Hợp tác nghiên cứu xây dựng qui trình tạo khối sâm Ngọc Linh làm nguyên liệu sản xuất chế phẩm phục vụ sức khoẻ cộng đồng

BỘ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ
HỌC VIỆN QUÂN Y



BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU


HỢP TÁC NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH
TẠO KHỐI TẾ BÀO SÂM NGỌC LINH LÀM
NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PHỤC VỤ
SỨC KHỎE CỘNG ĐỒNG



CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI




PGS,TS. Nguyễn Văn Minh
HỌC VIỆN QUÂN Y




Đại tá, GS.TS. Hoàng Văn Lương

HÀ NỘI - 2009
CÁC CÁ NHÂN VÀ ĐƠN VỊ THAM GIA NGHIÊN CỨU

I. CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI:

PGS.TS. Nguyễn Văn Minh

II. CỘNG TÁC VIÊN CHÍNH:

1. GS.TS Sang Yo Byun
2. GS.TS Lê Bách Quang
3. GS.TS Hoàng Văn Lương
4. PGS.TS Nguyễn Tùng Linh
5. TS Lê Văn Đông
6. TS Nguyễn Văn Long
7. TS Vũ Bình Dương
8. BS Nguyễn Hoàng Ngân.
9. ThS Đào Văn Đôn.
10. DS Chử Văn Mến
11. ThS Nguyễn Trọng Điệp.
12. DS Nguyễn Văn Thư
13. ThS Nguyễn Văn Dự
14. ThS Chu Đức Thành

III. CÁC ĐƠN VỊ PHỐI HỢP NGHIÊN CỨU:

1. Trường Đại học Ajou – Hàn Quốc

2. Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương
3. Viện Dược liệu
4. Trung tâm NCƯD Sinh – Y – Dược học – HVQY.
5. Trung tâm Đào tạo, nghiên cứu Dược – HVQY.
6. Bộ môn khoa Giải phẫu bệnh lý – Bệnh viên 103 – HVQY
MỤC LỤC

Trang
MỤC LỤC
CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3
1.1. CÔNG NGHỆ SINH KHỐI TẾ BÀO THỰC VẬT 3
1.1.1. Khái niệm 3
1.1.2. Ưu và nhược điểm của công nghệ sinh khối tế bào thực vật 4
1.1.3. Qui trình lý thuyết tạo sinh khối tế bào thực vật 4
1.1.4. Yế
u tố ảnh hưởng tới sự phát triển tế bào, hàm lượng hoạt chất 5
1.1.5. Thành tựu của công nghệ sinh khối tế bào 13
1.1.6. Tình hình ứng dụng công nghệ sinh khối tế bào thực vật cho các loài
sâm
16
1.2. SÂM NGỌC LINH 17
1.2.1. Đặc điểm thực vật 17
1.2.2. Thành phần hóa học 18
1.2.3. Tác dụng dược lý 19
1.2.4. Nuôi trồng 20
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠ

NG PHÁP
NGHIÊN CỨU
22
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 22
2.1.1. Nguyên liệu 22
2.1.2. Hóa chất 22
2.1.3. Các thiết bị nghiên cứu 22
2.1.4. Động vật thí nghiệm 24
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24
2.2.1. Phương pháp tạo sinh khối tế bào rễ sâm Ngọc Linh 24
2.2.2. Phương pháp kiểm nghiệm, xây dựng tiêu chuẩn cơ sở 32
2.2.3. Phương pháp đánh giá tính an toàn và tác dụng sinh học 41
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 66
3.1. XÂY DỰNG QUI TRÌNH TẠO KHỐI TẾ BÀO SÂM NGỌC LINH 66
3.1.1. Nuôi cấy tạo callus 66
3.1.2. Phương pháp duy trì nuôi cấy callus trên môi trường thạch 69
3.1.3. Kết quả nuôi cấy trong môi trường lỏng 73
3.1.4. Kết quả tối ưu hóa môi trường nuôi cấy 78
3.1.5. Kết quả lựa chọn chất làm tăng hoạt chất (elicitor) 83
3.1.6. Nuôi cấy trên hệ thống bioreacotor 87
3.1.7. Kết xây dựng qui trình thu hoạch sâm Ngọc Linh sinh khối 88
3.1.8. Kết quả nghiên cứu bào chế
cao đặc (5 :1) từ sâm Ngọc Linh sinh khối 92
3.2. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VÀ TIÊU CHUẨN
CƠ SỞ
94
3.2.1. Kết quả kiểm tra hàm lượng chất tồn dư 1-NAA 94
3.2.2. Kết quả xác định thành phần hoạt chất chính của sâm Ngọc Linh sinh
khối
96

3.2.3. Kết quả xây dựng tiêu chuẩn cơ sở 101
3.3. TÍNH AN TOÀN VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG CỦA SÂM NGỌC LINH
SINH KHỐI
122
3.3.1. Kết quả đánh giá tính an toàn của sâm Ngọ
c Linh sinh khối 122
3.3.2. Một số tác dụng dược lý của sâm Ngọc Linh sinh khối 137
KẾT LUẬN 166
KIẾN NGHỊ 169
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC







CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG ĐỀ TÀI







BC Bạch cầu
CNT Chuột nhắt trắng
CCT Chuột cống trắng
DĐVN Dược điển Việt Nam

Hb Hemoglobin
HC Hồng cầu
HST Huyết sắc tố
HVQY Học viện Quân y
LD
50
Liều chết 50% động vật thí nghiệm
NMSL Nước muối sinh lý
MDA Acid Malonyl Dialdehyd
POL Peroxid hóa lipid
SD Độ lệch chuẩn (standard deviation)
SLVK Số lượng vi khuẩn
SK Sinh khối
SKTB SKTB
SGOT Serum glutamo-oxalo transaminase
SGPT Serum glutamo-pyruvic transaminase
SNL Sâm Ngọc Linh
TLCT Trọng lượng cơ thể
TKTW Thần kinh trung ương
TCCS Tiêu chuẩn cơ sở
TC Tiểu cầu
VK Vi khuẩn

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng Tên bảng Trang
2.1 Ký hiệu và mức của biến đầu vào. 29
2.2 Ký hiệu và mức yêu cầu của biến đầu ra 30
2.3 Chương trình pha động 36
2.4 Sơ đồ chuẩn bị các giếng đo xác định hoạt độ SOD 57

2.5 Sơ đồ phản ứng xác định GPx 59
2.6 Sơ đồ phản ứng xác định TAS 61
3.1 Kết quả tạo thành callus sau 35 ngày nuôi cấy 66
3.2 Khối lượng callus trong các môi trường khác nhau 67
3.3 Tốc độ tăng trưởng callus sâm theo thời gian 67
3.4 Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng đến sự hình thành
callus
68
3.5 Đặc tính tế bào sau các lần cấy chuyển 69
3.6 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến tốc độ phát triển tế bào 71
3.7 Ảnh hưởng của pH môi trường tới sự sinh trưởng tế bào sâm 72
3.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ phòng nuôi cấy đến tốc độ phát triển tế
bào
73
3.9 Tốc độ phát triển tế bào sâm Ngọc Linh trên môi trường lỏng 74
3.10 Tốc độ phát triển tế bào sau các lần cấy chuyển 75
3.11 Ảnh hưởng của pH môi trường 76
3.12 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy 77
3.13 Ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng 77
3.14 Kết quả nuôi cấy tế bào sâm theo thiết kế phần mềm 79
3.15 Ảnh hưởng của biến đầu vào với biến đầu ra 80
3.16 Kết quả nuôi cấy tế bào SNL trên môi trường tối ưu 83
3.17 Kết quả lựa chọn loại elicitor 84
3.18 Kết quả lựa chọn nồng độ acid jasmonic 85
3.19 Thời điểm tiếp xúc với elicitor 86
3.20 Kết quả lựa chọn thời gian tiếp xúc của elicitor với tế bào 86
3.21 Kết quả nuôi cấy trên hệ thống Bioreactor 5lit 87
3.22 Kết quả nuôi cấy trên hệ thống Bioreactor 15 lit 88
3.23 Hàm lượng 1-NAA tồn dư và hoạt chất trong SNL sinh khối. 89
3.24 Hàm lượng 1-NAA tồn dư và hoạt chất trong SNL sinh khối 89

3.25 Kết quả phân tích chất tồn dư 1-NAA và hoạt chất trong các
mẻ nuôi cấy SNL sinh khối
91
3.26 Mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ 1-NAA 94
3.27 Nồng độ 1-NAA trong mẫu SNL sinh khối. 95
3.28 Hàm lượng saponin toàn phần trong sinh khối sâm 98
3.29 Sự phụ thuộc của diện tích píc và nồng độ các ginsenosid 99
3.30 Hàm lượng Rb1, Rg1 và Rd trong mẫu sâm sinh khối 100
3.31 Hàm lượng saponin toàn phần trong SNL tự nhiên 103
3.32 Hàm lượng Rb1, Rg1 và Rd trong mẫu sâm sinh khối 104
3.33 Chương trình pha động định lượng Ginsenosid Rg1, Rb1 và Rd 107
3.34 Kết quả xác định độ ẩm trong SNL sinh khối 110
3.35 Kết quả xác định tro toàn phần có trong SNL sinh khối 110
3.36 Chương trình pha động định lượng các ginsenosid 113
3.37 Hàm lượng Rb1, Rg1 và Rd trong mẫu sâm sinh khối 116
3.38 Kết quả đo độ nhiễm khuẩn của cao đặc sâm SNL sinh khối 117
3.39 Chương trình pha động định lượng các ginsenosid trong cao
đặc SNL sinh khối
120
3.40 Độc tính cấp SNL sinh khối theo đường uống 122
3.41 Ảnh hưởng của SNL sinh khối đối với TLCT thỏ 123
3.42 Điện tim của thỏ ở đạo trình DII (n = 8) 124
3.43 Ảnh hưởng của SNL sinh khối đối với số lượng HC thỏ. 125
3.44 Ảnh hưởng SNL sinh khối đối với HST thỏ 126
3.45 Ảnh hưởng của SNL sinh khối đối với số lượng BC thỏ 127
3.46 Ảnh hưởng của SNL sinh khối đối với số lượng TC thỏ 128
3.47 Ảnh hưởng của SNL sinh khối đối với hoạt độ SGOT của thỏ 129
3.48 nh hng ca SNL sinh khi i vi hot SGPT ca th 130
3.49 nh hng ca SNL sinh khi i vi creatinin mỏu th 131
3.50 nh hng ca SNL sinh khi i vi ure mỏu th 132

3.51 Kt qu nghiờn cu v mụ bnh hc ca gan th 133
3.52
Kết quả nghiên cứu về mô bệnh học của thận thỏ
134
3.53
Kết quả nghiên cứu về mô bệnh học của lách thỏ
134
3.54 Thi gian bi ca chut thớ nghim 137
3.55 Thi gian bỏm rotarod ca chut sau 60 phỳt th thuc 138
3.56 Thi gian bỏm rotarod ca chut sau 2 tun th thuc 139
3.57 Sc c chõn chut cỏc lụ nghiờn cu 140
3.58 nh hng ca SNL sinh khi n trng lng chut 140
3.59 Tc hỡnh thnh phn x cú iu kin tỡm thc n trong mờ l
ca cỏc lụ chut nghiờn cu (n = 8)
142
3.60 Tc dp tt phn x cú iu kin tỡm thc n trong mờ l ca
chut nht trng cỏc lụ nghiờn cu (n=8)
142
3.61 Tỏc dng ca trờn kh nng hc tp, nhn thc chut nht
trng
143
3.62 Tỏc dng trờn kh nng ghi nh chut nht trng 144
3.63 ỏp ng ca chut vi mụi trng l 145
3.64 Tỏc dng ca SNL sinh khi trờn năng lực thần kinh 145
3.65 Nng MDA cỏc mu gan chut nghiờn cu. 147
3.66 Nng GSH cỏc lụ chut nghiờn cu 148
3.67 nh hng ca SNL sinh khi liu 1,2g/kg n nng MDA 149
3.68 nh hng ca sinh khi sõm liu 1,2g/kg n nng GSH 150
3.69 Nng GSH /mỏu cỏc lụ chut nghiờn cu 151
3.70 Hot SOD trong mỏu cỏc lụ nghiờn cu 152

3.71 Hot GPx trong mỏu chut gõy c bng CCl4 153
3.72 Trng thỏi chng oxy húa ton phn (TAS) ca huyt tng 154
3.73 Hot SGOT v SGPT cỏc lụ nghiờn cu. 156
3.74 Trng lng gan cỏc lụ nghiờn cu. 156
3.75 T l % tng th tớch bn chõn chut sau gõy viờm 160
3.76 T l % c ch (I%) phự viờm cp bn chõn chut sau gõy
viờm
161
3.77
Khối lợng u hạt ở các lô nghiên cứu
162
3.78 Ngng au bn chõn chut b gõy viờm cp 163




DANH MC CC HèNH

Hỡnh Tờn hỡnh Trang
1.1 Qui trỡnh to sinh khi t bo thc vt 6
1.2 ng cong phỏt trin ca t bo thc vt 12
1.3 Sõm Ngc Linh (Panax vietnamenesis) 17
1.4 Cu trỳc húa hc cỏc saponin chớnh trong sõm Ngc Linh 19
2.1 Thit b Rota-Rod Cat. No. 47600, Ugo Basile 43
2.2
Grip strength meter, Cat. No. 47106, Ugo Basile
44
2.3
Chuồng mê lộ (classic maze)
46

2.4
Mê cung nớc (Morris water maze)
47
2.5
Bảng đục lỗ Hole Board Cat. No. 6650, Ugo Basile
48
2.6
Máy đo phản xạ tự động có điều kiện Automatic Reflex
Conditioner. Cat. No. 7530, Ugo Basile
49
2.7 Hỡnh 2.7. Plethysmometer Cat. No.7140, Ugo Basile 63
2.8 Paw Pressure Analgesy Meter Cat. No. 37215 , Ugo Basile 65
3.1 R v callus sõm Ngc Linh 66
3.2 Callus SNL sau cỏc ln cy chuyn trờn mụi trng thch 70
3.3
T boSNL trờn mụi trng thch (A); trong mụi trng lng (B)
74
3.4 Sc ký mu trng (a), mu th 5 ng/ml (b). 96
3.5 Sc ký ca mu SNL t nhiờn (a) v SNL sinh khi (b) 97
3.6
Sc ký HPLC ca cỏc ginsenosid chun (a) v SNL sinh khi (b)
97
3.7 Hỡnh nh vi phu r SNL t nhiờn 101
3.8 Hình ảnh soi bột rễ SNL tự nhiên 101
3.9
Sắc ký đồ chuẩn (a) và SNL tự nhiên (HPLC-b), sắc ký lớp
mỏng (c)
102
3.10
Sắc ký đồ của mẫu SNL tự nhiên (b) và cao đặc SNL sinh khối (a)

115
3.11
Sắc ký đồ HPLC của ginsenosid chuẩn (a) và cao đặc SNL sinh khối
(b)
116
3.12 Hình ảnh gan thỏ thực nghiệm (HE, 100X) 135
3.13 Hình ảnh mô bệnh học thận thỏ thực nghiệm (HE, 100X) 135
3.14 Hình ảnh lách thỏ thực nghiệm (HE, 100X) 135
3.15 H×nh ¶nh đại thể cña gan ë c¸c l« chuét nghiªn cøu 157
3.16 Hình ảnh mô bệnh học gan chuột nghiên cứu (HE, 100X) 158


DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ Tên biểu đồ Trang
3.1
Ảnh hưởng của các yếu tố đầu vào đến tốc độ phát triển của
tế bào
80
3.2
Ảnh hưởng của các yếu tố đầu vào đến lượng saponin trong tế
bào
81
3.3
Sự thay đổi hàm lượng 1-NAA và hoạt chất ginsenosid qua các lần
rửa
89
3.4 Tương quan nồng độ 1-NAA và diện tích píc 95
3.5 Sự phụ thuộc của diện tích píc vào nồng độ Rg1, Rb1 và Rd 99

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ Tên sơ đồ Trang
3.1 Sơ đồ quy trình thu hoạch SNL sinh khối 90
3.2 Quy trình chiết xuất siêu âm cao SNL sinh khối 92
3.3 Sơ đồ xử lý dịch chiết và hoàn thiện cao SNL sinh khối 93


1
ĐẶT VẤN ĐỀ

Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv) là dược liệu đặc hữu
thuộc họ nhân sâm (Araliaceae), bộ Hoa tán, được phát hiện đầu tiên vào năm
1973 tại núi Ngọc Linh, hiện nay được đưa vào Sách đỏ Việt Nam. Sâm Ngọc
Linh chỉ mọc ở độ cao trên 1.500 mét, chủ yếu mọc tập trung ở vùng núi
Ngọc Linh thuộc hai huyện Đắc Tô, tỉnh Kon Tum và huyện Trà My, tỉnh
Quảng Nam.
Trải qua nhiều năm ph
ối hợp nghiên cứu cả ở trong nước và ngoài nước,
Sâm Ngọc Linh đã được xác định tương đối toàn diện về thành phần hoá học
và dược học. Theo Nguyễn Minh Đức và cộng sự, Sâm Ngọc Linh có 52 hoạt
chất saponin được, trong đó có 26 loại saponin mới không có ở các loài sâm
khác cùng chi. Sâm Ngọc Linh có nhiều tác dụng dược lý: tác dụng bổ dưỡng,
tăng lực, cải thiện trí nhớ, cải thiện năng lực tâm thần kinh, t
ăng cường hưng
phấn vỏ đại não, cải thiện tính linh hoạt của hoạt động thần kinh, kích thích
miễn dịch, chống stress và chống trầm cảm, chống stress oxy hóa và lão hóa,
bảo vệ gan, tác dụng chống viêm, điều hòa huyết áp, hạ lipid máu, dự phòng
xơ vữa động mạch, thu nhỏ ổ loét dạ dày tá tràng, tăng cường chức năng sinh

dục,
Sâm Ngọc Linh là cây thuốc có giá trị, nên đã bị khai thác kiệt quệ
. Kết
quả các đợt điều tra của Viện Dược liệu ở vùng núi Ngọc Linh, thuộc tỉnh
Quảng Nam và Kon Tum, trong những năm gần đây không phát hiện lại được
mẫu sâm nào. Thực tế này có thể khẳng định, Sâm Ngọc Linh về cơ bản đã bị
cạn kiệt trong tự nhiên. Chúng chỉ còn lại trong các vườn bảo tồn, vườn giống
hoặc mới được trồng thêm tạ
i chỗ ở vùng núi Ngọc Linh. Các dự án bảo tồn
và phát triển cây Sâm Ngọc Linh đã được triển khai thực hiện ở các tỉnh
Kontum, Quảng Nam. Tuy nhiên, công tác bảo tồn, lưu giữ phát triển nguồn
gen Sâm Ngọc Linh gặp rất khó khăn. Do không đủ đáp ứng nhu cầu cung cấp
nguyên liệu, một số Xí nghiệp Dược phẩm phải ngừng sản xuất 3 chế phẩm từ
Sâm Ngọc Linh là tinh sâm nước, tinh sâm viên, viên ngậm.
Trên thế giới, công nghệ sinh khối tế bào thực vật đã được ứng dụng rộng
dãi, tạo ra những sản phẩm có giá trị cao, ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: dược
phẩm, sản phẩm chức năng, chất phụ gia thực phẩm, nông nghiệp, lâm
nghiệp, vừa tạo ra nguyên liệu vừa giúp phát triển và bảo tồn nguồn gen quí
hiếm. Chính vì vậy, sinh khối tế bào thực vật
đang ngày càng được quan tâm,

2
đầu tư phát triển. Đặc biệt, công nghệ này đã được sử dụng tạo khối tế bào
nhân sâm Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc để bào chế các sản phẩm bổ
duưng, phòng chống các bệnh tim mạch, chống gốc tự do, tăng cường chức
năng hệ thần kinh trung ương, các loại mỹ phẩm, Hàn Quốc có khoảng trên
70 sản phẩm về nhân sâm bán trên thị trường, trong số đó, r
ất nhiều là sản
phẩm của sinh khối tế bào nhân sâm.
Đứng trước tình hình trên, bên cạnh việc đầu tư tổ chức quy hoạch, trồng

và bảo tồn Sâm Ngọc Linh, một vấn đề cấp thiết đặt ra, cần phải phát triển
công nghệ sinh khối tế bào Sâm Ngọc Linh tạo nguồn hoạt chất ổn định, đáp
ứng nhu cầu làm thuốc, mỹ phẩm, Đây là một hướng đi c
ấp bách và phù hợp
với xu hướng phát triển công nghệ sinh khối tế bào thực vật của nhiều nước
trên thế giới để sản xuất hoạt chất nguồn gốc thực vật.
Trung tâm nghiên cứu ứng dụng Sinh - Y - Dược học, Học viện Quân y
đang hợp tác với Trung tâm Nghiên cứu Tài nguyên Sinh học, Trường Đại
học Tổng hợp Ajou, Hàn Quốc đang triển khai nghiên cứu công nghệ sinh
khối tế bào Sâm Ng
ọc Linh. Trong quá trình tiến hành đề tài này, việc đánh
giá tác dụng dược lý của Sâm Ngọc Linh sinh khối có so sánh với Sâm Ngọc
Linh tự nhiên là nhiệm vụ quan trọng.
Mục tiêu:
1. Xây dựng quy trình công nghệ sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh
quy mô phòng thí nghiệm.
2. Nghiên cứu phương pháp kiểm nghiệm, tiêu chuẩn cơ sở của sâm
Ngọc Linh sinh khối và cao đặc sâm Ngọc Linh sinh khối.
3. Đánh giá tính an toàn, một số tác dụng dược lý của sâm Ngọc
Linh sinh khố
i.

3
Ch−¬ng 1. TỔNG QUAN
1.1. CÔNG NGHỆ SINH KHỐI TẾ BÀO THỰC VẬT
1.1.1. Khái niệm
Sinh khối tế bào (SKTB) thực vật là kỹ thuật nuôi cấy, duy trì, tạo khối
lượng lớn tế bào thực vật trong môi trường dinh dưỡng phù hợp và điều kiện
nuôi cấy vô khuẩn mà không thâm canh gieo trồng. Các tế bào khi nuôi cấy
vẫn giữ nguyên được các đặc tính vốn có ban đầu, đặc biệt là các hoạt chất

hay các chất chuyển hóa thứ
cấp sinh ra từ các tế bào gần như được giữ
nguyên. Nghiên cứu đầu tiên về công nghệ SKTB thực vật được thực hiện
vào những năm 20 của thế kỷ XX khi các nhà khoa học đã thành công trong
việc nhân giống vô tính cây Lan (orchid). Tuy nhiên, chỉ tới năm 1962 hai
nhà khoa học Murashige và Skoog tìm ra môi trường thích hợp cho nuôi cấy
thì công nghệ sinh khối mới thật sự mang lại ý nghĩa kinh tế [67]. Từ năm
1990 đến nay đã có nhiều sản ph
ẩm nghiên cứu thành công đã áp dụng rộng
rãi trong sản xuất các sản phẩm phục vụ ngành công nghiêp dược phẩm và
thực phẩm như: sản xuất paclitaxel - taxol từ tế bào cây thủy tùng (Taxus sp),
sản xuất chất kháng khuẩn Shikonin từ rễ cây Lithospermum erythrorhizon,
sản xuất chất làm thơm Vani từ nuôi cấy tế bào cây Vanilla planifolia và rất
nhiều các công trình nghiên cứu khác đang được nghiên cứu sản xuất quy mô
công nghiệp [67].
Lý thuyết c
ủa công nghệ sinh khối dựa trên cơ sở tính toàn năng
(totipotent) và tính biệt hóa của một số tế bào thực vật. Các tế bào này khi
được đưa vào môi trường dinh dưỡng và điều kiện thích hợp, chúng có thể
phát triển thành một một cơ quan, một cây hoàn chỉnh hoặc một khối lượng
lớn dòng tế bào đó. Dựa trên cơ sở đó, công nghệ nuôi cấy mô thực vật có thể
tạo ra cây từ đỉ
nh sinh trưởng được tách ra, cây sau đó nhân nhanh tạo ra
nhiều mầm cây con, từ đó có thế kích thích tạo rễ và phát triển thành cây hoàn
chỉnh. Người ta nuôi cấy tạo mô sẹo (callus) từ một mô bất kì của cây, sau đó
biệt hóa thành mô sinh trưởng, tạo trồi, tạo rễ và cuối cùng cũng phát triển
thành một cây mới hoàn chỉnh [36],[ 51].
Khác với nuôi cấy mô, công nghệ SKTB thực vật không nuôi cấy tạo ra
cây hoàn chỉnh mà chỉ nuôi vô tính các dòng tế bào để tạo khối l
ượng lớn sản

phẩm có thể sự dụng cho chiết tách các hoạt chất. Quá trình này cũng bắt đầu
từ việc tạo ra callus từ những tế bào, mô khác nhau của thực vật, sau đó chúng
được làm giảm hoặc mất tính biệt hóa [
36] và được thuần hóa trên môi trường

4
dinh dưỡng nhất định, cuối cùng là tăng khối lượng trên hệ thống các bình
nuôi cấy lớn (các Bioreactor). Trong qúa trình đó đặc tính của tế bào được giữ
nguyên như ban đầu, các quá trình sinh học của tế bào vẫn xảy ra như đối với
tế bào khi còn tồn tại trong cây tự nhiên. Trong đó có việc tổng hợp và tích
lũy hoạt chất [41].
1.1.2. Ưu và nhược điểm của công nghệ SKTB thực vật
1.1.2.1.
Ưu điểm
So với nuôi trồng tự nhiên, công nghệ SKTB thực vật có những ưu
điểm vượt trội sau:
- Công nghệ SKTB thực vật không chịu tác động của các yếu tố tự
nhiên như địa lý, khí hậu, thổ nhưỡng, bệnh dịch, thiên tai…do toàn bộ qui
trình sinh khối được tiến hành trong phòng thí nghiệm, nhà máy. Điều này
giúp khắc phục được ảnh hưởng bất lợi của điều ki
ện tự nhiên tới năng suất
và chất lượng sản phẩm. Ngoài ra, còn loại bỏ được yếu tố thời vụ như khi
gieo trồng nên giúp chủ động được nguồn nguyên liệu phục vụ sản xuất.
- Thời gian sản xuất nguyên liệu theo công nghệ SKTB rút ngắn hơn
nhiều so với gieo trồng tự nhiên. Giai đoạn nghiên cứu từ khi tiến hành tạo
callus (giai đoạn đầu tiên của quy trình)
đến việc nuôi cấy trên môi trường lỏng
phải mất khá nhiều thời gian. Tuy nhiên sau khi đã lựa chọn được điệu kiện,
môi trường nuôi cấy thì thời gian cho sản xuất 1 mẻ sinh khối thường khoảng
từ 15 – 50 ngày. Như vậy nó đã rút ngắn rất nhiều về thời gian so với trồng cây

ngoài tự nhiên nên chủ động được nguồn nguyên liệu phục vụ sản xuất. Theo
Guilk và cs (2006) [
45] trong nghiên cứu xây dựng quy trình sinh khối dừa cạn
(Catharanthus roseus) sản xuất alkaloid nhân Indole thời gian cho 1 mẻ nuôi
cấy sản phẩm là 20 ngày. Trong khi sản xuất sinh khối sâm Hàn Quốc (Panax
ginseng C.Mayer.) theo Wu JY và cs (1999) [
78] cần thời gian thích hợp cho 1
chu kỳ nuôi cấy trên môi trường lỏng là 14 – 15 ngày.
- Chất lượng của sản phẩm sản xuất theo công nghệ SKTB thực vật rất
ổn định. Do các yếu tố như: nhiệt độ, pH; nồng độ oxy hòa tan, thành phần
môi trường, điều kiện chiếu sáng…đều được kiểm soát chặt chẽ đảm bảo cho
tế bào phát triển tốt, hàm lượng hoạt chất ổn định. Vì v
ậy, sản phẩm thu được
có chất lượng ổn định đáp ứng được yêu cầu sản xuất theo tiêu chuẩn GMP.
- Một trong những ưu điểm nổi bật của công nghệ SKTB thực vật là có
thể điều khiển quá trình sinh tổng hợp tạo các hoạt chất cao hơn so với nuôi

5
trồng ngoài tự nhiên. Vì vậy sản phẩm thu được có hàm lượng hoạt chất cao
hơn so với nuôi trồng tự nhiên, nên nó rất phù hợp với các dược liệu chứa
hoạt chất có hàm lượng thấp hoặc các chất rất khó tổng hợp hóa học được
như: taxol, vinblastin, vincristin, shikonin, reserpin…Các kỹ thuật phổ biến
để tăng tích lũy hoạt chất là: dùng các chất kích thích tăng hoạt chất (elicitor);
hoặc các tiền chất cho quá trình sinh t
ổng hợp hoạt chất (precursor); dùng kĩ
thuật nuôi cấy 2 pha (two phase culture); sử dụng nghiệm pháp gen kích
hoạt… [
48, 41]. Các nghiên cứu về SKTB thông đỏ (Taxus sp) cho thấy khi sử
dụng các biện pháp kích thích làm tăng hoạt chất, thì sản phẩm thu được đều
có hàm lượng hoạt chất cao hơn trong cây tự nhiên từ 10 – 15 lần. Schulte và

cs (1987) đã thông báo sự tạo thành anthraquinone trong các nuôi cấy tế bào
các chi Asperula, Galium, Rubia và Sherardia (được tối ưu các điều kiện)
cao hơn trong cây tự nhiên từ 4-6 lần. Đặc biệt hàm lượng anthraquinone cao
nhất ở loài Rubia fruticosa lên t
ới 20% trọng lượng khô cao gấp 20 lần [71].
- Đối với các dược liệu qú y hiếm sản xuất theo công nghệ này thì giá
thành sản xuất sẽ thấp hơn. Lí do là trong thời gian ngắn có thể tạo ra một
khối lượng lớn sản phẩm trong khi chi phí nguyên liệu cho nuôi cấy thấp.

1.1.2.2. Nhược điểm
Tuy nhiên công nghệ SKTB thực vật cũng có những hạn chế mà các
nhà khoa học đang tập trung giải quyết:
- Hàm lượng các hoạt chất trong SKTB còn thấp, đặc biệt là với các tế
bào có cùng nhiều nhóm hoạt chất tồn tại thì việc kích thích tăng hàm lượng
đồng thời các chất vẫn chưa khắc phục được.
- Chi phí đầu tư dây truyền sản xuất tốn kém do đặc thù của nuôi cấy tế
bào thực vậ
t khác với nuôi cấy nấm và vi khuẩn nên hệ thống các bình nuôi
cấy (bioreactor) cần phải thiết kế riêng đối với từng loại tế bào. Tuy nhiên,
hiện nay ở Nhật Bản, Mỹ, Hàn Quốc các nhà khoa học đã thiết kế được các hệ
thống Bioreactor từ 10.000 – 50.000 lít dùng cho sản xuất các sản phẩm bằng
công nghệ SKTB thực vật.
1.1.3. Quy trình lý thuyết tạo sinh khối tế bào thực vật
Quá trình tạo SKTB thực vật th
ường được tiến hành theo năm giai đoạn
kế tiếp nhau [
36],[51] (hình 1.1).

6







Hình 1.1. Qui trình tạo sinh khối tế bào thực vật
A - Nuôi cấy tạo callus; B - Duy trì nuôi cấy callus trên môi trường thạch;
C - Nuôi cấy trong môi trường lỏng; D - Khuếch đại qui mô nuôi cấy;
E - Thu hoạch sinh khối

Giai đoạn 1: Tạo callus
Callus là dòng tế bào đầu, chưa biệt hóa tạo ra trong phòng thí nghiệm,
tương tự như những tế bào gốc tạo ra để hàn gắn vị trí tổn thương của cây.
Callus được hình thành từ các mô, các tế
bào được tách ra từ cơ thể thực vật
nhờ tác động của chất điều tiết sinh trưởng. Trong giai đoạn này ngoài thành
phần môi trường và điều kiện nuôi cấy thì kĩ thuật vô khuẩn được xem là yếu
tố quan trọng nhất. Lựa chọn chất sát khuẩn, phương pháp tiệt khuẩn đúng sẽ
giúp cho tế bào phát triển tốt mà không bị nhiễm nấm cũng như vi khuẩn.
Giai đoạn 2: Duy trì nuôi cấy callus trên môi trường thạch mềm
Việc duy trì nuôi cấy trên môi trường thạch mềm đảm bảo cho tế bào
thích nghi hoàn toàn với điều kiện sống mới (tách ly toàn toàn ra khỏi cơ thể
mẹ), ngoài ra làm cho tế bào có hình thái mềm, xốp có đủ sức sống và đặc
biệt làm mất khả năng biệt hoá thành các cơ quan bộ phận khác. Điều này tạo
thuận lợi cho cấy chuyển tế bào sang môi trườ
ng nuôi cấy lỏng.
Giai đoạn 3: Nuôi cấy tế bào trong môi trường lỏng

Đây là bước rất quan trọng, quyết định tốc độ phát triển cũng như hàm
lượng hoạt chất của sinh khối. Trong giai đoạn này phải khảo sát đầy đủ các yếu
tố ảnh hưởng như: điều kiện nuôi cấy, thành phần môi trường nhằm mục đích cho
sinh khối phát triển nhanh nhất, hàm lượ
ng hoạt chất trong sinh khối cao nhất.
B
D
A
C
E

7
Giai đoạn 4: Khuyếch đại quy mô nuôi cấy (scale-up)
Sau khi đã tìm được các điều kiện và môi trường nuôi cấy thích hợp, để
tăng khối lượng sản phẩm, các tế bào phải được nuôi cấy trong hệ thống các
bình nuôi cấy (bioreactor) thể tích khác nhau tùy theo quy mô. Ở giai đoạn
này các yếu tố về điều kiện sản xuất như loại bioreactor, kiểu cánh khuấy,
phân áp oxy hòa tan là những yếu tố cần phải kh
ảo sát. Hiện nay, sản xuất
taxol và shikonin người ta đã sử dụng các bioreactor 10000 và 50000 lít.
Giai đoạn 5: Thu hoạch khối tế bào
Thu hoạch SKTB là bước cuối cùng trong quy trình nuôi cấy. Thông
thường các hoạt chất được tích lũy chủ yếu trong tế bào, vì vậy phương pháp lọc
lấy tế bào là cách phổ biến để thu sản phẩm. Tuy nhiên, có một số trường hợp hoạt
chất lại được giải phóng ra ngoài môi trường trong quá trình phát triển. Vì vậ
y
việc thu hồi các hoạt chất mất nhiều công sức và chi phí tốn kém. Các hoạt chất
sau khi tách chiết sẽ được nghiên cứu tác dụng dược lí và bào chế các sản phẩm.
1.1.4. Yếu tố ảnh hưởng tới sự phát triển tế bào, hàm lượng hoạt chất
1.1.4.1. Thành phần môi trường nuôi cấy

Thành phần môi trường là 1 trong 2 nhóm yếu tố quyết định thành công
của quá trình sinh khối. Môi trường nuôi cấy phù hợp sẽ thúc đẩy tế bào phát
triển đồng thời nó cũng ảnh hưởng tới các quá trình sinh lí, sinh hóa của tế bào,
quyết định năng suất và hàm lượng hoạt chất. Các nhà khoa học đã thiết lập
được một số môi trường nuôi cấy cơ bản với những thành phần và tỷ lệ muối
vô cơ khác nhau. Môi trường thường được sử dụng nhất trong nuôi cấy mô tế
bào thực vật là Murashige Skoog (MS) [51]. Đặc tính quan trọng của môi
trường MS là n
ồng độ cao các muối nitrat của kali và amoniac. Môi trường B5
được thiết lập bởi Gamborg cũng đang được nhiều nhà nghiên cứu sử dụng.
Thành phần muối vô cơ trong môi trường B5 thấp hơn trong môi trường MS.
Bên cạnh đó còn có nhiều loại môi trường khác như Nitsch, White… Tuy
nhiên, người ta thường sử dụng một loại môi trường hoặc kết hợp hai loại môi
trường cơ bản, rồi tập trung vào sử dụng các hormone thực vậ
t khác nhau. Sự
kết hợp môi trường thích hợp thường tạo được những sản phẩm có khả năng
tồn tại và tốc độ tăng trưởng cao hơn. [
36],[ 51].
a/ Các nguồn cacbon
Hydratcacbon là nguồn cung cấp toàn bộ năng lượng cho tế bào phát triển
khi nuôi cấy trong điều kiện các tế bào đã bị tách li hoàn toàn ra khỏi cây.

8
Các chất hay sử dụng là đường glucose, saccarose, maltose, fructose…
các loại đường này có thể sử dụng riêng lẻ hay kết hợp trong qua trình nuôi
cấy. Nồng độ và loại đường không những ảnh hưởng đến tốc độ phát triển của
tế bào mà còn ảnh hưởng đến các con đường sinh tổng hợp các sản phẩm
chuyển hóa thứ cấp. Misawa và cộng sự, 1985 khi nghiên cứu nuôi cấy tế bào
Coleus blumei đã khảo sát nồng độ đườ
ng saccarose ảnh hưởng tới hàm lượng

hoạt chất acid rosmarinic. Kết quả cho thấy khi dùng với nồng độ 7,5% trong
môi trường nuôi cấy thì hàm lượng hoạt chất đạt 3,3 g/l. Trong khi nếu dùng
2,5% đường thì hàm lượng hoạt chất chỉ là 0,8%. Đối với SKTB rễ dừa cạn
(Catharanthus roseus) Knobloch and Berlin, 1980 cho thấy hàm lượng các
alkaloid nhân indole cao nhất khi nồng độ đường nuôi cấy nằm trong khoảng
từ 4 -12%.
Ngoài ra hàm lượng đường trong môi trường nuôi cấy còn gây ra áp
suất thẩ
m thấu, khi áp suât thẩm thấu tăng tác động vào tế bào sẽ kích làm
tăng tổng hợp các phytoalexin, những chất này sẽ kích thích sản xuất các sản
phẩm thứ cấp. Do và Cormier, 1990 [42] đã tạo tress áp suất thẩm thấu bằng
cách sử dụng đường và một số chất khác để làm tăng hàm lượng
anthocyanindin trong SKTB cây Vitis vinifera. Theo lí thuyết đó, Sakamoto et
al., 1993 khi nuôi cấy tế bào Aralia cordata nếu sử dụng nồng độ đường 3%
thì kích thích làm tăng hàm l
ượng hoạt chất. Tuy nhiên, nếu tăng nồng độ
đường tới 5% thì hàm lượng hoạt chất giảm. Vì vậy trong thực nghiệm phải
tối ưu hóa loại đường và nồng độ đường sử dụng nhằm đảm bảo cho tế bào
phát triển tốt nhất, hàm lượng hoạt chất cao nhất.
b/ Nguồn nitơ và các ion vô cơ
Nếu cây trồng tự nhiên cần các muối vô cơ như một yế
u tố thiết yếu để
sinh trưởng và phát triển thì để nuôi cấy thành công những tế bào chưa biệt
hóa ở một miếng mô được cắt ra từ cây, trong môi trường nuôi cấy cũng cần
phải có các muối vô cơ. Nuôi cấy tế bào thực vật đòi hỏi phải cung cấp đầy đủ
nguồn ni tơ và các ion vô cơ như phospho, kali, canxi, magnesi, mangan,
sulfua. Trong đó nguồn Ni tơ yêu cầu cung cấp với hàm lượng rất cao, b
ởi
đây là nguồn năng lượng thích hợp và có hiệu quả cho tế bào phát triển.
Nguồn ni tơ được đưa vào dưới dạng các muối amoni hoặc nitrat như

NH
4
NO
3
; NaNO
3
thông thường hay kết hợp với các muối khác như NH
4
HPO
4
,
Ca(NO
3
)
2.
Tuy nhiên việc cân đối đối giữa tỷ lệ NH
4
+
/NO
3
-
là rất quan trọng
ảnh hưởng tới hàm lượng hoạt chất có trong SKTB. Trong SKTB tam thất
(Panax notoginseng) Zhang et al. (1996) [
83] thấy rằng hàm lượng saponin
tăng khi tỷ lệ
NH
4
+
/NO

3
-

giảm.

9
Tuy nhiên nếu tăng lượng amoni quá cao có thể gây một số độc tính
cho tế bào và khi đó thí hàm lượng saponin lại giảm. Ngoài ra, các vi khoáng
chất như: Cu
2+
; Zn
2+
; Co
2+
; Mo
2+
; I
-
…. là những thành phần không thể thiếu
đối với tế bào thực vật. Các chất này đóng vài trò như là các coenzym tham
gia vào các quá trính sinh lí, sinh hóa của tế bào. Đặc biệt chúng tham gia vào
kích hoạt các enzym của quá trình sinh tổng hợp các hoạt chất.
c/ Vitamin
Những môi trường cơ bản mô tả ở trên gồm myo-inositol; acid
nicotinic; thiamin hydroclorid; pyroxin…. Vitamin đóng vai trò là các
coenzym tham gia các quá trình chuyển hóa của tế bào nên có tác dụng kích
thích sự phát triển của các tế bào. Nồng độ của myo-inositol trong môi trường
này là 100mg/l. Trong sự tăng trưởng củ
a các tế bào thực vật, các chất hữu cơ
đôi khi được thêm vào môi trường. Những phần phụ này bao gồm: acid amin,

pepton, các chất men, chiết xuất từ mạch nha và nước dừa, nước dừa cũng
được biết có chứa nhiều chất điều tiết sinh trưởng giúp tế bào phát triển.
d/ Hormone thực vật
Hormone thực vật hoặc các chất điều tiết sinh trưởng là rất cần thiết đối
với các tế bào chưa biệt hoá để đẩy mạnh sự tăng trưởng của nhiều dòng tế
bào. Hormon thực vật được chia thành 2 nhóm chính
- Nhóm khung auxin: chất điển hình là acid 2,4-diclorophenoxyacetic
(2,4-D); 1-naphtalenacetic acid (NAA); Indole-3-acetic acid (IAA); Indole-3-
butyric acid (IBA) thường xuyên được sử dụng với nồng độ trong khoảng 0,1-
50µM dùng làm chất kích thích tăng trưởng trong nuôi cấy tế bào. Đặc biệt
trong SKTB 2,4-D và NAA là những chất không thể thiếu đặc biệt là giai
đoạn nuôi cấy tạo callus.
- Cytokinin: gồm kinetin và benzyladenine có vài trò làm tă
ng sinh tổng
hợp nguyên liệu di truyền, kích thích quá trình sinh trưởng làm cho tế bào
phát triển nhanh hơn. Các chất này có thể được sử dụng đơn lẻ. Tuy nhiên
trong đa số các nghiên cứu, chúng thường được sử dụng kết hợp với nhóm
auxin như 2,4-D, NAA. Mỗi loại tế bào thực vật khác nhau yêu cầu những
mức hormone thực vật khác nhau cho sự phát triển của tế bào cũng như tạo
các sản phẩm thứ cấp c
ủa nó. Việc lựa chọn các chất điều tiết sinh trưởng
thích hợp nhất để xác định sự tối ưu nhất đối với mỗi loại thực vật là thật sự
quan trọng.
Ngoài 2 nhóm trên còn có các chất khác: Acid jasmonic, acid ginberilic,
các ethylen… cũng có thể được sử dụng trong môi trường để kích thích tổng
hợp nguồn hoạt chất.

10
e/ Các chất kích thích làm tăng hoạt chất (elicitor)
Bình thường, bản thân trong tế bào có hệ thống tự bảo vệ (SAR-

Syschemic acquired resistance; ISR – Induced systemic resistance) tế bào để
chống đỡ lại các mầm bệnh (pathogens), khi các mầm bệnh tác động vào tế
bào, hệ thống tự bảo vệ này được khởi động. Những chất có khả năng kích
thích khởi động hệ thống tự bảo vệ này gọi là các elicitor. Tuy nhiên, trong
nhiều trường hợp elicitor là chấ
t không độc cho tế bào nó vẫn có thể tồn tại
cùng với tế bào. Vì vậy người ta có thể định nghĩa elicitor như sau: Elicitor là
những các chất có bản chất hoá học khác nhau từ nhiều nguồn gốc, có tác
dụng kích thích tạo các sản phẩm chuyển hoá thứ cấp để chống đỡ lại các
mầm bệnh khi xâm nhập vào tế bào thực vật, trong đó có việc kích thích làm
tăng tổng hợp các sản phẩm thứ
cấp.
Cơ chế hoạt động của elicitor là kích hoạt hệ thống tự bảo vệ theo cách
thức truyền tín hiệu: Elicitor gắn kết với receptor trên màng tế bào, các tín
hiệu của elicitor được truyền đi thông qua các chất truyền tín hiệu thứ cấp:
kênh ion, GTP-Protein; các phân tử oxy hoạt động, Inositol 1,4,5-
trisphosphates các enzym, các chất trung gian dẫn truyền kết qủa cuối cùng
kích thích sinh tổng hợp các sản phẩm chuyển hoá thứ cấp.
Sơ đồ
cơ chế tác dụng của elicitor
Elicitor được chia làm 2 loại
- Elicitor hữu sinh (biotic elicitor): Gồm các chất (nội sinh, hay ngoại
sinh) thu được có nguồn từ thực vật, vi sinh vật: nấm, dịch chiết các thực vật
+ Elicitor ngoại sinh (exogenous elicitors): bản chất là những thành
phần đã có hoạt tính elicitor.
+ Elicitor nội sinh (endogenous elicitors) là sản phẩm tương tác của chính
các yếu tố gây bệnh với tế bào thực vật sinh ra: đây thực chất là các elicitor thực
sự.
- Elicitor vô sinh:
+ Gồm các chất hoá học tổng hợp: Acid salicylic, acid Benzoic, acid

Ferulic, acid Jasmonic,
+ Các yếu tố vật lý: ánh sáng, tia UV, nhiệt độ,
+ Ion kim loại nặng.
+ Những tổn thương cơ học

11
Trong nghiên cứu sử dụng các elicitor cần phải lựa chọn được nồng độ,
loại elicitor cũng như thời gian tiếp xúc của từng loại elicitor cho phù hợp với
từng loại tế bào.
1.1.4.2. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy
a/Nhiệt độ nuôi cấy
Nhiệt độ nuôi cấy có ảnh hưởng quan trọng tới sự phát triển khối tế bào
thực vật và s
ự hình thành các chất chuyển hoá thứ cấp. Mỗi loại tế bào thực vật có
một khoảng nhiệt độ thích nghi nhất định. Nhiệt độ quá thấp sẽ làm tế bào ngừng
phát triển hoặc chết đi, nhiệt độ quá cao sẽ gây chết tế bào. Trong khoảng nhiệt độ
tồn tại của tế bào thực vật thường có một nhiệt độ tối ưu. Tại nhiệt độ này, s
ự phát
triển của khối tế bào đạt tốc độ tối đa. Tuy nhiên, khác với vi khuẩn, vi nấm tế bào
thực vật thường thích nghi ở khoảng nhiệt độ thấp từ 20 – 28
0
C. Trong nghiên cứu
SKTB dừa cạn (Catharanthus roseus) C. M. Bailey và cs 1989 [7] đã tối ưu hóa
được khoảng nhiệt độ thích hợp cho tế bào phát triển tốt nhất và hàm lượng
vinblastin và vincristin cao nhất khi nuôi ở nhiệt độ từ 22-25
0
C. Theo Kee Won
Yu và cs (2005) [22] nhiệt độ thích hợp cho việc nuôi cấy tế bào nhân sâm (Panax
ginseng CA.Mayer) là 24-26
0

C.
b/ Thời gian nuôi cấy
Thời gian nuôi cấy ảnh hưởng lớn tới lượng tế bào thu được và sự sinh
tổng hợp các chất chuyển hoá thứ cấp. Các tế bào sinh vật nói chung và tế bào
thực vật nói riêng trong công nghệ sinh khối đều có một đường cong phát
triển, đường cong này được chia thành 4 pha:
- Pha tiềm tàng hay còn gọi là pha thích nghi (lag phase) tại pha này,
các tế bào thực vật gần như không phát triển, nó chỉ thích nghi với điều kiện
và môi trường nuôi c
ấy mới.
- Pha phát triển (logarit phase or exponent phase) pha này các tế bào đã
trải qua thời gian thích nghi và bắt đầu phát triển với tốc độ theo hàm luỹ
thừa. Trong pha này, khối tế bào phát triển nhanh tạo ra một lượng lớn. Trong
giai đoạn này nếu cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng tế bào có thể phát triển
cực đại.
- Pha dừng (stationary phase): trong pha này các tế bào gần như không
phát triển và nhân lên nữa. Lượng tế bào trong môi trường tiến dần tớ
i hằng
định. Trong pha này các tế bào thực vật bắt đầu tổng hợp các chất chuyển hoá
thứ cấp, pha này càng dài, lượng hoạt chất trong khối tế bào càng cao. Vì vậy
cần phải cung cấp dinh dưỡng để duy trì sự tồn tại của tế bào trong pha này
nhằm kéo dài thời gian sinh tích lũy các sản phẩm thứ cấp.

12
A. Yari Khosroushahi và cs, 2005. khi khảo sát tối ưu hóa môi trường
nuôi cấy tế bào thông đỏ
(Taxus baccata) thấy rằng ngoài sử dụng các elicitor,
khi bổ sung 1% saccarose vào môi trường khi kết thúc pha phát triển thì hàm
lượng Taxol tăng gấp 16 lần so với nhóm chứng [80].

Hình 1.2. Đường cong phát triển của tế bào thực vật

- Pha ly giải hay pha suy tàn (death phase, lysis phase), trong pha này
các tế bào thực vật bắt đầu chết dần, lượng tế bào giảm. Biểu hiện bên ngoài
là thay đổi màu sắc tế bào và môi trường nuôi cấy, thay đổi pH môi tr
ường.
Như vậy cần phải xác định điểm kết thúc của qúa trình nuôi cấy - đó là
thời điểm bắt đầu chuyển sang pha ly giải. Khi đó sẽ thu được khối lượng tế
bào lớn nhất, hàm lượng hoạt chất tốt nhất và không bị lãng phí môi trường.


13
c/ pH môi trường nuôi cấy
Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của tế bào và hình thành saponin
vẫn chưa được nghiên cứu. Tuy nhiên, mô thực vật được biết là có khả năng

thích nghi lớn với sự thay đổi của pH. Trong môi trường nuôi cấy, pH có thể
được thay đổi bằng chính các tế bào thực vật để tối ưu hoá môi trường nuôi
cấy. pH có ảnh hưởng tới sự phát triển của tế bào và sự tổng h
ợp các chất
chuyển hoá thứ cấp. Theo W. M. van Gulik và cs trong nghiên cứu nuôi cấy tế
bào Nicotiana tabacum cho thấy khoảng pH thích hợp để nuôi cấy là 5,4-5,6
trong khi đó đối với Catharanthus roseus thì pH = 5,8 là tối ưu [
45].
d/ Nồng độ oxy hoà tan.
Sự phát triển của tất cả các tế bào hiếu khí nói chung đều cần sự có mặt
của oxy. Oxy cần thiết cho quá trình hô hấp của tế bào, phân cắt các phân tử
hữu cơ tạo năng lượng cho các quá trình phát triển của cơ thể sinh vật. Tốc độ
phát triển của tế bào thực vật càng cao càng cần nhiều oxy. Trong thực tế, các
tế bào thực vật phát triển tương
đối chậm, chính vì vậy nồng độ oxy cung cấp
cho tế bào không cần cao. Thông thường nồng độ oxy hòa tan thích hợp trong
môi trường nuôi cấy tế bào thực vật khoảng 20-40% [
36].
Nồng độ oxy quá cao cũng không ảnh hưởng nhiều tới tốc độ phát triển
của tế bào. Tuy nhiên khi nồng độ oxy quá thấp có thể gây chết tế bào. Trong
quy trinh sinh khối, giai đoạn nuôi cấy tế bào trên hệ thống các bioreactor nồng
độ oxy hòa tan đóng vai trò quan trọng. Theo Nguyễn Thành Trung và cs, 2006
khi nghiên cứu nuôi cấy tế bào sâm Triều tiên (Panax ginseng) cho thấy nồng
độ oxy hòa tan trong hệ thống bioreactor 15 lít phù cho tế bào phát triển tốt
nhất là 35- 40% [
63], [50].
Trong thí nghiệm nuôi cấy tế bào Lithospermum erythrorhizon của
Yasuhiro F

và cs (1985) mức nồng độ oxy hòa tan đã được sử dụng là 50% thì

hàm lượng shikonin cao nhất đạt 2.300mg/l tương đương với hàm lượng hoạt
chất là 46% [
81]. Như vậy, tuỳ theo đặc tính của tế bào và tốc độ phát triển của
mỗi giai đoạn mà ta điều chỉnh nồng độ oxy hoà tan cho phù hợp.
1.1.5. Thành tựu của công nghệ sinh khối tế bào thực vật
Cho đến nay, rất nhiều hoạt chất nguồn gốc thực vật có giá trị kinh tế
cao là sản phẩm của công nghệ SKTB thực vật.[
36, 66, 41, 51]
1.1.5.1. Các hoạt chất dùng trong dược phẩm
Các alkaloid

14
Người ta có thể thu được các chất như caffein từ nuôi cấy tế bào cây
Coffea arabica, betalain trong callus củ cải đường, berberin từ tế bào cây
Coptis japonica (loài cây này phải trồng từ 4-6 năm mới thu được hàm lượng
đáng kể berberin trong rễ, trong khi hàm lượng này có thể thu được sau 4 tuần
bằng phương pháp nuôi cấy tế bào)… Những chất này được sử dụng rộng rãi
trong công nghiệp hương liệu và trong y học.
Reserpine là alkaloid chiết xuất từ cây Ba gạc (Rauwolfia sp) có tác d
ụng
chữa bệnh cao huyết áp và các bệnh rối loạn tuần hoàn đã được sản xuất bằng
phương pháp nuôi cấy tế bào cây Rauwolfia serpentina. Từ hệ thống bioreactor
10000 lít có thể sản xuất được 3.500 kg reserpine trong thời gian 30 ngày,
tương đương với lượng hàng năm của cả thế giới thu được từ rễ cây đó.
Các nhà nghiên cứu thuộc tổ hợp dược phẩm Gibageigy (Based, Thụy
Sĩ) đã sả
n xuất được loại alkaloid là scopolamine từ tế bào cây Hyoscyanus
aegypticus nuôi cấy trong hệ lên men không có cánh khuấy. Bằng cách chọn
lọc các dòng tế bào cao sản nhờ kỹ thuật đột biến tế bào trần, biến dị đơn
dòng (monoclonal variation) và kỹ thuật gen, người ta đã tăng được sản lượng

scopolamine lên gấp hàng ngàn lần. Sikuli và cộng sự (1997) sau khi gây
nhiễm cây Datura stramonium với Agrobacterium rhizogenes đã nhận thấy
hàm lượng hyoscyamine ở rễ đạt c
ực đại 100 mg/l sau 6 tuần nuôi cấy .
Nhiều nghiên cứu cho thấy nuôi cấy callus và tế bào của cây
Catharanthus roseus có hàm lượng serpentin ngang với cây dược liệu bình
thường. Một số nghiên cứu đã phân lập được các dòng tế bào Cantharanthus
sản xuất serpentin và ajmalacine từ nuôi cấy in vitro. Bằng loại môi trường
sản xuất đặc biệt người ta đã đưa được sản lượng alkaloid của hai dòng tế bào
tốt nhất lên một mức cao hơn n
ữa, trong đó một dòng tạo được 162 mg/L
serpentin, còn dòng kia tạo được 72 mg/L serpentin cùng với 264 mg/L
ajmalacine. Mới đây, người ta đã hoàn thiện được công nghệ nuôi cấy tế bào
của cây C. roseus để sản xuất viblastine và vincristine là hai chất chống ung
thư rất mạnh, hiện đang để chữa ung thư máu.
Các steroid
Các Steroid là những hợp chất sử dụng nhiều trong ngành dược làm
nguyên liệu để bán tổng hợp các thuốc trợ tim, thuốc chống viêm gi
ảm đau,
các hormon tuyến thượng thận…Năm 1969 Kaul và cs đã nuôi cấy thành
công tế bào của cây Dioscorea deltoidea để sản xuất diosgenin


15
Một số chất khác
Thí dụ điển hình nhất là công nghệ sản xuất shikonin, một loại sắc tố đỏ
có khả năng diệt khuẩn, có trong rễ của cây Lithospermum erythrorhizon.
Bình thường shikonin tích lũy không nhiều trong rễ. Tuy nhiên, các nhà khoa
học Nhật đã tạo được dòng tế bào rễ cây Lithospermum có khả năng tích lũy
đến 15% shikonin và đã hoàn chỉnh công nghệ nuôi cấy tế bào sản xuất

shikonin. Công nghệ này cho phép trong một chu kỳ
nuôi cấy thu hoạch tới 5
kg hoạt chất và giúp giảm rất nhiều giá thành của shikonin. Cho tới nay toàn
bộ nguồn nguyên liệu shikonin đều được sản xuất bằng công nghệ này.
Paclitaxel là chất tách chiết từ vỏ và lá kim của cây thủy tùng – thông
đỏ (Taxus sp) đang được sử dụng hiệu quả trong điều trị nhiều loại ung thư.
Việc cung cấp taxol gặp khó khăn vì bản thân cây thủy tùng khan hiếm và
hàm lượng taxol trong chúng rất th
ấp. Công ty Escagenetics (California, Mỹ)
đã thành công trong sản xuất taxol bằng công nghệ SKTB thực vật. Hàm
lượng taxol trong SKTB cao hơn 10 -20 lần so với cấy tự nhiên. Hiên tại 2
sản phẩm này là độc quyền sở hữu trí tuệ toàn cầu của hãng Figire và đang
bán với doanh số mỗi năm hàng tỷ đô la.
1.1.5.2. Các chất dùng trong thực phẩm
a/ Các chất màu
- Anthocyanin
Các anthocyanin là các sắc tố tiêu biểu có trong các loài thực vật hạt kín
(angiosperms) và các loài thực vật có hoa (flowering plants) củ
a các họ
Poaceae, Fabaceae, Rosaceae, Cruciferae, Vitaceae và Solanaceae tập trung ở
các bộ phận khác nhau như: rễ, lá, hoa và quả. Anthocyanin tách chiết từ nho
là nguồn tiềm tàng nhất trên thế giới. Hiện nay, người ta cũng đã tiến hành
nuôi cấy tế bào của các loài Vitis vinifera, Daucus carota và Euphorbia millii
để sản xuất anthocyanin với hàm lượng cao, từ 10-20% trọng lượng khô.
- Crocin
Crocin và crocetin một loại sắc tố màu đỏ tươi được tìm thấy trong đầu
nhụy cây nghệ tây (Crocus sativus). Đây là loạ
i nguyên liệu có giá trị cao do
thực tế cây nghệ tây chỉ có thể sinh trưởng ở những vùng địa lý đặc biệt trên
thế giới và đòi hỏi nhiều nhân công khi thu hoạch. Muốn thu hoạch 1 kg đầu

nhụy nghệ tây (một loại gia vị có giá trị) cần phải có khoảng 150.000 hoa.
Hiện nay, người ta đã phát triển các phương pháp nuôi cấy tế bào của đầu
nhụy cây nghệ tây trong điều kiện in vitro để sản xuấ
t các callus có màu chứa
crocin và các crocetin.