Nghiên cứu áp dụng kỹ thuật di truyền phân tử để chẩn đoán bệnh di truyền phổ biến ở người Việt Nam nhằm hạn chế hiệu quả gen bệnh và đề xuất hướng điều trị

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SINH HOC
NGHIÊN CỨU ÁP DỤNG KỸ THUẬT DI TRUYỂN p h â n t ử
ĐỂ CHẨN ĐOÁN BỆNH DI TRUYỂN p h ổ b i ế n ở n g ư ờ i
VIỆT NAM NHẰM HẠN CHÊ HIỆU QUẢ GEN BỆNH
VÀ ĐỂ XUẤT HƯỚNG ĐIỂU TRỊ
Mã số: QG -02,- 13
Chủ trì đề tài: TS. Võ Thị Thương Lan
Các cán bộ tham gia:
1. PGS.TS. Trịnh Hồng Thái - Khoa Sinh học, Trường ĐHKHTN-
ĐHQGHN
2. Ths. N guyễn Thi Trung - K hoa Sinh hoc, Trường Đ K H TN -
o J cr .
ĐHQGHN
3. Ths. Nguyễn Quỳnh Uyển - Truns tâm CNSH, ĐHQGHN
4. Ths. Lê Nhật Minh - Viện Vệ sinh Dịch tễ Hà Nội
5. BS. Trán Kiêm Hao - Đại học Y Hà Nội
ỉ là Nội - 2005
BÁO CÁO TÓM TẮT
1. Tên đề tài:
Nghiên cứu áp dụng kỹ thuật di truyền phân tử để chẩn đoán bệnh di truvền
phổ biến ở người Việt Nam nhằm hạn chế hiệu quả gen bệnh và đề xuất
hướng điều trị.
Mã số: QG-03-13
2. Chủ trì đề tài: TS. Võ Thị Thương Lan
3. Các cán bộ tham gia:
- PGS.TS. Trịnh Hồng Thái - Khoa Sinh học, Trường ĐHKHTN-ĐHQGHN
- Ths. Nguyễn Thị Trung - Khoa Sinh học, Trường ĐKHTN-ĐHQGHN
- Ths. Lè Nhật Minh - Viện Vệ sinh Dịch tễ Hà Nội
- Ths. Nguyễn Quỳnh Uyển - Trung tâm CNSH, ĐHQGHN
- BS. Trần Kiêm Hảo - Đại học Y Hà Nội

4. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu:
4.1. Mục tiêu:
- Sử dụng phương pháp đa hình ADN (PCR-RFLP) phân tích đột biến trên
intron 18 của gen mã cho yếu tố VIII liên quan đến bệnh di truyền gây khó đỏng
máu Hemophilia A. Trong điều kiện cho phép, kết quả được áp dụng chẩn đoán
trước sinh.
- Sứ dụng phương pháp nested-PCR và kết hợp với PCR-RFLP phân tích các
kiểu đột biến trên gen CYP21 liên quan đến bệnh tăng sản thượns thận bẩm sinh
gâv nam hoá. Kết quả có thể được áp dụng để xét nghiệm chẩn đoán.
4.2. Nội dung:
- Tách chiết ADN từ bệnh phẩm máu để dùng cho kỹ thuật PCR-RFLP với
các cặp mồi đặc hiệu nhằm phân tích các đột biến điểm cùa gen mã cho yếu tố
VIII liên quan đến bệnh máu khó đông.
- Tách chiết ADN từ tóc của bệnh nhi dùng cho kỹ thuật nested-PCR và
PCR-RFLP nhằm phát hiện đột biến điểm, dột biến mất đoạn trên gen CYP21 liên
quan 'tốn bênh táng sán thương thận bám sinh.
5. Các kết quà đạt được:
- Xây dim SI được plnrơim pháp đa hình ADN (PCR-RFLP) sử dụn2 enzvm
iỉiới hạn Bell tròn VÙIIÍI intron 18 của 2CI1 mã cho Yêu tố VIII xác định được nhũne
cá thê’ là các hà mẹ manu sen bệnh truyén cho con.
- Xây dựng được phương pháp đa hình ADN kết hợp với PCR-RPLP^sử
dụng enzym giới hạn Acil trên vùng exon 1 của gen CYP21 để xác định đột biến
điểm E1PL.
- Xây dựng được phương pháp nested-PCR sử dụng enzym giới hạn HhaẢ
trên vùng intron 2 của gen CYP2Ỉ để xác định đột biến I2g tại vị trí cắt nối exon-
intron.
- Xây dựng được phương pháp xác định nhanh đột biến mất đoạn 8 bp ở
exon 3 trên gen CYP21.
- Góp phần đào tạo 1 nghiên cứu sinh theo hướng nghiên cứu của đề tài (dự
kiến bảo vệ vào tháng 3/2006).

- Đã có 2 bài báo đăng trên tạp chí chuyên ngành.
6. Tình hình kinh phí:
Kinh phí được cấp: 60.000.000 đ
Kinh phí đã sử dụng: 60.000.000 đ
CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI
TS. Võ Thị Thương Lan
Cơ QUAN CHỦ TRÌ ĐỂ TÀI
Đại học Quốc Gia Hà Nội
SƯMMARY
1. The title project:
Application of molecular genetic methods in diagnosis of genetic deseases
in Vietnamese population for prevention of harmíul effects on the health.
Code number: QG-02,-13
2. Project Coordinator: Dr. Vo Thi Thuong Lan
3. Project members:
- Assoc.Pro.Dr. Trinh Hong Thai. Department of Biology. Hanoi Universitv of
Science, Hanoi National University.
- MSc. Nguyen Thi Trung. Department of Biologv, Hanoi Universitv of Science,
Hanoi National University.
- MSc. Nguyen Quynh Uyen. Center of Biotechnologv, Hanoi National University.
- MSc. Le Nhat Minh. Pasteur Institute of Hanoi.
- Dr. Tran Kiem Hao. Hanoi Medicine College.
4. The objectives and research contents:
4.1. The objectives:
- Application of PCR-RFLP method to analyse mutation in the intron 18 of
the gene encoding the factor VIII that involves in Hemophilia A.
- Application of PCR-RFLP and nested- PCR methods to analyse mutations
in the exon 1, intron 2 and deletion in the exon 3 of the gene CYP2Ỉ that involves
in the conơenital adrenal hyperpalasia.
4.2. The research contents:

- Isolation of DNA from blood for PCR with the speciíic primers of the
gene encoding the factor VIII that involves in Hemophilia A.
- Application of PCR-RFLP to detect mutation in the intron 18 of the gene
encodins the factor VIII.
- Isolation of DNA from hairs for nested-PCR and multiplex-PCR \vith the
speciíic primers of the gene encodins the 21 hvdroxylase that involves in the
consenital adrcnal hvperplasia.
- Application of PCR-RFLP to detect mutation in the exon 1. intron 2 and
clolction in the exon 3 ol the eenc cncodiim the 21 hvdroxylasc.
4
5. Main results:
- A method of PCR-RFLP using the restriction enzvm Bell for the intron 18
of the gene encoding the íactor VIII to detect mothers bearing the mutated aene.
- A method of PCR-RFLP using the restriction enzym Acil for the exon 1 of
the CYP21 gene to detect mutation in this exon.
- A method of nested-PCR in combination with PCR-RFLP using the
restriction enzym Hhaì for the intron 2 of the CYP21 gene to detect mutation in
this intron.
- A method of PCR to rapidly detect the deletion on the exon 3 of the
CYP21 gene.
- Two papers have been published/accepted.
- One Graduate student is being directed under the research direction of the
project.
Center of Biotechnologv Project Coordinator
TS. Vo Thi Thuong Lan
Project implementing Organization
Hanoi National ưniversitv
I. M ỤC LỤC
Trang
Lời mở đầu

7
Nội dung chính
9
Kết luận
27
Tài liệu tham khảo
28
Phụ lục
30
Phiếu đăng ký kết quả nghiên cứu
31
6
II M Ở ĐẨU
1. Bệnh ưa chẩy máu hay còn gọi là Hemophilia là một bệnh di truyền
gen lặn, liên kết nhiễm sắc thể giới tính X. Bệnh do thiếu các yếu tố đông
máu tham gia vào quá trình đông máu như yếu tố VIII (Hemophilia A) hoặc
yếu tố IX (Hemophilia B) [1, 2], trong đó thiếu hụt yếu tố VIII là chủ yếu.
Gen mã hóa tổng hợp yếu tố VIII (FVIII) nằm trên nhánh dài của nhiễm sắc
thể giới tính X (Xq28) có kích thước 186 kb bao gồm 26 vùng exon và 25
vùng intron [4]. Trên gen FVIII có các vị trí nhận biết của enzvme giới hạn
ổc/I/intron 18; Xbaĩ/intron 22; Hindỉỉĩ/ intron 19; ổg/1/intron 25; Mspl vùng
đuôi 3’ Đây là những marker được dùng để đánh giá sự bất thường của
FVIII gây ra bệnh máu khó đông [6, 7, 8]. Bước đầu, chúng tôi đã chọn
marker nhận biết bởi enzym Bell nhằm phân tích sự đa hình ADN trên vùng
intron 18 bằng phương pháp PCR-RFLP [5]. Kết quả mà chúng tồi nhận
được phần nào đáp ứng cho vấn đé cấp bách được đặt ra là cần xác định được
những bà mẹ mang gen dị hợp tử xhx và chẩn đoán sớm, có thể là ngay từ
giai đoạn bắt đầu mang thai, để có những biện pháp xử lý thích ứng với mỗi
trường hợp.
2. Bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) là bệnh di truyền lặn

[10, 14]. Đây là một tronơ những bệnh chuyển hoá thường gặp nhất, đặc
trưng bởi sự thiếu hụt hoạt tính của một trons các enzym cần thiết cho quá
trình sinh tổng hợp cortisol; 21-hydroxylase (21-OH), 1 lp-hydroxylase (11-
OH), 17-hydroxylase (17-OH), 3P-HSD và 20-22 Desmolase [10]. Hầu hết
(90-95%) các trường hợp mắc bệnh TSTTBS là do thiếu hụt enzym 21-OH.
Giám thiểu lượng enzym 21-OH tác động nghiêm trọng đến tổng hợp
cortisol của thượng thận, khiến phần lớn aldosterone bị thiếu hụt, dẫn đến
tănti tiết ACTH tuyến yên và sán xuất thừa anđroơen. Enzym 21-OH được
mã hoá bời sen CYP2Ỉ nằm trên nhiễm sác thể sỏ' 6p 2ỉ-3, chiều dài khoảng
3 kb vù gồm 10 exon. Đột biến tròn gen này xảy ra chủ yếu tại exon 1, intron
2, và mất đoạn trên cxon 3 [14. 17]. Bước đáu chúng tôi sử dụng phươns
pháp PCR-RPLP và nesteđ-PCR với các cặp mồi dặc hiệu để phân tích
nhữim đột biẽn hay iiặp nàv [14, 15, 18]. Két quá chúng tỏi nhận được phục
vụ cho cỏn2 tác chan đoán sớm. Điéu này rất có ý nahĩa trons phát hiện
7
bệnh và điều trị thích hợp, hạn chế nguy cơ tử vong do suy thượng thận cấp.
Bên cạnh nguy cơ tử vong cao, bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh dẫn đến
hiện tượng nam hoá ở trẻ gái, giả dậy thì sớm, gây ảnh hưởng nặng nề đến sự
phát triển thể chất, chức năng sinh dục, sinh sản, tâm lý của bệnh nhi và gia
đình.
8
r a NỘI DUNG CHÍNH CỦA ĐỂ TÀI
Đề tài được tiến hành với hai bệnh: bệnh máu khó đông Hemophilia A
và bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh.
* Bệnh máu khó đông Hemophilia A là một bệnh di truyền gen lặn.
Đại đa số bệnh nhân (>90%) mắc bệnh này do đột biến trên gen mã cho yếu
tố FVIII. Gen này nằm trên nhiễm sắc thể giới tính X. Do đó, bệnh chỉ được
biểu hiện ở người con trai khi người mẹ mang gen mã cho yếu tố FVIII bị
đột biến. Trên gen FVIII có một số dấu chuẩn là những vị trí nhận biết của
enzyme giới hạn Bc/I/intron 18, A7x/I/intron 22, Hindỉĩỉ/ intron 19,

#g/I/intron 25, Msp\ vùng đuôi 3’ Đây là những dấu chuẩn cho phép đánh
giá được sự bất thường của FVIII gây ra bệnh máu khó đông. Bước đầu,
chúng tôi đã chọn dấu chuẩn nhận biết bởi enzym Bell nhằm phân tích sự đa
hình ADN trên vùnơ intron 18 bằng phương pháp PCR-RFLP. Mẫu ADN
được tách từ mẫu máu lấy từ các bà mẹ và của bệnh nhân nam (con trai).
* Bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) cũng là bệnh di
truyền lặn. Hầu hết bệnh nhân TSTTBS liên quan đến đột biến trên gen
CYP21 nằm trên nhiễm sắc thể thường. Đột biến xảy ra trên gcn này chủ yếu
ở exon 1, intron 2 và mất đoạn ở exon 3. Vì vậy chúng tôi phân tích cả 3 loại
đột biến này sử dụns ADN tách từ mẫu tóc của một số bệnh nhân trẻ em,
một số là trẻ sơ sinh bị mất muối, suy thận cấp được chẩn đoán mắc bệnh
TSTTBS. Do hầu hết bệnh nhàn nhỏ tuổi (2 tháng-5 tuổi) nên chúng tôi áp
dụng phương pháp tách chiết ADN từ mẫu tóc chứ không lấy máu nhằm
giam thiếu đau đối với bệnh nhân và lượng mẫu không đòi hỏi nhiều.
Dưới đây chúng tôi xin trình bày tóm tắt những kết quả m à đề tài đạt được.
1. B ỆN H M ÁU K HÓ Đ Ô N G H E M O PH IL IA A
1.1. Đối tuọng cho máu:
Chín bà mẹ và 9 ncười con trai (đéu bị m ắc bệnh máu khó đông
H em ophila A) dược chọn làm đối tượng nghiên cứu.
9
1.2. Tách chiết ADN genom e từ máu: ■
Năm ml máu được lấy từ mỗi đối tượng nghiên cứu. Máu được chống
đông bằng EDTA lOmM. Thêm 15 ml dung dịch phá vỡ tế bào hồng cầu và
trộn đều bằng lắc nhẹ. ủ mẫu trong đá 30 phút cho đến khi hồng cầu ly tan
hết. Ly tâm thu cặn là các bạch cầu có nhân. Các tế bào bào bạch cầu được
dùng để tách ADN thông qua các bước sử dụng dung dịch phá vỡ màng
nhân, phân hủy protein bằng proteinase K và tủa ADN bằng isopropanol.
Bước cuối cùng, ADN được rửa với cồn 70% và hoà trong 400 ul đệm TE.
ADN này được sử dụng trong phản ứng PCR.
1.3. Phản ứng PCR:

Phản ứng PCR được thực hiện với cặp mồi đặc hiệu cho vùng intron 18
để nhân bản đoạn tương ứng từ gen FVIII trong ADN genome. Do phản ứng
PCR rất nhạy với sự thay đổi nồng độ các chất tham gia phản ứng, nhiệt độ
gắn mồi, số chu kỳ nhân bản nên chúng tôi đã tiến hành các thí nghiệm
thăm dò tìm điều kiện tối ưu cho phản ứng. Chúng tôi tìm được điều kiện tối
ưu cho phản ứng ở thể tích 50 ul như sau: 5ịi1 ADN khuôn; 200|iM dNTPs;
l,5mM MgCl2; 0,5 u Taq; lịil mỗi loại mồi nồng độ 40nM; 5|il đệm PCR.
Phản ứng PCR thực hiện trên máy Amp Gen 9700 với chương trình 94°C- 7 ’;
30 chu kỳ: 94°c - 1’; 58°C-1’; 72°c -1’; 720C 10 phút; 4°C-20\ Trình tự cặp
mồi đặc hiệu được trình bày trên Bảng 1.
Báno 1: Trình tự cặp mồi đặc hiệu của °en FVIII dùng trong phàn ứng PCR để
phát hiện đột biến gây bệnh máu khó đông Hemophilia A.
Gcn FVIII
Mồi 8.1
5' TAAAAGCTTTAAATGGTCTAGGC 3’
Mồi 8.2
5' TTCGAATTCTGAAATTATCTTGTTC 3'
10
1.4. Kết quả nghiên cứu:
1.4.1. Kết quả phản ứng PCR:
ADN tách từ các bệnh nhân Hemophilia A và các bà mẹ được dùng
trong phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu 8.1 và 8.2. sản phẩm sau phản ứng
được điện di trên gel polyacrylamide 10%, 100V trong 60phút. Gel được
nhuộm bạc để quan sát các băng ADN. Kết quả được trình bày trên Hình 1.
Kết quả cho thấy sản phẩm PCR là đoạn ADN có độ dài 142 bp được nhân
bản từ các mẫu bệnh phẩm nghiên cứu. Những sản phẩm PCR của bệnh nhân
và bà mẹ sẽ được phân tích tính đa hình bằng phản ứng cắt với enzym giới
hạn Bell để xác định cá thể mang gen bệnh máu khó đông.
MI 1 2 3 4 5 6 7 8 M
\ ~ ~

" — _ _ _
>
i
194
118bp
147bp
Hình 1: Kết quả PCR với cặp mồi 8.1 và 8.2 của các mẫu bệnh phẩm. M l: Thang
ADN 4>x \14Haellh M2: Thang ADN pBR322 MspV, Các mẫu từ số 1 đến số 7:
Sản phẩm PCR của bệnh nhân Hemophilia A. Mẫu số 8: đối chứng dương.
1.4.2. Kết quả phản tích RFLP của intron 18 bằng emzym giới hạn Bell:
Sán phẩm PCR, đoạn ADN có kích thước 142 bp, được tiến hành phân
tích tính đa hình bằng phản ứng cắt với enzym giới hạn Bell. Đoạn ADN dài
142 bp thuộc vùn2 intron 18 trên nhiễm sắc thể X bình ihường có một vị trí
nhận biết của enzym ni ới hạn Bell tại nucleotit thứ 99. Do đó nó sẽ bị cắt
thành hai đoạn ADN có chiều dài tương ứng là 99 bp và 43 bp. Khi xảy ra
đột biến điếm làm thay đổi trình tự tại vị trí nhận biết của BclI, đoạn ADN
1.4. Kết quả nghiên cứu:
1.4.1. Kết quả phản ứng PCR:
ADN tách từ các bệnh nhân Hemophilia A và các bà mẹ được dùng
trong phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu 8.1 và 8.2. Sản phẩm sau phản ứng
được điện di trên gel polyacrylamide 10%, 100V trong 60phút. Gel được
nhuộm bạc để quan sát các băng ADN. Kết quả được trình bày trên Hình 1.
Kết quả cho thấy sản phẩm PCR là đoạn ADN có độ dài 142 bp được nhân
bản từ các mẫu bệnh phẩm nghiên cứu. Những sản phẩm PCR của bệnh nhân
và bà mẹ sẽ được phân tích tính đa hình bằng phản ứng cắt với enzym giới
hạn BclI để xác định cá thể mang gen bệnh máu khó đông.
3 4 5 6 7 8 M
— — ^ —* <■* — * v ế
194 bp
__

118 bp — L j V
___

_____

___
«—J *- 147bp
Hình 1: Kết quả PCR với cặp mồi 8.1 và 8.2 của các mẫu bệnh phẩm. M l: Thang
ADN (Ị)X MAHaeYlh M2: Thang ADN pBR322 Msph Các mẫu từ sô' 1 đến số 7:
Sản phẩm PCR của bệnh nhân Hemophilia A. Mẫu số 8: đối chứng dương.
1.4.2. Kết quả phân tích RFLP của intron 18 bằng emzym giói hạn Bell:
Sàn phẩm PCR, đoạn ADN có kích thước 142 bp, được tiến hành phân
tích tính đa hình bàng phán ứng cắt với enzym giới hạn Bell. Đoạn ADN dài
142 bp thuộc vùng intron 18 trên nhiễm sắc thể X bình thường có một vị trí
nhận biết của enzym ciới hạn Bell tai nuclcotit thứ 99. Do đó nó sẽ bị cắt
thành hai đoạn ADN có chiéu dài tương ứng là 99 bp và 43 bp. Khi xảy ra
đột biên điếm làm thay đổi trình tư tai vị trí nhận biết của Bell, đoạn ADN
11
không bị cắt và giữ nguyên chiều dài 142 bp. Như vậy tính đa hình độ dài
các đoạn ADN cắt với enzym giới hạn Bell (PCR-RFLP) gồm các đoạn ADN
có kích thước 142 bp; 99 bp và 43 bp. Kết quả này cho thấy hoàn toàn có thể
sử dụng đa hình BclI/ intron 18 để xác định những cá thể mang đột biến, đặc
biệt xác định những bà mẹ dị hợp tử đối với gen bệnh có khả năng truyền
gen bệnh cho con trai gây nên trạng thái bệnh lý ở người con. Kết quả trình
bày trên Hình 2.
i m ■ ' '
Hình 2: Kết quả điện di và phân tích PCR-RFLP. Ml: ADiN chuẩn (Ị) X I74 Híieĩĩh
M2: thang ADN chuẩn pBR 322 Msp\. Mẫu số 1-2: cặp me con thứ 1; mẫu số 3-4:
cặp mẹ con thứ 2; mẫu số 5-6: cặp mẹ con thứ 3; mẫu số 7-8: cặp mẹ con thứ 4.
Phân tích kết quả đa hình của những cặp mẹ con trên Hinh 2 cho thấy:

a/ Với cặp mẹ con thứ nhất (mẫu số 1: người con trai; mẫu số 2: người
mẹ) và cặp mẹ con thứ tư (mẫu sô' 7: người con trai; mẫu số 8: người mẹ)
cho thấy rõ tính đa hình của các cá thể. Theo kết quả RFLP của hai người mẹ
này thì đột biến xay ra trên một nhiễm sắc thể giới tính X tại vùng khống mã
hoá intron 18, thuộc đoạn ADN dài 142bp được nhân lên bằng phản ứng
PCR. Đột biến nàv tưưnu ứng với sự thay đổi nucleotide làm mất vị trí nhận
biết của enzym ciới hạn Bell. Kết quá là một đoạn ADN dài 142 bp vẫn được
giữ nguyên, không bị cắt bởi Bell. Như vậy, có thể kết luận được người mẹ
có kiểu gen x hx và là người mang gen bệnh.
Đổng thời phân tích RFLP trên Hình 2 ở hai người con trai (mẫu sô 1
và mẫu số 7) của hai bà mẹ này cho thấy chỉ có duy nhất một đoạn ADN
kích thước 142 bp. Kết hợp với sô liệu được cung cấp về tình trạng mắc bệnh
máu khó đông Hemophilia A của những người con trai này, chúng tôi có thể
đi đến kết luận chính xác rằng: người con trai nhận một gen tổn thương x h từ
mẹ và có kiểu gen là XhY và biểu hiện kiểu hình bệnh máu khó đông.
Tổng hợp lại có thể nhận định chính xác về tình trạng bệnh ở hai cặp
mẹ con thứ nhất và thứ tư như sau: cả hai người mẹ có kiểu gen dị hợp tử
x hx. Người mẹ mang gen bệnh và truyền gen đó cho con trai mình tạo nên
kiểu gen XhY gây nên bệnh máu khó đông.
b/ Với cặp mẹ con bệnh nhân thứ hai (mẫu số 3: con trai và mẫu số 4:
người mẹ) chỉ có một đoạn ADN 142bp. Kết quả này cho thấy trên nhiễm
sắc thể X không có vị trí nhận biết của enzym giới hạn Bell. Có thể kết luận
người mẹ có kiểu gen đổng hợp tử x hx h do đột biến xảy ra trên cả hai nhiễm
sắc thể giới tính làm mất vị trí nhận biết của enzym giới hạn Bell. Nếu vậy,
người mẹ phải bị bệnh máu khó đông. Những trường hợp người phụ nữ mang
gen đồng hợp tử x hx h có biểu hiện bệnh rất nặng và vô cùng hiếm hoi. Trên
thế giới hiện nay chỉ ghi nhận 10 trường hợp phụ nữ bị bệnh máu khó đông
và những người này thường chết từ độ tuổi rất sớm do mất máu nhiều lần
trong đời sống sinh lý binh thường có ở bất kỳ người phụ nữ nào. Tuy nhiên
những thông tin lâm sàng chỉ ra rằng ở người mẹ ở cặp thứ hai không phải

như vậy. Kết quả với bà mẹ thứ hai có thể được giải thích như sau: Đoạn
ADN dài 142 bp ớ đây không bị cắt có thể do nhiểu lý do như enzvm giới
hạn không hoạt độns, có chất ức chế trong phản ứng, hoặc do sai sót trong
quá trình nhân bản ADN Hơn nữa, tần số đa hình cho mỗi chỉ thị không
phái hoàn toàn là 100%. Do đó, chưa thể kết luận được người mẹ mang gen
đổnơ hợp tử xhxh vì có thế vi trí của enzym giới hạn Bell trên vùng không
mã hoá intron 18 ở người mẹ này là trường hợp đặc biệt. Trong những trường
hợp như vậy một tro nơ những hướng suy nghĩ tiếp theo mà chúng tôi mong
muốn được tiến hành là xác định trình tự đoạn ADN này. Ngoài ra, người
13
con trai bị bệnh máu khó đông nên cần làm thêm một số chỉ thị khác như
enzym giới hạn Xbal trên vùng không mã hoá intron 22, enzym giới hạn
Hindỉll trên vùng không mã hoá intron 19, enzym giới hạn BglI trên intron
25
c/Với cặp mẹ con bệnh nhân thứ 3 (mẫu số 5: con trai; mẫu sô 6:
người mẹ) có thể kết luận cả hai mẹ con đều không mang đột biến ở vị trí
nhận biết của Bell. Do đó, băng ADN 146 bp của người con bị phân cắt bởi
BclI thành hai đoạn ADN 99 bp và 43 bp. Kết quả này chỉ ra rằng nhiễm sắc
thể X là bình thường với chỉ thị enzym giới hạn BclI. Tuy nhiên kết hợp
thông tin lâm sàng, người con trai bị bệnh máu khó đông Hemophilia A như
vậy là nhiễm sắc thể X của người con trai này phải là không bình thường.
Kiểu gen XhY biểu hiện bệnh là do nhận một nhiễm sắc thể X tổn thương từ
mẹ nhưng đột biến không xẩy ra ở vị trí của Bell mà ở vị trí khác. Điều này
cũng phù hợp khi phân tích tính đa hình của người mẹ. Kết quả trên Hình 2
cho thấy người mẹ chỉ có hai đoạn ADN là 99 bp và 43 bp. Như vậy cả hai
nhiễm sắc thể X của người mẹ này là bình thường ở vị trí Bell. Muốn có
những kết luận chính xác về tình trạng bệnh máu khó đông của cặp mẹ con
này cần tiến hành phân tích thêm ở những chỉ thị khác tương tự như đã nêu
trong trường hợp cặp mẹ con thứ hai. Nếu kết quả phân tích tính đa hình với
người mốich kết quả bình thường thì có thế đưa đến một kết luận khác:

nhiễm sắc thể X của mẹ là hoàn toàn bình thường. Người con trai mắc bệnh
máu khó đông có thể là do đột biến tự phát xảy ra trong quá trình hình thành
tế bào sinh dục (ở nsười mẹ). Các đột biến mất đoạn hay đột biến điểm có
thể xảy ra khi người mẹ sinh con ở tuổi quá 35 hoặc trạng thái sức khoẻ
không tốt.
1.5. Kết luận:
Như vậy là có 4/9 2 Ĩa dinh; (44,44%) bà mẹ xác định được sự di hợp
tử về bệnh Hemophilia A (XhX) và truyền gen bệnh đột biến trên vùng intron
18 liên quan với enzvm ciới hạn Bell sang cho con của mình. Tí lệ này cũng
khôn" nhỏ khi so với các quẩn thế dân cư khác trong khu vực như Trung
Quốc Nhật Bàn. Tuy nhiên, với sò' lượng mẫu còn hạn chế, chúng tòi chưa
14
đưa ra những nhận định về tỉ lệ dị hợp tử lan truyền trong quần thể ngươi
Việt nam. Ở đây chúng tôi mới bước đầu xây dựng và triển khai một phương
pháp sinh học phân tử để chẩn đoán bệnh di truyền ở người. Bệnh nhân mắc
bệnh máu khó đông nếu được phát hiện sớm, điều trị kịp thời và đầy đủ sẽ
tham gia sinh hoạt và hoạt động xã hội như những thành viên bình thường.
Do vậy việc xác định sớm, xác định chính xác những cá thể mang gen bệnh
(người mẹ) cũng như các cá thể mang các đột biến tự phát sinh có khả năng
lan truyền trong quần thể đối với bệnh máu khó đông hemophilia A là vô
cùng cần thiết và hoàn toàn có thể tiến hành được. Qua đó có thể đưa ra
những ý kiến tư vấn di truyền khi người mẹ mang gen bệnh có thai. Ngoài ra,
kết quả chẩn đoán nhanh còn cung cấp những thông tin chính xác cho công
tác chăm sóc và điều trị bệnh nhân được tốt hơn. Đồng thời có thể đóng góp
cho việc điều tra chất lượng dân số và đề ra những chính sách thích hợp. .
15
2. BỆNH TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN BAM s in h (TSTTBS)
2.1. Đối tượng nghiên cứu:
Chẩn đoán sớm bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh đặc biệt có ý
nghĩa đối với các bệnh nhi nhằm tránh các tai biến cấp tính và điểu trị kịp

thời không đê lại hậu quả lâu dài vì hiện tượng nam hoá ở bé gái hoặc dậy thì
sớm ở bé trai. Vì vậy, chúng tôi chọn đối tượng nghiên cứu là các bệnh nhi
được điều trị ở Bệnh viện Nhi Trung ương. Nhằm giảm đau cho trẻ khi lấy
máu, đặc biệt với trẻ sơ sinh và giảm chi phí cho các khâu bảo quản mẫu,
chúng tôi lấy mẫu bệnh phẩm là tóc từ 43 bệnh nhi tăng sản thượng thận bẩm
sinh thể cổ điển (27 nam, 16 nữ) đã được chẩn đoán và điều trị tại Khoa Nội
tiết, Bệnh viện Nhi trung ương, thời gian từ 1993-2002. Tiêu chuẩn chẩn
đoán được trình bày trên Bảng 2.
Bảng 2 : Tiêu chuẩn chẩn đoán biểu hiện TSTTBS thể cổ điển (gồm thể mất muối-MM và
thể nam hoá đơn thuần-NHĐT).
Thể mất muối (MM)
Thể nam hóa dưn thuần (NHĐT)
Lâm
sàng
- Biểu hiện suv thượng thận cấp.
- Bất thườns bộ phận sinh dục
ngoài: phì đại âm vật ờ trẻ gái
hoậc/có phì đại dương vật ở trẻ
trai.
- Dặv thì sớm ờ trẻ trai.
- Chuyển giới bộ phạn sinh dục nơoài ớ
trẻ gái.
Xét
nghiệm
- 17-OHP > 6 nmol/1 và/hoặc
Progesterone >1,1 nmol/1
- Testosterone >1 nmol/1.
- Natri < 133. Kali > 5,2 mmol/1.
- 17-CS/ nước tiểu > 14 incrnol/
24 giờ.

- Karyotvpe.
- 17-OHP > 6 nmol/1 và/hoặc
Prosesterone >1,1 nmol/1
- Testosterone >1 nmol/1.
- Điện siái đỏ bình thường.
- 17-CS/ nước tiểu > 14 mcmol/ 24 giờ.
- Karyotype.
- X quans tuổi xươno tãns.
16
2.2. Tách chiết ADN:
Bệnh phẩm gồm 5-10 sợi tóc (chứa chân tóc) được giữ trong ơạc khử
trùng, bảo quản ở nhiệt độ phòng. Phần chân tóc được xử lý với Chelex 10%
ở nhiệt độ cao trong 10 phút. Dưới tác dụng của chelex, tế bào bị phá vỡ và
ADN giải phóng ra khỏi nhân. Sau khi ly tàm hai lần, mỗi lần 10.000
vòng/phút trong 5 phút ở 4° c, cặn tủa chelex bị loại bỏ, dịch trong chứa
ADN được thu lại và dùng cho phản ứng PCR. Chúng tôi dùne 3 jLil dịch
chiết chứa ADN cho mỗi phản ứng PCR có thể tích 25 Ịil.
2.3. Phản ứng PCR:
Chúng tôi áp dụng kỹ thuật RFLP-PCR kết hợp với nested-PCR để xác
định đột biến thường gặp ở exon 1, intron 2, và đột biến mất đoạn 8 bp ở
exon 3 của gen CYP21. Phản ứng PCR được thực hiện trên máy PerkinElm'er
9700. Trình tự các cặp mồi dùng để phát hiện những đột biến này được trình
bày trên Bảng 3.
Bảng 3: Trình tự các cặp mồi đặc hiệu của gen CYP2Ỉ dùns trong phàn ứng PCR
để phát hiện đột biến gây bệnh TSTTBS
Cặp mồi
Trình tự (5'-3')
A1/A2
AI
CTCCTGCAGACAAGCTGGTG

A2
GAACTCCTGGGTCAGCTGCT
B1/B2
BI
TTTTGTTCTTCAGGCG ATT CA
B2
TCCAGAGCAGGGAGTAGTTCTC
P1/P2
P1
TGGAACTGGTGGAAGCTCCGG
P2
GCATCTCCACGATGTGA
P7/P8
P7
GTGGTGCTGAACTCCAA'
P8
ACACCAGCTTGTCTGCAGGAGGCG
- Đẽ’ phát hiện đột biến E1 PL ỏ' exon thứ nhất, chúng tỏi áp dụng phản
ứn^ RFLP-PCR. Phàn ÚT12 PCR được thực hiện với cặp mồi B1/B2. Sau dó,
________________
-
_________________
, 17
ĐAI HOC G'J:vc "• t- - '
TRUNG TÃV - - \
sản phẩm PCR được tinh sạch qua cột và được cắt với enzym giới hạn Acìl
Đột biến E1PL làm thay đổi vị trí nhận biết của Acil, do đó với mẫu ADN
của bệnh nhân sẽ xuất hiện băng ADN 196 bp không bị cắt bởi Acil. Đối với
người bình thường, đoạn ADN này bị cắt thành hai phân đoạn tương ứng với
153 bp và 43 bp.

- Để phát hiện đột biến I2g ở intron 2 gây sai hỏng trong quá trình cắt
nối exon-intron, chúng tôi thực hiện phản ứng nested - PCR với hai cặp mồi
P1/P2 và P7/P8. Đầu tiên, phản ứng PCR được thực hiện với cặp mồi P1/P2.
Sau đó, sản phẩm PCR được pha loãng từ 50 đến 500 lần và được dùng làm
khuôn cho phản ứng PCR lần thứ hai với cặp mồi P7/P8. Sản phẩm PCR lần
thứ hai được cắt bằng enzym giới hạn Hhal để phát hiện đột biến I2g do đột
biến này làm xuất hiện vị trí nhận biết của enzym Hhal. Do đó, ở người bình
thường, sản phẩm nested-PCR không bị cắt bởi Hlial nên có kích thước 378
bp, trong khi với bệnh nhân mang đột biến I2g sẽ có 2 băng ADN là 354 bp
và 24 bp.
- Để phát hiện đột biến mất đoạn 8 bp ở exon thứ ba, chúng tôi áp
dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi A1/A2. Sản phẩm PCR có kích thước 150 bp
sẽ tương ứng với đột biến mất đoạn 8bp, trong khi sản phẩm ở người
bìnhhtường có kích thước 158 bp. Ngoài ra, có thể dựa vào độ đậm nhạt của
các băng ADN 158 bp và 150 bp để đánh giá khả năng đổng hợp tử hoãc dị
hợp tử đối với đột biến này.
Vị trí các cặp mồi cho phản ứng PCR được trình bày trên Hình 3.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
-C H H D -0—0— 0— O - O - O - O -
P i> P7+- 4-P8
Ai+ ■x; sen CYP2Ì
13I+ + B 2
Hình 3: VỊ trí các mỏi trên gen CYP2Í. A1/A2, cặp mồi dể phát hiện mất đoan 8
bp hay chuyến đoạn sen ớ exon 3. B1/B2. cặp mồi dể phát hiện đột biến E1PL ở
exon 1 Pl/P1 và P7/P8 là 2 cặp mồi dùng cho nested-PCR để phát hiện dột biến
A/C->G ở intron 2 (I2g).
18
Do phản ứng PCR rất nhạy với sự thay đổi nồng độ các chất tham gìa
phản ứng, nhiệt độ gắn mồi, số chu kỳ nhân bản nên chúng tôi đã tiến
hành các thí nghiệm thăm dò tìm điều kiện tối ưu cho phản ứng. Điều kiện

nhiệt độ và thời gian tối ưu cho các bước trong phản ứng PCR với các cặp
mồi được trình bày trên Bảng 4.
Bảng 4. Điều kiện phản ứng PCR tuơng ứng với các cặp mồi phát hiện đột biến
trên gen CYP21.
Cặp mồi
Điều kiện phản ứng PCR
A1/A2
94ưc 3 phút, 40 chu kỳ lặp lại gồm (94 °c 30 giây, 60
°c 1 phút, 72 X 1 phút), 72 °c 5 phút.
B1/B2
94”C 3 phút, 45 chu kỳ lập lại gồm (94 °c 30 giây, 54
°c 1 phút 30 giây, 72 °c 3 phút), 72 °c
10
phút
P1/P2
94“C 3 phut, 40 chu kỳ lặp lại gồm (94 "C 30 giây, 56
°c 1 phút, 72 °c 1 phút), 72 °c 10 phút
P7/P8
94°c 3 phut, 40 chu kỳ lặp lại gồm (94 "C 30 giây, 60
°c 30 giây, 72 °c 2 phút), 72 "C 10 phút
1
Ngoài ra, sản phẩm của phản ứng nested-PCR phụ thuộc vào độ pha
loãng sản phẩm PCR lần thứ nhất. Do đó, khi xác định đột biến I2g, chúng
tôi tiến hành PCR lần thứ hai với cặp mồi P7/P8 và với các độ pha loãng từ
50 đến 500 lần sản phẩm PCR lẩn thứ nhất (với cặp mồi P1 và P2). Chúng tôi
nhân thấy ở đô pha loãng 100 lần thì sản phàm PCR ro net khong co san
phẩm phụ. Đây là nồna độ pha loãng thích hợp cho cặp mồi P7/P8. Như vậy,
chúnơ tôi đã tìm đươc điêu kiên thích hợp cho cuc thí-inh phcin thcim giíi phun
ứnơ nhu' sau’ Nồna đô thích hơp cUti cuc thciĩih phun thum gici phcìn ưng P>^R
lán thứ nhất ớ thể tích 25 ul như sau: 3f.ll ADN khuôn; 200liM dNTPs;

1 5mM M^C12; 0,5 u Taq; lf.ll mỗi loai mói nổng độ 10 ịiM; 2.5|.il đệm
PCR Sin plrim PCR được điện di trên gel agarose Nusieve 3:1 nóng độ 3-
19
4%, điện thế 80V trong thời gian 2 giờ. Loại agarose Nusieve 3:1 có khả
năng phân ly các đoạn ADN kích thước nhỏ và sai khác nhau chỉ vài
nucleotide. Do đó, chúng tôi dùng Nusieve 3:1 thay cho việc sử dụng
polyacrylamide rất độc và mất nhiều thời gian chuẩn bị gel, điện di, xử lý
mẫu. Sau khi điện di, gel agarose được nhuộm ethidium bromide và các băng
ADN được chụp trên máy ImaTech 800.
2.4. Kết quả nghiên cứu:
2.4.1. Phát hiện đột biến E1PL ở exon 1 trên gen CYP21:
Để phát hiện đột biến E1PL ở exon 1, chúng tôi sử dụng cặp mồi
B1/B2 với B2 chứa trình tự không có ở CYP21P (mất đoạn 8-bp). Do đó cặp
mồi này chỉ cho phép khuếch đại đoạn ADN đặc hiệu của gen CYP21. Sản
phẩm PCR với cặp mồi B1/B2 được tinh khiết và phân cắt bằng enzyme giới
hạn Acil để phát hiện đột biến E1PL. Đột biến này làm thay đổi trinh tự nhận
biết của enzym, do đó sản phẩm PCR (196 bp) không bị cắt. ở người bình
thường, băng ADN 196 bp bị cắt bởi Aciĩ thành hai băng ADN 153 bp và 43
bp. Căn cứ vào sự xuất hiện của băng 196 bp hoặc băng 153 bp sau khi điện
di trên agarose NuSieve 4%, chúng tôi xác định được một mâu ADN cúa
bệnh nhi (có kiểu hình mất muối) cho 2 băng 196 bp và 153 bp, tương ứng
với kiểu gen dị hợp tử ở đột biến E1PL. Kêt quả được trình bày trên Hình 4.
- 196 fep
-3 5 3 bp
Hình 4: Phát hiện đột biến E1PL. Sản phẩm PCR với cặp mồi B1/B2 được cắt bời
enzyme Aci\. Mâu sô 9 có 2 băng 196 bp và 153 bp xác định kiểu gen dị hợp tử
E1PL. Cac mâu khác chỉ có một băng 153 bp, tương ứng với cá thể khôn° có đột
biến này. M: Thang ADN chuẩn <t>X174/7/a<?III.
2.4.2. Phát hiện đột biến I2g tại vị trí cắt nôi exon-intron:
Đột biên I2g được phát hiện nhờ sử dụng phản ứng nested-PCR với hai

cặp mồi P1/P2 và P7/P8. Đầu tiên, phản ứng PCR được thực hiện với cặp mồi
P1/P2. Sản phẩm PCR với cặp mồi P1/P2 được pha loãng 100 lần và được sử
dụng làm khuôn trong phản ứng PCR với cặp mồi P7/P8. Kỹ thuật này cho
phép làm giàu mẫu, đổng thời tăng tính chính xác của phản ứng. Sán phẩm
PCR thu được có kích thước 378 bp. Mồi P8 được thiết kế để phát hiện đột
biến I2g. Đột biến này làm xuất hiện vị trí nhận biết của enzym HhaI. Do đó,
sản phẩm nested-PCR với mẫu ADN của người mang gen bị đột biên I2g sẽ
bị cắt bởi Hhaĩ, tạo thành 2 đoạn 354 và 24 bp. Ngược lại, sản phẩm PCR với
mẫu ADN của người binh thườns không bị cắt bởi Hỉial nên xuất hiện băng
378 bp. Căn cứ vào sự có mặt của băng ADN 378 bp và 354 bp để nhân biết
các dạng đồns hợp tử bệnh do đột biên I2g, dị hợp tử mang gen bệnh và
người bình thườnơ. Trons tổng sô 43 bênh nhi. chung toi phat hiẹn được 8
trườn" hơp đồnơ hợp tử đôt biên I2s và 4 irưòng hợp đi hợp tư. Ket qua được
trình bày trên Hình 5.
21
- 196 kp
- 1 5 3 bp
Hình 4: Phát hiện đột biến E1PL. Sản phẩm PCR với cặp mồi B1/B2 được cát bói
enzyme Aciỉ. Máu sô 9 có 2 bãng 196 bp và 153 bp xác định kiểu gen dị hợp tử
E1PL. Các mâu khác chỉ có một băng 153 bp, tương ứng với cá thể khón° có đột
biến này. M: Thang ADN chuẩn ỳXm/Haeỉỉĩ.
2.4.2. Phát hiện đột biến I2g tại vị trí cắt nối exon-intron:
Đột biến I2g được phát hiện nhờ sử dụng phản ứng nested-PCR với hai
cặp mồi P1/P2 và P7/P8. Đầu tiên, phản ứng PCR được thực hiện với cặp mồi
P1/P2. Sản phẩm PCR với cặp mồi P1/P2 được pha loãng 100 lần và được sử
dụng làm khuôn trong phản ứng PCR với cặp mồi P7/P8. KỸ thuật này cho
phép làm giàu mẫu, đồng thời tăng tính chính xác của phản ứng. Sản phẩm
PCR thu được có kích thước 378 bp. Mồi P8 được thiết kế để phát hiện đột
biến I2g. Đột biến này làm xuất hiện vị trí nhận biết của enzym tìhaỉ. Do đó,
sản phẩm nested-PCR với mẫu ADN của người mang gen bị đột biến I2g sẽ

bị cắt bởi Hhaỉ, tạo thành 2 đoạn 354 và 24 bp. Ngược lại, sản phấm PCR với
mẫu ADN của người bình thường không bị cắt bời Hhal nên xuất hiện băng
378 bp. Căn cứ vào sự có mặt của băng ADN 378 bp và 354 bp để nhận biết
các ciạns đổnsi hợp tử bệnh do đột biên I2g, dị hợp tử mang gen bệnh và
nơười bình thường. Tron SI tổng số 43 bệnh nhi. chúng tỏi phát hiện được 8
trườn" hợp đồng hợp tử đột biến I2g và 4 irường hợp dị hợp tử. Kết quá được
trình bày trên Hình 5.
21
1 2
f
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
m m
MÊH H M
ái
- 196 kp
_:153 bp
Hình 4: Phát hiện đột biến E1PL. Sản phẩm PCR với cặp mồi B1/B2 được cắt bời
enzyme Aciỉ. Máu sô 9 có 2 băng 196 bp và 153 bp xác định kiêu gen dị hợp tử
E1PL. Các mẫu khác chỉ có một băng 153 bp, tương ứng với cá thê không có đột
biến này. M: Thang ADN chuẩn ỘX1 74///í2é’III.
2.4.2. Phát hiện đột biến I2g tại vị trí cắt nôi exon-intron:
Đột biến I2g được phát hiện nhờ sử dụng phản ứng nestcd-PCR với hai
cặp mồi P1/P2 và P7/P8. Đầu tiên, phản ứng PCR được thực hiện với cặp mồi
P1/P2. Sản phẩm PCR với cặp mồi P1/P2 được pha loãng 100 lần và được sử
dụng làm khuôn trong phản ứng PCR với cặp mồi P7/P8. Kỹ thuật này cho
phép làm giàu mẫu, đổng thời tăng tính chính xác của phản ứng. Sản phẩm
PCR thu được có kích thước 378 bp. Mồi P8 được thiết kế đê phát hiện đột
biến I2g. Đột biến này làm xuất hiện vị trí nhận biết của enzym Hlỉdì. Do đó,
sản phẩm nested-PCR với mẫu ADN của người mang gen bị đột biên I2g sẽ
bị cắt bởi Hlial, tạo thành 2 đoạn 354 và 24 bp. Ngược lại, sản phẩm PCR với

mẫu ADN của người bình thườns không bị cắt bởi Hhal nên xuất hiện băng
378 bp. Căn cứ vào sự có mặt của băng ADN 378 bp và 354 bp đế nhận biết
các dạng đổns hợp tử bệnh do đột biên I2g, dị hợp tử mang gen bệnh và
người bình thường. Trong tổng sô 43 bệnh nhi. chúng tôi phát hiện được 8
trườn" hợp đồng hợp tử đột biên I2s và 4 irường hợp đi hợp tư. Ket qua được
trình bày trên Hình 5.
21
- 196 kp
- 1 5 3 bp
Hình 4: Phát hiện đột biến E1PL. Sản phẩm PCR với cặp mồi B1/B2 được cắt bới
enzyme Aciỉ. Mâu sô 9 có 2 băng 196 bp và 153 bp xác định kiểu gen dị hợp tử
E1PL. Các mẫu khác chỉ có một băng 153 bp, tương ứng với cá thể không có đột
biến này. M: Thang ADN chuẩn ỘX174///«Ể'III.
2.4.2. Phát hiện đột biến I2g tại vị trí cắt nôi exon-intron:
Đột biến I2g được phát hiện nhờ sử dụng phản ứng nested-PCR với hai
cặp mồi P1/P2 và P7/P8. Đầu tiên, phản ứng PCR được thực hiện với cặp mồi
P1/P2. Sản phẩm PCR với cặp mồi P1/P2 được pha loãng 100 lần và được sử
dụng làm khuôn trong phản ứng PCR với cặp mồi P7/P8. Kv thuật này cho
phép làm giàu mẫu, đổng thời tăng tính chính xác của phản ứng. Sản phẩm
PCR thu được có kích thước 378 bp. Mồi P8 được thiết kế để phát hiện đột
biến Ỉ2g. Đột biến này làm xuất hiện vị trí nhận biết của enzym Hliaỉ. Do đó,
sản phẩm nested-PCR với mẫu ADN của người mang gen bị đột biên I2g sẽ
bị cắt bởi Hhal, tạo thành 2 đoạn 354 và 24 bp. Ngược lại, sản phẩm PCR với
mẫu ADN của người bình thường không bị cắt bời Hhal nên xuất hiện băng
378 bp. Căn cứ vào sự có mặt của băng ADN 378 bp và 354 bp để nhận biết
các dạng đổns hợp tử bệnh do đột biên I2g, dị hợp tử mang gen bệnh và
người bình thường. Trong tổng sỏ 43 bệnh nhi, chúng tồi phát hiện được 8
trườn° hợp đồng hơp tử đột biên I2s và 4 irường hợp đi hợp tư. Ket C]ua được
trình bày trên Hình 5.
21