Tìm hiểu các Enzym bảo vệ ôxi hoá của nấm linh chi Ganoderma Lucidum

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC Tự NHIÊN
■ • • •
Tên đề tài:
TÌM HIỂU CÁC ENZYM BẢO VỆ ÔXI HOÁ CỦA NẤM
LINH CHI GANODERMA LUCIDUM
Chủ trì đề tài: Th.s Tạ Bích Thuận
Cán bộ tham gia: Th.s Đậng Quang Hưng
CN Phạm Kiên Cường
p T / õ ĩ ~0
Hà Nội - 2005
Báo cáo tóm tắt:
a. Tên đề tài: Tìm hiểu các enzym bảo vệ oxi hoá của Nấm Linh chi Ganoderma
lucidum
d. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu:
Mục tiêu:
Đóng góp thêm một số dẫn liệu về sự có mặt của một số enzym bảo vệ oxi hoá ở
nấm
Ganoderma lucidum như catalase, superoxid dismutase, NADH oxidase
trong điều kiện nuôi cấy phòng thí nghiệm và đi sâu nghiên cứu enzym NADH
oxidase của nấm Ganoderma lucidum
Nội dung:
- Đánh giá sơ bộ hoạt độ của các enzym bảo vệ oxi hoá cataỉase, superoxid
dismutase, NADH oxidase của nấm Ganoderma lucidum
- Bước đầu tinh sạch enzym NADH oxidase của nấm Ganoderma lucỉdum
- Nghiên cứu một số tính chất của enzym NADH oxidase của nấm Ganoderma
e. Các kết quả đạt được:
- Đánh giá tốc độ mọc của nấm Linh chỉ ở dạng quả thể và dạng sinh khối.
- Đánh giá hoạt độ các enzym catalase, superoxid dismutase, NADH oxidase
của nấm Ganoderma lucidum ở mẫu quả thể và sinh khối.
- Tinh sạch một phẩn enzym NADH oxidase của nấm Ganoderma lucidum

- Nghiên cứu về độ bền nhiệt, ảnh hưởng các ion kim loại, khả năng sinh H20
của enzym NADH oxidase từ nấm Ganoderma lucidum
f. Tình hình kinh p h í:
Mã số: QT -0 3 -1 6
b. Chủ trì đề tài: Ths Tạ Bích Thuận
c. Các cán bộ tham gia: Ths. Đặng Quang Hung
CN. Phạm Kiên Cường
lucidum
Tổng kinh phí đề tài là:
Thanh toán dịch vụ công cộng:
Vật tư văn phòng:
Hội nghị:
Chi phí thuê mưón:
Chi phí nghiệp vụ chuyên môn:
15.000.000 VNĐ
600.000 VNĐ
250.000 VNĐ
900.000 VNĐ
7.000.000 VNĐ
5.000.000 VNĐ
Summary
a) The title of subject: Investigation on some anti-oxidation enzymes of Ganoderm
lucidum
d) Objectives and contents.
* Objectives:
Contribute die additional data to the presence of several anti-oxidation enzymes in
Ganoderma lucidum, such as catalase, superoxiđe dismutase, NADH oxidase in
culturing conditions and further investigate NADH oxidase from Ganoderma
lucidum.
* Contents :

> Partial evaluation of the activity of anti-oxidation enzymes catalase,
superoxide dismutase, NADH oxidase from Ganoderma lucidum.
> Partial purification of NADH oxidase from Ganoderma lucidum.
> Investigate several characteristics of NADH oxidase from Ganoderma
lucidum.
e) The obtained results:
> Evaluation of the growth rate of Ganoderma lucidum fruit body and biomass.
> Evaluate the enzyme activity of catalase, superoxide dismutase, NADH
oxidase from Ganoderma lucidum fruit body and biomass.
> Partially purified NADH oxidase from Ganoderma lucidum.
> Investigation of thermastability, the effect of metal ion, the capable of
producing HzO of NADH oxidase from Ganoderma lucidum.
Numerical code: QT - 03 - 16
b) The grant holder: M.Sc. Ta Bich Thuan
c) The Participants: M.Sc. Đang Quang Hung
B.Sc. Pham Kien Cuong
XÁC NHẬN CỦA BAN CHỦ NHIỆM KHOA
(ký và ghi rõ họ tên)
CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI
(ký và ghi rõ họ tên)
XÁC NHẬN CỦA TRƯỜNG
tì G. 1 s .
c J Ỉ * s ỷ J u >
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU

1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2
1. Giói thiộu về nấm Linh Chi Ganoderma lucidum 2
1.1. Vị trí của nấm Linh Chi trong hộ thống phân loại

2
1.2. Đặc điểm sinh học của Ganoderma lucidum

3
2. Giới thiệu chung oxi hoá khử sinh học

4
2.1. Oxi hoá khử sinh h ọ c

4
2.2. Oxi và sự hình thành các hợp chất gây tổn thương oxi hoá
có chứa oxi

4
3. Các enzym bảo vệ tổn thương oxi hoá 7
3.1. Superoxide dismutase (EC 1.15.1.1) 7
3.2. Catalase (EC 1.11.1.6) 10
3.3. Các NAD(P)H oxidase (NOX)
11
NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

16
KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u


18
1. Đánh giá tốc độ phát triển của nấm Ganoderma ỉucidum ở điều kiện
nuôi cấy dịch thể 18
2. Đánh giá tốc độ phát triển của nấm Ganoderma lucidum ờ điều kiện
nuôi cấy cho ra quả thể 18

3. Xác định hoạt độ các enzym NADH, CAT, SOD cùa nấm
Ganoderma lucidum 19
3.1 Kết quả xác định hoạt độ enzym NADH oxidase (NOX) của
nấm Ganoderma lucidum 19
3.2 Kết quả xác đinh hoạt độ enzym catalase (CAT) của
nấm Ganoderma lucidum

20
3.3. Kết quả xác đinh hoạt độ enzym superoxit dismutase (SOD) của
nấm Ganoderma lucidum




21
4. Bước đầu tinh sạch và nghiên cứu một số tính chất của NOX từ
sinh khối nấm Ganoderma ỉucidum
21
5. Nghiên cứu một số tính chất enzym NOX của nấm Ganoderma lucidum 23
5,1 Độ bền nh iệt 23
5.2. Ảnh hưởng của một số ion kim loại 23
5.3. Xác định NOX của nấm Ganoderma lucidum là thuộc loại sinh
H20 hay sinh H20 2 24
THẢO LUẬN 25
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 28
TÀI LIỆU THAM KHẢO 29
MỞ ĐẦU
Nấm Linh Chi từ lâu đã được coi như là một loại thuốc dân gian có tác dụng
tăng cường sức khỏe và chữa trị nhiều loại bệnh như bệnh gan, thận, bệnh tiểu đường,
bệnh dị úng, bổ phổi, cắt cơn ho suyễn, điều hoà huyết áp, làm giảm lượng đường

trong máu, tăng cường thị lực, giảm colesteron, chống ỉão hoá và cố khả năng chống
oxy hoá cao. Nấm Linh Chi có những loài có khả năng tăng cường sự thải độc ở gan,
kích thích hệ thống miễn dịch hoạt động có hiệu quả cao. Các nghiẻn cứu y và dược
học cũng cho thấy các loài Linh Chỉ khác nhau cũng có thể sản sinh ra các loại hợp
chất sinh học khác nhau có khả năng biệt dược quý. Ngoài ra nấm Linh Chi còn có
thể kìm hãm sự sinh tổng hợp ADN mói của tế bào ung thư, kìm hãm sự phát triển của
các khối u, tàm giảm cơn đau củã các bệnh nhân đã di căn.
Trải qua thời gian dài trong lịch sử tiến hoá với biến động của thời tiết, khí hậu
môi trường, Linh Chi vẫn trường tồn và giữ nguyên giá trị siêu dược liệu của mình,
trên cả nhân sâm. Ở các nước Châu Á như Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc việc
nghiên cứu, phát trién và sử dụng Linh Chi đang được triển khai với quy mô rộng lớn,
cả về phân loại học, thu hái tự nhiên, nuôi trồng chủ động, nghiên cứu về các thành
phần hoá học, các hợp chất tự nhiên, tác dụng dược liệu và các phương pháp điều trị
lâm sàng.
Việt Nam với vị trí địa lý tự nhiên đặc biệt, có khí hậu nhiệt đới gió mùa, có
hệ động vật và thực vật đa dạng. Trong những năm gần đây, việc nghiên cứu Linh Chi
đã được nhiều nhà khoa học quan tâm dến, nhưng đi sâu tìm hiểu khả năng chống oxy
hoá và các quá trình bảo vệ tổn thương oxy hoá của nấm Linh Chi vẫn chưa được
nghiên cứu đến.
Với mục đích nhằm nghiên cứu, tìm hiểu đánh giá khả năng dược liệu sẵn có
của nấm Linh C h i, chúng tôi đã được giao thực hiện đề tài "Tim hiểu các enzym bảo
vệ oxi hoá của nấm Linh Chi". Đề tài nghiên cứu nhằm các mục đích sau: Xác định
hoạt tính của một số enzym chống oxi hoá như catalase, superoxid dismutase, NADH
oxidase của dịch chiết nấm Linh Chi. Nghiên cứu một số tính chất của 1 enzym bảo
vệ oxi hoá có hoạt tính cao của nấm Linh Chi. Thông qua các mục tiêu nghiên cứu
nhằm cho phép tìm hiểu thêm về các enzym chống oxi hoá của nấm Linh Chi.
1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. Giới thiệu về nấm Lỉnh Chỉ Ganoderma lucidum
ỉ.ỉ. Vị trí của nấm Linh Chi trong hệ thống phân loại

Các nấm Linh Chi trước đây được xếp vào trong nhóm nấm nhiều lỗ
(polypore). Lịch sử nghiên cứu hệ thống tự nhiên của họ Linh Chi có thể nói là lịch sử
nghiên cứu cấu trúc bào tử đảm của chúng. Từ 120 năm về trước, Karten, nhà nấm
học Phần Lan, lần đầu tiên đã tách từ các nấm polypore ra một nhóm nấm đặc biệt,
xây dựng nên chi nấm mới độc lập Gânoderma Karst theo kiểu bào tử đảm đặc trưng.
Đó là kiểu bào tử đảm có lớp vỏ kép, hình trứng cụt, bề mặt sần sùi mụn cóc, gò nhỏ,
nhờ đó việc phân loại các nấm Linh Chi đã tiến một bước quan trọng. Người ta dễ
dàng lọc ra từ các nhóm Polypore, Formes, Boletus các loài mà vị trí tự nhiên của
chúng là thuộc về Ganoderma, Chính Patouillard (1889) đã góp phần to lớn trong việc
khái quát kiểu bào tử đặc trưng của Ganoderma Karst Tuy rằng bản thân tên chi
này - derma nghĩa là lớp vỏ, gamo là láng bóng thể hiện nét chủ đạo về hình thái quả
thể bên ngoài vì đa số chúng đều có lớp vỏ láng bóng chói như màu vemi, màu từ
vàng - vàng cam - đỏ hung, nâu tím - nâu đen [4]. Tuy nhiên, tính đồng nhất cao về
cấu trúc bào tử của các loài trong chi này vẫn là đặc trưng cơ bản nhất
Quá trình phân hoá của Ganoderma Karst và Amauroderma Murr và mối quan
hệ chặt chẽ giữa chúng chủ yếu dựa vào cấu trúc đảm bào tử. Donk - nhà nấm học
Haỉan đã xây dựng nên họ Linh Chi Ganodermataceace Donk, lần đầu tiên được tách
khỏi họ polyporaceace và cho đến nay đã được thừa nhận rộng rãi [1]
Trong quá trình phân hoá dạng sống của các nhóm Ganoderma từ trên cây
xuống đất cùng với quá tìn h tiến hoá cấu trúc bào tử đảm, Linh Chi đã được phân
loại:
Giới nấm Mycetalia
Ngành nấm đảm Basiđiomycota
Lóp nấm đảm Basidiomycetes
Bộ nấm lỗ Aphyllophorales
Họ Linh Chi Ganodermataceace
Chi Ganoderma
Loài Ganoderma lucidum
2
1.2. Đặc điểm sinh học của Ganoderma lucidum

1.2.1. Đặc điểm hình thái
Nấm có quả thể có cuống dài, ngắn hay hầu như không có cuống. Mũ nấm dính
lộch hay dính bên, màu nâu đò, bóng loáng, mũ nấm dạng thận, đôi khi xòe hình quạt
hoặc ít nhiều dị dạng [4]. Trên mặt mũ có vân gợn đổng tầm và có tia rãnh phóng xạ,
màu sắc từ vàng nâu - vàng cam - đò cam - đỏ nâu - nâu tím - nâu đen mũ nấm sẫm
màu dần khi già. Đường kính tán biến động từ 2-30 cm, dày 0,8 - 2,5 cm. Thit nấm
dày từ 0,4 - 2 cm màu vàng kem - nâu nhạt - trắng. Khi ở dạng tươi, thịt nấm mềm,
dai, khi già khô chắc, cứng và nhẹ. Hệ sợi nấm kiểu trimitic, đầu tận cùng lớp sợi
phình hình trúng màng dày đan kít vào nhau tạo thành lớp vỏ láng phủ trên mặt mũ và
cuống.
1.2.2. Đặc điểm sinh sản của Ganoderma lucidum
Thể sinh sản là dạng ống, dày từ 0,2 - l,7cm gắn các ống nhỏ thẳng đứng,
miệng tròn trắng - vàng ánh xanh, có 4 đảm bào tử , hình trứng - trứng cụt. Bào tử giá
có vỏ với lớp cấu trúc hai lớp màng, màng ngoài nhẩn không màu, màng trong màu
nâu gỉ sắt, phát triển thành những gai nhọn vươn sát màng ngoài. Đường kính 5 - 6,5
X 8,5-11,5 cm [4]
1.2.3. Chu trình sống của Ganoderma lucidum
Các bào tử đảm đơn bội, trong điéu kiện thuận lợi nảy mầm tạo ra hệ sợi sơ cấp
(primary hyphase). Trong thực nghiệm tỷ lệ nảy mầm ở nhiệt độ 28 - 30°c khá thấp.
Hệ sợi sơ cấp đom bội mau chóng phát triển, phối hợp vói nhau (plasmogamie) tạo ra
hệ sợi thứ cấp (sợi song hạch dicargon hyphase) phát triển, phân nhánh rất mạnh, lan
khắp giá thể. Lúc này, thường có hiện tượng hình thành bào tử vô tính màng dày
(gasterospores - Chlamydospores). Chúng dễ dàng rơi ra và khi gặp điều kiện phù hợp
sẽ nảy mầm cho ra hệ sợi song hạch tái sinh [2]. Hệ scd thứ cấp phát triển mạnh đạt
tới giai đoạn cộng bào, tức là các vách ngăn (septum) được hoà tan. Tiếp đó là giai
đoạn sợi bện kết (mating) để chuẩn bị cho sự hình thành mầm mống quả thể. Đây là
giai đoạn phân hóa hệ sợi. Từ hệ sợi nguyên thuỷ phát triển thành các sợi cứng
(skeletal hyphase) màng dày, ít phân nhánh rồi thành cấu trúc bó được gắn chặt bởi
các sợi bện (binding) phân nhánh mạnh. Từ đó phát triển thành các mầm mống quả
thé màu trắng mịn vươn dài đến các trụ tròn mập. Dần dần phần đỉnh trục bắt đầu xoè

thành tán, cùng lúc đó lớp vỏ láng đỏ da cam dần xuất hiện. Tán lớn phát triển dần
3
thành bào tầng (hymenỉum) và bất dầu phát tán bào tử đảm liên tục cho đến khỉ nấm
già sẵm màu, khô tốp lại và lụi dần trong vòng 3 -4 tháng.
1.2.4. Các yếu tố sinh thái của Ganoderma lucidum
Nấm Linh Chi có thể mọc trên gốc, rễ cây sống và cây đã chết, trên rất nhiều
cầy gỗ mọc trong rừng hoặc các cây ăn quả, đặc biệt các cây trong bộ Đậu như lim
xanh, lim vàng, phượng vĩ đều bị nấm này xâm nhập. Là loài phần bố rộng, điều
kiện phát triển tốt của nấm ở dạng sợi là 28 - 30°c. Quả thể gặp rộ vào mùa mưa từ
tháng 5-11. Nấm mọc tốt trong bóng rợp, có ánh sáng khuếch tán nhẹ. Do có lớp vỏ
bóng láng mà nó có thể chụi nắng rọi và chụi mưa liên tục. Đối với hộ sợi nấm, nuôi
cấy trên môi trường dịch thể với nhiệt độ thích hợp từ 27 - 32°c, phát triển tốt ở pH từ
7 - 8,5. Sau 15 - 20 ngày phần sợi già bắt đầu ngả vàng và mầm quả thể rất dễ xuất
hiện [1]
1.2.5. Thành phẩn hoá dược cơ bản và đặc tính dược lý của Ganoderma lucidum
Vói các phuơng pháp thông dụng, người ta đã phân tích các hợp chất tự nhiên
chủ yếu có trong Linh chi thường thấy như
Nước : 12 - 13 %
Cellulose : 54 - 56 %
Lignine : 13 - 14 %
Hợp chất Nitơ : 1,6 - 2,1 %
Lipit: 1,9 - 2%
Hợp chất phenol 0,08 - 0,1%
Hợp chất sterol toàn phần : 0,11 - 0,16%
Saponin toàn phần : 0,3 -1,33
Akaloiđ và glucosid tổng s ố : 1,82 - 3,06%
Ngoài ra các hợp chất nhóm lacton cũng lên đến trên 2%, cùng với một số các
hợp chất khác [2]
2. Giới thiệu chung oxi hoá khử sinh học
2.1. oxi hoá khử sinh học.

Oxi hoá - khử là một quá trình mà trong đó có sự cho và nhận điện tử, các chất
có thể nhận được điện tử gọi là các chất oxi hoá, còn các chất có thể cho điện tử được
gọi là các chất khử.
Trong cơ thể sống thường xuyên xảy ra các phản ứng oxi hoá - khử và chúng
gắn liền với nhiều quá trình trao đổi chất, trao đổi năng lượng của tế bào và cơ thể.
Điển hình nhất của các phản ứng oxi hoá khử trong cơ thể chính là hệ thống các chuỗi
vận chuyển điện tử nằm trên màng ty thể hoặc lục lạp và các quá trình oxi hoá các
chuỗi axít béo. Chính từ những quá trình oxi hoá khử này mà các dạng oxỉ hoạt động
bao gồm gốc superoxide (0 2‘), peroxide hydro (H20 2) và gốc hydroxyl (*OH) được
hình thành. Sự tích luỹ các sản phẩm oxi hoá này ở nồng độ cao là nguyên nhân dẫn
đến các tổn thương oxi hoá của cơ thể sinh vật [7].
Ngoài các quá trình phản ứng oxi hoá diễn ra trong cơ thể dẫn đến sự hình thành
các hợp chất oxi hoá thì sự fác động của các yếu tố môi trường bên ngoài lên cơ thé
trực tiếp hoặc gián tiếp cũng có thể làm gia tăng sự hình thành các hợp chất oxi hoá.
2.2. Oxi và sự hình thành các hợp chất gây tổn thương oxi hoá có chứa oxi.
2.2.1. Vai trò của oxi đối với cơ thể sống.
Quá trình quang hợp xuất hiện cách đây khoảng 2,4 tỷ nãm và đó là một mốc
quan trọng trong sự tiến hoá của sinh giới. Sự tích luỹ ngày càng tăng lượng oxi đã
cho phép phát triển nhiều dạng hô hấp có sử dụng oxi một cách có hiệu quả. Những
dạng hô hấp này sử dụng oxi như là chất nhận điện tử cuối cùng để tạo ra H20 và
đồng thời giải phóng ra năng lượng cho các hoạt động của tế bào. Quá trình hô hấp có
sử dụng oxi đổng thời tạo ra một áp lực chọn lọc mà kết quả là sự hình thành các
enzym bảo vệ oxi hoá khác nhau trong các hệ thống sinh vật.
2.2.2. Cơ chế hình thành các dạng hợp chất có chứa oxi hoạt động
Oxi là chất có thế oxi hoá - khử cao nhất và ngược lại H20 là chất có thế oxi hoá
- khử thấp hơn nhiều so với phân tử oxi. Từ một phần tử oxi cần 4 điện tử và 4 proton
để tạo ra 2 phân tử HzO. Các mức phản ứng xảy ra như sau:
O2 + C —> 0 2* (gốc Superoxide)
0 2*+ e + 2H+ H20 2 (peroxide hydro)
H20 2 + e + H+ í; H20 + *OH (gốc hydroxyl)

OH* + e + H+ H20
Trong số các hợp chất trên thì 0 2*, H20 2, *OH được xếp vào các hợp chất chứa
oxi hoạt động. Ngoài ra thuộc vào nhóm các hợp chất có chứa oxi hoạt động còn có
các gốc khác nhau như NO*, N 02\ các alkyl tự do (R‘) hay các alkoxyl tự do (R0‘),
các peroxide hữu cơ (ROOH), ion oa* và các peroxynitrite (ONOOH)
Các gốc chứa 0X1 hoạt động là nhũng tác nhân gây ra sự tổn thương oxi hoá và
chúng được hình thành theo những cơ chế khác nhau
2.2.3. Các phản ứng quang động học
Sự hoạt hoá oxi có thể xảy ra qua các phản ứng quang động học để hình thành
các dạng oxi ỏ trạng thái singlet. Oxi ở trạng thái singlet có thể nhanh chóng phản
ứng với hầu hết các phân tử hữu cơ (RH), đặc biệt là các dạng chứa liên kết đôi của
các axit béo [29],
Ngoài ra, các oxi singlet cũng được hình thành từ các gốc o c r và H20 2 theo
phản úng sau:
0C1 + H2O2 —► '^2
2.2.4. Sự hình thành các oxi hoạt động bởi các kim loại chuyển tiếp và phản ứng
Fenton.
Một số ion kim loại trong cơ thé có thể tồn tại ở một vài trạng thái oxi hoá bên
cạnh trạng thái cơ bản và các điện tử từ các ion kim loại đó có thể chuyển vào các
phân tử oxi. Quá trình cho điện tử này dẫn đến hình thành các gốc superoxide (0 2*x
H20 2, *OH. Năm 1894 Fenton [29] đã mô tả H20 2 có khả năng oxi hoá các hợp chất
thơm với sự có mặt của các muối sắt (thuốc thử Fenton). Sau đó Haber và Weiss kết
luận rằng phản ứng của Fenton là do sự hình thành các gốc *OH theo các trình tự phản
ứng sau:
Fe2+ + H20 2 -> F e0 2+ + H20 .
Fe02+ + H+ -> FeOH3+ -> Fe3+ + ‘OH.
Fe2+ + H20 2 -> Fe3+ + OH + *OH.
Fe2+ + H+ + H20 2 Fe3+ + H20 + *OH.
*OH + H20 2 -> H20 + H+ + 0 2* 0 2* + H20 2 0 2 + OH + *0H
Fe3+ + H20 2 -> FeOOH2+ + H+ ^ Fe2+ + 2H+ + 0 2*

Sau khi các gốc tự do được hình thành từ các phản ứng Fenton thì quá trình phản
ứng của các gốc tự do đó có thể kích thích hình thành các dạng hợp chất oxi hoá khác
như peroxynitrite, o a Trong số này thì peroxynitrite (ONOOH) đóng vai trò quan
trọng trong việc khởi đầu quá trình peroxid hoá lipit, kìm hãm sự vận chuyển điện tử ở
6
ty thể, làm bất hoạt glyceraldehyde 3P dehydrogenase cũng như Na/K-ATPase và các
kênh Na+ trên màng.
3. Các enzym bảo vệ tổn thương oxi hoá
Để chống lại tác dụng tổn thương oxi hoá, các cơ thổ sinh vật có một số cơ chế
khác nhau trong đó điển hình là sự phát triển hệ thống các enzym triệt tiêu hay phân
huỷ các hợp chất oxi hoá
3.1. Superoxide dismutase ịEC 1.15.1.ỉ ).
Superoxide dismutase (SOD) là enzym có mặt ở hầu hết các cơ thể sống hiếu khí
và các bào quan có sự hình thành oxi hoạt động. SOD lần đầu tiên được tách bởi
Mann và Kellis vào năm 1938, lúc bấy giờ các tác giả này cho rằng đó là một protein
có chứa kim loại đồng (Cu2+). Sau đó người ta gọi enzym này với một số tên như:
erythrocuprein, indophenoloxidase hay tetrazolium oxidase. Đến năm 1969 Me Cord
và Fridovich [22] đã phát hiện ra chức năng xúc tác đặc biệt của enzym này và đặt tên
là superoxide dismutase (SOD) xúc tác cho phản úng biến đổi superoxide (02*) thành
peroxide hydro (H20 2) và oxi (0 2) theo các phản ứng như sau:
SOD-Cu2+ + 0 2* -> SOD-CuI+ + 0 2
SOD-Cu1+ + 2H+ -> SOD-Cu2+ + H20 2
Phương trình tổng quát là:
0 2* + 0 2* + 2H+ SQD > 0 2 + H20 2
Như vậy SOD có vai trò là trung tâm trong việc triệt tiêu gốc superoxide được
tạo ra bởi quá trình oxi hoá.
Về mặt di truyền thì tất cả các enzym SOD đều được mã hoá trong nhân và
chuyển đến cơ quan đích nhờ trình tự tín hiệu dẫn đường.
Các nghiên cứu của Farr và Kogoma [14] về cơ chế điều hoà biểu hiện của gen
SOD ở cơ thể tiền nhân (prokaryote) như E. coli cho thấy hoạt độ SOD được điều

khiển bởi operon SOD-RS.
Về mặt phân loại các enzym SOD đều cần có các ion kim loại cho hoạt động xúc
tác của chúng và dựa trên thành phần cofactor kim loại mà người ta chia SOD thành
các dạng khác nhau bao gồm:
- Các SOD có chứa Mn (MnSOD) có ở ty thể của giói nhân chuẩn (eukaryote), ở
các cơ thể tiền nhân (prokaryote) [5] và ở tế bào chất của Staphylococcus xyỉosus [8].
7
- Các SOD có chứa Fe (FeSOD) được phát hiện thấy ở lục lạp của thực vật như
tảo hay ở các tế bào tiền nhân (prokaryote) như E. coli và gần đây là ở Euglena
gracilis [8].
- Các SOD có chứa Cu và Zn (Cu/Zn SOD) có ở tế bào chất của nhỉéu loại vi
khuẩn khác nhau [15].
- Gần đây người ta phát hiện thấy SOD ở một số vi sinh vật kị khí bắt buộc có
chứa nickel (Ni) [16].
Các enzym này được tách riêng biệt trên các gel điộn đi polyacrilamide và hoạt
tính của chứng được phát hiện bằng phương pháp nhuộm và xác định đặc điểm dựa
trên độ nhạy cảm của chúng với các chất như KCN và H20 2. Trong đó MnSOD kháng
lại cả 2 chất kìm hãm KCN và H20 2, CuSOD nhạy cảm với cả KCN và H20 2, FeSOD
kháng với KCN nhưng lại nhạy cảm với H20 2.
Ngoài ra, các nghiên cứu của Tomomi còn cho thấy xuất hiộn các enzym SOD
ngoại bào đã được tách và tinh sạch từ mô phổi của chuột thí nghiệm [31], tuy nhiên
chưa thấy có báo cáo nào về các SOD ngoại bào ở thực vật.
a) Các SOD chứa mang an (MnSOD)
MnSOD là một nhóm enzym được tách ra từ ty thể - hệ thống oxi hóa
photphoryl hoá của tế bào nhân chuẩn (eukaryote) hay từ các tế bào tiền nhân
(prokaryote), Các MnSOD từ các vi khuẩn thuộc chi Streptococcus có cấu tạo dimer
phân tử với hai phần dưới đơn vị có khối lượng khoảng 20,7kDa. Khi so sánh với
FeSOD cũng được tách từ vi khuẩn này thì người ta thấy rằng chúng có một trình tự
22 amino axit giống hệt nhau vì vậy có thể tế bào đã có thể có cùng một cách thức để
tạo ra hai enzym này [21].

Enzym này trơ với tác dụng của HCN, hoạt động tối thích ở pH 8,8 và nó tương
đối bền với nhiệt với NaN3, H20 2, ditiothreitol và iodoacetamide Tuy vậy enzym bị
mất tới 50% hoạt động ở nồng độ P043', hay c r lOOmM [27],
b) Các SOD chưa sắt (FeSOD)
Martin và cộng sự [21] cho thấy rằng FeSOD ở tế bào chất vi khuẩn s. mutans
OMZ176 là một holoenzym có khối lượng vào khoảng 43kDa và mỗi phần dưới đơn
vị có khối lượng là 20,7kDa. Mỗi phân tử chứa 0,25 nguyên tử Fe/1 phần dưói đơn vị.
FeSOD bị mất tói 94% hoạt tính khi thẩm tách trong dung dịch o-phenanthroline và
8
ascobate natri. Theo các tác giả này thì trật tự axit amin của enzym này có dặc điểm
giống với trật tự axit amin của MnSOD cùng tìm thấy trong vi khuẩn đó.
Theo Meier và cộng sự thì trung tâm hoạt động của FeSOD có chứa khoảng 3
gốc histydine kết hợp ở dạng phối trí với ion Fe2+ đồng thời một phân tử nước cũng
liên kết với nguyên tử Fe2+
c) Các SOD chứa đồng và kẽm (Cu/ZnSOD)
Cu/ZnSOD lần đầu tiên được phát hiện ở Photobecter leiơgnathi và sau đó được
phát hiện ra ở hầu hết các vi khuẩn tiền nhân như Brucella abortus, Legionella sp, E.
coli [9], Neisseria meningitidis và một số đại diện của chi Haemophilus,
Actinobaccilus và Pasteurella, Salmonella sp [10]. Gen mã hoá và cấu trúc của
enzym này cũng đã được xác định.
Cu/ZnSOD là enzym có cấu trúc đặc biệt điển hình, dạng dimer có khối lượng
phân tử vào khoảng 32 kDa [15]. Các tiểu đơn vị liên kết với nhau thành một cấu trúc
cuộn gập, bên trong là hai nguyên tử Cu2+ và Zn2+ trong đó ion Cu2+ liên kết với 4
vòng imidazole của histidine 44, 46, 61, 118 và ion Zn2+ liên kết với 3 vòng imidazole
của histydine 61, 69, 78.
Hình 2: Cấu trúc không gian của CuZnSOD
9
3.2. Catalase (EC Ì.11.1.6).
Catalase là enzym chứa nhân hem, xúc tác cho phẳn ứng phân huỷ H20 2 tạo
thanh 0 2 và H20 [6]. Trong phản ứng phân huỷ H20 2 bởi catalase thì một phân tử

H2O2 đóng vai trò chất oxi hoá và 1 phân tử H20 2 đóng vai trò chất khử.
Catalase
2 H2Oj

2HzO + 0 2
Catalase được tìm thấy ở ữong tất cả các vi sinh vật hiếu khí, trong tế bào động
vật và thực vật- Hoạt độ catalase ở các IĨ1Ô động vật có vú khác nhau rất lứn. Người ta
thấy rằng đối vói các cơ thể động vật hoạt tính calalase cao nhất ở trong gan và thấp
nhất ở các mồ liên kết. Hồng cầu của người là nhóm tế bào giàu catalase, tuy vậy
hổng cầu của vịt thì hầu như không có hoạt tính enzym này.
Về mặt cấu tạo, cho đến nay các nghiên cứu chi tiết cho thấy rằng catalase chứa
nhân hem có cấu trúc bậc bốn gổm 4 tiểu đơn vị giống nhau {dạng tetrameric), mỗi
tiểu đơn vị có khối lượng phân tử là 60kDa và đều chứa một nhân hem. Do đó catalase
có chứa 4 nhóm ferriproporphyrin trên một phân tử và khối lượng phân tử tổng số xấp
xỉ 240kDa [6].
Azide natri (NaN3) là một chất ức chế đặc hiệu với catalase thông qua khả năng
liên kết đặc hiệu vói nhãn hem trong trung tâm hoạt động của enzym. Vì vậy azit natri
thường được sử đụng để làm ngừng phản ứng ữong thí nghiệm phân tích hoạt độ
catalase [32]. Bên canh azit natri thì catalase còn có thể bị ức chế bởi nhiều hợp chất
khác như là xianit, hydroxylamin, metanol
Catalase giữ một vị trí nhất định trong các cơ quan, nó tham gia vào hoạt động
điều chỉnh lượng H20 2 và là enzym đặc biệt trong peroxisome của gan. Trong hồng
cầu catalase và glutathion peroxidase cùng tham gia chức năng bảo vệ hemoglobin và
các protein có cầu disulfit [6].
Catalase với hoạt tính phân huỷ H20 2 nên có tác dụng làm giảm hiệu ứng Fenton
vốn có khả năng tạo ra gốc hydroxyl rất độc vói tế bào và cơ thể.
Trong các enzym xúc tác cho phản ứng phân hủy H20 2, ngoài catalase còn có
enzym khác như : pseudocatalase, peroxidase
Pseudocatalase là enzym đã được nghiên cứu kỹ ở vi khuẩn Lactobacillus
plantarum. Đâ)> là một dạng catalase không chứa nhân hem, vì vậy được gọi là

catalase giả hay pseudocatalase. Pseudocatalase là enzym khá giống với catalase về
cấu trúc và chức năng nhưng thay vì nhân hem ứong catalase thì pseudocatalase lại có
10
chứa mangan (Mn) [18]. Phản ứng mà pseudocatalase xúc tác cũng giống như cataiase
thực hiện, nghĩa là phân huỷ H20 2 thành H20 và giải phóng ra 0 2 mà không cần chất
khử.
Tương tự như cataỉase, peroxidase cũng là enzym xúc tác cho phản úng phân
huỷ H A . Trong khi sản phẩm tạo thành của cataỉase là 0 2 và H20 thì sản phẩm tác
dụng của peroxidase là HzO mà không hình thành 0 2. Khác với catalase, để xúc tác
phản ứng phân hủy H20 2, các peroxidase cần có chất khử. Phản ứng chung do
peroxidase xúc tác như sau.
H20 2 2H20
Chất cho ở trạng Chất cho ở trạng
Peroxidase tMl 0 « hoá
Peroxidase có mặt phổ biến ở trong các tế bào thuộc chi Streptococcus.
Coenzym khử của peroxidase ở Streptococcus thường là NADH, các enzym này còn
có tên là NADH peroxidase. Phản ứng phân huỷ H20 2 có NADH peroxidase xúc tác
sẽ tạo ra H20 và giải phóng NAD+. Do enzym cần coenzym khử vì vậy khi tế bào cạn
kiệt các nguồn chất khử thì enzym không thể giải độc bởi H20 2.
3.3. Các NAD(P)H oxidase (NOX).
NOX là một nhóm enzym xúc tác cho phản ứng oxi hoá khử với sự tham gia của
oxi phân tử và cơ chất khử NAD(P)H. Enzym này rất phổ biến ở nhiều loài sinh vật và
đã được nghiên cứu khá kỹ ở nhiều đối tượng khác nhau.
Các nghiên cứu về sự phân bố trên đối tượng động vật cho thấy enzym NOX
thường gắn trên bề mặt màng tế bào [24, 25], xuyên qua màng hoặc có thể có trong
huyết thanh. Khi nghiên cứu vể vai trò của NOX ở hệ thống động vật và con người,
Morre cho rằng NOX có thể được sử dụng như là một oxidase tận cùng của quá trình
vận chuyển điện tử trên bề mặt màng tế bào và khử các oxi phân tử thành các
superoxide và các superoxide này cũng được xem như là một trong các nguyên nhân
của stress oxi hoá .

Các nghiên cứu về hệ thống oxi hoá khử trên màng cho thấy có sự vận chuyển
các điện tử từ chất cho điện tử bên trong tế bào (như NADH) và vận chuyển chúng
đến chất nhận điện tử bên ngoài (như là oxi phân tử). Các hệ thống oxi hoá khử trên
màng có thể kết hợp với các con đường truyền tín hiệu khác để điều tiết sinh trường
của tế bào. Kết quả là sự sinh trưởng của tê bào có thể được kiểm soát hoặc không
11
được kiểm soát và dẫn đến các tế bào có thể tăng sinh bình thường hoặc cũng có thể
chuyển dạng thành các tế bào ung thư. Theo các nghiên cứu của Chueh thì NOX trên
màng tế bào có nhiẻu liên quan đến hệ thống oxi hoá khử trên màng và sự chuyển
dạng tế bào [11]. Tuy nhỉên chưa có nhiều dẫn liệu chi tiết về cơ chế tác động này.
Morre và Bridge [23] cho rằng NOX trong những tế bào chuyển dạng của động vật có
vú có những đáp úng với thuốc và có tính đặc hiệu ung thư, cụ thể là gen của enzym
này được hoạt hoá liên tục trong các tế bào chuyển dạng. Tương tự Keller và cộng sự
cho thấy NOX của các tế bào ung thư tỏ ra kháng với các protease, hay bromua
cyanogen và có nhũng tính chất tương tự như một prion. Những kết quả nghiên cứu
này gợi ý xem NOX như là đích của trị liệu. Theo các nghiên cứu của Morre và cộng
sự thì tác dụng chống ung thư của chè xanh có liên quan đến sự ức chế NOX trong các
tế bào ung thư bởi epigallocatechin gallate [23].
NOX cũng đã được phát hiện và nghiên cứu ở nhiều đối tượng thực vật khác
nhau điển hình là đối tượng dậu tương [24] và rau dền [25]. NOX của đậu tương bị
kích thích bởi auxin [24] và có thể đóng vai trò trong sự đáp ứng với những tác động
cơ học ỉên thực vật.
3.3.1 Phân loại NOX
Các nghiên cứu trên ở các hệ thống vi sinh vật cho thấy NOX của các vi sinh vật
chủ yếu thuộc vào hai nhóm. Một nhóm NOX xúc tác phản ứng oxi hoá một phân tử
NADH để tạo thành H20 2 (NOX1) và nhóm thứ hai xúc tác cho phản ứng oxi hoá hai
phân tử NADH để tạo ra hai phân tử H20 (NOX2).
NADH + 0 2 + H+ ———>Na+ + H20 2
2NADH + 0 2 + 2H+ n0x2> 2NAD+ + 2H20
Vị trí phân bố của enzym NOX cũng tuỳ thuộc từng loài vi sinh vật, đa phần

nằm trong tế bào chất, hoặc cũng có thể liên kết với màng tế bào như ở loài
Amphibacillus sp.
Saeki và cộng sự đã tinh sạch NOX của Bacillus megaterium bằng phương pháp
sắc ký ái lực trên gel 5’-AMP Sepharose và xác định được enzym có cấu trúc dimer
với khối lượng phân tử khoảng 52kDa và mỗi tiểu đơn vị có một phân tử FAD trong
trung tâm hoạt động, có 476 axit amin ở những tiểu đơn vị, thành phần các axit amin
cystein tryptophan ở mức thấp. Điều đặc biệt là NADH oxidase cửa Bacillus
megaterium không nhũng xúc tác đặc hiệu cho phản ứng oxi hoá NADH, mà còn xúc
12
tác cho cả phản ứng oxi hoá NADPH khi không bổ sung thêm FMN hoặc FAD vào
hỗn hợp phản ứng. Tuy nhiên, nếu bổ sung thêm 0,2 mM FAD thì phản ứng xảy ra
nhanh hơn (gấp 24 lần), Nếu bổ sung FMN để oxi hoá NADPH thì tốc độ phản ứng
chi tâng gấp 3 lần. Vấn đề này đến nay vẫn chưa được làm rõ. Những nghiên cứu về
NOX của Bacillus megaterium cho thấy NOX xúc tác cho phản ứng oxi hoá NAĐH
để tạo thành H20 2.
David và cộng sự khi tinh sạch NOX trên các đối tượng vi sinh vật khác như
Thermus aquatic us bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion trên gel DEAE-cellulose và
sắc ký ái lực AMP-Sepharose cùng vói phân tích cấu trúc enzym này và phát hiện thấy
NOX có cấu trúc dimer vói khối lượng phân tử khoảng 55kDa, mỗi dưói đơn vị có
chứa một phân tử FAD trong trung tâm hoạt động [12,13], thành phần FAD liên kết
rất chặt chẽ, nhưng cũng có thể bị phân tách không thuận nghịch ở pH thấp trong các
quá trình sắc ký kỵ nước. NOX của Thermus aquaticus xúc tác cho phản ứng oxi hoá
NADH để hình thành H20 2. Đặc biệt NOX của Thermus aquaticus còn có khả nâng
xúc tác cho phản ứng chuyển hoá hydroperoxide thành H20.
Hamada và cộng sự cho thấy NOX trên màng tế bào Amphibacilỉus sp là một
enzym có cấu trúc dimer với khối lượng phân tử khoảng 56 kDa. Enzym này cũng oxi
hoá NADH đổ tạo ra H20 2 và đặc biệt enzym hoạt động không cần sự có mặt của
FAD. Các tác giả này cũng đã xác định được nhiều hợp chất ảnh hường tới hoạt tính
của enzym. Trong đó axít 2,4,6-trinitro-benzenesulfonic ức chế hoàn toàn hoạt tính
enzym vì nó có khả năng thay đổi nhóm amino axít của protein như lyzin. Sự mẫn

cảm với axit này có thể giải thích bằng đặc điổm ưa kiềm của vi khuẩn và của enzym.
Nếu thay đổi nhóm carboxyl vào đầu N, N’-dicyclohexyl cacbodiimide và l-ethyl-3
(3-dimethyl amino propyl) cacbodiimide thì không ảnh hưởng tới hoạt tính. Khi
nghiên cứu trình tự amino axit đầu N:VFKIKRKQEGAH TVERKDRT,
thấy rằng chúng không tương đồng vói trình tự đầu N của NOX được tìm thấy ở các vi
khuẩn khác, chỉ có 7 trong 20 axit amin mang chức năng chính như lysine và cystein.
FAD (dạng khử) (dạng oxi hoá)
Hình 3: Vai trò của FAD trong NADH oxidase của Thermus aquaticus
NOX đã tinh sạch không có khả nãng xúc tác phản úng khử các đổng hydroperoxide
khi có AhpC.
Khác với những NOX của Amphibacillus sp, hay của Bacillus megaterium, NOX
của Streptococcus mutans có cả hai nhóm. Nhóm sinh H20 2 có cấu trúc tetramer gồm
4 tiểu đơn vị, khối lượng mỗi tiổu đơn vị khoảng 56 kDa và cần bổ sung FAD cho
hoạt động xúc tác. Nhóm sinh H20 có cấu trúc monomer với khối lượng phân tử
khoảng 50 kDa và có một phân tử FAD trong trung tâm hoạt động [17].
Cho đến nay vẫn còn nhiều ý kiến khác nhau về vai trò của các NOX trong các
hệ thống vi sinh vật. Theo Higuchi và cộng sự [17] cho rằng NOX của Streptococcus
mutans có vai trò bảo vệ cơ thể khỏi các tổn thương oxi hoá nhưng các tác giả này
cũng chưa đưa ra bằng chứng cụ thể là NOX đã tham gia như thế nào vào chức năng
này.
3.3.2 Vai trò của NOX trong bảo vệ tổn thương oxi hoá
Vai trò của các NOX ữong các hệ thống vi sinh vật đến nay vẫn là vấh để còn
nhiều tranh luận. Theo Higuchi và cộng sự [8] cho rằng NOX của Streptococcus
mutans có vai trò bảo vệ cơ thể khỏi các tổn thương oxi hoá nhưng các tác giả này
cũng chưa đưa ra bằng chứng cụ thể là NOX đã tham gia như thế nào vào chức năng
này. Tuy nhiên theo Carmela và cộng sự thì NOX có vai trò quan trọng trong trao đổi
chất hiếu khí của Streptococcus pyogenes và đặc biệt là khi sống trong môi trường
giàu oxi, hạn chế về hydrocacbon. Để làm sáng tỏ điều này các tác giả này đã tiến
hành gây đột biến bất hoạt gen mã hoá NOX đối với Streptococcus pyogenes và thấy
rằng nhũng thể đột biến sinh trưởng trong môi trường giàu dinh dưỡng, nồng độ 0 2

thấp thì không thể hiện sự khác nhau giữa dạng đột biến và hoang dại. Tuy nhiên,
những cơ thể Streptococcus pyogenes đột biến không thể sinh trưởng ở điều kiện giàu
oxi và tỏ ra mẫn cảm hơn đối vói H20 2. Đặc tính của các thể Streptococcus pyogenes
đột biến nuồi trong môi trường lỏng, trong điều kiện hạn chế cacbonhydrat và giàu
oxi được biểu hiện ở pha log. Ở đó, quá trình sinh trưởng giảm và tích luỹ một lượng
H20 2 trong môi trường sinh trưởng nhiều hơn so với chủng Streptococcus pyogenes
hoang dại. Đặc điểm này có thể được khắc phục bằng cách thêm glucose, hoặc bổ
sung enzym catalase vào môi trường nuôi cấy thể đột biến. Điều đó chứng tỏ NOX có
vai trò quan trọng trong trao đổi chất hiếu khí của Streptococcus pyogenes và cần thiết
khi Streptococcus pyogenes được nuôi trong môi trường giàu oxi, hạn chế về
hydrocacbon. Cũng theo Carmela và cộng sự thì NOX của Streptococcus pyogenes
xúc tác trực tiếp cho phản ứng nhận 4 điện tử của oxi thành H20 (quá trình khử) và
bảo vệ chất nhận điện tử trong suốt quá trình ừao đổi chất hiếu khí cùa sinh vật. Hơn
14
nữa, NOX khử trực tiếp oxi thành H20 không tạo thành dạng oxi phản ứng có hại, nó
bảo vệ các streptococcus nhóm A chống lại trạng thái stress oxi hoá.
Nói tóm lại, NOX là enzym thuộc hệ thống bảo vệ tổn thuơng oxy hoá của các
sinh vật. Tuy vậy sự tham gia của NOX như thế nào vào các quá trình bảo vệ là vấn
đề cẩn được đi sâu nghiên cứu.
15
NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u
Nguyên liệu :
Nấm Linh Chi Ganoderma lucidum - ký hiệu Gal dược lấy từ phòng Giống
nấm gốc của Trung tâm Công nghộ sinh học - Đại học Quốc Gia Hà Nội. Mâu quả thể
tuơi được nuôi trồng ở điều kiện tự nhiên sau khi thu hái được giữ ở -80°c và lấy ra
phân tích dần. Mẫu sinh khối sợi được thu hoạch và nghiên cứu ngay sau khi nuôi cấy
được 15-20 ngày [4].
Các hoá chất:
Xanthine, xanthine oxidase, cytochrome c, glucose, NaCl, glycerol, SDS,
Coomassie Brilliant blue (CBB), NADH oxidase được mua từ hãng Sigma. Các gel

DE-52, gel Sephadex G-100 mua từ hãng Pharmacia (Thuỵ Điển). Các hoá chất khác
đều đạt độ tinh sạch dùng cho phân tích.
Dụng cụ:
Dụng cụ chính dùng cho nghiên cứu bao gồm máy ly tâm Beckman (Mỹ),
Kubota (Nhật), Eppendoft (Đức), pH met của hãng Orion, máy đo quang phổ
Ultrospec 1000 của Pharmacia (Thuỵ Điển), bộ chạy điện di gel protein của Biorad
(Mỹ )
Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp nuôi cấy mẫu Ganoderma lucidum: Dạng bịch sản xuất ra quả
thể nấm. Dạng môi trường lỏng (glucose và khoai tây) để thu sinh khối nấm [1,2]
- Phương pháp tách chiết: Mẫu thu hái được bảo quản lạnh -80°c sau đó đem
nghiền mâu sinh khối trong cối xay, còn với mẫu quả thể được nghiền trong Nitơ
lỏng, Sau đó ngâm trong đệm chiết 15-20 phút ở 4°c. Ly tâm ở tốc độ 16000 vòng/
phút ở 4°c trong 15-20 phút. Thu dịch trong dùng để phân tích protein và hoạt độ
enzym, cùng các nghiên cứu tiếp theo.
- Protein được xác định theo phương pháp của Lowry, dùng albumin huyết
thanh bò làm chất chuẩn [3, 20]
- Hoạt độ SOD được xác định theo phương pháp McCord và Fredovich [22]
16
- Hoạt độ catalase được xác đinh theo phương pháp của Thibodeau và cộng sự
[30], cơ chất H20 2 còn lại được đinh lượng theo phương pháp của Mottola và cộng sự
- Hoạt độ của NOX được xác đinh theo phương pháp của Poole và Qairborme
- Điện di trên gel polyacrylamide được tiến hành theo phương pháp của
Laemmli [19]
- Tinh sạch enzyme bằng cột gel sắc ký trao đổi ion qua cột DE-52, sắc ký lọc
gel qua cột Sephadex G100 [12,13].
p Ĩ/35V
17
KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u
1. Đánh giá toc độ phát trien cửa nấm Gal ở điêu kiện nuôi cây dịch thể

Môi tnrờng lỏng tối thiểu dùng cho nuôi cấy nấm Gal cần có : Glucose - 20g,
khoai tây 300g, nước cất lift, pH 7.5. Khử trùng môi trường ở 1,2 at trong 20 phút sau
đó đem cấy giống thạch nghiêng vào môi trường- Hệ sợi của nấm Gal phát triển thích
hợp ở 26-28°C. Sau 18-24 giờ cấy, hệ sợi bắt đầu phát triển mạnh trên môi trường
nuôi cấy lỏng.
Hình4. Hệ sợi nấm Ganoderma lucỉdum
Chủng Ganoderma lucidum (Gai) có tốc độ sợi mọc từ 150 - 200 |im/h. Nấm
Linh Chi tuy mọc chậm song hệ sợi rất dày đặc và phân nhánh mạnh. Thường sau 15-
20 ngày nuôi cấy phẩn sợi già bắt đầu ngả vàng và mầm thể quả dễ xuất hiện.
2. Đánh giá tốc độ phát triển của nấm Gal ở điều kiện nuôi cấy cho ra quả
thể.
Sử dụng các loại mùn cưa sạch có bổ sung thêm dinh dưỡng như cám ngũ cốc,
vỏ hạt bông. Lưu ý nếu dùng mùn của gỗ lim nên dùng ở tỷ lệ nhỏ từ 10-20%. Để tạo
điều kiộn tốt cho quá trình hình thành quả thể của nấm, xử lý phối trộn giá thể vào túi
đem khử trùng. Để tránh độ tạp nhiẽm ban đầu của cơ chất tổng hợp, yêu cầu khâu
khử trùng giá thể cần phải kỹ và nhiều lần ở 121 °c trong 60 phút. Sau khi được giá
18
thể đã thanh trùng, (tem cấy giống thuần khiết vào giữa khối cơ chất. Nuôi ủ trong
buồng tối ờ nhiệt độ từ 25- 30°c.
Hình 5. Ganoderma lucidum dạng quả thể
Khi ười tối có thể mở cửa phòng nuôi trồng tạo điều kiện thoáng mát cho hộ
sợi nấm phát triển tốt. Sau khoảng 25-30 ngày nuôi cấy, hệ sợi nấm bắt đầu bện kết.
Lúc này cần chuyển bịch trồng nấm ra ánh sáng, nhiệt độ cần từ 25-28°C. Độ ẩm cần
từ 80- 90%. Mở nút bịch nấm tạo điéu kiện cho nấm hình thành và phát tán rộng. Sau
khoảng 2-3 tháng kể từ khi cấy giống, tán nám sẽ phát triển thành thục, mỗi bịch chỉ
cho 1-2 tán nấm lớn, năng suất thu hái lương đối thấp từ 2,5 - 4%.
3. Xác định hoạt độ các enzym NADH, CAT, SOD của nấm Ganoderma
lucidum (Gal)
3.1 Kết quả xác định hoạt độ enzym NADH oxidase (NOX) của nấm Gal
Kết quả xác đinh hoạt độ của enzym NADH oxidase nhìn trên hình 6 cho thấy

hoạt độ NOX của nấm Ganoderma ỉucidum nhìn chung là tương đối thấp, enzym này
khi thu ở dạng sinh khối cao hơn so với hoạt độ NOX ở dạng quả thể.
Khi xác định hoạt độ tổng số của enzym cho thấy NOX ở dạng sinh khối là
0,0047 đv/mgPr, còn ở dạng quả thể là 0,0028 đv/mgPr
19
Hoạt tính NADH
6
0
NOX sinh khối NOX quả thể
Hình 6. Xác định hoạt độ NOX của nám Ganoderma lucidum
3.2 Kết quả xác định hoạt độ enzym catalase (CAT) của nấm Gal
Catalase (CAT) là enzym chủ yếu giữ vai trò quan trọng phân huỷ các H20 2
trong hầu hết các cơ thể sinh vật. Khi xác định hoạt độ CAT của mẫu G al, kết quả
thu được ở hình 7 cho thấy hoạt độ của enzym CAT của nấm Gal nhìn chung là tương
đối mạnh, hoạt độ riêng CAT ở dạng quả thể là 2,331 đv/mgPr, còn ờ dạng sinh khối
là 2,319 đv/mgPr, nhìn vào biểu đồ ta thấy hoạt độ của enzym này ở dạng quả thể cao
hơn chút ít so với dạng sinh khối
2.34
Hoạt tính Catalase
£
e 2.33
^ 2.32
GJ-
2.31
CAT SINH KHỐI CAT QUẢ THỂ
Hình 7. Xác định hoạt độ của enzym catalase (CAT)
20