Nghiên cứu quy trình phân tích một số kháng sinh họ Floquinolon trong mẫu tôm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC Tự NHIÊN
# $ # £ * * * *
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
MỘT SỐ KHÁNG SINH HỌ
FLOQUINOLON TRONG MAU t ô m
M Ã SỐ : QT-07-57
CH Ủ TRÌ Đ Ề TÀI : TS. Dương Hồng Anh
CÁC C ÁN BỘ THAM GIA: ThS. Phạm Ngọc Hà
CN. Trần Thanh Tuấn
CN. Nguyễn H oàng Tùng
ĐA! HỌC QUỐC GIA HÀ NÔi
TRUNG TẨM THÒNG TIN THƯ VIÊN
H À N Ộ I-3 /2 0 0 8
IM TẮT KẾT QUẲ THỰC HIỆN
Đề tài cap DHQGHN năm 2007
1. Tên đề tài:
Nghiên cứu quy trình phân tích dư lượng một số kháng sinh họ Floquinolon trong
mẫu tôm
Mả số: QT - 07 - 57
2. Chủ trì đề tài: TS. Dương Hồng Anh
3. Các cán bộ tham gia: ThS. Phạm Ngọc Hà
CN. TrầnThanh Tuấn
CN. Nguyễn Hoàng Tùng
4. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
Mục tiêu của đề tài:
- Nghiên cứu tối ưu hoá quy trình phân tích dư lượng một số kháng sinh họ
Floquinolon trong mẫu tôm trên cơ sở sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn để xử lý
mẫu và phân tích định tính, định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao.
Nội dung nghiên cứu:

- Nghiên cứu quy trình phân tích dư lượng một số kháng sinh họ Floquinolon
trong mẫu tôm dựa trên hai giai đoạn:
> Chiết chất phân tích khỏi nền mẫu bằng phương pháp chiết lỏng rắn thông
thường, làm sạch và làm giàu dịch chiết bằng phương pháp chiết pha rắn sử
dụng các loại cột chiết khác nhau: cột trao đổi cation hỗn hợp (MCX), cột
trao đổi anion hỗn hợp (MAX), cột HLB.VỚi mõi cột chiết pha rắn các giai
đoạn rửa chất bẩn, rửa giải được tối ưu hoá nhằm đem lại hiệu quả chiết tốt
nhất.
> Phân tích định tính, định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
với detectơ huỳnh quang
- Lấy mẫu tôm tưoi bán tại các chợ trên địa bàn Hà Nội phân tích để minh hoạ khả
năng sử dụng của phương pháp
5. Tóm tắt kết quả nghiên cứu đạt được
Tóm tắt kết quả nghiên cứu, ỷ nghĩa khoa học của kết quả đạt được:
- Đã tối ưu hoá 03 qui trình phân tích dư lượng một số kháng sinh họ Floquinolon
trong mẫu tôm.
> Quy trình 1: mẫu tôm được chiết bằng dung môi EtOH/axit axetic (99/1).
Dịch chiết được làm sạch và làm giàu bằng kỹ thuật chiết pha rắn sử dụng
cột MCX gồm các bước: nạp mẫu, rửa tạp chất lần 1 bằng 3 mL EtOH/axit
axetic (99/1), rửa tạp chất lần 2 bằng 3mL MeOH, rửa tạp chất lần 3 bằng
3mL NH3/H20/M e0H (10/85/5), rửa giải bằng 3mL NH3/MeOH/fị(Y'íỹ£^;)
Thực hiện quá trình chuyển đổi dung môi và phân tích định tính định lượng
bằng HPLC-FLD. Qui trình có hiệu suất thu hồi vói bốn loại floquinolon 64 -
83%, giới hạn định lượng 5,0 - 7,0 |J.g/kg đáp ứng yêu cầu phân tích mẫu
tôm.
> Quy trình 2: mẫu tôm được chiết bằng đệm phôtphát pH=7,4. Dịch chiết
được làm sạch và làm giàu bằng kỹ thuật chiết pha rắn sử dụng cột MAX
gồm các bước: nạp mẫu, rửa tạp chất lần 1 bằng 3 mL NH3 5%, rửa tạp chất
rửa tạp chất lần 3 bằng ' 3mL H20/M e0H
Qợ/0) trong 4% HCOOH, rửa giải bằng 3mL HzO/MeOH Cố70(j) trong6 %

HCOOH. Thực hiên quá trình chuyển đổi dung môi và phân tích định tính
định lượng báng HPLC-FLD. Qui trình có hiệu suất thu hồi với bốn loại
floquinolon 62 - 84%, giới hạn định lượng 4,9 - 6 , 6 |J.g/kg đáp ứng yêu cầu
phân tích mẫu tôm
> Quy trình 3: mẫu tôm được chiết bằng đệm phôtphát pH=7,4. Dịch chiết
được làm sạch và làm giàu bằng kỹ thuật chiết pha rắn sử dụng cột HLB gồm
các bước: nạp mẫu, rửa tạp chất lần 1 bằng 3 mL NH3 5%, rửa tạp chất lần 2
bằng 3mL NH3 /M e0H/H20 (lOMy 5VP), rửa giải bằng 3mL NH3/H20/M e0H
(lO/to/80). Thực hiện quá trình chuyển đổi dung môi và phân tích định tính
định lượng bằng HPLC-FLD. Qui trình có hiệu suất thu hồi với bốn loại
floquinolon 60- 85%, giới hạn định lượng 5,1 - 7,6 ng/kg đáp ứng yêu cầu
phân tích mẫu tôm
- Đã lấy 4 mẫu tôm tươi ở các chợ Hà Nội phân tích, phát hiộn dư lượng kháng
sinh Ciprofloxacin, Norfloxacin và Enrofloxacin trong 3 mẫu phân tích với cỡ độ
từng kháng sinh 5 -1 3 |ig/kg.
Tóm tắt kết quả nghiên cứu, ý nghĩa thực tiễn của kết quả đạt được:
- Các quy trình phân tích dư lượng một số kháng sinh họ Floquinolon trong mẫu
tôm trên cơ sở sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn (dùng cột MAX, MCX hoặc HLB)
để xử lý mẫu và phân tích định tính, định lượng bằng phương pháp HPLC/FLD
có giới hạn định lượng phù hợp với yêu cầu thực tế, nếu so sánh với phương pháp
HPLC/MS/MS đạt tương quan tốt thì có thể chuyển giao cho cơ sở sử dụng là
PTN của Cục Quản lý chất lượng an toàn vệ sinh, thú y thủy sản (NAFIQAVED)
6. Kinh phí của đề tài
6.1. Kinh phí được cấp: 20 triệu đổng
6.2. Giải trình các khoản chi:
- Thuê khoán chuyên môn:
- Hoá chất, nguyên liệu, dụng cụ:
- Hội nghị, hội thảo:
- Điện nước và quản lý phí:
9.000.000 đồng

9.096.000 đồng
520.000 đồng
1.600.000 đồng
KHOA QUẢN LÝ
Trung tâm NC CNMT &PTBV
CHỦ TRÌ ĐỂ TÀI
TS.
GS.TS. Phạm Hùng Việt
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN
HREF OF THE PROJECT
1. Name of project:
Study on analytical method development for determination of Fluoroquinolone
Antibacterial Agents in shrimp sample.
The code number: QT - 07- 57
2. The Coordinator: Dr. Duong Hong Anh
3. The Participants of the project: MSc. Pham Ngoc Ha
BSc. Tran Thanh Tuan
BSc. Nguyen Hoang Tung
4. Purpose and contents of the research
Purpose:
- Optimizing analytical procedures for determination of Fluoroquinolone
Antibacteria agents (FQs) in shirmp sample based on using solid phase
extraction technique and high performance chromatography/ fluorensence for
quantitation and qualification.
Content:
- Study on analytical procedure for determination of Fluoroquinolone
Antibacterial Agents in shrimp sample:
> Firstly, the homogenous shirmp sample was extracted by shaking with
suitable solvent. The extract was cleanup by solid phase extraction technique
using several cartridges: MAX, MCX and HLB. For each cartridge, the

procedures including wash and elution stages were optimized for the best
extraction efficiency.
> Fluoroquinolnes were quantitated and qualificated by high performance
chromatography/ fluorensence method.
- Several shirmp shamples were collected from markets in Hanoi for analysis as a
practical examples for the developed methods
5. Summary of obtained investigation results
- Completing 03 analytical procedure for determination of Fluoroquinolone
Antibacteria agents (FQs) in shirmp sample.
> Procedure 1: Firstly, the homogenous shirmp sample was extracted by.
shaking with phosphate buffer (pH=7,4). The extract was cleanup by solid
phase extraction technique using MAX cartridge. The clean up includes
following stages: samples filling, r ‘ washing by 3 mL of NH3 5%, 2Gd
washing by 3 mL of MeOH, 3rd washing by 3 mL of 4% HCOOH in
Me0H/H20 (10:90), elution by 3mL 6 % HCOOH in Me0H/H20 (95:5).
The elute was analysed by HPLC-FLD. Average recoveries obtained for FQs
were in range of 62 - 84%. Quantitative determination limits were in range of
4,9- 6 , 6 ng/kg. The investigated procedures were suitable for analysis of
shữmp samples.
> Procedure 2: Firstly, the homogenous shirmp sample was extracted by
shaking with EtOH/axit axetic (99/1). The extract was cleanup by solid phase
-


-

0 MCX cartridge. The clean up includes following
stages: samples filling, 1“ washing by 3 mL of EtOH/axetic acid (99/1), 2nd
washing by 3 mL of MeOH, 3" 1 washing by 3 mL of NHj/MeOH/HjO
(10/5/85), elutíon by 3mL NH3/Me0 H/H2 0 (10/85/5). The elute was

analysed by HPLC-FLD. Average recoveries obtained for FQs were in range
of 64 - 83%. Quantitative determination limits were in range of 5,0 - 7,0
M-g/kg. The investigated procedures were suitable for analysis of shirmp
samples.
> Procedure 3: Firstly, the homogenous shirmp sample was extracted by
shaking with phosphate buffer (pH=7,4). The extract was cleanup by solid
phase extraction technique using MAX cartridge. The clean up includes
following stages: samples filling, r 1 washing by 3 mL of NH3 5%, 2nd
washing by 3 mL of NH3 /M e0H/H20 (10/10/80), elution by 3mL NH3
/MeOH/HjO (10/80/10). The elute was analysed by HPLC-FLD. Average
recoveries obtained for FQs were in range of 60 - 85%. Quantitative
determination limits were in range of 5,1- 7,6 ng/kg. The investigated
procedures were suitable for analysis of shirmp samples.
Ciprofloxacin, Norfloxacin and Enrofloxacin were found in 3/4 shirmp samples
collected in Hanoi market at concentration in range of 5 - 13 ng/kg for each
antibacterial agents.
MỤC LỤC
Trang
MỤC LỤC 1
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT 3
DANH MỤC CÁC BẢNG 4
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, Đ ổ THỊ 4
MỞ ĐẦU 6
I. TỔNG QUAN 7
1.1. Tình hình sử dụng kháng sinh trong nuôi tôm ở Việt Nam 7
1.2. Dư lượng kháng sinh trong thuỷ sản và tác hại 9
1.3. Đối tượng nghiên cứu - các kháng sinh floquinolon trong tôm 9
1.4. Một số phương pháp xác định nhóm kháng sinh floquinolon trong mẫu
thực phẩm
1.5. Lựa chọn phương pháp xác định nhóm kháng sinh floquinolon trong

mẫu tôm
1.6. Giới thiệu chung vể cấu tạo, cơ chế hoạt động của các cột chiết pha rắn
được sử dụng trongnghỉên cứu
1.6.1. Cột MAX 13
1.6.2. CộtM CX 13
1.6.3. CộtHLB 14
II. MỤC TIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 15
2.1. Mục tiêu nghiên cứu 15
2.2. Phương pháp nghiên cứu 15
III. THỰC NGHIỆM 16
3.1. Hoá chất, dụng cụ, thiết bị 16
3.2. Điều kiện phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao 16
3.3. Thực nghiộm 17
3.3.1. Pha các dung dịch chuẩn và dung địch cần sử dụng 17
1
23
27
30
3.3.2. Xây dựng, đánh giá phương pháp chiết pha rắn/ kết hợp sắc ký
lỏng hiệu năng cao phân tích dư lượng FQs trong mẫu tôm 18
IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23
4.1. Nghiên cứu các qui trình xử lí mẫu bằng kỹ thuật chiết pha rắn 23
4.1.1. Tối ưu hoá các bước trong qui trình chiết pha rắn sử dụng cột
MAX
4.1.2. Tối ưu hoá các bước trong qui trình chiết pha rắn sử dụng cột
MCX
4.1.3. Tối ưu hoá các bước trong qui trình chiết pha rắn sử dụng cột
HLB
4.2. Phép đo định tính và định lượng các FQs bằng phương pháp HPLC/FLD 33
4.2.1. Khảo sát khoảng tuyến tính của các đường chuẩn xác định FQs 33

4.2.2. Sai số và độ lặp lại của phép đo 35
4.3. Đánh giá phương pháp phân tích FQs trong mẫu tôm 37
4.3.1. Cách tính hàm lượng FQs trong mẫu tôm
4.3.2. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp 37
4.3.3. Hiệu suất thu hồi của phương pháp 38
4.3.4. Kết quả phân tích dư lượng FQs trong một số mẫu tôm 39
V. KẾT LUẬN 42
VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO 43
2
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
CIP
: kháng sinh ciprofloxacin
ELISA
: phương pháp miễn dịch enzym
ENR
: kháng sinh enrofloxacin
FQs
: kháng sinh họ floquinolon
HLB
: cột chiết pha rắn loại cân bằng ưa nước - kỵ nước
HPLC/FLD
: sắc kí lỏng hiệu năng cao/ detectơ huỳnh quang
LC/MS/MS : sắc kí lỏng/detectơ khối phổ kép
LOD
: giới hạn phát hiện của phương pháp
LOM
: kháng sinh lomefloxacin
LOQ
: giói hạn định lượng của phương pháp
MAX

: cột chiết pha rắn loại anion hỗn hợp
MCX
: cột chiết pha rắn loại cation hỗn hợp
NOR
: kháng sinh norfloxacin
SPE
: phương pháp chiết pha rắn
PLE
:phương pháp chiết lỏng dưới áp suất cao
3
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1. Một số kháng sinh thường được sử dụng ở Viột Nam trong
nuôi tôm 7
Bảng 2. Độ lặp của phép đo xác định NOR, CIP, LOM, ENR 36
Bảng 3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của các phương
pháp xác định FQs trong mẫu tôm sử dụng các loại cột chiết
khác nhau 37
Bảng 4. Kết quả khảo sát hiệu suất thu hổi của phương pháp phân
tích sử dụng cột MAX 38
Bảng 5. Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi của phương pháp phân
tích sử đụng cột MCX 38
Bảng 6 . Kết quả khảo sát hiệu suất thu hổi của phương pháp phân
tích sử dụng cột HLB 39
Bảng 7. Dư lượng FQs trong mẫu tôm tươi tại chợ Phùng Khoang 40
Bảng 8 . Dư lượng FQs trong mẫu tôm tươi tại chợ Phùng Thanh
Xuân 40
Bảng 9. Dư lượng FQs trong mảu tôm tươi tại chợ Hàng Bè 40
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, Đ ổ THỊ
* 7 •

Trang
Hình 1. Cấu trúc của các FQs nghiên cứu 10
Hình 2. Cấu trúc và cơ chế lưu giữ của cột MAX 13
Hình 3. Cấu trúc và cơ chế lưu giữ của cột MCX 14
Hình 4. Cấu trúc và cơ chế lưu giữ của cột HLB 14
Hình 5. Qui trình chiết tách các FQs từ mẫu tôm 18
Hình 6 . Các bước cơ bản trong qui trình sử dụng cột MAX 19
Hình 7. Các bước cơ bản trong qui trình sử dụng cột MCX 20
4
Hình 8 . Các bước cơ bản trong qui trình sử dụng cột HLB 21
Hình 9. Sự thay đổi diện tích tín hiệu theo tỉ lệ M e0H/H20 trong dung
môi rửa lần 3 23
Hình 10. Sự thay đổi diộn tích túi hiệu theo nồng độ axit fomic trong
dung môi rửa giải 24
Hình 11. Sự thay đổi chiểu cao tín hiệu theo tỉ lê MeOH/ H20 trong dung
môi rửa giải 25
Hình 12. Sự thay đổi sấc đổ khi thay đổi các điều kiện rửa và rửa giải cột
MAX 26
Hình 13 Sự thay đổi diện tích tín hiộu theo tỉ lệ MeOH/ H20 28
Hình 14. Sự thay đổi diện tích tín hiệu theo tỉ lệ NHj/MeOH trong đung
môi rửa giải 28
Hình 15. Sự thay đổi chiểu cao tín hiệu theo tỉ lộ M e0H /H20 trong dung
môi rửa giải 29
Hình 16 Sự thay đổi sắc dổ khi thay đổi thành phẩn hệ dung môi rửa giải
cột MCX 30
Hình 17. Sự thay đổi diộn tích tín hiệu theo tỉ lệ M e0H/H20 trong dung
môi rửa lẩn 2 31
Hình 18. Sự thay đổi chiều cao tín hiệu theo tỉ lệ MeOH /H20 trong đung
môi rủa giải 32
Hình 19. Sự thay đổi của sắc đổ khi thay đổi các bứớc rửa và rửa giải cột

HLB 33
Hình 20. Khoảng tuyến tính của NOR; G P; LOM; ENR 34
Hình 21. Đường chuẩn xác định NOR, CIP, LOM, ENR ưong khoảng
nổng độ 3,3-201ppb 35 .
Hình 22. Sắc đổ phân tích mẫu tôm tươi lấy tại chợ Phùng Khoang 40
Hình 23. Sắc đồ phân tích mảu tôm tươi lấy tại chợ Thanh Xuân 40
Hình 24. Sắc đổ phân tích mẫu tôm tươi lấy tại chợ Hàng Bè 41
5
MỞ ĐẨU
Nghề nuôi tôm Việt Nam thực sự phát triển từ sau năm 1987 và nuôi tôm
thương phẩm phát triển mạnh vào những năm đầu thập kỷ 90. Nuôi tôm đã trỏ thành
ngành kỉnh tế quan trọng, tạo công ăn việc làm, tăng thu nhập cho người dân và tạo
nguồn thu ngoại tệ đáng kể cho đất nước thông qua xuất khẩu. Diện tích nuôi tôm đã
tăng từ 250.000 ha (năm 2000) lên đến 478.000 ha (năm 2001) và 540.000 ha (nãm
2003) [1]. Sản lượng nuôi tôm cũng tăng mạnh, đặc biệt từ sau năm 2000, Việt Nam
trở thành một trong năm nước có sản lượng tôm nuôi cao nhất trên thế giới. Năm 2001
xuất khẩu thủy sản Việt Nam đạt 1,76 tỷ đô la, riêng xuất khẩu tôm đã thu về 780
triệu đô la. Sang các năm 2002, 2003 giá trị xuất khẩu tôm tiếp tục tăng và đến năm
2004, giá trị xuất khẩu tôm đã tăng gấp 1,6 lần so với năm 2001 [1,2].
Tuy nhiên, nghề nuôi tôm ở Việt Nam đang phải đối mặt với một thách thức
nghiêm trọng, đó là sự bùng nổ của các loại bệnh dịch làm ảnh hưởng nặng nề tới sản
lượng tôm. Để phòng bệnh cũng như trị bệnh, người ta phải sử dụng nhiẻu các loại
thuổc và hóa chất như oxytetracylin, sulfonamid, amoxicilin , trong đó có kháng sinh
nhóm floquinolon (FQs). Chính việc sử dụng kháng sinh trong môi trường thủy sản sẽ
làm ảnh hưởng đến chất lượng xuất khẩu của tôm và môi trường nuôi tôm. Làm cho
các vật nuôi và con người kháng lại thuốc khi sử dụng thực phẩm cố nhiễm thuổc, làm
vi khuẩn gây bệnh bị nhờn thuốc. Từ đó, dẫn đến giảm hiệu quả chữa trị của thuốc
kháng sinh. Kiểm soát dư lượng kháng sinh FQs là một yêu cầu nghiêm ngặt đối với
thuỷ sản xuất khẩu vì trong thời gian qua, thuỷ sản Việt nam như tôm và cá da trơn
xuất khẩu vào thị trường Hoa Kỳ và Nhật đã bị một số lần trả lại do phát hiện dư lượng

kháng sinh FQs.
Viộc xác định dư lượng kháng sinh trong tôm đang thu hút được sự chú ý của
dư luận cũng như của các nhà khoa học. Hiện nay chỉ có một phòng thí nghiệm của
Cục Vệ sinh và An toàn Thuỷ sản có chức năng kiểm soát dư lượng FQs trong cá, tôm
phục vụ xuất khẩu bằng phương pháp thử nhanh ELISA và đang xây dựng phương
pháp SPE/LC/MS/MS để phân tích kiểm chứng. Xuất phát từ các nhu cầu đó, chúng
tôi đề xuất đề tài nghiên cứu xây dựng qui trình phân tích dư lượng FQs trong mẫu
tôm bằng phương pháp chiết pha rắn kết hợp sắc ký lỏng hiệu năng cao dùng detectơ
huỳnh quang là thiết bị có mặt phổ biến trong các phòng thí nghiêm phân tích.
6
I. TỔNG QUAN:
1.1. Tình hình sử dụng kháng sinh trong nuôi tôm ở Việt Nam
Viêt Nam là nước nhiệt đói gió mùa, có khí hậu nóng ẩm nên nguy cơ chịu sự rủi
ro vì bộnh dịch trong nuôi trồng thuỷ sản là rất lớn. Chúng ta đã từng chịu thiột hại
nặng nề khi mất tới 161.000 tấn tôm vào năm 1991 do dịch bệnh. Và vào năm 1994
rất nhiều chủ nuôi tôm đã bị phá sản khi dịch bùng phát ở khắp các tỉnh phía nam trên
một diện tích gần 84.858 hecta dẫn tới thiệt hại khoảng 294 tỉ đồng (26.7 triệu đô la
mỹ). Để ngăn ngừa dịch bệnh, chữa bệnh cho tôm và dập dịch khi bùng phát, nhiều
loại hoá chất trong đó có các thuốc kháng sinh đã được sử dụng từ khi chuẩn bị ao
nuôi, tôm giống cho tói suốt quá trình nuôi tôm khi có dấu hiệu bệnh [1,4].
Các kháng sinh chủ yếu được trộn lẫn với thúc ăn của tôm để đưa vào ao nuôi.
Thường các chủ nuôi tôm ngừng sử dụng kháng sinh khi không cố dấu hiệu của bệnh.
Khi tôm có bệnh lại sử dụng nhiều loại kháng sinh với lượng lớn thường từ 0,5- 6 g/Kg
thức ăn/ một lần, ngày. Tuy nhiên rất nhiều người nuồi tôm không có đầy đủ thông tin
về thuốc kháng sinh mà họ sử dụng như cách thức, liều dùng, hiộu quả và ảnh hưởng
của thuốc. Họ thường học từ những người nuôi tôm khác hoặc từ người bán hàng. Một
vài người còn không nhớ nổi tên thuốc mình sử dụng [11, 13, 21]. Theo một nghiên
cứu mới đây của Lê Xuân Tuấn [13]. Ở Việt Nam nhìn chung sử dụng các kháng sinh
cho ở bảng dưới đây để chữa và ngăn ngừa bệnh cho tôm.
Bảng 1. Một số kháng sinh thường được sử dụng ở Việt Nam trong nuôi tôm [13J

STT
Tên thuốc
Thành phần thuốc Công dụng
1
Anti- Vibrio f/s
Sulfamethosazole
AmpiciUine
Trimethoprim
chữa và ngăn ngừa
bệnh đốm đen cho tôm
2
Biosultrim for shrimp
Ampicillin,
Furaltadone,
Sulfachlorpyridazine
Chữa các bộnh truyền
nhiễm gây nên bởi vi
khuẩn
3
Bioxde for shrimp/ biotech
for shrimp
Ampicilline,
Furaltadone,
Sulfachlorpyridazine
Ngăn chặn và chữa các
bệnh phân trắng, cháy
đuôi, khử trùng ao nuôi
7
4
Coli- Flumycin

Fumequin, Colistin,
Neomycin
Phòng và chữa các
bệnh do vi khuẩn cho
tôm
5
DAI- TRIM
Sulfphamethoxazole
10%, Trimethoprim
2%
Diệt khuẩn
6
Enro- c for shrimp
Enrofloxacin HCl,
Colistin sulfate
Chữa bộnh cháy đuôi
gây nên bỏi Vibriosis,
bệnh đốm đen, bệnh
đốm vàng, bộnh đường
ruột.
7
Egc- Mycine for shrimp
Enr ofloxacin,
Gentamycin sulfate,
Colistin sulfate
ngăn ngừa và trị bệnh
toàn thân
8
Enro- strep for shrimp
Enrofloxacin phòng và chữa bệnh

đốm đen, đốm nâu, và
bênh chết hoai
9
Norfloxacin 300 for shrimp
Norfloxacin
Hydrochloride 30%
ngăn và chữa bộnh
cháy đuôi, các bệnh
gây nên bải vi khuẩn
phẩy
1 0
Neotetracol- strep for
shrimp
Flumequine,
Neomecine sulfate
Phòng và chữa bệnh
cháy đuôi, bệnh trương
mang
1 1
Norfloxacin 300 for shrimp Norfloxacin,
Trimethoprim,
Sulfamethoxazole
Phòng, chữa bệnh lây
nhiễm gây nên bởi
vikhuẩn phẩy và bệnh
cháy đuôi
1 2
Oxolinic 30% for shrimp Oxolinic acid
Phòng và chữa bệnh
lây nhiễm gây nên bởi

vi khuẩn phẩy,
Pseudomonas ; bệnh
đốm đen, đốm nâu
Ngoài ra nhiều thức ăn cổng nghiệp nhập lậu vào Việt Nam có chứa các thuốc
kháng sinh như oxytetracyline, sulfadimethoxine, trimethoprim, sulfadiazine, vẫn
được sử dụng nhằm khích thích sự tăng trưởng của tôm mặc dù đã bị cấm. Nhìn
chung rất nhiều kháng sinh đã được sử dụng để phòng chống các bệnh cho tôm ở hầu
hết các trại nuôi tôm ở Việt Nam cũng như trên thế giới, Nhưng việc sử dụng kháng
sinh lại không đúng cách. Chính điều này đã dẫn tới hiộn tượng kháng thuốc và dư
lượng kháng sinh trong thuỷ sản.
8
1.2. Dư lượng kháng sinh trong thuỷ sản và tác hại
Dư lượng kháng sinh trong thực phẩm nói chung và trong thuỷ sản nói riêng đang
ngày càng thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học cũng như dư luận bởi tác hại của
nó tới con người và môi trường. Dư lượng kháng sinh có thể gây dị ứng, ngộ độc cho
con người khi ăn phải thực phẩm tồn dư kháng sinh. Nhưng điều đáng lo ngại hơn cả
là dư lượng kháng sinh có thể tạo ra các chủng vi khuẩn kháng thuốc. Nguy hiểm hơn
các chủng vi khuẩn này có thể truyền khả năng kháng thuốc của mình cho các chủng
vi khuẩn khác. Ví dụ như bất cứ kháng sinh nào dung chữa bênh cho người và động
vật nếu có tổn dư một lượng nhỏ cũng có thể gây kháng thuốc cho Ecoli. Khi Ecoli
kháng thuốc thì nó có thể truyền Plasmid kháng thuốc của nó cho các loại vi khuẩn
gây bệnh khác trong đường ruột [11]. Điẻu này gây khó khăn rất lớn cho công tác điẻu
trị bệnh nhiễm khuẩn và gây tổn thất lớn về kinh tế. Bên cạnh đó dư lượng kháng sinh
có thể gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến hệ miễn nhiễm, làm mất khả nãng kháng
khuẩn của cơ thể. Khi tích tụ lâu ngày có thể gây đột biến, rối loạn nội tiết và ung thư.
Chính vì lo ngại điều này các nước ngày càng kiểm soát chặt chẽ dư lượng kháng sinh
trong thực phẩm nói chung và trong thuỷ sản nói riêng.
Tính đến tháng 6/2007, trong 6.000 lô hàng thuỷ sản xuất khẩu của Việt Nam thì
có tới 92 lô bị phát hiện dư lượng kháng sinh cao bị trả về điểu này không chỉ gây tổn
thất lớn về mặt kinh tế mà còn có nguy cơ đánh mất các thị trường đầy tiểm nãng như

Mỹ, Nhật, EU, Nga và mục tiêu phát triển kim ngạch xuất khẩu ở mức 3,5- 4 tỉ đô la
sẽ trở thành vô vọng nếu như không khắc phục kịp thời.
1.3. Đổi tượng nghiên cứu - các kháng sinh floquinolon trong tom
Trước đây oxytetracyclin được sử dụng rộng rãi trong nhiều năm nhưng gần đây
nhóm kháng sinh FQs và sự kết hợp giữa sulfadiazine và trimethoprim được sử dụng
phổ biến hơn do có phổ kháng khuẩn rộng. Chúng được dùng để chống lại vi khuẩn
Gram (-). Vì vậy được dùng để trị các bệnh phát sáng, đốm đen, cháy đuôi, phân
trắng. Các kháng sinh nhóm quinolone được sử dụng rất phổ biến ở Thái Lan đặc biệt
là oxolinic axit, norfloxacin (NOR) và enrofloxacin (ENR). Khi phỏng vấn 100 người
sử dụng kháng sinh trong nuôi tôm ở Thái Lan thì có tới 46 người có sử dụng kháng
sinh FQs (46%) trong đó có 29 người sử dụng NOR (29%), 9 người sử dụng ENR
(9%) [1 1]. Họ thường dùng NOR và ENR để trị bệnh với liều lượng 0,5- 0,6 g/kg thức
9
ăn, 3 lần một ngày và kéo dài một tuần [3, 4]. ở Việt Nam kỹ thuật nuôi và chãm sóc
tồm cũng tương tự như Thái Lan vì vậy nhóm FQs cũng được sử dụng rất phổ biến.
Khi phân tích mẫu nước tại các đầm nuôi tôm tại Nam Định, Thái Bình, Cần Giờ, Cà
Mau thì có tổi hơn nửa số mảu tại các địa phương này chứa NOR với hàm lượng cao
(cao nhất là 2,605 M-g/g) [13]. Chính việc sử dụng phổ biến nhóm FQs đã dẫn đến tồn
tại dư lượng kháng sinh trong tôm. Điều này đã gây tổn thất lớn cho nước ta khi các lô
hàng xuất khẩu đều bị trả về do phát hiện có dư lượng kháng sinh FQs.
Năm 2005, 19/21 lô hàng xuất khẩu sang Mỹ bị phát hiện cố dư lượng kháng sinh
dẫn đến 3 bang của hoa kì cấm nhập khẩu thuỷ sản Viột Nam. Đến năm 2007 Nhật
Bản và Nga cũng phát hiện có dư lượng FQs trong tôm xuất khẩu của Việt Nam. Điều
này không chỉ gây thiệt hại lớn về kinh tế mà nguy hại hơn là mất thị trường ở các
nước này. Bên cạnh đố do lo ngại tác hại của dư lượng kháng sinh nên các nước EU,
Mỹ, Nhật Bản, Hàn Quốc đểu hạ thấp giới hạn cho phép của các kháng sinh này. Vì
vậy vấn đẻ phân tích dư lượng kháng sinh ngày càng trở nên cấp thiết nhất là đối với
ngành thuỷ sản của Viột Nam.Vì những lí do trên chúng tôi chọn đối tượng nghiên
cứu là xây dựng quy trình phân tích dư lượng kháng sinh FQs trong tôm.
Các FQs được lựa chọn để nghiên cứu là norfloxacin (NOR), cipprofloxacin (CIP),

lomefloxacin (LOM) và enrofloxacin (ENR).
Hình 1. Cấu trúc cùa các FQs nghiên cứu
10
1.4. Một số phương pháp xác định nhóm kháng sinh floquinolon trong mẫu thực
phẩm
Việc định tính và định lượng các floquinolon gặp nhiều khó khăn do các mẫu
thực phẩm nói chung và mẫu tôm nói riêng có nền mẫu phức tạp gồm protein, lipid,
carbohydrat, vitamin, các hợp chất phenol, axit hữu cơ, các chất hoá học sử dụng trong
nông nghiệp như thuốc trừ sâu, các loại kháng sinh ngoài ra giữa các FQs có sự
khác nhau rất ít về cấu trúc. Bên cạnh đó hiộn nay tiêu chuẩn trên thế giói có xu hướng
hạ thấp giới hạn cho phép của các FQs trong thực phẩm vì vậy để phân tích dư lượng
FQs yêu cầu phải tách làm sạch làm giàu và có một phép đo với độ nhạy cao.
Trước khi xử lí mẫu, người ta sử dụng một số phương pháp để tách các chất
cẩnphân tích khỏi nẻn mẫu rắn. Một sổ phương pháp thường được sử dụng là: phương
pháp chiết lỏng rắn thông thường bằng dung môi, phương pháp chiết Soxhlet, phương
pháp chiết siêu âm, phương pháp chiết lỏng dưới áp suất cao PLE (Pressurized Liquid
Extraction). Dịch chiết sau đó được làm sạch và làm giàu trước khi phân tích bằng các
phương pháp phân tích công cụ.
Dịch chiết từ mẫu thực phẩm thường được làm sạch qua các cột silicagel,
florisil, cột thẩm thấu qua gel hoặc các cột chiết pha rắn.
Dịch chiết sau khi làm sạch và làm giàu được phân tích bằng các phương pháp
sắc kí lỏng đêtectơ uv, FLD, MS/MS [7,9, 10, 14, 15, 16, 19, 20], điện di mao quản,
điên hoá [6,17,18,22]
1.5. Lựa chọn phương pháp xác định nhóm kháng sinh floquinolon trong mẩu
tôm
Floquinolon là những cấu tử không bền nhiột, do vậy không thể sử dụng
phương pháp chiết Soxhlet để xử lí mẫu. Nhóm nghiên cứu của chúng tôi trước đây đã
thực hiện quy trình chiết bằng phương pháp chiết lỏng dưới áp suất cao PLE, sau đó
làm sạch bằng chiết pha rắn và phân tích HPLC/FLD, tuy nhiên với phương pháp chiét
này nền dịch chiết sau khi qua bước chiết pha rắn vẫn quá bẩn, hạn chế bước nhận

dạng tín hiộu. Do vậy chúng tôi quyết định lựa chọn việc chiết chất cần phân tích từ
mảu đã đồng thể hoá bằng cách lắc với dung môi thích hợp sau đó li tâm gạn lấy dịch
trong.
11
Trong bước tiếp theo dịch chiết được làm sạch và làm giàu bằng phương pháp
chiết pha rắn [23]. Các hợp chất FQs có chứa cả nhóm COOH và NH2 trong phân tử
với pKa cỡ 5 - 9, do vậy tuỳ theo pH các hợp chất này có thể mang điện tích dương
hoặc điện tích âm do vậy có thể sử dụng các cột chiết trao đổi anion và cation để xử lí
dịch chiết. Mặt khác trong phân tử các FQs cũng có các cấu trúc vòng thơm do vậy
cũng có thể sử dụng các cột chiết theo cơ chế hấp phụ pha ngược. Sau khi tham khảo
tài liộu, chứng tôi quyết dịnh lựa chọn 3 loại cột chiết pha rắn để khảo sát là cột trao
đổi cation hỗn hợp (MCX), cột trao đổi anion hỗn hợp (MAX) và cột cân bằng ưa
nước - kỵ nước (HLB). Với từng loại cột chiết các bước rửa chất bẩn, rửa giải sẽ được
khảo sát tối ưu hoá.
Để phân tính định tính và định lượng các FQs, người ta thường sử dụng sắc kí
lỏng. Việc tách các FQs được thực hiện dễ dàng với cột tách pha ngược sử dụng nước
và Acetonitrìl làm pha động. Bên cạnh đó ta có thể sử dụng rất nhiéu loại đetectơ để
định lượng.
Bailac và các đồng nghiệp [7] đã công bố phương pháp xác định CIP, DAN, ENR,
FLO, SAR, DIF, oxolinic axit và FLU, sử dụng chiết pha rắn kết hợp LC-UV, kết quả
cho giới hạn phát hiện (LOD) là 16-30 Ug/Kg. Do các FQ có khả năng phát huỳnh
quang nên người ta thường sử dụng detecto FLD bởi vì nó nhạy hơn và chọn lọc hơn
ƯV. Ramos và các cộng sự [14] sử dụng LC-FLD xác định 5 FLQ (CIP,ENR, oxolinic
axit, FLU và SAR) trong thịt lợn và cá hồi LOD 5ug/Kg riêng SAR là 10 Ug/Kg. Sử
dụng LC-MS xác định FQ cho LOD tương đối thấp. Trong nghiên cứu của Hermo [9]
đã chỉ ra rằng LOD thấp hơn 10-30 lần khi sử dụng LC-UV và khi sử dụng LC-
MS/MS thì LOD thấp hơn 35 lần khi dùng LC-UV.
Trên cơ sở trang thiết bị và kinh nhiệm đã có, trong nghiên cứu này chúng tôi lựa
chọn phương pháp HPLC-FLD sửdụng cột tách Amit C16 đã được tác giả Eva Golet
phát triển làm phương pháp định lượng [8 ]

12
1.6. Giới thiệu chung về cấu tạo, cơ chế hoạt động của các cột chiết pha rắn được
sử dụng trong nghiẻn cứu
1.6.1. Cột MAX
Cột MAX là cột trao đổi anion hhỗn hợp với chất nhổi cột là silicagel đã được
ankyl hoá, cỡ hạt 60 um, cố pH hoạt động từ 1 tới 14, dung lượng trao đổi là
0,3meq/g. Cột MAX lưu giữ các chất theo cơ chế trao đổi anion và cơ chế hấp phụ
pha ngược. Theo những nghiên cứu trước đây chỉ ra cột MAX rất thích hợp cho viộc
phân tích các mẫu sinh học vì dung lượng hấp phụ lớn.
Hình 2. Cấu trúc và cơ chế lưu giữ của cột MAX
1.6.2. Cột MCX
Cột MCX là cột trao đổi anion hỗn hợp với chất nhồi cột là silicagel đã được
sulfonat hoá, cỡ hạt 60 um, có pH hoạt động từ 1 tới 14, dung lượng trao đổi là
lmeq/g. Cột MCX lưu giữ các chất theo cơ chế trao đổi canion và cơ chế hấp phụ pha
ngược.
13
1.6.3. Cột HLB
Cột HLB là một hệ hấp phụ pha ngược dựa trên sự cản bằng của chất ưa nước và
chất kị nước; vói chất nhồi cột là sản phẩm của quá trình trùng hợp m -divinybenzen
và N-viny-2-pyrolidon, cỡ cột là 80A°, cỡ hạt là 30^m; có thể sử đụng cột với những
mẫu pH nằm trong khoảng từ 1 đến 14. Cấu trúc và cơ chế lưu giữ của cột HLB được
trình bày theo hình 4.
Hình 4. Cấu trúc và cơ chểlưii giữ của cột HLB
14
II. MỤC TIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
2.1. Mục tiêu nghiên cứu
- Nghiên cứu tối ưu hoá quy trình phân tích dư lượng một số kháng sinh họ
floquinolon trong mẫu tôm trên cơ sở sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn để xử lý mẫu
và phân tích định tính, định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.
2.2. Phương pháp nghiên cứu

Mẫu tôm được đổng thể hoá. Cân một lượng nhất định cho vào cốc, thêm dung
môi chiết thích hợp, rung lắc để chiết FQs ra khỏi nền mẫu tôm, sau đó lỉ tâm gạn lấy
dịch trong. Làm sạch và làm giàu dịch chiết bằng kỹ thuật chiết phã rắn sử dụng các
loại cột chiết khác nhau: cột trao đổi cation hỗn hợp (MCX), cột trao đổi anion hỗn
hợp (MAX), cột HLB. Sau đó, FQ được phân tích định tính và định lượng bằng sắc ký
lỏng hiệu năng cao với detectơ huỳnh quang sư dụng phương pháp ngoại chuẩn. Với
mỗi cột chiết pha rắn các giai đoạn rửa chất bẩn, rửa giải được tối ưu hoá nhằm dem
lại hiệu quả chiết tốt nhất.
Các thông số như hiệu suất thu hổi, độ lặp ỉại, giới hạn phát hiện được xác định
để đánh giá phương pháp phân tích. Một số mẫu tôm tươi được lấy tại các chợ Hà Nội
và phân tích để minh hoạ khả nâng sử dụng của phương pháp.
15
ra. THỰC NGHIỆM:
3.1. Hoá chất, dụng cụ, thiết bị
- Chất chuẩn dạng bột: ciprofloxacin (Bio Fluka -17850), norfloxacin
(SIGMA:0-8757), lomefloxacin (SIGMA: L-2906), enrofloxacin (Fluka)
- Dung dịch axit photphoric 85%, axetonitril, amoniac 25%, axit clohydric 37%,
metanol tinh khiết (Merck, Darmstadt, Đức)
- Cột chiết pha rắn HLB 6 mL 150 mg, MAX 6 ml 150 mg, MCX 6 ml 150 mg
(Oasis, Mỹ)
- Giấy pH, giấy lọc kích thước 0,45^im, 0 ,2 |im
- Bình định mức 1, 2, 5, 50, 2000 ml, lọ đựng mẫu thể tích 1,5ml, micropipet 10,
100, 1000, 5000 ịú.
- Bộ chiết pha rắn Supelco, máy lắc Vortex (Bohemia, Mỹ), máy ly tâm Rotina
35R (Hettich, Đức).
- Cân phân tích độ chính xác 0,000 lg Mettler (Thuỵ sỹ)
- Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC -
LC10AB), sử dụng detectơ huỳnh quang (FLD) của hãng Shimadzu - Nhật Bản.
3.2. Điều kiện phán tích sắc ký lỏng hiệu năng cao:
Các điều kiện phân tích sắc kí lỏng hiệu năng cao được sử dụng như sau:

- Tiền cột: RP-Amit C16 (3,0 mm), cột: RP-Amit C16 (250 X 3,0 mm; 5ụm,
Supelco)
- Nhiệt độ lò: 50°c
- Áp suất tối thiểu: lObar; áp suất tối đa: 400bar
- Thể tích bơm mẫu: 200 ụl.
- Tốc độ dòng 0,7ml/phút.
- Detectơ huỳnh quang (FLD): Bước sóng kích thích (excitation): V! = 278nm
Bước sóng phát xạ (emission): v2= 445nm
- Pha động: sử đụng chế độ gradien dung môi với: Dung dịch H3PO4 25mM (A),
dung môi Axetonitril (B)
16
3.3. Thực nghiệm
3.3.1. Pha các dung dich chuẩn và dung dịch cần sử dụng
- Dung dịch axit photphoric 25mM: Lấy 3412 ụl dung dịch H3P 0 4 85%, pha
thành 2L dung dịch H3P 04 25mM trong nước deion
- Pha 100ml dung dịch hỗn hợp MeOH /H20 (1:1) + 0.2% HCl: Lấy 50ml
MeOH + 50ml H20 + 550ụl HC1 37%
- Pha lOOmỉ dung dịch hỗn hợp NH3/MeOHIH20 (5:15:85): Lấy 5ml NH3 +
15ml MeOH + 85ml nước deion
- Nước deion đ ể hoạt hóa cột (được điều chỉnh về giá trị pH = 3: Dùng axit
chlohydric để điều chỉnh nước deion về pH = 3
- Pha dung dịch chuẩn gốc - nồng độ 400ppm: Cân 0,02g từng chất chuẩn cho
vào bình định mức 50ml, dùng dung dịch MeOH / H20 (1:1) + 0,2% HC1 để
định mức được các dung dịch chuẩn gốc của từng đơn chất có nồng độ
400ppm. Dung dịch được đựng trong lọ nâu, bảo quản trong tủ lạnh và pha lại
hàng tháng
- Pha dung dịch hỗn hợp chuẩn để phân tích : Từ dung dịch chuẩn gốc của các
đơn chất có nồng độ 400ppm, pha loãng trong axit H3PO4 25mM được dãy
dung dịch hỗn hợp chuẩn có nồng độ từ lppm đến lOppm. Dung dịch sau khi
pha được lọc qua màng lọc, rồi cho vào lọ đựng mẫu, sau đó đem đi phân tích

trên thiết bị HPLC
3.3.2. Xây dựng, đánh giá phương pháp chiết pha rắn! kết hợp sắc ký lỏng hiệu
năng cao phân tích dư lượng FQs trong mẫu tôm
3.3.2.I. Chiết và tách các FQs ra khỏi mẫu tôm mẫu
Cân chính xác 5 g mẫu tôm cho vào cốc, thêm 30 ml dung môi chiết (dung môi
chiết là đêm photphat (pH= 7,4) nếu sử đụng cột HLB, cột MAX, dung môi chiết là
EtOH/axit axetic (99 :1) nếu sử dụng cột MCX). Quy trình chiết tách được chỉ ra
trong hình sau.
17
Hình 5: Qui trình chiết tách các FQs từ mẫu tôm
Mẫu được đồng hóa bằng dụng cụ chuyên dụng trong 5 phút, đem rung lắc
trong 30 phút trên máy lắc tự động, sau đó li tâm trong vòng 10 phút với tốc độ 4000
vòng/ phút. Gạn lấy lớp dịch trong phía trên vào bình tam giác. Sau đó lấy 10 ml dịch
chiết thu được cho qua cột chiết để loại tạp chất và làm giàu.
3.3.2.2. Nghiên cứu các qui trình xử lí mẫu bằng kỹ thuật chiết pha rắn
Các FQs sau khi được chiết ra khỏi mẫu tôm có hàm lượng nhỏ và dịch chiết có
chứa rất nhiều chất gây ảnh hưởng vì vậy cần phải được làm sạch và làm giàu bằng kỹ
thuật chiết pha rắn sử dụng các loại cột chiết khác nhau. Hãng Water- Oasis Mỹ,
hãng sản xuất các cột chiết pha rắn đã có nghiên cứu về FQs và đưa ra các quy trình
cơ bản sử dụng cột MAX và MCX để xử lí các mẫu dịch chiết từ thận bò [12,24]. Trên
cơ sở các bước cơ bản này, chúng tôi đã khảo sát lại từng bước rửa chất bẩn và rửa giải
để sử dụng cho dịch chiết mẫu tôm.
18
* Cột MAX:
Hình 6 : Các bước cơ bản trong qui trình sử dụng cột MAX
Trên cơ sở các bước bản mà hãng Water-Oasis đưa ra trong hình 6 , sau bước
rửa lần 1 bằng NH3 5% và bước rửa lần 2 bằng MeOH, chúng tôi đưa thêm một bước
rửa lần 3 bằng hỗn hợp M e0H/H20 (chứa 4% axit focmic) để loại bỏ các chất ảnh
hưởng có độ phân cực lớn hơn độ phân cực của FQs. Phần trăm MeOH trong hỗn hợp
thay đổi từ 10 tới 80%. Sau khi thêm bước rửa lần 3, chúng tôi tiếp tục khảo sát dung

môi rửa giải M e0H /H20 (chứa axit focmic). Nồng độ axit focmic thay đổi từ 2 tới
10%, MeOH thay đổi từ 100 tới 60%.
19
Đối với quy trình sử dụng cột MCX, sau bước rửa lần 1 bằng dung dịch
EtOH/Act (99:1) và lần 2 bằng MeOH 100%, chúng tổi đưa thêm một bước rửa lần 3
bằng hỗn hợp N H ^ e O H / H20 (tỷ lệ dung dịch NH3 theo thể tích cố định là 10%),
phần trăm MeOH theo thể tích thay đổi từ 5 tới 75%. Sau khi tìm được tỷ lệ thích hợp
cho bước rửa lần 3, chúng tôi tiếp tục khảo sát dung môi rửa giải là hỗn hợp
NHj/MeOH/ HzO trong đó % NH3 thay đổi từ 3 tới 13 %, MeOH thay đổi từ 60 tới
90%.
* Cột MCX ĩ
Nạp mẫu đã được xử lí
vào cột đã hoạt hoá
1r
Rửa lần 1: dung dịch
* EtOH/ACt (99/1)
1
r
Rửa lần 2: 100%
MeOH
\
Rửa giải bằng NH-Ị
trong MeOH
Chít phân tích tổn tại ở
dạng cation và trung hoà
Hình 7. Các bước cơ bản trong qui trình sử dụng cột MCX
* Cột HLB :
Hãng Water-Oasis không đưa ra quy trình cơ bản để sử dụng cột HLB cho FQs.
Tuy nhiên trong những nghiên cứu trước đây của chúng tôi về phân tích FQs trong
nước và bùn, cột HLB thường được sử dụng cho bước chiết pha rắn với ưu điểm có

dung tích hấp thu cao, giá thành thấp hơn so với cột trao đổi cation nên trong nghiên
cứu này chúng tôi cũng khảo sát việc sử dụng cột HLB trên cơ sở quy trình xử lí cơ
bản đối với mẫu dịch chiết của nước thải và bùn trước đây. Đối với quy trình này, sau
bước rủa lần 1 bằng NH3 5%, chúng tôi đưa thêm một bước rửa lần 2 bằng hỗn hợp
NHj/MeOH/ H20 (tỷ lệ dung dịch NH3 theo thể tích cố định là 10%), % MeOH theo
thể tích thay đổi từ 10 tới 70% để khảo sát việc rửa các chất ảnh hưởng có độ phân cực
20