Nghiên cứu sự tương tác giữa Lectin và enzim amylase và proteinase.PDF

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN
NGHIÊN CỨU Sự TƯƠNG TÁC GIỮA LECTIN VÀ
ENZIM AMYLASE VÀ PROTEINASE
VÀ KHẢ NĂNG ÚNG DỤNG
Mã số: QT - 08 - 67
Chủ trì đề tài:
TS. Nguyễn Quang Vinh
7;A' HO C Q U Ố C GIA HA NOI
^RUNG Tá m THÕMG tin thư v iện
' ữ r / % '/
HÀ NỘI - NĂM 2009
BÁO CÁO TÓM TẮT
1. Tên để tài:
"Nghiên cứu sự tương tác giữa lectin và enzim amylase và proteinase
và khả năng ứng dụng".
Mã số: QT-08-67.
2. Chủ trì đề tài:
TS. Nguyễn Quang Vinh
3. Cán bộ tham gia:
CN Trần Văn Quang - giảng viên trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
4. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu:
Mục tiêu:
- Tách lectin, enzim và nghiên cứu tính chất của chúng ở một số loài
sinh vật biển và nấm lón.
- Nghiên cứu tương tác giữa lectin và amylase và proteinase thương
phẩm và tự nhiên.
Nội dung nghiên cứu:
- Thu mẫu và phân tích các chỉ số về enzim (proteinase và amylase) ở
một sổ loài sinh vật biển và nấm lớn.
- Tách, tinh sạch chế phẩm lectin từ một số mẫu được chọn.

- Nghiên cứu sự tương tác giữa lectin tách được với proteinase và
amylase tự nhiên và thương phẩm.
5. Các kết quả đạt được:
- Đã thu thập được 5 loài động vật biển và 18 loài nấm lớn mọc tự
nhiên và nuôi trồng ở địa bàn Hà Nội và một số tỉnh thành.
- Đã phát hiện thấy lectin ở 4 loài trong số 5 loài động vật biển thu
gom ở vùng biên Quảng Ninh, trong đó loài có hoạt tính cao nhất là Hải miên
(Callyspongia sp.). Lectin ở loài này khá bền nhiệt, hoạt độ bị ức chế bởi
đường lactose. Đã tinh sạch một phần lectin từ Hải miên bàne phương pháp
lọc phân tử qua cột Sephadex G-100 và bằng sắc ký trao đổi ion trên cột
DEAE-cellulose (độ sạch tăng lên gần 10 lần).
- 18 loài nấm lớn mọc tự nhiên và được nuôi trồng đã được nghiên cứu
điều tra về hoạt độ proteolytic (PA) và amylolytic (AA) phát hiện thấy AA ở
16/18 loài (chiếm 88,9%) và PA ở 12/16 loài (chiếm 75%).
- Thử nghiệm phương pháp Wolgemuth trên bản nhựa cho thấy có thể
dùng phương pháp cải tiến này để xác định hoạt độ của amylase.
- Ket quả nghiên cứu tính chất của proteinase và amylase ở 3 loài nấm
ăn thường gặp là: nấm sò trắng, nấm hương, nấm rơm, cho thấy proteinase ở
các loài nấm trên thuộc nhóm proteinase - serine và/hoặc proteinase-aspartic,
còn amylase là a-amylase và/hoặc ß-amylase.
- Khi tương tác với enzim, lectin từ rong biển ưỉva conglobata đã kìm
hàm hoạt độ của các proteinase ở nấm sò trấng, nấm hương và nấm rơm,
nhưng không ảnh hưởng tới hoạt độ của amylase ở các loài nấm trên. Lectin
tách từ Hải miên Caỉỉyspongia sp. hầu như không ảnh hưởng đển a-
chymotripsin nhưng lại kìm hãm rõ nét hoạt độ của papain.
6. Tình hình kinh phí của đề tài
Kinh phí được cấp: 20 triệu đồng.
Kinh phí quyết toán: 20 triệu đồng.
PHÒNG ĐÀO TẠO CHỦ TRÌ ĐÈ TÀI
____

_
\ / ^ Nguyễn Quang Vinh
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN
• * • •
• MÓ HIỀU HƯ Ỏ N G
11
STUDY ON INTERACTIONS OF LECTINS AND ENZYMES
(PROTEINASE AND AMYLASE) AND THEIR POSSIBLE APPLICATION
SUMMARY
Five species of marine coral and sponge were examined for lectins
(hemagglutinins) and hemagglutinating activity (HAA) was found in extracts
of 4 species of which Callyspongia sp. is the species containing ABO blood
group non-specific lectin with the highest HAA. Lectin from this sponge was
partially purified by sephadex G-lOO gel filtration and DEAE-cellulose ion-
exchange chromatography (the purity of the preparation is increased in about
10 times). The lectin is relactivily thermostable (50% HAA remained at 60‘*C
in 30 minutes) and its HAA is inhibited by Lactose.
Eighteen species of mushrooms growing in nature and cultivated were
screened for presence of proteolytic and amylolytic activities (PA & AA) and
AA was found in 16/18 species (88,9%) and PA in 12/16 species (75%).
Activity of amylase can be determined by procedure of Wolgemuth carried
out in microtiter plate.
Characteristics of proteinase and amylases from Pleiirotus pulmonatus,
Lentinula edodes and Volvariella volvacea (three edible mushrooms) were
estimated and the results obtained show that proteinases in these mushrooms
belong to group proteinase-serine and/or proteinase-aspartic, and amylases
are a-amylase and/or (3-amylase.
Studies o f interaction of the lectins and enzymes showed that lectin
from marine alga Ulva conglobata have no effect on activity of amylases, but
inhibits activity of proteinases in three mushroom above mentioned, while

the lectin isolated from Callyspongia sp. has almost no influence on activity
of a-chymotripsin, but markedly inhibits the activity of papain.
Ill
MỤC LỤC
Mở đầu
Chưcmg 1
Chương 2
Tổng quan
1.1. Lectin - một sổ tính chất và ứng dụng của chúng
1.2. về enzim và enzim amylase và proteinase
Nghiên cứu lectin và enzim
2.1. Kết quả nghiên cứu lectin ở một số loài nấm và sinh
vât biên
2.2. Ket quả nghiên cứu amylase và proteinase ở nấm lớn
Chương 3 Nghiên cứu sự tương tác giữa lectin và enzim
3.1. Tương tác giữa lectin và proteinase
3.2. Tương tác giữa lectin và amylase
Kết luận và kiến nghị
Tài liệu tham khảo
Trans
1
8
15
15
22
30
30
33
36
38

IV
nguyên còn ít được khai thác này sẽ mở ra những triển vọng mới cho việc ứne
dụng trong sinh học và y học.
Trên cơ sở những điều đã trình bày trên, chúng tôi thực hiện đề tài:
"Nghiên cứu sự tương tác giữa ỉectin và enzint amylase và prơíeỉnase và khả
năng ứng dụng".
CHƯƠNG 1
TỎNG QUAN
Để tìm hiểu một hợp chất tự nhiên, thông thường người ta bắt đầu bàng
nghiên cứu điều tra hợp chất đó trong các nguồn nguyên liệu có sằn trong tự
nhiên. Trên cơ sở kết quả nghiên cứu điều tra, một hoặc một số đổi tượng giàu
hợp chất quan tâm hoặc chứa họp chất có tính đặc hiệu đáng chú ý, được chọn
để nghiên cứu sâu hơn. Việc nghiên cứu lectin và enzim cũng tuân theo quy tắc
trên và đã được triển khai rộng rãi trên các đối tượng sinh vật.
1.1. Lectin - một số tính chất và ứng dụng của chúng
Ngày nay, lectin được định nghĩa là: "Protein hoặc glycoprotein liên kết
đưÒTig không có nguồn gổc miễn dịch, có khả năng ngưng kết tế bào hoặc (và)
kết tủa phức chất xacarit" [12]. Từ định nghĩa này thấy rõ hai tính chất quan
trọng của lectin là khả năng ngưng kết tế bào, trong đó có tế bào hồng cầu, và
khả năng kết tủa các phức chất xaccarit. Người ta thường phát hiện lectin bằng
chính một trong hai phản ứng này.
Lịch sử nghiên cứu lectin [13] được chính thức thừa nhận bắt đầu từ năm
1888 khi Stillmark phát hiện ra tính chất ngưng kết tế bào hồng cẩu của người
và nhiều động vật khác của rixin - một độc tố có bản chất protein được tách ra từ
hạt thầu dầu {Ricinus communis). Sự ngưng kết hồng cầu này là khác nhau ở các
động vật khác nhau; không ngạc nhiên khi lectin còn được gọi là hemagglutinin.
Tuy vậy, rixin không chỉ ngưng kết tế bào hồng cầu mà còn ngưng kết các tế
bào khác như: tế bào gan, tế bào biểu bì, bạch cầu
Công trình của Stỉllmark đã kích thích các nghiên cứu về huyết thanh học
và miễn dịch học. Tiếp sau nghiên của Stillmark, hàng loạt nghiên cứu đã được

công bố về sự có mặt của lectin ở thực vật, vi sinh vật và động vật.
Từ giừa thế kỷ thứ XX trở đi, nhờ tiếp cận hoá sinh và việc áp dụng các
phương pháp mới trong kỳ thuật tách chiết các hợp chất tự nhiên, các nghiên
cửu về lectin đã được triển khai sâu rộng và một loạt tính chất độc đáo và khả
nâng ứng dụng của lectin đã được đề cập.
1.1.1. M ội sổ tính chất hoả lý của lectìn [14]
- về thành phần hoá học: Trong thành phần axit amin của các lectin đã
được nghiên cứu thì axit amin axit (như aspactat) và các hydroxiamino axit (như
xerin, treonin) chiếm tỷ lệ khá cao (khoảng 30%), còn các axit amin chứa lưu
huỳnh ít hoặc không có. Mặc dầu vậy, về thành phần axit amin cũng như trình tự
của chúng trong chuỗi polypeptit của lectin, người ta nhận thấy nhừng lectin
tách ra từ các loài cùng chi hoặc cùng nhóm có thành phần và trình tự axitamin
giống nhau nhiều hoTi là những loài khác chi khác nhóm.
Tuyệt đại đa số các lectin đã biết, trong thành phần của mình, ngoài
axitamin còn chửa thành phần đường (xáccarit). Các đường tìm thấy trong lectin
thường là mannose, glucose, galactose, galactosamine. Người ta cũng tìm thấy
trong phân tử của một số lectin các ion kim loại như Mg^^, Ca^^, Mn‘^. Các ion
kim loại này cần thiết cho sự tương tác giữa các gổc đường và lectin.
- Khối lượng phân từ của lectin
Khối lượng phân tử của các lectin khác nhau là rất khác nhau. Tuy nhiên,
khối lượng phân tử của đa số lectin đã nghiên cứu dao động trong khoảng từ 32
kDa đến 120 kDa; sự khác biệt là các lectin liên kết axit sialic: phân tử có hoạt
tính của chúng là những tập hợp với khổi lượng vào khoảng từ 200 đến 500
kDa. Đặc điểm nổi bật của hầu hết các lectin đã nahiẽn cứu là cấu trúc phân tử
có hoạt tính gồm các phần dưới đơn vị (pdđv). Phân tử có hoạt tính có thể là
dimer, tetramer, hexomer hoặc cao hơn như các lectin liên kết axit sialic có thể
gồm từ 10 đến 24 pdđv. Các pdđv có thể là giống hệt nhau hoặc khác nhau, kết
hợp với nhau thành đại phân tử nhờ các liên kết không cộng hoá trị hoặc nhờ các
cầu disulíìia. Phần dưới đơn vị của lectin có thể là một chuỗi polypeptit hoặc có
thể gồm hai hay nhiều chuỗi polypeptit nối với nhau bàng các cầu disulÍLia. Mỗi

pdđv có thế có các trung tâm liên kết đường và/hoặc không có trung tâm liên kết
ion kim loại, thể hiện tính đa hoá trị của phân tử lectin.
- Tỉnh đặc hiệu đường của lectin
Khả năng liên kêt đường (xáccarit) là một trong những tính chất quan
trọng nhất của lectin. Đặc tính có thể liên kết với một loại đường nhất định, chủ
yếu là đưòng đơn (monoxaccarit) thể hiện tínli đặc hiệu đưòng của lectin. Việc
xác định tính đặc hiệu này dựa trên mức độ ức chế phản ứng ngưng kết tế bào
hồng cầu khi so sánh các đưòng thêm vào phản ứng với nồng độ nhất định, ỏ
đây sự ức chế khả năng ngưng kết tế bào hồng cầu của lectin là do trung tâm liên
kết đường của lectin bị đưòng được thử phong toả (liên kết trước) nên không
tiếp xúc được với các trung tâm thụ cảm trên bề mặt tế bào hồng cầu. Trung tâm
liên kết đường của lectin được phân bố trên mồi pdđv của lectin và là một
domen gồm một số gốc axit amin chính được bao bọc bởi một vùng gồm các
axit amin khác. Một sổ ion kim loại như Mg^^, cũng tham gia vào
tương tác giữa lectin với đường, chúng liên kết với lectin ở những vị trí nhất
định gọi là các trung tâm liên kết kim loại. Các trung tâm này thường phân bổ ờ
vùng gần trung tâm liên kết đường của lectin. Việc loại bỏ các ion kim loại trong
những trường hợp này làm mất hoạt tính liên kết đường cũng như một sổ tính
chất khác của lectin. Trong số các lectin đã nghiên cứu, những lectin liên kết
Galactose và N-Axetyl-Galactosamine chiếm ưu thế về số lượng cũng như sự
phổ biến.
Như vậy, khả năng liên kết đường của lectin mang tính chọn lọc và thuận
nghịch và là cơ sở của nhiều tính chất sinh học và ứng dụng quan trọng của
lectin.
1.1.2. M ột số tính chất sinh học của lectin [14]
- Sự ngimg kết tế bào
Nếu tất cả các tế bào được bao bọc bởi đường thì với khả năng liên kết
đường của mình, lectin dễ dàng ngưng kết các tế bào, trong đó có tế bào hồng
cầu, là điều đễ hiểu. Chính phản ứng ngưng kết này cho đến nay vẫn được dùng
để phát hiện sự có mặt của lectin trên các đối tượng nghiên cứu.

Phản úng ngưng kết xảy ra khi trong những điều kiện nhất định lectin tạo
thành nhiều cầu nối giữa các tế bào cạnh nhau. Sự ngưng kết này phụ thuộc vào
nhiều yếu tố như tính chất phân tử của lectin (số lượng trung tâm liên kết
đường), tính chất của bề mặt và trạng thái sinh lý của tế bào hay điều kiện bên
ngoài như nhiệt độ, pH, nồng độ tế bào Những thay đổi không làm mất khả
năng liên kêt đường của lectin như thay đôi hoá trị (sô phân dưới đơn vị) hay
kích thước phân tử, có thể ảnh hưởng lớn đến sự ngưng kết tế bào của lectin. Thí
dụ, sự polyme hoá lectin đậu tương làm tăng khả năng ngưng kết hồng cầu bởi
lectin tới 100 - 200 lần; ngược lại khi biến đổi lectin đậu rựa (Con A) từ dạng
tetrameric thành dạng hoá trị hai (dimer) làm giảm hoạt tính ngưns kết của
lectin tới 500 lần. Sự thay đổi thành phần xaccarit trong phân tử lectin không
ảnh hưcmg đến khả năng ngưng kết tế bào.
Đa số các nghiên cứu về ngưng kết tế bào bởi lectin được tiến hành với
các tế bào động vật, kể cả tế bào hồng cầu máu người. Máu người khác máu
động vật là được phân thành nhóm A, B, o, M, N. Khi nghiên cứu phản ứng
ngưng kết tế bào hồng cầu, người ta phát hiện một số lectin có tính đặc hiệu
nhóm máu, nghĩa là một lectin chỉ gây ngưng kết tế bào hồng cầu thuộc một
nhóm máu nhất định trong số các nhóm máu kể trên. Ngoài tế bào động vật,
lectin cũng liên kết các tể bào khác như vi khuấn, vi nấm, protozoa, tế bào thực
vật Sự ngưng kết tế bào là cơ sở của nhiều ứng dụng quan trọng của lectin.
- Khả năng kích thích phân bào: khi tương tác với các tế bào lectin có khả
năng kích thích phân bào nguyên nhiễm (mitosis) như trong nghiên cứu với tể
bào limpho T của hệ miễn dịch ở người. Lectin đầu tiên được nghiên cứu về khả
năng kích thích phân bào nguyên nhiễm là lectin từ đậu côve (phaseolus
vulgaris) - ký hiệu là PHA, Không phải bất kỳ lectin nào cũng gây kích thích
phân bào, nhưng nhiều lectin từ cây họ đậu đỗ là tác nhân gây kích thích phân
bào (mitogen) các tế bào limpho T ở người.
Một nghiên cứu khác [15] cho thấy lectin của hạt một sổ loài mít hoang
dại ở Việt Nam cũng biểu hiện khả năng kích thích phân bào các tế bào limpho
T ở người.

- Một vài tính chất khác của ỉectin
Một số lectin từ lâu đã được biết là độc tố như rixin, abrin, modexin
Một số thực vật khác hay vi sinh vật cũng chứa lectin - độc tố, nhưng độc tính
của các lectin thường thấp hơn nhiều (tới 1000 - 2000 lần) so với độc tính của
rixin và abrin.
Cơ chê tác động của lectin - độc tổ như rixin, abrin đã được biết khá rỏ.
Ngưòi ta thây các lectin trên đều cấu tạo gồm hai chuỗi polypeptit (chuỗi nặng
p- và chuỗi nhẹ a-) nối với nhau bằng các cầu disulfua. Chuỗi P- có trung tâm
liên kết đưòrng, còn chuồi a- thì ức chế sinh tổng hợp protein trong các hệ thống
vô bào, thể hiện độc tính của lectin. Phân tử lectin nguyên vẹn (gồm chuồi nặng
P- và chuỗi nhẹ a-) khi đã liên kết với gốc galactose (hoặc N-Acetyl-
Galactosamine) trên bề mặt màng tế bào qua chuồi ị3, được tế bào thu nhận và ở
đó chuỗi a - ức chế sinh tổng hợp protein bàng cách ngăn cản quá trình kéo dài
chuồi polypeptit trên riboxom.
Một số lectin có khả năng tương tác với các kháng thể của người (IgA,
IgD)[16].
Ỉ.I.S. ửng dụng của lectin [14]
Với những đặc trưng và tính chất của mình, lectin đang được ứng dụng
rộng rãi trong hoá sinh học, tế bào học, miễn dịch học, y học, dược học, và nhiều
lĩnh vực liên quan khác.
Trước hết, lectin là công cụ hữu hiệu để nghiên cửu các phức chất đường
như các glycoprotein, glycolipit, polyxaccarit mà nhiều chất trong sổ này là
những phân tử có hoạt tính sinh học như các kháng thể miền dịch, các enzim có
bản chất glycoprotein - glycoprotein là thành phần của bề mặt màng tế bào. Nhờ
tính chất liên kết đường của lectin nên khi một polyme sinh học (biopolymer)
nào đó liên kết với lectin có thể coi đó là bằng chứng rằng polyme đó có chứa
đường, hơn nữa nếu lectin có tính đặc hiệu đường nhất định thì có thể khẳng
định đường (hoặc các đưòng) liên kết đặc hiệu với lectin có trong thành phần
xaccarit của poỉyme sinh học đã nghiên cứu.
Một khi lectin được gắn vào giá thể không tan (như agarose hay

sepharose) sẽ trở thành phương tiện hữu hiệu trong sắc ký ái lực để tinh sạch các
glycoprotein, glycolipit, hay các phức chất đường khác. Thực tế bàng sắc ký ái
lực trên cột chửa lectin người ta đã tinh sạch được nhiều glycoprotein của màng
tế bào, nhiều polyxaccarit, oligoxaccarit, hay glycolipit và nghiên cứu tính chất
của chúng. ConA là lectin được dùng rộng rãi với mục đích này. Lectin từ hạt
các loài thuộc chi Artocacpus cũng được dùng để tinh chế protein kháng thể
huyết thanh người [16, 17'.
Gần đây lectin còn được ứng dụng trong kỹ thuật ELLA (Enz>Tne-Linked
Lectin Assay) và kỹ thuật ELLA được dùng để xác định thành phần và tính chất
của chitin [18] hay các dẫn xuất đường trong tương tác với lectin [19].
ứ ng dụng quan trọng khác của lectin là việc xác định cấu trúc hoá học các
yếu tố quyết định nhóm máu A, B, o ở người. Chính việc sử dụng các ỉectin đặc
hiệu nhóm máu (như lectin đặc hiệu nhóm máu A của đậu Lim, lectin đặc hiệu
nhóm máu o của đậu Lotus tetragonoỉobus hay của lươn Anguilla angidỉỉa kết
hợp với nghiên cứu phản ứng ức chế bởi đường của các lectin trên, ns;ười ta đã
xác lập được các loại đường ưu thế miễn dịch của các kháng nguyên A, B, và o
(H) tương ứng là N'-Acetyl-galactosamine, D-Galactose và L-Fucose.
Một ứng dụng khác của lectin là việc sử dụng chúng như chất tải thuốc
trong hoá trị liệu chữa bệnh hay được dùng như chất dẫn thuốc có định hướng
trong chữa bệnh theo liệu pháp LEAPT (Lectin-directed enzyme- activated
prodrug therapy) [11],
Ngoài các ứng dụng đã kể trên, lectin còn được dùng để phân loại vi
khuẩn [20, 22], nấm cũng như nghiên cứu cấu trúc màng của chúng, để chẩn
đoán bệnh do nhiễm khuẩn [21].
1.2. về enzim và enzim amylase và proteinase
Enzim, như chúng ta đã biết, là những chất xúc tác sinh học, thúc đẩy các
quá trình trao đổi chất trong cơ thể sổng, về bản chất, hầu hết các enzim đã biết
là protein đơn giản hoặc phức tạp. Xét về tính chất và đặc điểm xúc tác, enzim
có nhiều tính chất giống như các chất xúc tác vô cơ, nhưng chúng thể hiện hàng
loạt đặc điểm chỉ có ở loại chất xúc tác smh học như: tính kém bền nhiệt, hoạt

độ của enzim phụ thuộc nhiều vào pH và thành phần của môi trường, nhưng
chúng lại có tính đặc hiệu và hiệu quả xúc tác cao. Nói chung, sự xúc tác bởi
enzim xảy ra với tốc độ cao trong các điều kiện nhẹ nhàng (như điều kiện trong
cơ thể sống). Bên ngoài cơ thể sống, trong các điều kiện gần với điều kiện trong
cơ thể, enzim vẫn duy trì được tính đặc hiệu và hiệu quả xúc tác cao.
Theo bản chât hoá học, enzim có thể chia thành hai nhóm lớn: enzim là
protein đơn giản và enzim phức tạp mà trong thành phần ngoài protein ra còn
chứa các yếu tố khác không phải là protein gọi là các coenzim; các coenzim
thường có thể là dẫn xuất của các vitamin hay các ion kim loại.
Theo khuyến cáo của Hiệp hội sinh học quốc tể, tất cả các enzim đã biết
được chia thành sáu nhóm:
1) Oxidoreductase - là những enzim xúc tác cho các phản ứng oxi hoá -
khử.
2) Transferase - những enzim này xúc tác cho các phản ứng chuyển nhóm
nguyên tử (như nhóm amin, nhóm metyl, gốc photphat )
3) Hydrolase - các enzim này xúc tác cho các phản ứng thuỷ phân các
hợp chất phức tạp thành các thành phần đơn giản.
4) Liase - các enzim phân cat không cần nước kèm theo sự hình thành nối
đôi.
5) Isomerase - là nliững enzim xúc tác cho các phản ứng đồng phân hoá
các dạng phân tử.
6) Ligase (synthetase) - xúc tác cho các phản ứng tổng hợp các chất.
Mồi nhóm enzim trên còn có thể được chia thành các phân nhóm nhỏ hơn
tuỳ vào cơ chất chịu chuyển hoá hoặc cơ chế xúc tác.
1.2.1. Amylase
Amylase thuộc nhóm enzim thuỷ phân - Hydrolase. Amylase là tên gọi
chung cho các enzim thuỷ phân các polyxaccarit (tinh bột, glycogen ) thành các
sản phẩm maltose và glucose. Thuộc nhóm này có 3 loại: a-Amylase, p~
Amylase và y-Amylase hay glucoamylase. Amylase có phổ biến ở động vật
(trong nước bọt, dịch tuyến dạ dày, trong máu, trong gan), trong thực vật (ở hạt

ngũ cốc nảy mầm), trong dịch nuôi cấy vi sinh vật hoặc vi nấm.
- a-Amyỉase là một endoenzim có khả năng phân cắt các liên kết a-1,4
glucozit nam ờ bên trong cơ chât (tinh bột, glycogen) một cách ngẫu nhiên; quá
trình thủy phân polyxaccarit bởi a-Amylase là quá trình đa giai đoạn, sản phẩm
thuỷ phân đường đa bởi a-Amylase chủ yểu là các oligoxaccarit (dextrin) và một
phần maltose, rứiừnơ sản phâm không băt màu với iot. Tác động của a-Amylase
thường làm giảm nhanh độ keo, độ polyme hoá của pol>7caccarit. Vì vậy có thể
xác định hoạt độ của a-Amylase bằng cách đo sự thay đổi độ nhớt của duna dịch
hoặc nhờ phản ứng màu với iot.
a-Amylase là một metaloenzim, trong phân tử có chứa ion Ca'", khi tách
hoàn toàn khỏi phân tử thì enzim bị mất hoạt tính. Hoạt tính của a-Amylase
bị kìm hãm bởi các ion kim loại nặng như Cu^^, Ag"
a-Amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối, rượu loãna, hoạt
động tốt trong môi trường axit yếu (pH 5-7). Các a-Amylase có độ bền nhiệt
khác nhau, bền nhất là các enzim tách từ vi sinh vật.
- ỊỈ~Ámylase
Enzim này phân cắt các liên kết 1,4 glucozit từ đầu không khử của phân
tử polyxaccarit để tạo thành các phân tử maltose. Sản phẩm thuỷ phân bởi Ị3-
Amylase chủ yếu là maltose. ị3-Amylase không càn cho hoạt động của
mình (rất bền khi không có Ca^ ) nhưng hoạt động của nó cũng bị kim hãm bởi
lot pH thích hợp cho hoạt động của enzim trong khoảng 4-6. P-
Amylase kém bền nhiệt hơn a-Amylase; nó có phổ biến trong giới thực vật, đặc
biệt có nhiều trong hạt nảy mầm.
- Gìucoamyỉase
Glucoamylase là một exoenzim, thuỷ phân liên kết a-1,4 glucozit trong
phân tử polyxaccarit, tách tuần tự từng gổc glucose từ đầu không khử của đại
phân tử và có khả năng xúc tác thuỷ phân cả liên kết 1,6 glucozit. Glucoamylase
có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glycogen, dextrin, maltose thành
glucose mà không cần trợ giúp của các amylase khác. Đa số các glucoamylase
đã biết đều thuộc loại enzim "axit", thể hiện hoạt lực tối đa ở pH 3,5-4,5. Hầu

hết các glucoamylase bị mất hoạt tính khi đun nóng đến 70*^0, kém bền dưới tác
dụng của rượu etylìc, axeton. Glucoamylase có trong dịch tiêu hoá, trong gan
của người và động vật; trong hạt nảy mầm, đặc biệt trong môi trường nuôi cấy
các vi sinlì vật mà chủ yếu là chủng nấm mốc Aspergillus.
- Y nghía kinh tẻ - kỹ thuật của amyỉase
Amylase là enzim có ứng dụne; rộng rãi nhât. Hàns năm trên thế giới khối
lượng chế phẩm amylase được sản xuất lên lới hàng chục \ạn tấn và ngày càns
tăns. Amylase được dùnơ trona nhiều lĩnh vực như; Cỏn2 nehiệp thực phẩm, y
10
học, nông nghiệp Trong công nghiệp thực phẩm, việc sàn xuất rượu, bia được
cải thiện khi thay thế một phần phương pháp truyền thổng bằng sử dụng các chế
phâm amylase như việc dùng amylase của nâm môc hay vi khuân đê đường hoá
các nguyên liệu phi malt đã tiết kiệm được nguyên liệu cao cấp, tăng hiệu suất
rượu bia, giảm thời gian sản xuất, tăng năng suất lao động, giảm giá thành sản
phẩm.
Trong công nghiệp dệt: amylase được dùng để rửa hồ trước khi nhuộm
vải.
Trong y học: người ta dùng amylase để sản xuất glucose tiêm hoặc hỗ trợ
cho bừa ăn của người ốm nặng.
1.2.2. Proteinase
Proteinase cũng là các enzim thủy phân thuộc nhóm hydrolase, xúc tác
cho quá trình phân cắt các liên kết peptit trong các peptit hoặc protein có sự
tham gia của H2O (thuỷ phân protein).
Trong các proteinase, enzim tiêu hoá được nghiên cứu sớin nhất. Năm
1857, Corvisart đã tách được tripxin từ dịch tuỵ, đó là proteinase đầu tiên nhận
được ở dạng chế phẩm. Vào năm 1961, Bruke đã tách được pepxin từ dạ dày
chó.
Các proteinase ở thực vật được phát hiện muộn hơn và Wurtz là người
đầu tiên tách được proteinase ở thực vật vào năm 1879, đỏ là papain từ cây đu
đủ {Carica papaya). Từ nửa đầu thế kỷ 20 trở đi, nhờ áp dụng những phương

pháp mới, người ta đã phát hiện thêm nhiều proteinase khác như bromelain ở
dứa, catepxin ở mô động vật và đặc biệt nhiều proteinase khác nhau từ các giống
vi sinh vật Baciỉỉus, Aspergỉỉìus, Streptomyces
Việc phân loại và gọi tên enzim xúc tác cho phản ứng thủy phân protein
cũng thay đổi theo thời gian. Theo Grasman và Dykerhoff (1928), các enzim
nhóm này được phân loại như sau:
Proteinase
Protease
Peptiđase
11
Theo Bergman và Ross (1936), peptidase lại được chia thành 2 nhóm nhỏ
là: Enđopeptidase và exopeptidase.
Barret và Donald (1986) chia các enzim nhóm này như sau:
Endopeptidase (Proteinase)
Peptidase (Protease)-
Exopeptidase
Hartley (1960) lại phân chia proteinase thành bốn nhóm nhỏ theo cơ chế
xúc tác, nhưng do những hiểu biết mới về mặt hoá học trung tâm phản ứng của
nhóm enzim này, Barrett đã thay đổi cho phù hợp và được Uỷ bản Danh pháp
Quốc tế công nhận []. Theo cách phân loại này, các proteinase được chia thành 4
nhóm nhỏ; tên của các nhóm nhỏ này bao gồm cả tên của axitamin quan trọng
nhất có vai trò xúc tác trong trung tâm hoạt động của enzim, đó là:
+ Proteinase - serine (EC.3.4.21)
+ Proteinase - cysteine (EC.3.4.22)
+ Proteinase - Aspartic (EC.3.4.23)
+ Proteinase - Kim loại (EC.3.4.24)
- Proteinase - serine
Là những proteinase có nhóm -OH của gốc axitamin serin trong trung tâm
hoạt động (TTHĐ) có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của
enzim. Thuộc phân nhóm này gồm các enzim như tripsin, Chymotripsin,

Kalikrein, Hoạt độ của chúng bị kìm hăm mạnh bởi Diisopropylfluophotphat
(DFP) và nhiều protein đặc hiệu khác (ppí).
Các Proteinase - serine thường hoạt động mạnh ở vùng pH kiềm và chúng
có tính đặc hiệu tương đối rộng. Tính đặc hiệu thể hiện chúng chỉ phân cắt các
liên kết peptit về phía axitamin có chứa nhóm -CO- của liên kết bị phân giải. Vỉ
dụ tripsin thuỷ phân các peptit chứa nhóm -CO- của các axitamin kiềm như
Lysin, Arginin.
12
- Proteinase - cysteine
Trong trung tâm hoạt động của các enzim phân nhóm này thườna chứa
nhóm -SH. Nhóm -SH có vai trò quan trọng trong phân tử enzim vì nó có khả
năng phản ứng cao, tham gia vào sự tạo thành phức trung gian enzim - cơ chất,
kết hợp giữa cơ chất và cofactor, duy trì cấu hình của enzim.
Các proteinase - cysteine thường hoạt động mạnh ờ môi trường pH tmng
tính và có tính đặc hiệu rộng. Proteinase - cysteine chỉ hoạt động mạnh khi
nhóm -SH không bị bao vây. Vì thế các chất như: cysteine, axit ascorbic,
glutation khử ở nồng độ xác định có tác dùng làm bền, hoạt hoá các enzim này.
Một sô muối kim loại nặng, đặc biệt là các muối thuỷ ngân như HgCl2,
cloromercuriben-zoat (P-CMB) hay iodoaxetamit ức chế mạnh hoạt độ của các
proteinase - cysteine. EDTA có khả năng liên kểt với kim loại trong dung dịch,
vì vậy thường làm tăng độ bền của proteinase “ cysteine.
- Proteinase - Aspartic
Phân nhóm này gồm các proteinase có chứa các nhóm cacboxil (-C 00-)
trong TTHĐ. Nhóm cacboxit này thuộc mạch bên của Aspactat, glutamat, đóng
vai trò xúc tác trong TTHĐ của enzim.
Các proteinase- Aspartic thường hoạt động mạnh ờ môi trường pH axit và
bị ức chế bởi Diazo-axetyl norleucine metylester (DNME). Chúng có tính đặc
hiệu đối với các axitamỉn thơm hoặc axitamin kỵ nước ở cả hai phía của liên kết
peptit bị phân giải.
- Proteinase - kim loại

Là nhừng proteinase cần kim loại cho hoạt động xúc tác của chúng. Kim
loại có thể tham gia vào hoạt động xúc tác của enzim theo nhiều cách khác nhau:
là thành phần cấu tạo của enzim, hoặc tạo thành liên kết cộng hoá trị với các gốc
axitamin trong phân tử enzim. Ngoài ra một số ion, đặc biệt là Ca“~ thường có
tác dụng làm bền cẩu trúc không gian của phân tử enzim do đó có ảnh hưởng
đến hoạt động xúc tác của enzim.
Các proteinase kim loại hoạt động mạnh nhất ở môi trườna pH trunạ tính
và có tính đặc hiệu về phía gốc axitamin chứa nhóm -NH- của liên kết peptit.
Hoạt động của các proteinase - kim loại bị kìm hãm dưới tác dụng của EDTA, a-
phenantrolin.
Với việc phát hiện các proteinase mới, mỗi phân nhóm proteinase trên còn
bao gồm các họ enzim có thể có nguồn gốc rất khác nhau.
- ứng dụng của proteinase
Có hai cách chính trong sử dụng proteinase: (1) Điều hoà định hướng tác
dụng của enzim trong chính nguyên liệu chửa nó và (2) tách enzim ra khỏi
nguyên ỉiệu ở dạng chế phẩm và sử dụng trong các quá trình sản xuất và nghiên
cứu.
Sử dụng enzim theo cách thứ nhất trong nhiều trường hợp làm tăng giá trị
sản phẩm, ví dụ có thể dùng yếu tố nhiệt độ để điều chỉnh hoạt độ của một sổ
enzim trong cá, chè, thuốc lá làm tăng rõ rệt vị hương, màu sắc của sản phẩm.
Tuy nhiên, phạm vi ứng dụng enzim theo cách này thường bị hạn chế.
Sử dụng enzim theo cách thứ hai thì phạm vi ứng dụng rộng rãi hơn và
hiệu quả hofn. Theo cách này proteinase được dùng vào nhiều mục đích khác
nhau như; trong công nghiệp thực phẩm để chế biến bơ, phomat, sản xuất nước
mắm, sản xuất nước giải khát , trong công nghiệp dệt để hồ tơ, rũ hồ lụa, trong
công nghệ dược phẩm và y học dùng làm thuốc tăng khả năng tiêu hoá, tăng
chất lượng bột dinh dưỡng, làm thuốc tiêu viêm, thuốc uổng giảm đau (a-
chymotripsin) Đẻ phục vụ mục đích trên, ở nhiều nước đã hình thành và phát
triển mạnh ngành kỷ thuật sản xuất chế phẩm enzim.
Như vậy, việc nghiên cứu có nhóm chất riêng rẽ như lectin hay enzim

proteinase và amylase đã đưa lại những hiểu biết giá trị và các ứng dụng hiệu
quả trong đời sống xã hội. Mặc nhiên, trong sinh giới hay trong cơ thể sinh vật,
các chất không tồn tại độc lập, chúng có thể tương tác với nhau tạo sự chuyển
hướng trao đổi chất theo chiều có lợi cho sinh trưởng và phát triển của sinh vật.
Mặt khác, trong sử dụng các nguồn nguyên liệu tự nhiên cho mục đích kinh tế
hoặc đời sống, người ta cũng đã hướng tới sử dụng nhừng sản phâm tự nhiên có
tác dụng tăng cường như thuốc (các thực phẩm chức nãnạ). Nahiên cứu sự
tương tác giữa các chất, một mặt làm sáng tỏ vai trò của từng chất, mặt khác làm
tăng hiệu quả của sản phẩm sử dụnơ.
14
CHƯƠNG2
NGHIÊN CỨU LECTEV VÀ ENZIM
Như đã nêu ở trên (phần mở đầu) - Lectin và enzim được nghiên cứu
nhiều trên các đổi tượng động thực vật bậc cao hoặc vi sinh vật. Các đổi tượng
sinh vật bậc thấp như nấm, rong biển hay một số động vật biển chưa được quan
tâm nhiều, trong khi đó nguồn sinh vật này ở nước ta rất đa dạng và phong phú.
Đối tượng mà chúng tôi quan tâm là một số loài nấm lófn và một số sinh vật biển
được thu gom ở các vùng khác nhau trên cả nước.
Việc điêu tra nghiên cứu lectin, proteinase và amylase được tiến hành như
sau: phát hiện lectin trong nguyên liệu bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu máu
người; hoạt độ của proteinase và amylase được khảo sát theo phương pháp
khuếch tán trên đĩa thạch với các cơ chất tương ứng (cazein đối với proteinase
và tinh bột đối với amylase).
Đổi với hoạt độ của amylase, ngoài phưomg pháp khuếch tán trên đĩa
thạch, chúng tôi còn xác định hoạt động của enzim này bằng phương pháp
Wolgemuth có cải tiến (thực hiện trên bản nhựa có các hàng giếng nhỏ V =
0,2ml).
Hàm lưọng protein được xác định bàng phương pháp Lowry. Tinh sạch
một phần hay thu chế phẩm tinh sạch các protein có hoạt tính trên bàng phương
pháp sắc ký lọc phân tử qua cột sephadex hoặc/và cột trao đổi ion DEAE -

cellulose (DEAE - cel).
2.1. Kết quả nghiên cứu lectin ở một số loài nấm và sinh vật biển
Các nghiên cứu điều tra trước đây của chúng tôi đã phát hiện một số loài
rong biển và một sổ loài nấm lớn được nuôi trồng hoặc mọc tự nhiên chửa lectin
với hoạt độ ngưng kết tể bào hồng cầu naười (HAA) khá cao (bảna 1).
Lectin ở một số loài trên đã được tinh sạch và nghiên cứu các tính chất
đặc trưng.
Kết quả nghiên círu điều tra lectin ở một số động vật biển (bảns 2) cho
thấy lectin cũng khá phổ biển ở đối tượng này. Mặc dù không có tính đặc hiệu
nhóm máu người, trong sô 5 loài đã điêu tra có 4 loài chứa lectin và loài có hoạt
độ HAA cao nhất là Hải miên {Caỉlyspongia sp.)
Bảng 1. Hoạt tính lectin (HAA) của một sổ rong biển và nấm lớn
Loài sinh vật
HAA (đ\'/ml)
Nhóm máu nsưng kết
A B 0
Rong biển
1. Ulva congỉobovata Kjell (Rong cải biển)
160 320
320
2. Codium arabicum Kuetz (Rong đai Ả Rập)
4096 4096 8192
3. Enteromorpha tubulosa (Rong lục)
640 320
640
Nấm
4. Agaricus bisporus (Nấm mỡ)
5120 5120 5120
5. Copriniis sp. (Nấm mực)
640

320 640
ß.Naucoria sp.
1280 1280 1280
Bảng 2. Hoạt độ ngưng kết hồng cầu (HAA) của dịch chiết
từ một sổ động vật biển
Loài động vật biển
HAA (đv/mỉ)
Nhóm máu nsưns kết
A B
0
1. Labophytum ransonv (San hô mềm)
0 0
0
2. Alcyomim sp. (San hô mềm) 1280 320
320
3. Homaxineỉỉa sp. (Hải miên) 320
160
160
4. Caỉỉyspongia sp. (Hải miên) 20480 10240
10240
S.Teỉesto arhorea (San hô thân rỗng) 160
160
1
160
Ghi chú: Tên loài độns vật do TS. N2 U) ễn Huy Yết (Phân \ iện Hải dươns học
Hải Phòna) định loại.
Hai loài trong sô các loài đã điêu tra trên là nấm Naucoria sp. và Hải miên
Caỉlyspongia sp. được chúng tôi chọn để nghiên cứu tiếp theo về lectin.
- Tính đặc hiệu đường của ỉectin
Kêt quả nghiên cứu mức độ ức chế phản ứng ngưng kết tế bào hồng cầu

của lectin từ nấm Naucoria sp. và Hải miên bởi một sổ đường đơn và
oligoxacarit được trình bày ở bảng 3.
Bảng 3. Sự ức chế phản ứng ngưng kết hồng cầu máu người của nấm và
hải miên bởi đường
Loài sinh vật
Nồng độ tối thiểu của đường gây ức chế (mM)
Loại đường
Naucoria sp.
Caỉlyspongia sp.
D-Glucose >200 >200
D-Glucosamine >200
>200
Metyl-P-D-
Glucopyranoside
>200 >200
D-Mannose >200 >200
D-Galactose >200 >200
D-Galactosamine >200 >200
L-Fucose >200 >200
L-Rhamnose >200 >200
a-Lactose >200 25
p-Lactose
>200 200
Sacarose
>200 >200
Từ kết quả ờ bảng 3 có thể thấy tới nồng độ 0,2M, không có đườns nào
trong số 11 loại đườnơ được thử có tác dụng ức chế hoạt tính ngưng kết hồna
cầu của lectin từ nấm Naiicoria sp., tron2 khi đó đường Lactose có khà nănơ ức
OAi HOC q i k ; c S1A HA N(^|
"U'NG fHUtJG TIN THƯ VlÉN

chế hoạt độ ngưng kết hồng cầu của lectin từ hải miên Calỉyspongia sp., đặc biệt
là đồng phân a-Lactose ức chế khá mạnh (tới nồng độ 0,025M) gấp gần 10 lần
P-Lactose (0,2M). Việc không phát hiện thấy loại đường ức chế lectin từ nấm
Naucoria sp. có thể là do số loại đường được thử còn hạn chế, trong khi đó sự
ức chế hoạt độ ngưng kết của lectin từ hải miên bởi hai đồna phân của cùng một
loại đưòng với mức độ khác nhau có thể giả thiết là trong dịch chiết của hải
miên có thể tồn tại hai lectin khác nhau (các isolectin). Đây cũng là điều khá thú
vị vì nguồn sinh vật bậc thấp nói chung và sinh vật biển như hải miên khá phong
phú, nhưng chưa được nghiên cứu nhiều về lectin.
- Anh hưỏmg của nhiệt độ
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ ngưng kết hồng cầu của lectin từ hai
loài sinh vật trên được nghiên cứu bằng cách xử lý mẫu ở các nhiệt độ khác
nhau (30°c - lOO'^C) trong 30 phút trước khi tiến hành phản ứng ngưng kết hồng
cầu máu người như thường lệ. Ket quả nghiên cứu được trình bày ở bảng 4.
Bảng 4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ lectin từ nấm Naiicoria sp. và hải
miên Caỉlyspongỉa sp.
18
Từ bảng 4 và ảnh 1 thấy rõ lectin từ hai loài được nahiên cứu trên khá bền
nhiệt; ở nhiệt độ 70°c trong 30 phút, hoạt độ vẫn còn tóã 25-50%, đặc biệt lectin
của hải miên ở 80^c trong 30 phút vẫn biểu hiện tới 25% hoạt độ, thậm chí ở
100*^C vẫn còn duy trì được >5% hoạt độ. Đây cũng là điều kiện thuận lợi trong
việc bảo quản và xử lý mẫu khi khai thác đôi tượng này.
■ é ú ỳ ' '
Ảnh 1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính lectin từ hài miên
Callyspongia sp.
(M ầu được xử lý ở các nhiệt độ khác nhau trong 30 phút:
A - 30°c, B - 40^C, c - 50°c, D - 6 0'c, E - 70°c,
F - 80°c, G - 90°c, H - 100°C)
Do tính độc đáo của lectin từ hải miên, chúng tôi đi sâu nghiên cứu phô
protein và tinh sạch một phần lectin từ đôi tượng này.

Bằnơ phương pháp sắc ký lọc phân tử trên cột gel Sephadex G-100, dịch
chiết từ hải miên cho hai đinh protein chính, trong đó có một đinh kèm vai có
hoạt tính lectin; độ tinh sạch của lectin tăng lên 4,4 lần (hình 1, bảng 5). Như có
thể thấv trên hình 1, đỉnh protein có hoạt tính lectin được rút khoi cột đầu úên
19
chứng tỏ lectin có khôi lưọng khá lớn, và việc đỉnh protein này tách khôno rõ
ràng (kèm vai ổLnh) nói lên rằng có thể đây không chỉ gồm 1 loại lectin.
HÃÃỹlOtil
600 -
OD280
2.5
SỐ phân đoạn
Hinh 1 : sắc kí đồ qua cột sephadex G-100
- 2
1.5
- 1
0.5
0
-^5— HAA
♦ " Hàm lượng protein
Bảng 5. Tóm tắt kết quả sắc ký lọc phân tử dịch chiết hải miên
{Caỉỉyspongỉa sp.) qua cột Sephadex G-100
Mầu
Hàm lượne
protein
Hoạt độ tổna
số
Hoạt độ riêne (đv
HAAy'ma protein)
Độ

sạch
me
% đv HAA %
Thô (dịch
chiết)
12,50 100
102400
100 8192
1,0
Sau cột
2,51
20,1
90200 88,1
35936
4.4
Nghiên cứu phổ protein trong dịch chiết hải miên băng phương pháp sẳc
ký trao đổi ion trên cột DEAE- cellulose ÍDEAE - cel) (hình 2, bảng 6) cho thấy
20
ml
20
Sô phân đ(t
O
0,1
0,2
0,3 0,4 0,5
Protein
■ * n> HA A
0,6 1
NaCI (M)
H inh 2 ; sắc kí đồ qua CỘ I DEAE - C d