa và kết quả.
- Từ tháng 7 đến tháng 9: thời kỳ quả chín rộ.
1,3. Các thành phần hoạt chất chính có mặt trong rễ sâm Ngọc Linh
- Họp chất saponin được xem là thành phần hoạt chất chủ yếu. Đã
xác định được cấu trúc protopanaxadiol II. Các saponin dammaran được
xem là hoạt chất quyết định như ginsenoside-Rbl, -Rb2, -Rb3, Rd đã được

xác định. Trong đó ginsenoside-Rb 1 chiếm tỷ lệ 2%, -Rb2 (0.12%), -Rb3
(0.11%). Các saponin dẫn chất đã xác định được các đại diện ginsenoside-
Re, -Rgl, notoginsenoside-Rl.
+ Ginsenoside Rgl + Re = 1.35%
- Hợp chất gluxit:
16
+ Đường tự do: 6.19%
+ Đường toàn phần: 26.77%
- Các thành khác
+ Hàm lượng polysaccharide là: 19.7%
+ Tinh dầu: 0.05-0.10%
Bảng I. Thành phần các axit amin
TT
Axit amin
Axỉt amin tư do
(%) '
TT
Axit amin
Axỉt amỉn tư do
(%) *
1.
Tryptophan
10.2 7. Prolin
3.07
2. Lysin
17.9 8.
Glycin 4.10
3.
Histidin
1.02 9. Methyonin 0.51

4.
Arginin 46.6 10.
Valin
0.51
5.
Threonin
1.2 11.
Tyrosin
0.51
6. Serin
5.1 12. Phenylanin 0.51
Bảng 2. Thành phần các nguyên tổ vi, đa lượng
TT Nguyên tố vi đa
lượng
Hàm lương
(%)
TT
Nguyên tố vi đa
lượng
Hàm
lượng (%)
1.
Na
0.3 8.
p
0.3
2. Ca 0.3 9. Mn
0.05
3. Mg 0.5
10. Zn

0.003
4.
Fe
0.1 11. Sn
0.005
5.
Si 0.01 12.
Ni
-
6. Ti
0.01 13. Cu
0.002
7. B
-
14.
Cr
-
ĐAI HỌC QUÓC GIA HÀ NỘM
TRUNG 1AM íh ONG riN IHƯ VíỆN
000600000 3/1
17
Một số hình ảnh của đoàn nghiên cứu thực địa tại Ngọc Linh, Quảng Nam
Khu vực phân bố của cây Sâm Ngọc Linh, Panax vietnamensis
2. TẠO MÔ SẸO TRÊN MÔI TRƯỜNG RẮN
2.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng mẫu cấy bằng dung dịch
sodium hypochỉoride
Rễ sâm Ngọc Linh tươi 4-5 năm tuổi thu tại núi Ngọc Linh, tỉnh
Quảng Nam (Hình 5A), được rửa sạch bằng nước lã từ 3-5 phút, sau đó khử
trùng bằng cồn 70% trong 2 phút. Cuối cùng rễ sâm được chuyển vào tủ cấy
vô trùng và khử trùng trong dung dịch sodium hypochlorite với các thời

gian khác nhau. Mầu được cắt thành từng miếng nhỏ có kích thước từ 0.2 -
0.5 cm và được cấy vào môi trường MS cơ bản để tạo mô sẹo. Sau thời gian
2 tuần nuôi cấy, chúng tôi đánh giá tỷ lệ nhiễm và sau 4 tuần đánh giá tỷ lệ
tạo mô sẹo, kết quả thu được ở Bảng 3.
Bảng 3. Tỷ lệ bị nhiệm và tỷ lệ tạo mô sẹo sau thòi gian khử trùng khác nhau
Thòi gian khử
trùng (phút)
rgì *» 1 A A ■ •
Tỷ lệ mâu bị
nhiễm (%)
Tỷ lệ mẫu sống sót
và tạo mô sẹo (%)
Nhận xét
10
35 75
Số mẫu bị nhiễm nấm
khá nhiều, các mẫu
khác tạo mô sẹo tốt.
15 5 95
Số mẫu bị nhiễm nấm
không đáng kể, số còn
lại tạo mô sẹo tốt.
20
0 50
Tất cả các mẫu không bị
nhiễm nhưng khả năng
tạo mô sẹo kém, có biểu
hiện thâm nâu sau 2-3
tuần.
Sodium hypochlorite là một chất khử trùng, tẩy mạnh và độc đối với

sinh vật, có tác dụng giết chết các bào tử nấm và tế bào vi sinh vật. Khi tăng
19
thời gian khử trùng lên, tỷ lệ mẫu bị nhiễm giảm đáng kể, nhưng đi kèm với
điều này là tỷ lệ mẫu sống và khả năng tạo ĨĨ
1
Ô sẹo cũng bị giảm. Trong thí
nghiệm này, chúng tôi tìm thấy thời gian để khử trùng rễ sâm tối ưu bằng
dung dịch sodium hypochlorite 5% là 15 phút. Với khoảng thời gian này, tỷ
lệ mẫu bị nhiễm là 5% và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo là 95%.
Như vậy, chúng tôi sử dụng phương pháp khử trùng mẫu bàng dung
dịch sodium hypochlorite 5% là 15 phút để khử trùng mẫu cho các thí
nghiệm tiếp theo.
2.2. Ảnh hưởng của nồng độ 2,4D đến sự hình thành mô sẹo
Trên môi trường nuôi cấy MS cơ bản, mô sẹo đã hình thành sau 4
tuần nuôi cấy. Kết quả thu được khi không sung 2,4D vào môi trường nuôi
cấy thì các mẫu không hình thành mô sẹo (Hình 5B). Khi tăng nồng độ từ 0
đến 1 mg/L 2,4D thì mô sẹo hình thành và phát triển tốt (Hình 5C). Ở nồng
độ 1 mg/L mô sẹo có màu vàng nhạt, xốp, hơi mềm, trọng lượng khô thu
được 13.5 g/L (Bảng 4). Tiếp tục tăng nồng độ đến 2 m/L, mô sẹo phát triển
chậm lại, hơi rắn và ngả sang màu vàng, nâu sau 2 - 3 tuần. (Hình 5).
*>
\ r
Bảng 4. Anh hưởng của nông độ 2,4D đên sự hình thành và phát của mô sẹo
2,4-D mg/L TLK của mô
sẹo (g/L)
Diễn biến quá trình hình thành mô sẹo
0.0 0.0
Không hình thành mô sẹo, rễ sâm chuyển sang
màu vàng
0.5

9.6
Mô sẹo hình thành, về sau chuyển sang màu
xanh và dần dần trở nên rắn
1.0
13.5
Mô sẹo hình thành, phát triển tốt, có màu vàng
nhạt, xốp hơi bở
2.0
7.5
Mô sẹo hình thành, hơi rắn về sau chuyển
sang màu vàng, nâu
20
Trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thì auxin được coi là nhân tố cần
thiết cho sự hình thành mô sẹo, tuy nhiên điều này cũng cho thấy nêu sử
dụng nồng độ không thích hợp thì sẽ ảnh hưởng không tốt đến sự hình
thành mô sẹo. Đặc biệt ở các nồng độ auxin cao sẽ ức chế quá trình hình
thành mô sẹo, điều này đã được chứng minh khi nghiên cứu quá trình phát
sinh phôi của Picea abies và p. ginseng (Furuya, 1983; Bourgaud và cộng
sự 2001). Trong nuôi cấy p. ginseng, Son và cộng sự, (1999) cũng nhận
được kết quả tương tự với auxin 2,4D ở nồng độ 1.0 mg/L là tối ưu cho sự
hình thành ĨĨ
1
Ô sẹo. Furuya và cộng sự (1983) đã tình thấy rằng 2,4D là cần
thiết cho sự hình thành và phát triển mô sẹo của p. ginseng, nhưng nồng độ
của 2,4D cao có thể gây ức chế sự sinh trưởng. Thí nghiệm này cho thấy
rằng 2,4D là auxin thích hợp cho sự hình thành và phát triển của mô sẹo.
Như vậy, kết quả thu được ở đây cho thấy nồng độ 1 mg/L 2,4D là tối ưu
cho sự hình thành và phát triển mô sẹo của sâm Ngọc Linh.
Hình 5. Quá trình hình thành mô sẹo và rễ bất định cùa sâm Ngọc Linh (P. vietnamensis):
(A) củ sâm Ngọc Linh tươi thu từ núi Ngọc Linh; (B) mô sẹo hình thành ờ nồng độ 1 mg/L

2,4D; (D, E) rê bât định hình thành ờ nông độ 2 mg/L IBA; (F) rễ bất đinh hình thành ờ
nông độ 2 mg/L NAA.
21