nghiên cứu nuôi cấy in vitro cây sâm ngọc linh (panax vietnamensis ha et grushv.

1
MỞ ĐẦU
Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)
là cây thuốc có giá trị dược liệu và giá trị kinh tế cao, được biết đến trên thế
giới với tên gọi Vietnamese ginseng, ngoài ra còn có các tên khác như: sâm
Việt Nam, sâm Khu V, Thuốc giấu, sâm Đốt trúc, Rợm con. Sâm Ngọc Linh
phân bố ở vùng núi Ngọc Linh thuộc 2 tỉnh Kon Tum và Quảng Nam, còn có
ở Langbian-Lâm Đồng. Đặc biệt, Việt Nam là nơi phân bố sâm Ngọc Linh
duy nhất trên toàn thế giới. Điều đáng tự hào là ở sâm Ngọc Linh có thành
phần ginsenosid được đánh giá vào loại nhiều nhất so với các loài khác của
chi Panax trên thế giới. Ở phần thân rễ chứa các hợp chất saponin (hơn 50
loại), polyacetylen (7 loại), acid béo, acid amine, các hợp chất sterol, đường
tự do, các vi lượng,… Thân và lá cũng có chứa nhiều loại saponin và vi
lượng,… được dùng làm thuốc bổ, chữa viêm họng, huyết áp thấp, xuất huyết
dạ dày, chống stress,… Sâm Ngọc Linh có thể chế biến thành dạng bột, dạng
viên, dạng sâm nước để uống. Ngoài ra, sâm Ngọc Linh được đồng bào dân
tộc Xê-đăng sử dụng như một vị thuốc trị bá bệnh, tăng lực, chống mệt mỏi,
… [4, 6, 7].
Dựa trên nhiều bằng chứng nghiên cứu khoa học đã chứng minh loài
sâm này có giá trị cao về mặt dược liệu, các nhà khoa học đã xếp sâm Ngọc
Linh vào nhóm sâm quý của thế giới cùng với nhân sâm Triều Tiên (Panax
ginseng C.A. Meyer), sâm Mỹ (Panax quinquefolium L.) và sâm Tam thất
(Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen) [7].
Hiện nay, mặc dầu nhà nước đã có chủ trương bảo vệ nguồn cây thuốc
quý này nhưng nguồn sâm tự nhiên vẫn bị khai thác lén lút, trái phép một
cách nghiêm trọng, có thể dẫn đến cạn kiệt nguồn sâm tự nhiên. Vì vậy, cần
có nhiều nghiên cứu, sản xuất, cũng như đánh giá chuẩn xác về giá trị y học
và giá trị kinh tế của sâm Ngọc Linh. Trong các hướng nghiên cứu, hướng
1
2
nuôi cấy mô hứa hẹn sẽ đưa cây sâm Ngọc Linh phát triển cả về số lượng lẫn

chất lượng, đáp ứng đủ nhu cầu của thị trường và mang lại hiệu quả kinh tế
cao.
Nhân giống hữu tính cây sâm Ngọc Linh bằng cách gieo hạt thông
thường cho tỷ lệ hạt nảy mầm thấp khoảng 30-40% [5], còn nếu nhân giống
vô tính bằng cách cắt đầu mầm của cây sâm sau khi thu hoạch giâm xuống
đất, cho tỷ lệ sống cao (95%) nhưng cây con chỉ mọc vào tháng 2 đến tháng 4
dù trồng bất kỳ ở thời điểm nào trong năm và mỗi đầu mầm chỉ phát triển
thành một cây con [7]. Vì vậy, nghiên cứu nhân giống vô tính in vitro cây sâm
Ngọc Linh hết sức cần thiết, nhằm mục đích tạo nguồn cây giống dồi dào đáp
ứng kịp thời cho nhu cầu mở rộng nguồn sâm nguyên liệu.
Xuất phát từ những vấn đề trên, chúng tôi đã chọn đề tài “Nghiên cứu
nuôi cấy in vitro cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)”
nhằm góp phần xác định môi trường nuôi cấy thích hợp cho nhân giống vô
tính in vitro của loài sâm này.
2
3
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. KHÁI NIỆM VÀ SƠ LƯỢC LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN NUÔI CẤY
MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT
1.1.1. Khái niệm
Hai khái niệm, tính tạo hình và tính toàn năng quyết định sự hiểu
biết trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật và sự tái sinh cây. Nhiều quá trình
phức tạp xảy ra trong các giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cây trồng
liên quan đến sự thích ứng với điều kiện của môi trường nuôi cấy [41].
Tính tạo hình có thể thay đổi quá trình trao đổi chất, tăng trưởng,
và phát triển theo hướng tốt nhất khi thực vật được nuôi cấy trong môi trường
phù hợp. Đặc biệt là khả năng có thể bắt đầu phân chia tế bào từ bất cứ loại
mô nào của cây để tái sinh các bộ phận hoặc trải qua các con đường phát triển
khác nhau khi có điều kiện kích thích sinh trưởng hợp lý. Khi tế bào thực vật

và các mô được nuôi cấy trong ống nghiệm thường thể hiện tính tạo hình rất
cao, một loại mô hoặc cơ quan có thể được hình thành từ một dạng mô khác
và có thể được tái sinh cây hoàn chỉnh [13, 41].
Theo Haberlandt (1902), tất cả các tế bào của một cơ thể đa bào
đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cơ thể đó và khi gặp điều kiện
thích hợp, mỗi tế bào đều có khả năng tái sinh và phát triển thành một cá thể
hoàn chỉnh. Tức là, mỗi tế bào riêng rẽ của một cơ thể đa bào đều chứa đầy đủ
toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết của cả sinh vật đó và nếu gặp điều
kiện thích hợp thì mỗi tế bào có thể phát triển thành một cơ thể sinh vật hoàn
chỉnh. Sự duy trì tiềm năng di truyền này được gọi là tính toàn năng. Thực tế
trong nuôi cấy tế bào và tái sinh ở thực vật cung cấp bằng chứng thuyết phục
nhất cho tính toàn năng. Nhưng việc xác định điều kiện nuôi cấy và chất kích
3
4
thích sinh trưởng có thể rất khó khăn để nhận thấy tính toàn năng ở thực vật,
mà quá trình này chủ yếu dựa vào kinh nghiệm [3, 14, 41].
Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật cho phép tái sinh chồi
hoặc cơ quan từ các mô như lá, thân, hoa, rễ, củ hoặc đỉnh sinh trưởng. Trước
kia người ta dùng phương pháp này để nghiên cứu các đặc tính cơ bản của tế
bào như sự phân chia, đặc tính di truyền và ảnh hưởng của các hóa chất đối
với tế bào và mô trong quá trình nuôi cấy [3, 41].
Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là sự duy trì và nuôi dưỡng mô,
tế bào, cơ quan hay cây hoàn chỉnh của thực vật trong điều kiện in vitro. Kỹ
thuật nuôi cấy mô dùng cho cả mục đích nhân giống và cải thiện di truyền
như sản xuất sinh khối các sản phẩm hóa sinh, bệnh học thực vật, duy trì và
bảo quản nguồn gen quý,… Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật là một
trong những thành công sớm nhất và đã được ứng dụng rộng rãi nhất của công
nghệ sinh học. Việc ứng dụng nhân giống vô tính in vitro đã thành công nhiều
ở rất nhiều loài thực vật mà trước đây các phương thức nhân giống truyền
thống gặp rất nhiều khó khăn [3, 14].

1.1.2. Sơ lược lịch sử phát triển của nuôi cấy mô và tế bào thực vật
Lịch sử phát triển của nuôi cấy mô và tế bào thực vật có thể chia
làm 3 giai đoạn như sau:
1) Giai đoạn khởi đầu từ năm 1902 – 1933, Gottlibe Haberlandt
(1902), đưa ra giả thuyết về “tính toàn năng của tế bào thực vật”. Tuy nhiên,
ông đã không thành công với các tế bào mô mềm, biểu bì do chúng không thể
phân chia được.
2) Giai đoạn thứ hai từ năm 1934 – 1965, phát hiện ra các
hormone sinh trưởng đầu tiên và xây dựng được các môi trường cơ bản.
4
5
3) Giai đoạn ba từ 1965 – 1978 – đến nay, phát hiện ra các kĩ
thuật nuôi cấy mô có ý nghĩa như tạo cây đơn bội, nuôi cấy tế bào trần, kết
hợp nuôi cấy mô tế bào với kỹ thuật gen,…
Từ năm 1898, Gottlibe Haberlandt đã tiến hành nuôi cấy tế bào ở
nhiều loài thực vật nhưng không thành công. Đến năm 1902, ông đưa ra
phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật để chứng minh cho tính toàn năng của
tế bào và cho rằng mỗi tế bào bất kỳ của sinh vật nào cũng đều mang toàn bộ
lượng thông tin di truyền của cơ thể đó và có khả năng phát triển thành cơ thể
hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi [3]. Kotte và Robbins (1922) đã thành
công khi nuôi cấy rễ cây ngô. Fritz Went (1926) đã tìm ra chất kích thích sinh
trưởng (KTST) đầu tiên là 3-indoleacetic acid (IAA), đã giúp cho việc nuôi
cấy mô thực vật có nhiều thuận lợi hơn. Cũng trong thời gian này, hàng hoạt
vitamin nhóm B cũng được phát hiện như: thiamin (vitamin B1), pyridoxin
(vitamin B6), nicotinic (vitamin B3),… có vai trò lớn thúc đẩy sinh trưởng
trong nuôi cấy [19].
Năm 1939, Philip R. White đã nuôi cấy liên tục cây cà rốt và cây
thuốc lá trong ống nghiệm, Folke Skoog phát hiện ra đặc tính mới và quan
trọng của các KTST nhóm auxin, Skoog và Murashige phát triển môi trường
dinh dưỡng chuẩn Murashige-Skoog (MS) được ứng dụng rộng rãi trong nuôi

cấy mô và tế bào thực vật, Gautheret và Nobecourt đã duy trì được sự sinh
trưởng của callus cà rốt (Daucus carota) trong một thời gian dài. Năm 1946,
Ball đã tái sinh cây hoàn chỉnh từ nuôi cấy mô phân sinh chồi cà rốt, Morel
và Martin tạo được cây Thược dược (Dahlia) sạch virus từ nuôi cấy mô phân
sinh chồi của cây bị nhiễm [19]. Năm 1955, Miller và cs đã tìm ra cấu trúc và
sinh tổng hợp kinetin (KIN), là một cytokinin trong nuôi cấy mô thực vật
[10]. Skoog và Miller (1957) khám phá vai trò của tỷ lệ nồng độ
auxin/cytokinin trong nuôi cấy mô thực vật. Cooking (1960) đã tạo ra số
5
6
lượng lớn tế bào trần ở những thực vật khác nhau nhờ sử dụng enzyme phân
giải thành tế bào [12].
Năm 1966, Guha và cs đã nuôi cấy thể đơn bội từ bao phấn của
cây cà độc dược thành công [12]. Bourgin và Nitsch (1967) tạo cây đơn bội
thành công ở cây thuốc lá [10].
Với sự ra đời của enzyme giới hạn vào đầu những năm 1970,
nuôi cấy mô bắt đầu hướng tới một lĩnh vực nghiên cứu công nghệ thực vật
mới. Các tế bào toàn năng của thực vật có thể được thay đổi bằng cách chèn
các gen ngoại lai đặc trưng để tạo ra cây trồng biến đổi gen [48].
Trong vòng 30 năm trở lại đây, kỹ thuật nhân giống in vitro đã
tạo nên cuộc cách mạng lớn trong nhân giống thực vật và hướng tới mục tiêu
áp dụng kỹ thuật này để sản xuất cây giống thương mại. Kỹ thuật nhân giống
in vitro đã trở thành một phương pháp nhân giống chuẩn và phổ biến đối với
nhiều loại cây trồng như: cây công nghiệp, cây lâm nghiệp, cây cảnh, cây
dược liệu, cây ăn trái và rau xanh. Hiện nay, kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào
thực vật kết hợp với các kỹ thuật gen được ứng dụng rộng rãi trong nông
nghiệp, lâm nghiệp, y học,… để nhân giống, chọn dòng, lai xa nhiều loài thực
vật, chuyển gen vào cây trồng, sản xuất giống cây trồng, cung cấp nguồn
dược liệu,…
1.2. NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY TRỒNG

1.2.1. Môi trường nuôi cấy in vitro
Trong nuôi cấy in vitro, tất cả các nhu cầu của các tế bào thực
vật, cả chất hóa học và tác dụng của nó phải đáp ứng được trong bình nuôi
cấy: môi trường phát triển và môi trường bên ngoài (ánh sáng, nhiệt độ,…).
Môi trường phát triển cần cung cấp đầy đủ các các ion khoáng chất cần thiết
cho sự tăng trưởng và phát triển. Trong nhiều trường hợp cũng phải cung cấp
bổ sung thêm chất hữu cơ như amino acid và vitamin. Trong các điều kiện
6
7
nuôi cấy không quang hợp thì cũng yêu cầu bổ sung một nguồn carbon cố
định ở dạng đường (thường là sucrose). Một thành phần quan trọng khác cũng
phải được cung cấp đó là nước, chính là dung môi của các quá trình sinh học.
Các yếu tố vật lý như pH, nhiệt độ, môi trường khí, ánh sáng (chất lượng, thời
gian), và áp lực thẩm thấu cũng phải được duy trì trong giới hạn [3, 14, 41].
Trong môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật, thành phần
phụ gia quan trọng nhất quyết định kết quả nuôi cấy là các chất điều khiển
sinh trưởng. Có bốn nhóm chất điều hòa sinh trưởng chung đó là auxin,
cytokinin, gibberellin và abscisic acid, những chất này có vai trò quan trọng
trong nuôi cấy mô. Tỷ lệ của các chất điều hòa sinh trưởng cần cho sự tạo rễ
và chồi rất khác nhau, và mô là nơi dường như liên quan trực tiếp với lượng
chất điều hòa sinh trưởng được tổng hợp nội sinh ở các tế bào của mẫu nuôi
cấy [3, 30, 31, 32, 33].
Cơ sở cho việc xây dựng các môi trường nuôi cấy là xem xét các
thành phần cần cho sự sinh trưởng và phát triển của cây. Thành phần môi
trường nuôi cấy tế bào và mô thực vật thay đổi tùy theo loài và bộ phận nuôi
cấy. Đối với cùng một mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thí nghiệm thì thành
phần môi trường cũng sẽ thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóa của mẫu cấy [3,
14, 41].
1.2.1.1. Các thành phần của môi trường nuôi cấy
* Các nguyên tố đa lượng

Trong môi trường nuôi cấy cung cấp các nguyên tố đa lượng cần
thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của thực vật. Các nguyên tố đa lượng
gồm: nitrogen, phosphore, potassium, magnesium, calcium, sulphur. Những
nguyên tố này thường chiếm 0,1% trọng lượng khô của thực vật [3, 41].
* Các nguyên tố vi lượng
7
8
Các nguyên tố vi lượng cần thiết với hàm lượng rất thấp cho thực
vật sinh trưởng, phát triển và nhiều vai trò sinh lý khác. Các nguyên tố vi
lượng thường bao gồm: manganese, iodine, copper, cobalt, boron,
molybdenum, iron và zinc [3, 11, 14, 41].
* Hữu cơ bổ sung
Hai loại vitamin là thiamine (vitamin B1) và myo-Inositol (được
xem là một loại vitamin B), được cho là cần thiết cho nuôi cấy in vitro tế bào
thực vật và các amino acid thường sử dụng nhất là arginine, asparagin,
aspartic acid, alanine, glutamic acid, glutamine và proline [3, 41].
* Nguồn carbon
Nguồn carbon được sử dụng gồm: sucrose, glucose, maltose,
galactose và sorbitol. Nhưng sucrose được sử dụng phổ biến nhất do nó dễ
tìm, giá rẽ, dễ hấp thu và tương đối ổn định. Các nguồn carbon khác cũng có
thể được sử dụng nếu nó thật sự tối ưu hơn so với sucrose [3, 11, 41].
* Các tác nhân làm rắn môi trường
Khi nuôi cấy in vitro tế bào thực vật trên môi trường rắn, các gel
tạo một giá đỡ cho mô sinh trưởng trong điều kiện tĩnh. Agar là một loại
polysaccharide thu được từ một số loài tảo, chúng có ưu điểm hơn các tác
nhân tạo gel. Gelatin ở nồng độ cao (10%) cũng có hiệu quả tạo gel nhưng bị
hạn chế sử dụng vì nó nóng chảy ở nhiệt độ thấp (25
o
C). Các hợp chất khác
đã được thử nghiệm thành công bao gồm methacel, alginate, phytagel và gel-

rite [3, 41].
Tóm lại, các thành phần này là những nhu cầu hóa chất cơ bản
của môi trường nuôi cấy tế bào thực vật. Tuy nhiên, tùy vào các điều kiện của
mô hình thí nghiệm mà chúng ta có thể thiết kế một môi trường tối ưu cho sự
sinh trưởng và phát triển trong nuôi cấy tế bào thực vật.
8
9
1.2.1.2. Điều chỉnh sự phát triển của thực vật và nuôi cấy mô
Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật là các thành phần quan
trọng quyết định hướng phát triển của các tế bào thực vật. Các chất điều hòa
sinh trưởng thực vật được sử dụng nhất thường là các hormone tự nhiên của
thực vật hoặc các chất điều hòa sinh trưởng được tổng hợp.
Trong nuôi cấy tế bào thực vật các nhóm chất điều hòa sinh
trưởng được sử dụng gồm:
* Auxin
Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng rộng rãi
trong nuôi cấy mô thực vật. Trong đó, IAA là auxin tự nhiên có trong mô thực
vật, còn NAA, IBA, 2,4-D là các auxin nhân tạo, thường các auxin nhân tạo
có hoạt tính mạnh hơn.
Tên viết tắt /
Tên
Tên hóa học
2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic
acid
2,4,5-T 2,4,5-trichlorophenoxyacetic
acid
Dicamba 2-methoxy-3 ,6-
dichlorobenzoic acid
IAA Indole-3-acetic acid
IBA Indole-3-butyric acid

MCPA 2-Methyl-4-
chlorophenoxyacetic acid
NAA 1-Naphthylacetic acid
NOA 2-Naphthyloxyacetic acid
Picloram 4-amino-2,5,6-
trichloropicolinic acid
9
10
Auxin có ở các bộ phận của cây như mô phân sinh đỉnh, các bộ
phận non của cây (auxin nội sinh). Khi sử dụng auxin trong nuôi cấy cần lưu
ý đến đặc điểm của đối tượng cần nghiên cứu, đặc tính của auxin (ngoại sinh)
để xác định khoảng nồng độ và loại auxin cần thiết.
Auxin có khả năng thúc đẩy sự phân chia tế bào và phát triển của
tế bào, tạo và nhân nhanh callus, tạo phôi soma (2,4-D), kích thích sự phân
hoá của các mô dẫn, kích thích tạo chồi bất định (khi auxin ở nồng độ thấp)
[3, 11, 31, 41].
* Cytokinin
Các cytokinin là dẫn xuất của adenine. Các cytokinin được sử
dụng thường xuyên nhất là BAP, zeatin và 2-iP là các cytokinin tự nhiên, còn
BA và KIN là các cytokinin nhân tạo.
Tên viết
tắt / Tên
Tên hóa học
BAP 6-Benzylaminopurine
2iP (IPA) N 6 - (2-Isopentyl) adenine
Kinetin 6-Furfurylaminopurine
Thidiazuro
n
1-Phenyl-3 (1,2,3-thiadiazol-5-yl) urea
Zeatin 4-Hydroxy-3-methyl-trans-2-

butenylaminopurine
Cytokinin có khả năng kích thích phân chia tế bào, tạo và nhân
callus, kích thích phát sinh chồi trong nuôi cấy mô, tạo chồi bất định (khi ở
nồng độ cao), ức chế sự hình thành rễ [3, 11, 41, 32].
* Gibberelin
10
11
Gibberellin được tạo ra trong đỉnh rễ, chồi, lá non, hạt. Đóng vai
trò quan trọng đối với nhiều quá trình sinh lý như: sinh lý ngủ nghỉ của hạt và
chồi, sinh lý phát triển của hoa, làm tăng sinh trưởng chiều dài của thực vật,
Người ta đã phát hiện được trên 60 loại thuộc nhóm gibberellic
acid (GA), nhưng chỉ có một vài loại GA là được sử dụng trong các môi
trường nuôi cấy mô thực vật và GA3 là phổ biến nhất [3, 11, 41, 33].
* Abscisic acid
Abscisic acid là một chất điều hòa sinh trưởng thực vật tự nhiên
được tạo ra trực tiếp từ acid mevalonic hoặc do sự phân giải carotenoid.
Chúng được tạo ra trong lá, quả, đỉnh rễ, hạt.
Abscisic acid có khả năng ức chế phân chia tế bào, gây ra sự ngủ
nghỉ của chồi, làm chậm sự nảy mầm của hạt và sự ra hoa, đóng khí khổng,
tăng cường khả năng chống chịu của tế bào thực vật đối với điều kiện ngoại
cảnh bất lợi [3, 11, 30, 41].
Vào những năm 1950, chất điều hòa sinh trưởng thực vật bắt đầu
được mô tả và sử dụng trong nuôi cấy tế bào thực vật. Tuy nhiên, có một số
khó khăn do sự khác biệt lớn trong đáp ứng giữa các loài, giống và thậm chí
cả cây trồng trong các điều kiện khác nhau. Auxin và cytokinin được sử dụng
rộng rãi nhất trong nhóm các chất điều hòa sinh trưởng trong nuôi cấy mô
thực vật. Tỷ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái
trong các hệ thống nuôi cấy. Trong môi trường nuôi cấy cho phát sinh phôi
(embryogenesis), tạo callus hoặc tạo rễ, cần sử dụng tỷ lệ auxin/cytokinin cao.
Ở trường hợp tạo chồi và chồi nách, cần sử dụng tỷ lệ auxin/cytokinin thấp [3,

30, 31, 32, 41].
11
12
1.2.2. Một số phương thức nhân giống in vitro
Phương thức nhân giống vô tính in vitro là một bước tiến
bộ vượt bậc của khoa học kỹ thuật trong công tác nhân giống cây trồng, nó đã
có thể thay thế cho phương thức nhân giống cổ điển (gieo hạt, giâm cành,
giâm chồi, chiết, ghép, tách dòng,… ) và giải quyết những khó khăn mà
phương pháp cổ điển không thể vượt qua.
1.2.2.1. Nhân giống in vitro từ các cấu trúc sinh dưỡng
* Nhân giống in vitro thông qua nuôi cấy mô phân sinh đỉnh
Các bộ phận nhỏ nhất của đỉnh chồi hay đỉnh sinh trưởng làm
mẫu vật nuôi cấy, bao gồm mô phân sinh đỉnh và các mầm lá non. Nhưng rất
khó thành công khi nuôi cấy các mô phân sinh đỉnh riêng rẽ có kích thước
nhỏ và chỉ được ứng dụng với mục đích tạo cây trồng sạch bệnh. Nên trong
nhân giống in vitro người ta thường nuôi cấy cả đỉnh chồi hoặc đỉnh sinh
trưởng [3, 11, 41].
Nếu độ lớn của chồi nuôi cấy tăng thì tỷ lệ sống và tính ổn định
về mặt di truyền của chồi tăng và ngược lại. Nhưng chồi nuôi cấy càng lớn thì
khả năng mang mầm bệnh càng cao, chồi nuôi cấy càng nhỏ thì khả năng
mang mầm bệnh càng thấp. Do đó, phải kết hợp hài hòa được các yếu tố trên
để tìm ra phương thức lấy mẫu tối ưu [3].
Nếu mẫu được nuôi cấy trên môi trường thích hợp, từ một
đỉnh sinh trưởng, mẫu sẽ phát triển thành một chồi hay nhiều chồi. Chồi tiếp
tục phát triển vươn thân, ra lá và rễ để trở thành một cây hoàn chỉnh. Xét về
nguồn gốc của các cây đó có ba khả năng: 1) Cây phát triển từ chồi đỉnh; 2)
Cây phát triển từ chồi nách phá ngủ; 3) Cây phát triển từ chồi mới phát sinh
[3, 11].
* Nhân giống in vitro thông qua nuôi cấy chồi bất định
12

13
Theo phương thức này, đỉnh chồi bất định có thể phát triển trực tiếp
trên mẫu hoặc gián tiếp thông qua callus từ sẹo trên bề mặt vết cắt của mẫu
(đoạn thân, mảnh lá, cuống lá, hoa, nhánh củ, đoạn mầm). Chồi bất định
có thể phát triển gián tiếp thoáng qua giai đoạn hình thành callus từ các chồi
in vitro. Các chồi sau đó phát triển từ ngoại vi mô callus và không có liên kết
với các mô có mạch dẫn của mẫu ban đầu. Tại các tế bào nhu mô nằm ở trong
biểu bì hoặc ngay phía dưới bề mặt của thân, chồi bất định sẽ phát sinh trực
tiếp [3, 8, 11].
1.2.2.2. Nhân giống in vitro thông qua giai đoạn callus
Cây hoàn chỉnh nếu được tái sinh trực tiếp từ mẫu vật nuôi cấy in
vitro ban đầu thì nhanh chóng thu được cây và khá đồng nhất về mặt di
truyền. Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp mô nuôi cấy không tái sinh cây
ngay mà phát triển thành khối callus. Callus là một khối tế bào phát triển vô
tổ chức, hình thành do sự phản phân hóa của các tế bào đã phân hóa. Tế bào
callus khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền. Để tránh
tình trạng đó nhất thiết phải sử dụng loại callus vừa phát sinh, tức là callus sơ
cấp để tái sinh cây thì hy vọng sẽ thu được cây tái sinh đồng nhất [3, 41].
1.2.2.3. Nhân giống in vitro thông qua phát sinh phôi vô tính
Ở một số loài, sự phát sinh phôi vô tính hình thành trực tiếp từ
những phôi bất định nằm trong phôi tâm. Phôi vô tính rất giống phôi hữu
tính ở hình thái, quá trình phát triển và sinh lý, nhưng do không phải là sản
phẩm của sự thụ tinh giữa giao tử đực và giao tử cái, mà nó có nguồn gốc từ
phôi soma, vì vậy không có quá trình tái tổ hợp di truyền, các phôi vô tính
giống hệt với các tế bào soma đã sinh ra chúng về bản chất di truyền [3, 41].
Từ phôi vô tính có thể sản xuất hạt nhân tạo bằng cách bọc
nó trong một hạt polymer như: agar, agarose, alginate… Trong cấu trúc lưới
của các hạt đó, nước, chất dinh dưỡng và chất sinh trưởng được cung cấp thay
13
14

cho nội nhũ, giúp cho phôi vô tính có thể nảy mầm trở thành cây hoàn chỉnh
[3, 12, 11].
1.3. TỔNG QUAN MỘT SỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG
IN VITRO CÂY SÂM
1.3.1. Một số kết quả nghiên cứu nuôi cấy in vitro chi Panax
Sâm là cây thuốc có giá trị dược liệu và giá trị kinh tế cao, có nhiều chi,
họ khác nhau nhưng chủ yếu là các loại thuộc chi Panax. Hiện nay, các nhà
khoa học trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu thành công trong
việc chứng minh giá trị về tác dụng của nó trong y học cũng như việc ứng
dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào nhằm khai thác mọi tiềm năng vốn
có trong loại dược liệu quí này [1, 4, 7, 9]
Năm 1993, Sarita và cs đã tiến hành nghiên cứu nhân nhanh phôi soma
bất định ở cây nhân sâm (Panax ginseng C. A. Meyer), thấy rằng phôi soma
và phôi phát sinh từ callus được hình thành từ phôi hợp tử non. Phôi soma
được nhân nhanh từ các phôi ngẫu nhiên có sự sinh trưởng và phát triển phụ
thuộc vào hormone sinh trưởng trong môi trường. Trong đó, nhóm auxin được
sử dụng gồm 2,4-D, NAA, IAA ở nồng độ 1,0 mg/l đã làm tăng nhanh số
lượng phôi soma nuôi cấy ở lần thứ hai và thứ ba từ phôi soma ban đầu. Còn
nhóm cytokinin (KIN, BA) làm ức chế phôi bất định. Sau đó, phôi soma được
tăng trưởng và tái sinh thành cây con thông qua hai giai đoạn, đầu tiên là kéo
dài chồi trên môi trường MS có bổ sung 1,0 mg/l KIN, tiếp theo là tạo rễ trên
môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l KIN và 1,0 mg/l GA3

[42].
Shoyama và cs (1996) đã tiến hành vi nhân giống cây sâm Tam thất
(Panax notoginseng) phát sinh từ phôi soma và phân tích RAPD của cây con
tái sinh. Phôi soma phát sinh từ callus bắt nguồn từ nụ hoa non của sâm Tam
thất trong 18 tuần nuôi cấy trên môi trường ½ MS có bổ sung GA và BA. Các
môi trường tối ưu nhất cho sự hình thành rễ là môi trường MS có bổ sung
14

15
NAA. DNA tổng số được chiết xuất từ lá của cây con tái sinh của cây sâm
Tam thất. Phân tích RAPD sử dụng 21 đoạn mồi ngẫu nhiên, nhóm nghiên
cứu đã thấy được tính đồng nhất về di truyền của cây sâm Tam thất. Các sản
phẩm khuếch đại là đơn hình cho tất cả các cây con được tái sinh bằng cách
tạo phôi, cho thấy phôi soma có thể được sử dụng cho vi nhân giống vô tính
của loài cây này [44].
Yong và Woong (1997) đã nghiên cứu sự tăng cường hình thành phôi
soma đơn bằng cách tiền xử lý co nguyên sinh (pre-plasmolyse) từ lá mầm
cây Nhân sâm đã nuôi cấy. Các tác giả cho biết, nuôi cấy mô lá mầm của phôi
hữu tính cây nhân sâm trên môi trường MS không có chất điều hòa sinh
trưởng đã tạo trực tiếp phôi soma. Phôi soma chỉ được hình thành gần vết cắt
của lá mầm. Những phôi đa và/hoặc phôi đơn được hình thành với tần số khác
nhau tùy theo mức độ trưởng thành của phôi được sử dụng khi cấy. Nhưng
khi cấy phôi hữu tính đã được tiền xử lý co nguyên sinh bằng sucrose 1,0 M
trong 24 giờ, thì tần số hình thành phôi đơn đã tăng cao ở bất kỳ mức độ
trưởng thành nào của lá mầm [51].
Năm 1998, Yong và cs đã tái sinh cây nhân sâm thông qua sự hình
thành chồi bất định từ mô lá mầm. Ở đây, mô lá mầm của sâm Triều Tiên hình
thành phôi soma trực tiếp trên môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng
và kết quả có 89% mô cấy đã hình thành phôi soma. Cytokinin ức chế mạnh
quá trình hình thành phôi soma nhưng kích thích sự hình thành chồi bất định
trực tiếp. Trong đó, BAP có hiệu quả hơn kinetin cho sự hình thành chồi bất
định. Khi kết hợp auxin (IBA 0,05 mg/l) với cytokinin (BAP 5 mg/l) sẽ làm
tăng cường sự hình thành chồi bất định, với tần số cao nhất là 40%. Chồi bất
định được hình thành chủ yếu ở phần bên trong, còn phôi soma được hình
thành gần vết cắt của lá mầm. Chồi phát triển từ chồi bất định sau khi cấy
chuyển lên môi trường MS có bổ sung GA3 (10 mg/l). Rễ được hình thành từ
15
16

các chồi khi cấy trên môi trường ½ MS có bổ sung auxin (IAA). Sau đó, cây
hoàn chỉnh được đem trồng trong nhà kính với tỉ lệ sống là 36% [50].
Jianyong và cs (1999) đã nuôi cấy tế bào Nhân sâm (từ rễ của Panax
ginseng C. A. Meyer ) trên môi trường bổ sung carbohydrate khác nhau bao
gồm sucrose, glucose, fructose, ở nồng độ 10-110 g/l. Sucrose là nguồn cung
cấp carbon tốt hơn các monosaccharide khác cho sự phát triển của tế bào nhân
sâm và nồng độ tối ưu là từ 30 đến 50 g/l. Sự gia tăng nồng độ ban đầu trong
phạm vi này làm tăng mật độ tế bào tối đa và chỉ số tăng trưởng đáng kể,
trong khi đó nồng độ cao hơn lại ức chế sự phát triển của tế bào. Sự cung cấp
nguồn sucrose và một số thành phần khác của môi trường khi mô phát triển
làm tăng chỉ số tăng trưởng hơn 60-70% và năng suất sinh khối hơn 50%
[26].
Claire và cs (2000) nghiên cứu vai trò của polyamine và các con đường
trao đổi chất trong phôi soma của nhân sâm (Panax ginseng) trong nuôi cấy
lỏng. Khả năng tạo phôi từ callus trong nuôi cấy lỏng là một quá trình gồm ba
thử nghiệm: nuôi cấy huyền phù tế bào có bổ sung một hỗn hợp
auxin/cytokinin, chỉ bổ sung auxin và chỉ bổ sung cytokinin. Kết quả cho thấy
khi kết hợp các polyamine hoặc tiền chất của nó (arginine và ornithine) vào
môi trường tái sinh để cảm ứng thì số lượng phôi tăng lên đến 4 lần [17].
Claire và cs (2002) đã xác định vai trò ảnh hưởng tốt của các auxin
khác nhau và các polyamine ở những giai đoạn hình thành và phát triển phôi
soma của nhân sâm trong nuôi cấy in vitro. Nhóm nghiên cứu nhận định việc
sản xuất cây con khả thi thông qua sự phát sinh phôi của nhân sâm cần có môi
trường nuôi cấy khác nhau tương ứng ở các giai đoạn phát triển kế tiếp. Các
ảnh hưởng của auxin và polyamine đã được thử nghiệm ở các thí nghiệm khác
nhau. Nhân nhanh callus từ rễ gốc phôi trên môi trường tối ưu ½ MS bổ sung
3-(benzo [b] selenyl) acetic acid (BSAA) và KIN; Các polyamine ngoại sinh
16
17
sử dụng ở giai đoạn này sẽ có hại như gây ra hóa nâu callus, làm giảm khả

năng khởi đầu tạo phôi và xu hướng tăng sự thủy tinh hóa. Sử dụng BSAA là
auxin thuận lợi nhất ở giai đoạn khởi đầu và nó được tăng cường hoạt động
khi có sự hiện diện của các polyamine, mà spermidine là hiệu quả nhất. Các
auxin cần thiết hiệu quả nhất ở giai đoạn tái sinh phôi đó là BSAA và
seleniated 2,4-D (2,4-D-Se). Spermidine có ảnh hưởng cao đến sự phát triển
đồng thời cả chồi và rễ [18].
Năm 2002, Marta và cs đã xác định vai trò đặc trưng của spermidine
trong giai đoạn khởi đầu phát sinh phôi soma ở nhân sâm. Sự phát sinh phôi
soma của sâm Triều tiên đã được bắt đầu từ khối huyền phù của callus trong
môi trường ½ MS có bổ sung auxin tổng hợp là BSAA. Nhóm nghiên cứu
thấy rằng khi bổ sung thêm spermidine vào môi trường ban đầu này, đã tăng
đáng kể số lượng phôi soma [37].
Jung và cs (2005) nghiên cứu sự tăng trưởng và sản xuất saponin của rễ
nhân sâm trong các môi trường nuôi cấy, đánh giá theo giá trị pH, nồng độ
nitơ, sucrose và phosphate khác nhau. Độ pH của môi trường không có tác
động tăng trưởng rễ đáng kể, nhưng ảnh hưởng rõ ràng đến hàm lượng
saponin. Hàm lượng saponin thu được tối đa là 0,26% ở pH 6,0. Nồng độ tối
ưu tăng trưởng rễ và sản xuất saponin là 30 g/l sucrose, 382,7 mg/l nitơ và
40,4 mg/l phosphate [27].
Sijun và cs (2005) đã xây dựng quy trình sản xuất cây giống sâm bắc
Mỹ (Panax quinquefolium L.) hiệu quả cao thông qua phát sinh phôi soma từ
mẫu cấy lá mầm. Nhóm tác giả đã tiền xử lý mẫu lá mầm bằng sucrose 1,0 M
ở 4
o
C, kết quả đã cải thiện chất lượng phôi và tần số phát sinh phôi. Tần số
phát sinh phôi thứ cấp ở mô có nguồn gốc từ phôi soma được nuôi cấy trên
môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D và 1,0 mg/l NAA đạt 90%. Những
phôi soma có thể phát triển xa hơn đến trưởng thành trên môi trường SH bổ
17
18

sung 1% than hoạt tính và một nửa chúng có thể nảy mầm. Khoảng 85% phôi
đã nảy mầm có thể chuyển thành cây với hệ thống rễ cái phát triển tốt trên
môi trường ½ MS với 0,5% than hoạt tính. Tỷ lệ sống của cây con khi được
trồng trong phòng nuôi và bên ngoài môi trường lần lượt là 95,6% và 93,7%.
[45].
Xiang và cs (2007) thực hiện tái sinh cây thông qua phát sinh phôi
soma trực tiếp ở cây sâm Nhật Bản (Panax japonicus). Phôi soma trực tiếp
thu được từ các phôi hữu tính trên môi trường MS có bổ sung 4,4 µM 2,4-D.
Sau đó, phôi soma thứ cấp được nuôi cấy lặp đi lặp lại. Việc tạo phôi soma
thứ cấp được tăng cường bằng cách tiền xử lý co nguyên sinh (1,0 M
mannitol trong 10 giờ). Tần số hình thành phôi soma lần thứ hai từ các đoạn
lá mầm đã giảm xuống, nhưng số lượng phôi soma trên mỗi mẫu cấy lại tăng
lên rất nhiều. Khi có tiền xử lý co nguyên sinh sẽ làm chậm quá trình phát
triển và thích ứng môi trường mới của phôi ở giai đoạn lá mầm. Nếu không
tiền xử lý co nguyên sinh thì phôi lá mầm được tạo thành sau 8 tuần nuôi cấy.
Tất cả lá mầm của phôi soma đã được tiền xử lý đều phát triển trên môi
trường MS bổ sung 5 µM GA3, nhưng trên môi trường đối chứng không có
hormone chỉ có 15,3% mẫu phát triển. Sau 2 tháng nuôi trên môi trường ½
WPM (Woody Plant Medium), cây con đã ra hoa một cách tự nhiên. Trong
bao phấn của hoa in vitro, sự phát sinh vi bào tử (microsporogenesis) xảy ra
bình thường với số lượng hạt phấn thấp [49].
Năm 2008, Thành và cs đã nhân nhanh rễ bất định của nhân sâm Triều
tiên trên môi trường MS cơ bản, kết quả thu được sự hình thành và phát triển
của callus thích hợp nhất là 2,4-D, còn IBA là thích hợp cho sự hình thành và
tăng trưởng của rễ bất định. Số rễ được hình thành trên môi trường bổ sung
IBA nhiều hơn so với NAA. Nồng độ sucrose ban đầu đã ảnh hưởng đến sự
tăng trưởng sinh khối tế bào và sản phẩm saponin, kết quả cho thấy nồng độ
18
19
sucrose 50 g/l là tối ưu nhất cho sự sinh trưởng của rễ bất định với khối lượng

khô (KLK) là 1,62 ± 0,19 g [9].
1.3.2. Một số nghiên cứu nuôi cấy in vitro sâm Ngọc Linh
Năm 1968, Vũ Đức Minh đã tìm thấy cây thuốc này tại vùng núi Ngọc
Linh và đặt tên là sâm Khu 5. Năm 1973, đoàn điều tra cây thuốc của Ban
Dân y Khu 5 đã phát hiện một loài Panax mọc hoang thành quần thể trên
vùng núi Ngọc Linh về phía triền núi Kon Tum và đặt tên là sâm Đốt trúc với
tên khoa học là Panax articulatus. Năm 1976, công trình nghiên cứu sơ bộ
của Nguyễn Thới Nhâm tại Ba lan cho thấy thành phần saponin của sâm Ngọc
Linh khá giống nhân sâm. Vào năm 1985, tên khoa học của sâm Ngọc Linh
được xác định là Panax vietnamensis Ha et Grushv., thuộc họ nhân sâm
(Araliaceae), loài sâm thứ 20 được tìm thấy trên thế giới [4, 7].
Năm 2007, Thanh và cs đã nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi
cấy đến sự tăng trưởng sinh khối và sự tích lũy sản phẩm ginsenoside trong
nuối cấy tế bào lỏng của sâm Ngọc Linh. Kết quả cả môi trường MS đầy đủ
và ½ MS đều làm tăng sinh khối và tăng sản xuất ginsenoside, thu được 9,8
g/l và 6,81 mg/l KLK. Khi tăng nồng độ sucrose từ 20 đến 50 g/l thì KLK
cũng tăng từ 5,4 g/l lên đến 10,3 g/l, nhưng khi tăng nồng độ sucrose cao hơn
60 g/l thì dẫn đến sự kìm hãm tăng trưởng tế bào, khi nồng độ 70 g/l sucrose
thì dẫn đến giảm sinh khối và giảm tích lũy ginsenoside [46].
Luong và cs (2009) nghiên cứu về ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy
đến sự hình thành callus và sinh khối tế bào ở Panax vietnamesis, cho thấy
trong bốn loại môi trường được sử dụng (MS, White, Gamborg và Nitch), môi
trường MS cho thấy kết quả tốt nhất, tỷ lệ hình thành callus thành công và
khối lượng tế bào hình thành được 30% và tương ứng với 62,93 ± 3,63 mg
KLK. Ở môi trường Nitch cho kết quả thấp nhất, tỷ lệ hình thành callus và
sinh khối tế bào tương ứng là 15% và 27,10 ± 2,24 mg KLK. Kết quả cho
19
20
thấy rằng môi trường MS là thích hợp nhất cho sự hình thành callus và sản
xuất sinh khối tế bào ở Panax vietnamesis [34].

Năm 2009, Nguyễn Thành Sum và cs đã khảo sát môi trường thích hợp
tạo rễ bất định và nhân sinh khối sâm Ngọc Linh. Sử dụng mẫu có kích thước
1,0×1,0×0,25 cm cấy trên môi trường MS có bổ sung 30 g/l sucrose, 8,0 g/l
agar và 2,4-D với các nồng độ khác nhau. Thực nghiệm cho thấy, môi trường
chứa 3 mg/l 2,4-D đã cho kết quả hình thành mô sẹo và rễ bất định tốt nhất
sau 2 tháng nuôi cấy. Những đoạn cắt 1,0 cm của những mẫu rễ bất định này
sau đó được chuyển sang môi trường MS, White và Gamborg (B5) có bổ sung
30 g/l sucrose, 8,0 g/l agar, và IBA hoặc NAA với các nồng độ khác nhau.
Nghiên cứu cho thấy môi trường White có bổ sung NAA đã đạt được kết quả
tăng sinh khối rất khả quan. Trong môi trường White bổ sung 3,0 mg/l NAA,
thích hợp cho sự phát triển rễ bất định ở sâm Ngọc Linh [8].
Dương Tấn Nhựt và cs (2010), nhân giống vô tính sâm Ngọc Linh và
trồng thử nghiệm ở giai đoạn vườn ươm. Callus được cảm ứng từ củ sâm
Ngọc Linh được cắt thành lát mỏng và cấy lên môi trường MS bổ sung 1,0
mg/l 2,4-D và 0,2 mg/l TDZ (thiadizurol), trong điều kiện chiếu sáng 16
giờ/ngày. Môi trường tốt nhất cho tỷ lệ tăng sinh khối callus là môi trường
MS bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D kết hợp 0,2 mg/l TDZ. Số chồi tái sinh từ callus
đạt cao nhất trên môi trường SH (Schenk và Hilderbrandt – 1972) bổ sung 1,0
mg/l BA, 1,0 mg/l NAA và 2 g/l than hoạt tính. Trong giai đoạn tăng trưởng
chồi, môi trường ½ MS được bổ sung 1,0 mg/l BA và 0,5 mg/l NAA, 50 g/l
sucrose, 2,0 g/l than hoạt tính và được đặt trong điều kiện ánh sáng đèn LED
70% đỏ và 30% xanh là tốt nhất. Sau 6 tháng trồng ngoài khu vực vườn ươm
cho thấy tốc độ sinh trưởng nhanh hơn so với cây sâm Ngọc Linh gieo bằng
hạt với tỷ lệ sống sót của 1000 cây sâm in vitro là 87% [6].
20
21
Nguyễn Thị Liễu và cs (2011) đã nghiên cứu khả năng tạo rễ bất định
của sâm Ngọc Linh, mẫu cấy được thu thập từ củ sâm tươi có kích thước
1,0×1,0×0,25 cm trên môi trường MS có bổ sung 50 g/l sucrose, 8,0 g/l agar,
1,0 mg/l 2,4-D cho kết quả hình thành callus và rễ bất định tốt nhất sau 2

tháng nuôi cấy. Rễ bất định được cắt 1,0 cm và cấy chuyển lên môi trường
Gamborg (B5) được bổ sung 50 g/l sucrose, 8,0 g/l agar, 5,0 mg/l IBA, kết
quả hình thành và phát triển rễ bất định cũng như sự tăng sinh khối rất tốt. Từ
kết quả ban đầu này đã mở ra một hướng nghiên cứu mới là tạo sinh khối rễ
sâm Ngọc Linh trong thời gian ngắn, số lượng nhiều, chủ động nguồn nguyên
liệu để cung cấp cho ngành dược, giảm dần số lượng nhập khẩu, tiết kiệm
được nguồn vốn và giảm giá thành sản phẩm [5].
Năm 2011, Nhut và cs đã tạo rễ và vi nhân giống sâm Ngọc Linh từ lá
có nguồn gốc nuôi cấy từ callus. Các phương pháp cảm ứng lá có nguồn gốc
từ callus, nhân nhanh callus, cảm ứng chồi bất định và tái sinh cây sâm Ngọc
Linh đã được kiểm tra. Trong nghiên cứu này, callus được hình thành trên cả
hai môi trường có riêng rẽ 2,4-D hoặc kết hợp với TDZ. Callus cảm ứng có
tần số cao nhất thu được trên môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D và 0,2
mg/l TDZ. Môi trường nhân nhanh callus tốt nhất là môi trường SH có bổ
sung 0,2 mg/l TDZ và 1,0 mg/l 2,4-D. Số lượng chồi có nguồn gốc từ callus
thu được cao nhất (8,2 chồi) trên môi trường SH vừa bổ sung 50 g/l sucrose
kết hợp với 2,0 mg/l BA. Tạo rễ từ chồi bất định tốt nhất trên môi trường SH
có bổ sung 1,0 mg/l NAA. Cây con đã được di thực thành công với tỷ lệ sống
85% và chiều dài rễ tăng đáng kể sau hai tháng trồng trên núi Ngọc Linh [38].
1.3.3. Khái quát về sâm Ngọc Linh
1.3.3.1. Đặc điểm hình thái
Sâm Ngọc Linh là cây thân thảo, sống lâu năm, có chiều cao từ 0,4-0,8
m. Thân rễ (củ) nạc gồm nhiều đốt, phân nhánh, nằm ngang, đường kính 1,5-
21
22
2,5 cm, phần đầu có nhiều vết sẹo do thân khí sinh tàn lụi hàng năm. Thân rễ
còn mang nhiều rễ phụ, ở cây hoang dại, thân rễ là phần phát triển mạnh nhất
chứa chất dự trữ và hoạt chất. Hình dạng rất thay đổi, rễ củ ở cây sâm hoang
dại rất phát triển có dạng con quay, hình trụ, có màu vàng nhạt mang nhiều rễ
con với những vàm ngang. Lá kép chân vịt, gồm 2-3 lá mọc vòng; lá chét

thuôn, dài 10-14 cm, rộng 3,0-5,0 cm; gốc nhọn, đầu vuốt nhọn; mép khía
răng cưa; cuống lá chét dưới 1 cm. Hoa mọc ở ngọn, cụm hoa thường gồm 1
tán, cá biệt có tán phụ, cuống cụm hoa dài 15-30 cm. Hoa nhỏ, màu trắng ngà,
cuống hoa 1,0-1,5 cm; đài 5, hợp ở gốc, hình tam giác rộng; nhị 5, chỉ nhị
mảnh; bầu 2 ô, cá biệt 1 ô, đầu nhụy chẻ đôi. Quả hình cầu hoặc hình cầu hơi
dẹt, đường kính 0,6-1,0 cm, khi chín màu đỏ, có chấm đen. Mỗi quả có 1-2
hạt, gần tròn, đường kính 2,0-3,0 mm, màu trắng xám. Đối với sâm trồng, rễ
củ rất phát triển, tăng trưởng hàng năm rất rõ rệt, chúng có ba dạng chính:
dạng củ cà rốt, dạng con quay và dạng bó củ (là dạng rất phổ biến). Sâm Ngọc
Linh trồng thường cao đến 1 m, mang nhiều lá kép có khi đến 7 lá chét to hơn
bình thường [2, 4, 7].
1.3.3.2. Vùng phân bố
Loài sâm này phát triển tự nhiên ở vùng núi Ngọc Linh thuộc hai tỉnh
Kon Tum và Quảng Nam, ngoài ra còn có ở núi Langbian thuộc tỉnh Lâm
Đồng. Việt Nam là nơi phân bố duy nhất của sâm Ngọc Linh trên toàn thế
giới [2, 4, 7].
1.3.3.3.Đặc điểm sinh thái học
Cây sâm Ngọc Linh đặc biệt ưa ẩm và ưa bóng, thường mọc rải rác
hoặc thành đám nhỏ dưới tán rừng kín thường xanh ẩm; độ cao 1900-2300 m
so với mực nước biển. Nhiệt độ trung bình của vùng có sâm mọc tự nhiên từ
15-18
o
C, độ ẩm 90%, lượng mưa khoàng 3000 mm/năm; đất nhiều mùn, giàu
dinh dưỡng. Hàng năm, phần thân mang lá tàn lụi vào tháng 11; đến tháng 3
22
23
năm sau mọc lên thân mới, ra hoa vào tháng 4-5, quả chín vào tháng 9,10.
Sâm được tái sinh tự nhiên từ hạt hoặc từ phần đầu mầm thân rễ [2, 4, 7].
1.3.3.4. Thành phần hóa học
Hợp chất saponin được xem là thành phần hoạt chất chủ yếu của sâm

Ngọc Linh cũng như của các loài sâm khác trên thế giới. Các saponin
dammaran được xem là hoạt chất quyết định cho các tác dụng sinh học [20].
Về mặt hoá học, thân rễ và rễ củ sâm Ngọc Linh đã phân lập được 52
loại saponin, trong đó có 26 loại saponin thường thấy ở sâm Triều Tiên, sâm
Mỹ, sâm Nhật Bản, đại diện chính là Ginsenoside-Rb1, Ginsenosid-Rg1,
Ginsenosid-Rd và 26 loại saponin mới phát hiện trong sâm Ngọc Linh, đại
diện chính là: majonosid-R1, majonosid-R2. Đặc biệt majonosid-R2 chiếm
50% hàm lượng saponin toàn phần của sâm Ngọc Linh. Trong lá và cuống lá
đã phân lập được 19 saponin dammaran, trong đó 8 saponin có cấu trúc mới.
Ngoài thành phần saponin, trong sâm Ngọc Linh đã xác định có 17 loại acid
amin, 20 chất khoáng vi lượng và 0,1% hàm lượng tinh dầu [4, 7, 20, 25].
Bộ phận nằm dưới mặt đất của cây sâm Ngọc Linh trồng có khuynh
hướng phát triển thành một rễ củ thay vì một thân rễ như ở cây mọc hoang
dại. Từ bộ phận này của cây sâm Ngọc Linh trồng tại Trại Dược liệu Trà Linh,
tỉnh Quảng Nam, các nhà khoa học đã chiết xuất, phân lập và xác định cấu
trúc của 5 loại saponin damaran gồm ginsenosid-Rb1, ginsenosid-Rd,
ginsenosid-Rg1, vina-ginsenosid-R11 và majonosid-R2. Các kết quả nghiên
cứu cho thấy sâm Ngọc Linh trồng chứa thành phần saponin tương tự cây sâm
mọc hoang trong tự nhiên (hàm lượng saponin thô trong sâm trồng là 19,7%,
gần tương đương với sâm thiên nhiên 21,3%) [7, 25].
1.3.3.5. Tác dụng dược lý
Các công trình nghiên cứu dược lý và lâm sàng cho thấy sâm Ngọc
Linh có những tác dụng rất giống nhân sâm như: cải thiện tình trạng suy
23
24
nhược của cơ thể chống mệt mỏi, làm gia tăng sự vận động tự nhiên, trí thông
minh và sự nhanh nhẹn khéo léo, kháng viêm, giảm đau, phục hồi khí huyết,
chống oxy hóa. Ngoài ra, nó còn có tác động kháng khuẩn đáng kể đối với các
loài Streptococci gây bệnh và có tác dụng tốt với chứng viêm họng. Gần đây,
các thử nghiệm dược lý cho thấy majonosid-R2 là saponin chủ yếu của sâm

Ngọc Linh, có tác dụng chống stress và là một chất xúc tác quan trọng chống
ung thư (anti-cancer promoting agent) [2, 4, 6].
1.3.3.6. Sự cần thiết phát triển nguồn sâm Ngọc Linh
Sâm Ngọc Linh đã được các nhà khoa học chứng minh có giá trị dược
liệu cao, được xếp vào nhóm sâm quý của thế giới. Hiện nay, người ta có xu
hướng quay trở về với cây thuốc và thuốc có nguồn gốc thiên nhiên, và sâm
Ngọc Linh là một dược liệu quý có giá trị kinh tế cao, nên cũng chính là đối
tượng bị khai thác triệt để vì mục đích thương mại, đã dẫn đến cạn kiệt nguồn
sâm tự nhiên. Để giải quyết vấn đề này đòi hỏi phải có giải pháp toàn diện về
quản lý, bảo vệ, bảo tồn, quy hoạch vùng sâm nguyên liệu, cần thiết ứng dụng
những kỹ thuật mới trong sản xuất để nâng cao giá trị thương mại, xây dựng
thương hiệu sâm Ngọc Linh trên thị trường thế giới. Trong đó, kỹ thuật nhân
giống in vitro cho hệ số nhân giống cao, nên đây là giải pháp cần thiết góp
phần phát triển đáp ứng kịp thời nguồn sâm nguyên liệu trong công tác nhân
giống để mở rộng diện tích sâm trồng và sản xuất sản phẩm sâm Ngọc Linh.
Hình 1. Cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)
a. Cây sâm Ngọc Linh mọc tự nhiên; b. Cây sâm Ngọc Linh trong vườn
trồng;
c. Mẫu sâm Ngọc Linh tự nhiên được thu thập tại vùng núi Ngọc Linh.
1, 2, 3, 4, 5. Cây sâm Ngọc Linh có độ tuổi tương ứng: 3 tháng và 1, 2, 3, 5
năm tuổi
24
25
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu của chúng tôi là sâm Ngọc Linh, đây là loài sâm
chỉ phân bố ở Việt Nam, được xếp đầu bảng trong “Sách đỏ Việt Nam”, có giá
trị về mặt dược liệu cao, được xếp vào nhóm sâm quý trên thế giới.
Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) thuộc:

Bộ (ordo): Apiales
Họ (familia): Araliaceae
Phân họ (subfamilia): Aralioideae
Chi (genus): Panax
2.2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu nuôi cấy ban đầu là đỉnh sinh trưởng, thân củ, cuống lá của
cây sâm Ngọc Linh tự nhiên 5 năm tuổi. Mẫu được thu tại vùng núi Ngọc
Linh, huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam.
2.2.2. Môi trường nuôi cấy
Mẫu được cấy lên các môi trường ½ MS, MS, SH, White có bổ
sung 30 g/l sucrose, agar 8 g/l và các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm
auxin và cytokinin với nồng độ khác nhau tùy theo mục đích của từng thí
nghiệm. Môi trường nuôi cấy được khử trùng ở nhiệt độ 120˚C trong 20 phút,
áp suất 1 atm.
2.2.3. Điều kiện thí nghiệm
- Nhiệt độ phòng nuôi cấy: 25 ± 2
o
C.
- Cường độ ánh sáng: 2000-3000 lux.
25