Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN
• • • •
******************
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT
CÓ KHẢ NĂNG XỬ LÝ PHÉ PHỤ PHẢM NÔNG NGHIỆP
MÃ SỐ: QT 08-54
CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI: THS. NGUYÊN KIỀU BĂNG TÂM
ù
\ ) T / ỹ o l
HÀ NỘI, 2009
BÁO CÁO TÓM TẮT
Tên đề tài: Phân lập và tuyển chọn một số chùng vi sinh vật có khả năng xử lý phế
phụ phẩm nông nghiệp
Chủ trì: Thạc sỹ Nguyễn Kiều Băng Tâm
I. Mục tiêu nghiên cứu
Chọn lựa được các chủng vi sinh vật có hoạt tính sinh học cao nhàm xử lý phế
phụ phẩm nông nghiệp, hạn chế ô nhiễm môi trường và cung cấp nguồn phân bón giàu
hữu cơ cho cây trồng
II. Phương pháp nghiên cứu
1. Phương pháp phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật có hoạt tính sinh học cao
2. Xác định điều kiện sinh trưởng của các chủng đã lựa chọn
3. Phương pháp xử lý phế thải nông nghiệp bàng vi sinh vật và xác định một số tính
chất hoá sinh của đống ủ sau khi được xử lý bằng vi sinh vật
4. Đánh giá hiệu quả của sản phẩm sau khi ủ bằng phương pháp xác định hàm lượng
các chất dinh dưỡng trong cây.
III. Kết quả đạt được
+ Từ 14 chủng vi sinh vật đã tuyển chọn được 2 chủng có hoạt tính phân giải
xenlulozơ cao và 2 chủng có hoạt tính phân giải tinh bột cao. Các chủng này thuộc nhóm
ưa nhiệt và ưa pH từ 7-8. Các chủng này có thể sử dụng để xử lý rơm rạ làm phân bón. Khi
ủ phế thải chăn nuôi bằng vi sinh vật đã rút ngắn thời gian ủ từ 3-6 lần so với phương pháp

truyền thống mà hàm lượng các chất dinh dưỡng lại cao hơn, từ đó nâng cao năng suất cây
trồng lên khoảng 22,5%. Bên cạnh đó sản phẩm lại không chứa vi sinh vật gây bệnh nên an
toàn cho người sử dụng.
+ 02 bài báo theo nội dung đề tài đã được đăng trên tạp chí khoa học
+ 01 khoá luận tốt nghiệp đã được tiến hành theo nội dung đề tài
IV. Tình hình kinh phí: 20.000.000 đ
Đã chi theo dự toán và quyết toán với tài vụ, Trường ĐHKHTN, ĐHQG Hà Nội
Xác nhân của BCN Khoa Chủ trì đề tài
của Trưòìig ĐHKHTN
P'rlả Hiệu TRƯỎNG
/ / TM’J ' Ị y
ỉ[y 0 A.> H < //
ahga hoc
V Tự N H tE N yí
'Vx V V • / \
ABSTRACT
Title: Isolation and selection some strains of microorganisms for
agricultural waste treatment
Code: QT 08-54
Team leader: Nguyen Kieu Bang Tam
1. Object
Select the microorganism strains with highly biological activities to treat
agricultural by-products to reduce environmental pollution and provide with a
source of highly organic containminated fertilizer.
2. Content
* Select the microorganism strains with highly biological activities to treat
agricultural by-products
* Research growth conditions of selected strains of microorganisms
* Appreciate the effectiveness of product after treatment by microorganisms
3. Methods

* Methods of isolation, selection microorganism strains with highly
biological activities
* Methods of treatment agricultural by-products by selected strains of
microorganisms
* Methods of appreciation the effectiveness of product after treatment by
microorganisms
4. Results
+ Among 14 strains of microorganisms, 2 strains with the highest cellulose
decomposing ability and 2 strains with the highest starch decomposing ability have
been selected. They belong to thermophil group of organisms and growth well on
pH of 7-8. These strains can be used to treat straw to make biofertilizer.
The time of composting breeding waste by microorganisms is 3-6 times
shorter than the traditional method of composting whereas nutritious components of
the organic product and the plant productivity are higher than those in the control
sample. Moreover, the plants do not contain toxic microorganisms and safe for
consumers.
+ 02 articles published on scientific journal
+ 01 graduation thesis
MỤC LỤC
LỜI MỞ ĐÀU 1
CHƯƠNG 1. TỎNG QUAN TÀI LIỆU
3
1.1. Phế phụ phẩm trồng trọt và ảnh hưởng của nó đến môi trường

3
1.2. Phế thải chăn nuôi và ảnh hưởng của nó đến môi trường
4
1.3. Vai trò của vi sinh vật trong việc xử lý các phế thải hữu cơ 6
1.3.1. Khả năng chuyển hoá các hợp chất cacbon của vi sinh vật

6
1.3.2. Khả năng chuyển hoá các họp chất nitơ của vi sinh vật

7
1.3.3. Khả năng phân giải lipid của vi sinh vật 8
CHƯƠNG II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 9
2.1. Nguyên liệu 9
2.2. Phương pháp nghiên cứu 9
2.2.1. Kiểm tra mật độ vi sinh vật theo phương pháp Kock
9
2.2.2. Phân lập các chủng vi sinh vật phân giải xenluloza

10
2.2.3. Phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải tinh bột

11
2.2.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

11
2.2.5. Xác định điều kiện sinh trưởng và phát triển

12
2.2.6. Phương pháp xử lý phế thải trồng trọt bằng v s v 13
2.2.7. Phương pháp xử lý phế thải chăn nuôi bằng vi sinh vật
14
2.2.8. Phương pháp xác định các tính chất hoá sinh trong đống ủ

14
2.2.9. Phương pháp bố trí thí nghiệm trồng cây 15
2.2.10. Đánh giá nhanh độ chín và độ an toàn của phân ủ

16
2.2.11. Các phương pháp xác định hàm lượng các chất dinh dưỡng trong cây
cải ngọt 16
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
17
3.1. Phân lập và tuyển chọn một số v sv có hoạt tính phân giải họp chất
hydrat cacbon 17
3.2. Điều kiện sinh trưởng và phát triển của các chủng vi sinh vật

20
3.3. Khả năng sử dụng các chủng vi sinh vật tuyển chọn trong xử lý phế
phụ phẩm trồng trọt trong nông nghiệp
22
3.3.2. Một số đặc điểm của phế phụ phẩm nông nghiệp sau khi ủ 24
3.4. Nghiên cứu khả năng sử dụng phế thải chăn nuôi sau khi được xử lý
nhanh bằng chế phẩm vsv đối với cây trồng 24
3.4.3. Đánh giá độ chín của sản phẩm sau khi ủ 26
Kết luận 28
Tài liệu tham khảo 29
4
LỜI MỞ ĐÀU
Việt Nam là một quốc gia có trên 70% dân số sống bằng nghề nông nghiệp,
với diện tích đất cây trồng có hạt trên 8355,3 nghìn ha, trong đó 7322,3 nghìn ha
lúa, 1033 nghìn ha ngô còn lại là các loại cây có hạt khác [3,6], hàng năm sau khi
thu hoạch đã để lại trên đồng ruộng một khối lượng lớn phế phụ phẩm nông nghiệp
trồng trọt (rơm, rạ, thân, lá cây ).
Theo phương thức sản xuất nông nghiệp truyền thống, lượng phế phụ phẩm
nông nghiệp trồng trọt sau khi thu hoạch được chuyển về nhà và được sử dụng như
một nguồn nguyên liệu chính để đun nấu trong các nông hộ Cùng với sự phát triển

của xã hội và nhu cầu đời sống ngày một nâng cao, ngày nay hầu hết các hộ nông
dân đã sử dụng các nguồn nguyên liệu như than, gas, điện cho việc nấu nướng nên
phần lớn lượng phế phụ phẩm nông nghiệp sau khi thu hoạch được người nông dân
đốt ngay trên đồng ruộng tạo ra những chất độc hại : CH4, C02, bụi Việc đốt phế
phụ phẩm nông nghiệp trên đồng ruộng đang dần hình thành một thói quen xấu,
không những gây ảnh hưởng xấu tới môi trường sinh thái mà còn rất lãng phí nguồn
nguyên liệu có nguồn gốc thực vật này.
Qua nhiều nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam cho thấy, các loại phế thải
giàu họp chất hydrat cacbon như rơm rạ, thân, lá ngô, đậu, lá mía, phế thải sản xuất
cà phê, mía đường thường được sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất phân bón
hữu cơ sinh học. Thành phần của phế phụ phẩm nông nghiệp bao gồm phần lớn là
xenlulozơ, hemixenlulozơ, tinh bột, lignin, ngoài ra chúng còn chứa một số các chất
có giá trị dinh dưỡng đối với quá trình sinh trưởng và phát triển của cây trồng. Tuy
nhiên, trong thực tế phế thải này không thể sử dụng trực tiếp được mà cần phải
được xử lý trước khi đưa vào sử dụng. Sản phẩm của quá trình phân huỷ phế thải
này có tác dụng cải tạo độ phì nhiêu cho đất (làm cho đất tơi xốp, cải thiện tính chất
đất nhất là khả năng giữ nước ). Việc xử lý và tận dụng phế phụ phẩm nông nghiệp
giàu hợp chất hydrat cacbon với mục đích phục vụ sản xuất nông nghiệp bàng công
nghệ vi sinh đang là một trong những giải pháp hữu hiệu, là một hướng đi đúng đắn,
đang được nhiều nhà khoa học quan tâm và có triển vọng, vừa góp phần cải tạo độ
phì nhiêu cho đất, góp phần vào bảo vệ môi trường phát triển bền vững.
Trong thời kỳ đổi mới, ngành chăn nuôi Việt Nam cũng liên tục đạt tốc độ
tăng trưởng cao, góp phần tích cực trong sự nghiệp ổn định và phát triển kinh tế, xã
hội của đất nước, số lượng đàn gia súc, gia cầm không ngừng tăng qua mỗi năm,
1
chất lượng vật nuôi cũng được cải thiện. Điều này đã góp phần làm tăng giá trị sản
phẩm đầu ra, đáp ứng đủ nhu cầu tiêu dùng trong nước và xuất khẩu.
Tuy nhiên, do thiếu sự quản lý, do người nông dân thường chỉ tập trung đầu
tư để nâng cao năng suất và chất lượng vật nuôi mà chưa chú trọng nhiều đến các
vấn đề về môi trường, nên hàng năm một lượng lớn phế thải chăn nuôi không được

xử lý đó thải trực tiếp ra môi trường, gây ô nhiễm môi trường đất, nước, không khí,
ảnh hưởng trực tiếp đến môi trường sinh thái và sức khoẻ con người.
Từ lâu, người nông dân đó biết tận dụng và xử lý nguồn phế thải chăn nuôi
làm phân bón cho cây trồng, làm thức ăn cho gia súc v.v Tuy nhiên, việc xử lý
theo các biện pháp truyền thống thường mất nhiều thời gian, gây ô nhiễm không khí
mà hiệu quả về dinh dưỡng thu được của phân ủ không tối ưu.
Hướng nghiên cứu sử dụng vi sinh vật như một tác nhân sinh học để xử lý
nhanh nguồn phế thải chăn nuôi tại các hộ gia đình, các trang trại nhàm hạn chế ô
nhiễm môi trường, tạo sản phẩm phân bón hữu cơ có chất lượng phục vụ cho sản
xuất nông nghiệp đã và đang là một hướng đi tích cực, thu hút được sự quan tâm
của các nhà khoa học trong và ngoài nước.
Với mục đích nghiên cứu xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp bao gồm phế thải
trồng trọt và chăn nuôi theo hướng thân thiện với môi trường, chúng tôi đã tiến
hành nghiên cứu đề tài: " Phăn lập và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả
năng xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp".
2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Phế phụ phẩm trồng trọt và ảnh hưởng của nó đến môi trường
Phế phụ phẩm trồng trọt gồm tàn dư thực vật trong trồng trọt và chế biến
rơm
phụ phẩm trồng trọt chủ yếu gồm các nhóm : lignin, hemixenlulozơ và xenlulozơ;
đường và tinh bột; mỡ, dầu; protein.
Khả năng phân giải sinh học sẽ tăng dần từ lignin, hemixenlulozơ, xenlulozơ,
mỡ, protein đến tinh bột và đường. Lượng phế phụ phẩm phát sinh để thu được 1
tấn nông sản và thành phần hoá học của một số họp chất chính trong tự nhiên được
tổng hợp trong bảng 1.1, 1.2.
Bảng 1.1. Lượng phế phụ phẩm phát sinh để thu được 1 tấn nông sản
sau thu hoạch
Tên nông sản
Loại phế phụ phẩm

Khối lượng (kg)
Rơm, rạ
4000-6000
Lúa
Cám
150
trấu
200
Ngô
r - p l A. 1 r A,
Thân, lá cây
2100-2350
Vỏ, lõi bắp
500
Nguồn: Nguyễn Đình Hương, 2006
Bảng 1.2. Thành phần hoá học của một số thực vật
Nguyên liệu
Thành phần hoá học (% so với khối lượng khô)
Tinh bột,
đường
Protein Mỡ Hemixenlulo Xenlulo Lignin
Cây trồng nông nghiệp
5-30 5-40
5-15 15-60
5-30
Thân cỏ
50
8,7 2,7
31
-

Rễ cỏ
27 7,5 8,5
28
18
Cây thân gỗ lá kim
1,1
1,3
7,7
15
44
30
Cây thân gỗ lá to
0,8 2,5 1,8
24
47 20
3
Rau, quả
Táo 88 6
Cà chua 57
14
*
Bắp cải
33
17
3
Khoai tây 84
8
*
Nguồn: Lê văn Khoa, Trần Khắc Hiệp, Trịnh Thị Thanh 1996.
* Chỉ có dưới dạng vết

Bảng 1 và 2 cho thấy, một lượng lớn phế thải nông nghiệp được phát sinh,
nếu như không có biện pháp xử lý và quản lý hiệu quả thì vừa gây ô nhiễm môi
trường vừa lãng phí một nguồn nguyên liệu giàu hidro cacbon.
Quá trình lưu giữ và tận dụng lại chất thải rắn nông nghiệp một cách không
hợp lý cũng dẫn đến những ảnh hưởng xấu tới môi trường không khí. Khí hậu nhiệt
đới nóng ẩm và mưa nhiều ở nước ta là điều kiện thuận lợi cho các thành phần hữu
cơ phân huỷ, thúc đẩy nhanh quá trình lên men, thối rữa và tạo mùi khó chịu cho
con người. Các chất khí: H2S, NH4, S02 phát sinh trong quá trình phân huỷ chất
thải hữu cơ nông nghiệp ngay trên đồng ruộng, trong các chuồng trại hoặc tại những
đống ủ phân xanh là các tác nhân chủ yếu tác động tới môi trường không khí [1].
Nếu như trước đây các phụ phẩm nông nghiệp được nhà nông tận dụng chủ yếu để
làm nhiên liệu đốt cho nấu ăn, thì hiện nay cuộc sống ngày một được nâng cao hơn,
chỉ có một phần phế phụ phẩm nông nghiệp được tái sử dụng như: trồng nấm, làm
ván ép, một phần làm nhiên liệu đốt còn lại được đem đốt trực tiếp ngay tại đồng
ruộng, khi đốt như vậy thì thường phát thải ra các chất gây ô nhiễm môi trường như:
CH4, C02 [1]. Mặt khác, sau vụ mùa thì những đống rơm, rạ được đốt nhiều đã
gây ra khói bụi gây ảnh hưởng đến môi trường: khói phủ trên diện rộng tại Hà Nội
đêm 16/10/2005, khiến nhiều nơi ở Hà Nội trong tình trạng mù mịt. Đây không phải
lần đầu tiên hiện tượng khói mỏng bao trùm Hà Nội. Năm 2004, vào đợt cuối tháng
6 Hà Nội cũng có hiện tượng khói phủ mờ. Khi đó, nhiều chuyên gia đã dự đoán
nguyên nhân do người dân ở các vùng lân cận Hà Nội đốt rơm rạ sau thu hoạch
cộng với lượng khói bụi đọng lâu trong khí quyển (Theo Ciren. Bộ tài nguyên và
môi trường. Trung tâm thông tin).
1.2. Phế thải chăn nuôi và ảnh hưởng của nó đến môi trường
Một trong những khó khăn, thách thức đối với ngành chăn nuôi hiện nay là
giải quyết các vấn đề liên quan đến phế thải chăn nuôi. Khi chăn nuôi ở quy mô nhỏ
lẻ phân tán, các loại phế thải chăn nuôi thường được tận dụng cho trồng trọt, những
4
tác động tiêu cực của chúng đối với môi trường là không đáng kể. Tuy nhiên, khi
ngành chăn nuôi phát triển theo hướng trang trại hoặc các làng nghề chăn nuôi

mang tính hàng hóa, vấn đề kiểm soát lượng phế thải trong chăn nuôi trở thành bài
toán khó đối với các nhà quản lý hiện nay [15]. Hiện nay, phần lớn lượng chất thải
chăn nuôi sẽ xả thẳng ra ngoài tự nhiên hoặc sử dụng không qua xử lý.
Theo Bộ NN&PTNT, mỗi năm chăn nuôi thải ra trên 73 triệu tấn chất thải
rắn (phân khô, thức ăn thừa) và 25-30 triệu khối chất thải lỏng (phân lỏng, nước tiểu
và nước rửa chuồng trại). Trong đó, khoảng 50% lượng chất thải rắn (36,5 triệu
tấn), 80% chất thải lỏng (20 - 24 triệu m3) xả thẳng ra tự nhiên, hoặc được sử dụng
trực tiếp [15]. Bảng 1.3 cho thấy lượng chất thải hàng ngày của các loài gia súc, gia
cầm.
Bảng 1.3. Lượng chất thải hàng ngày của các loài vật nuôi [5]
Vật
nuôỉ
Khối lượng
cơ thể (kg)
r f 9
Lượng chât thải theo % khôi lượng cơ thê
Lượng
phân tưoi
(kg/ngày)
Phân
Nước tiểu
Bò
135 - 800
5
4 -5 8
r p /V
Trâu
300 - 500
5 4 -5
12

Lơn
•
30-75
2
3
2
Dê/cừu
30- 100
3
1 - 1,5
3
Gà
1,5-2
4,5
0,08
Các chât thải từ quá trình chăn nuôi đã gây ra nhiêu vân đê vê môi trường.
Hartung và Philips đó phân tích và đưa ra mô hình về mối quan hệ giữa chăn nuôi
và các yếu tố ô nhiễm môi trường từ chăn nựôi như sau [2]:
Thức ăn Những chất khác: andehyd, amin, phenol
Sơ đồ 1: Mối quan hệ giữa chăn nuôi và các yếu tố
ô nhiễm môi trường từ chăn nuôi
5
Lượng phê thải không lô hàng ngày vật nuôi thải ra môi trường tôn đọng lại
gây ảnh hưởng xấu tới nguồn nước, không khí, đất, các sản phẩm từ vật nuôi.
Lượng phế thải này sẽ gây ô nhiễm đất, nước, không khí bởi chúng chứa nhiều các
nguyên tố như nitơ, photpho, kẽm, đồng, chì, asen, niken , tạo ra các khí độc và
đặc biệt là các loại mầm bệnh, ký sinh trùng và vi sinh vật gây hại Đó có thể là
các loại giun sán (giun đũa, giun tóc, giun móc, giun kim, sán dây, sán lá ), các
loài vi khuẩn như vi khuẩn Salmonella (có trong phân người, và phân động vật), vi
khuẩn E.coli, virut H5N1 (có trong phân, nước tiểu, xác các loài gia cầm), virut

PRRS gây bệnh tai xanh ở lợn, virut gây bệnh lở mồm long móng, vi khuẩn gây
bệnh tả, kiết lỵ cho gia súc. Một nghiên cứu mới đây cho thấy, nếu sử dụng chất
thải chăn nuôi làm phân bón thì 100% mẫu rau xanh đều có
E.coli [2].
Vấn đề ô nhiễm môi trường do chất thải chăn nuôi đã xuất hiện ở nhiều nơi,
đặc biệt là các vùng gần các trang trại chăn nuôi gia súc, gia cầm lớn, các xã có khu
chăn nuôi tập trung trong khu dân cư gây bức xúc cho người dân sống xung quanh,
đặc biệt là ô nhiễm vi sinh vật, ô nhiễm nước và ô nhiễm không khí.
Theo một kết quả nghiên cứu tại xã Hồng Hà (Hà Tây), do các khu chăn nuôi
đều nằm tập trung trong khu dân cư nên đã xảy ra ô nhiễm môi trường nước và
không khí nghiêm trọng, ảnh hưởng không nhỏ đến sức khoẻ người dân địa phương.
Kết quả phân tích chất lượng nước thải, nước mặt quanh khu vực xã Hồng Hà cho
thấy hàm lượng vi khuẩn Colifom cao hơn tiêu chuẩn cho phép 2 lần, BOD5 cao
hơn mức độ cho phép từ 50-150 lần, COD cao hơn 23-61 lần, hàm lượng chất rắn
cao hơn 5-13 lần, tổng N, p cao hơn 9-23 lân [16].
1.3. Vai trò của vi sinh vật trong việc xử lý các phế thải hữu cơ
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, thực vật và động vật thường thải ra
môi trường xung quanh một lượng lớn các chât hữu cơ trong đat. Mạt khac, khi
chúng chết đi chúng cũng để lại một lượng lớn chất hữu cơ khó phân giải cho đất,
gây ô nhiễm môi trường xung quanh. Dưới tác dụng cua cac chung VI sinh vạt, cac
chất hữu cơ chưa được phân giải bằng hệ enzym tiêu hoá của động vật, hay các chât
hữu cơ có trong xác động thực vật sẽ tiếp tục được hệ enzym thuỷ phân của vi sinh
vật có sẵn trong môi trường và của chủng vi sinh vật tuyên chọn đưa vào phân giải,
chuyển hoá thành các họp chât vô cơ đơn gian [13].
13 1. Khả năng chuyển hoá các hợp chất cacbon của vi sinh vật
Các hợp chất cacbon hữu cơ có nhiều trong cơ thê động vật, thực vật, VI sinh
6
vật như xenlulozơ, tinh bột, ligin Khi động thực vật chết đi, xác của chúne sẽ để
lại một lượng chất hữu cơ khổng lồ trong đất. Nhờ hoạt động của các nhóm vi sinh
vật dị dưỡng cacbon, các chất hữu cơ này dần dần bị phân huỷ tạo thành các hợp

chất đơn giản hơn, mà sản phẩm phân giải cuối cùng là C02. Khi môi trường bị ô
nhiễm các hợp chất hữu cơ chứa cacbon như xenlulozơ, tinh bột, các loại đường
đơn , người ta thường sử dụng các nhóm vi sinh vật có khả năng phân eiải
xenlulozơ, tinh bột để xử lý chất thải hữu cơ này [13].
- Khả năng phân giải xenỉuỉozơ: Xenlulozơ là loại hợp chất khá bền vững,
không tan trong nước (chỉ phồng lên do hấp thụ nước, không được tiêu hoá bởi hệ
enzym của con người và một số loài động vật). Vì vậy, ngoài phế thải thực vật,
xenlulozơ còn tồn tại rất nhiều trong phế thải chăn nuôi, nhất là trong thành phần
chất độn của phế thải [13].
Trong thiên nhiên, có nhiều nhóm vi sinh vật có khả năng phân huỷ
xenlulozơ nhờ có hệ enzym xenlulozơ ngoại bào. Trong đó vi nấm là nhóm có khả
năng phân giải mạnh như Tricoderma, Aspergillus, Fusarium, Mncor Ngoài ra,
còn có các chủng vi khuẩn, xạ khuẩn và niêm vi khuẩn cũng có khả năng phân huỷ
xenlulozơ như Clostridium, Ruminococcus, Strept0ỉnyces [\3]
- Khả năng phân giải tinh bột: Tinh bột là chất dự trữ chủ yếu của thực vật,
gồm 2 thành phần là amilo và amilopectin. Trong đất có nhiều loại vi sinh vật có
khả năng phân giải tinh bột ví dụ như Aspergillus, Fusarius, Bacillus, Cytophaga,
Pseudomonas .[7, 13].
1,3,2. Khả năng chuyển hoá các hợp chất nitơ của vi sinh vật
Trong thiên nhiên tồn tại nhiều dạng hợp chất nitơ hữu cơ như protein, axit
amin axit nucleic, urê Các hcrp chất này đi vào đất từ nguồn xác động, thực vật,
các loại phân chuồng, phân xanh, rác sinh hoạt. Thực vật không thề đồng hoá được
dạng nitơ hữu cơ phức tạp trên mà chỉ có thê sư dụng được sau qua trinh phan giâi
nitơ hữu cơ bởi hê cnzym CỦ3. VI sinh vạt - CỊUCI tỉ lỉĩh ũỉĩìon hoơ [13].
Trong tự nhiên có rất nhiều loại vi sinh vật có khả năng amôn hoá protein. Ví
dụ như các nhóm vi khuân Bacillus, Ps€udoỉnoìĩcis, Clostndiuĩĩĩ j xạ khuan co
Streptomyces rimosus, Streptomyces gnseus ', vi nâm có Aspergillus oryzae,
Aspergillus flavus, Aspergillus mger [13]
Khả năng chuyển hoá các hợp chất nitơ hữu cơ của vi sinh vật không chỉ làm
giảm ô nhiễm môi trường mà còn có thê tận dụng quá trình này vào sản xuat. Cac

nhà khoa học đã vận dụng quá trình này vào các quá trình chê biên và bảo quản
7
nông sản quí như: trứng, thịt, sữa, thịt hộp, cá hộp hay trong chế biến thức ăn cho
người và gia súc; chế biến phân hữu cơ chứa nitơ.
1.3.3. Khả năng phân giải lipid của vi sinh vật
Lipid (chât béo) là nhóm hợp chât hữu cơ tự nhiên, rất phổ biến trong tế bào
thực vật và động vật. Nó là este của axit béo và rượu đơn, đa chức. Lipid (chất béo)
là nhóm hợp chất hữu cơ tự nhiên, rất phổ biến trong tế bào thực vật và độns vật.
Nó là este của axit béo và rượu đơn, đa chức. Dựa vào thành phần cấu tạo, có thể
coi lipid gồm hai nhóm:
- Lipid đơn giản: là este của rượu và axit béo, gồm một số nhóm nhỏ sau:
triaxyl glixerin (glyxerit), sáp(Cerid), sterit.
- Lipid phức tạp: trong phân tử của chúng ngoài axit béo và rượu còn có các
thành phần khác như axit phosphoric, bazơ nitơ, đường. Nhóm này bao gồm:
Glixerophospholipit, Glixeroglucolipit, Sphingophospholipit, Shingoglucolipit
về tính chất: Lipid không tan vào nước, chỉ tan trong các dung môi hữu cơ
như ete, benzen, toluen. Lipid là dung môi hoà tan các loại vitamin như: vitamin A,
D, E, K, F [7].
Trong tự nhiên, có nhiều nhóm vi sinh vật có khả năng phân giải lipid như
Pseudomonas, Achromobacte, Actinomyces,
Với khả năng phân giải các hợp chất như trên, các nhà khoa học đó sử dụng
các loại vi sinh vật có sẵn trong môi trường; làm tăng hoạt tính của các chủng vi
sinh vật để xử lý các loại phế thải trong trồng trọt và chăn nuôi.
8
CHƯƠNG II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứ u
2.1. Nguyên liệu
Rơm rạ: Được lấy mẫu tại ruộng lúa sau thu hoạch tại Hà Tây
Phân ỉợn: được lây mâu từ khu chăn nuôi của người dân xã Đông Ngạc
huyện Từ Liêm, Hà Nội.
Chê phâm vi sinh vật: Do phòng Vi sinh vật — Viện Thổ nhường Nông hoá

sản xuât. Chê phâm vi sinh vật được tạo thành từ tổ hợp các vi khuẩn, nấm men, xạ
khuẩn. Thành phần men ủ vi sinh vật được trình bày trong bảng 2.1:
Bảng 2.1. Thành phần chế phẩm vi sinh vật
STT
Các nhóm vi sinh vât
•
Chỉ tiêu chất lượng
(Mật độ - CFƯ/g)
1
Xa khuẩn
•
1
00
o
X
o
o
0S
2
Vỉ khuẩn phân giải protein
>1,00
X
108
3
Nấm men
> 1,00
X
108
4.
Vi khuẩn phân giải photphat

>1,00
X
108
Rau cải ngọt: Giông cải ngọt Tosankan (Brassica integrifolia)
Cây cải ngọt Tosankan là thực vật có hai lá mầm, có chu kỳ sinh trưởng
ngắn (khoảng 40 ngày). Cây có giá trị về mặt dinh dưỡng cao. Cây cải ngọt phát
triển tốt trong điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa của Việt Nam và có thể trồng
quanh năm [8].
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Kiểm tra mật độ vi sinh vật theo phương pháp Kock
(1) Kiểm tra mật độ vi sinh vật tổng số: trên môi trường thạch thịt.
(2) Kiểm tra mật độ nấm men: trên môi trường Hansen.
(3) Kiêm tra ĩìĩật độ xợ khuân', tren moi trương Gâuse.
(4) Kiểm trơ mật độ E.colv. trên moi trương Mac Conkey.
(5) Kiểm tra mật độ Salmonella: trên môi trường ss.
9
(6) Kiểm tra mật độ nấm mốc: trên môi trường Czapeck.
Số lượng khuẩn lạc được tính bằng công thức-
N =
Ĩ.C
d(nx - 0,1 n2)
Trong đó:
• N: số v sv trong một đơn vị kiểm tra (CFU/g (ml))
V c ; . ,
• ! tong so khuan lạc đêm được trên tât cả các đĩa petri được giữ lại
• n l: số lượng đĩa petri được giữ lại ở độ pha loãng thứ nhất
• n2: so lượng đĩa petri được giữ lại ở độ pha loãng thứ hai
• d: hệ số pha loãng tương ứng với hệ số pha loãng thứ nhất.
2.2.2. Phần lập cảc chủng vi sinh vật phân giải xenluloza
Để phân lập các vi sinh vật có khả năng phân giải xenluloza. Đề tài tiến hành

phân lập trên môi trường Hutchinson và Clayton. Phương pháp tiến hành như sau:
- Chuẩn bị các môi trường Hutchinson và Clayton.
- Khử trùng môi trường rồi phân phối ra các hộp petri (Khi môi trường nguội
còn 40 - 50°C), mỗi hộp khoảng 20 -30 ml môi trường.
- Cân 10 g mẫu phế phụ phẩm nông nghiệp cho vào bình tam giác dung tích
250ml chứa sẵn 90ml nước sinh lý đã khử trùng, lắc trên máy lác 30 phút, được
dịch pha loãng 10 . Sau đó, dùng nước cất vô trùng pha loãng để đạt được độ pha
loãng 10*2, 10'3. Hút chính xác 0,05ml dịch pha loãng bằng pipet nhỏ (pipetman
200ml) vào các đĩa peptri chứa môi trường Hutchinson và Clayton đã khử trùng và
dàn đều dịch trên bề mặt môi trường bằng que trang vô trùng, những thao tác này
được làm trong tủ ấm trên n^ọn lửa đèn cồn. Dùng kẹp kim loại vô trùng gáp
khoanh giấy lọc tròn (có diện tích bằng diện tích bề mặt thạch) đã hấp khử trùng và
đặt lên bề mặt thạch và dùng que trang thuỷ tinh vô trùng làm cho giấy dính sát vào
bề mặt thạch. Bao gói và nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ 30°c trong 1- 2 tuần (chú ý
để ở nơi có độ ẩm không khí cao để đề phòng giấy lọc bị khô). Sau thời gian nói
trên lấy ra kiểm tra các vi sinh vật phát triển trên bề mặt giấy lọc.
10
Vi sinh vật phân giải xenlulozơ khi phát triển trên giấy lọc thường còn lẫn
với một số vi sinh vật khác. Muốn thuần khiết ta phải cấy chuyển sang môi trường
dịch thể có trộn các mẩu giấy lọc vụn. Các môi trường được sử dụng trong quá trình
này là: Môi trường Gauze, môi trường Hans và môi trường Czapeck. Sau khi làm
thuần xong bảo quản các chủng phân lập được trong ống thạch nghiêng chứa môi
trường phù hợp với từng loại.
2.2.3. Phăn lập các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải tinh bột
Đe phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải tinh bột đề tài sử
dụng các môi trường vẫn dùng để phân lập vi khuẩn có bào tử, nấm mốc, nấm men.
Phương pháp tiến hành như sau:
- Chuẩn bị môi trường Thạch - tinh bột (1000ml)
- Khử trùng môi trường rồi phân phối ra các hộp Petri (Khi môi trường nguội
còn 40 - 50°C), mỗi hộp khoảng 20 -30 ml môi trường.

- Cấy dịch pha loãng mẫu nghiên cứu (cấy khoảng 0,05ml) lên bề mặt thạch,
dùng que gạt thuỷ tinh gạt đều. Nuôi cấy ở nhiệt độ 28- 30°c trong khoảng 7- 10
ngày. Sau thời gian nói trên lấy ra kiểm tra khuẩn lạc các vi sinh vật phát triển trên
môi trường.
- Thu thập các khuẩn lạc mọc riêng rẽ cấy chuyển sang môi trường đặc hiệu
để làm thuần. Sau khi làm thuần xong bảo quản các chủng phân lập được trong ống
thạch nghiêng chứa môi trường phù hợp với từng loại.
2.2.4. Phương pit áp đảnh giá hoạt tỉnh sinh học
2.2.4.1. Đánh giá hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật phân giải
xenluloza.
Sử dụng phương pháp khuyếch tán phóng xạ trên thạch đĩa để xác định hoạt
tính phân giải xenluloza (William, 1893):
Nguyên tắc của phương pháp ỉà ezym CMC - aza thuỷ phân CMC trong môi
trường sẽ tạo thành vòng thuỷ phân màu vàng xung quanh lỗ được nhỏ enzym được
hiện màu bằng dung dịch lugol. Dựa vào hiệu số giữa đường kính vòng thuỷ phân
(D) và đường kính của lỗ đục (d) mà ta có thể xác định được hoạt tính CMC-aza
của v sv .
11
Cách tiến hành: Dùng môi trường thạch - cơ chất: môi trường CMC gồm: lơ
CMC (xenluloza tự nhiên), 15g thạch, 1000ml nước cất.
Phân phối đều vào bình tam giác có dung tích 250ml khử trùng ở latm trong
30 phút, đợi nguội đến 40° c thì đổ môi trường ra đĩa peptri (thường đổ khoảng từ
7-9 đĩa, mỗi đĩa dày khoảng l,5cm). Sau chờ thạch đông lại, dùng dụng cụ đục một
lỗ tròn (đường kính 0,8cm) vào giữa hộp petri (nếu đục một lỗ), nếu đục hai lỗ thì
đục đối xứng. Tiếp theo nhỏ 0,1 ml dịch enzym/l lỗ. Sau khi thạch khô (khoảng 15
phút), thì để các đĩa đó vào tủ lạnh sau 5-6 giờ thì lấy ra để vào tủ ấm ở 30°c
(không lật ngược đĩa) để enzym tác dụng với cơ chất CMC. Sau 24 giờ sau thì
nhuộm bàng 5ml dịch lugol (lg I2 và 2g KI trong 300ml nước cất) chờ 15 - 30 phút.
Sau đó, gạt bỏ hết dịch lugol, đo vòng thuỷ phân màu vàng trên nền đỏ tím.
Hoạt tính CMC- aza được hiển thị bằng hiệu số giữa đường kính vòng phân

giải (D) và đường kính lỗ khoan (d), (D- d) đơn vị đo là cm.
2.2.4.2. Đánh giá hoạt tỉnh phân giải tinh bột
Xác định hoạt tính phân giải tinh bột bàng phương pháp khuyếch tán trên
thạch đĩa. Phương pháp nghiên cứu tiến hành như phương pháp (2.2.4.1), thay CMC
bàng tinh bột tan.
Hoạt tính thủy phân tinh bột được hiển thị bằng hiệu số giữa đường kính
vòng phân giải (D) và đường kính lỗ khoan (d), đơn vị đo là cm.
2.2.5. Xác định điều kiện sinh trưởng và phát triển
2.2.5.1. Ảnh hưởng của pH:
Xác định ảnh hưởng của pH tới quá trình sinh trưởng và phát triển của vi
sinh vật bằng phương pháp nuôi cây ở các điêu kiện pH khác nhau
Phương pháp tiến hành cụ thê như sau:
+ Chuẩn bị môi trường phù hợp cho mỗi chủng vi sinh vật
+ Điều chỉnh môi trường về các nồng độ pH ở các mức khác nhau: 4,0; 5,0;
6,0; 7,0; 8,0 bằng dung dịch đệm Mc Ilvaine.
12
+ Khử trùng môi trường rồi cấy dịch pha loãng vi sinh vật ở nồng độ thích
hợp. Nuôi cây ở nhiệt độ phân lập các chủng trong 2-4 ngày. Sau thời gian nói trên
tien hanh kiem tra mật độ vi sinh vật phát triển trên môi trường.
2.2.5.2. Anh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy.
Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình sinh trưởng và phát triển của
vi sinh vật băng phương pháp nuôi cấy ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau.
Phương pháp tiến hành cụ thể như sau:
+ Chuẩn bị môi trường nuôi cấy thích hợp, khử trùng môi trường và phân
phối ra các hộp petri.
+ Dùng pipet hút chính xác lml v sv nuôi cấy sau 48h vào môi trường dịch
thể thích hợp đã chuẩn bị sẫn trong các ống nghiệm, cấy dịch pha loãng vi sinh vật
ở nồng độ thích hợp. Tiến hành nuôi tại các nhiệt độ khác nhau (25°c, 30°c, 35°c,
40°c, 45°c, 50°c, 55°C). Sau đó kiểm tra số lượng khuẩn lạc mọc trên môi trường
sau 2-4 ngày.

2.2.53. Anh hưởng thời gian nuôi cấy.
Để xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy, đề tài tiến hành xác định mật
độ tế bào vi sinh vật ở các thời điểm khác nhau
Phương pháp tiến hành như sau:
+ Chuẩn bị môi trường nuôi cấy thích hợp cho từng chủng vi sinh vật, khử
trùng môi trường
+ Cấy dịch pha loãng vi sinh vật vào môi trường dịch thể. Nuôi cấy lắc (150
vòng/phút) trong điều kiện nhiệt độ thích hợp cho từng chủng vi sinh vật.
+ Tiến hành xác định mật độ tế bào ở các thời điểm khác nhau: 0 giờ, 12giờ,
24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ, 72 giờ và 96 giờ.
2.2.6. Phương pháp xử lý phế thải trồng trọt bằng v s v
- Nguyên liệu trước khi đưa vào ủ được xác định trọng lượng khô tuyệt đối
điều chỉnh độ ẩm, pH và kích thước hợp lý cho quá trình ủ.
- Thực hiện thí nghiệm theo 2 công thức ủ: Mỗi công thức ủ có khối lượng
50kg
+ Công thức 1 (ĐC): rơm, rạ
13
+ Công thức 2 (TN): Rơm rạ +1% sinh khối dịch thể vi sinh vật
• • •
- Phôi trộn các nguyên liệu, đảo đều và điều chỉnh độ ẩm cho khối ủ sao cho
độ ẩm nguyên liệu đạt 50-60%, sau đó đánh đống.
- Trong quá trình ủ tiến hành kiểm tra theo dõi nhiệt độ đống ủ. Kiểm tra và
điêu chỉnh độ ẩm thường xuyên để độ ẩm khối ủ được ổn định.
- Cảm quan: màu sắc, độ mịn của nguyên liệu,
- Độ giảm trọng lượng cơ chất trong đống ủ
2.2.7, Phương pháp xử lý phế thải chăn nuôi bằng vi sinh vật
Phương pháp xử lý phế thải chăn nuôi bằng vi sinh vật (phương pháp ủ phân)
được tiến hành theo quy trình xử lý phế thải chăn nuôi [7]
★ Nguyên liệu trước khi đưa và ủ được điều chỉnh độ ẩm, pH và kích thước
hợp lý cho quá trình ủ.

- Độ ẩm được điều chỉnh bằng cách phơi khô tự nhiên hoặc trộn với các chất
độn khác như rơm rạ, cây xanh, thân cây hay than bùn theo tỷ lệ phù hợp.
- Điều chỉnh pH bàng cách rắc vôi bột trên đống ủ.
★ Đống ủ có khối lượng 50kg với thành phần chính là phân lợn, than bùn
được phối trộn với nhau và được bổ sung chế phẩm vi sinh vật, chất dinh dưỡng
theo quy trình xử lý phế thải chăn nuôi.
★ Trong quá trình ủ tiến hành kiểm tra, theo dõi nhiệt độ đống ủ, sự biến
động của quần thể vi sinh vật trong đống ủ.
- Kiểm tra và điều chỉnh độ ẩm đống ủ thường xuyên để độ ẩm được ổn định.
- Tiến hành quan sát về màu sắc, độ mịn của nguyên liệu, độ giảm trọng;
lượng cơ chất của đống ủ.
2.2.8. Phương pháp xác định các tính chất ho ả sinh trong đống ủ
1. Xác định độ ẩm [4], [9]
2. Xác định pH theo phương pháp cực chọn lọc hidro (máy đo pH meter).
3. Xác định hàm lượng chất hữu cơ theo phương pháp Walkey-Black [4], [9]
4. Xác định hàm lượng Nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldhal [4], [9]
5. Xác định hàm lượng p20 5 dễ tiêu bằng phương pháp so màu[4], [9]
14
6. Xác định hàm lượng K20 dễ tiêu theo phương pháp quang kế ngọn lửa [4], [9]
2.2.9. Phương pháp bố trí thí nghiệm trồng cây
Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, ba lần lặp lại.
- Nguyên liệu:
+ Đất thí nghiệm là đất phù sa ven sông Hồng không được bồi đắp hàng
năm, pHicci = 6,6; hàm lượng Nts 0,185%, cacbon hữu cơ là 2,32%. Đất thí nghiệm
được đánh tơi, nhặt bỏ xác hữu cơ, mầm cỏ. Phơi đất ngoài trời nắng từ 1-2 ngày để
tiêu diệt mầm cỏ dại và vi sinh vật gây bệnh.
+ Cây trồng: Giống cải ngọt Tosakan.
- Diện tích ỏ thỉ nghiệm: mỗi ô có diện tích là 2500 cm2 (50cm x50cm).
Chiều cao ô: 25 cm. Khối lượng đất trong mỗi ô: 20kg.
+ Thí nghiệm với 4 công thức:

Công thức 0(ĐC)\ Đối chứng, không bón phân hữu cơ + NPK
Công thức 1(CT1): Bón phế thải chăn nuôi đó qua xử lý (SPĐXL) + NPK
Công thức 2(CT2)\ Bón phân chuồng tươi +NPK
Công thức 3(CT3): Bón phân hữu cơ cầu Diễn + NPK
+ Cách thức bón phân: Các loại phân bón được bón lót vào trong đất. Trong
đó: SPĐXL được bón với khối lượng 0,4kg/ô; phân hữu cơ cầu Diễn: 50g/ô; phân
chuồng: 0,4kg/ô. Riêng ở công thức phân chuồng, phân chuồng được tưới bổ sung
sau 5 ngày và 20 ngày cấy.
+ Phân hóa học được tưới bổ sung theo công thức 31-14-7 (N-P20 5-K20)
(kg/ha).
+ Các biện pháp kỹ thuật như làm đất, chăm sóc, tưới nước được thực hiện
như trong điều kiện sản xuất thông thường theo qui trỡnh chăm sóc cây cải được
hướng dẫn bởi Trần Thế Tục, Nguyễn Ngọc Kính và theo Quy phạm về khảo
nghiệm hiệu quả các loại phân bón trên cây trồng (10TCN 216-2003) [10].
- Theo dõi các chi tiêu sinh trưởng".
+ Tỉ lệ nảy mầm: bàng số hạt nảy mầm trên tổng số hạt
+ Đo chiều cao cây: từ gốc rễ đến đầu lá cao nhất.
15
+ Khối lượng tươi trung bình của mỗi cây (mỗi công thức thí nghiệm nhổ 10
cây để cân).
+ Khối lượng khô trung bình của mỗi cây
+ Số lá và diện tích lá.
2.2.10. Đánh giá nhanh độ chín và độ an toàn của phẫn ủ
- Phương pháp plant test
Chuẩn bị khay có kích thước 38x28x6 cm và đổ đầy phân ủ. Cân lOg hạt cải,
rắc đều lên bề mặt khay. Sau khi gieo xong, phủ một lớp nilon lên bề mặt khay cho
tới khi cây nảy mầm. Thường xuyên theo dõi quá trình phát triển của cây và độ ẩm
của phân ủ. Sau 5 ngày gieo, tiến hành thu hoạch và cân trọng lượng tươi của cây
cải ở mỗi khay. Mức độ chín của đống ủ được đánh giá qua tỉ lệ nẩy mầm và trọng
lượng tươi của cải trên mỗi khay. Trọng lượng cải trên mỗi khay từ 60-100g sẽ cho

biết đống ủ đó chín. Neu trọng lượng của cải thu được nhỏ hơn 60g chứng tỏ phân ủ
chưa chín.
- Phương pháp xác định độ hoai mục của phân ủ theo TCVN 7] 68-2002 [10]
Sử dụng nhiệt kế có mức đo nhiệt độ từ 0°c đến 100°c, cắm sâu 50cm đến
60cm vào trong đơn vị bao gói có khối lượng khồng nhỏ hơn 10 kg. Sau 15 phút,
đọc nhiệt độ lần thứ nhất. Đo, ghi chép và theo dõi sự thay đổi về nhiệt độ trong
thời gian 3 ngày liên tiếp, mỗi ngày đo một lần (đo vào lúc 9 giờ).
Phân hữu cơ vi sinh vật bảo đảm độ hoai mục khi nhiệt độ của đơn vị bao gói
phân bón không thay đổi trong suốt thời gian theo dõi.
2.2.11. Các phương pháp xác định hàm lượng các chất dinh dưỡng trong
cày cải ngọt
1. Xác định hàm lượng N 03* theo phương pháp so màu (do Grandvan-Lianz
giới thiệu) [4].
2. Xác định hàm lượng vitamin c [4].
3. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Kjehldan 1883 [4].
4. Cân khối lượng rau, số lá, chiều cao cây, diện tích lá.
16
CHƯƠNG 3. KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
■
3.1. Phân lập và tuyên chọn một số vsv có hoạt tính phân giải hợp
chất hydrat cacbon
3.1,1. Phân lập và tuyển chọn một số vsvcó hoạt tính phân giải xenluloza
Từ các mẫu rơm rạ, đề tài đã tiến hành phân lập các chủng vi sinh vật có khả
năng mọc trên giấy lọc trong các điều kiện nhiệt độ nuôi cấy khác nhau. Kết quả
phân lập được thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Ket quả phân ỉập các chủng vi sinh vật
Nhiệt độ phân lập
r
SÔ lượng chủng vi sinh vật
Mầu rơm ra

•
sau thu hoach
•
15 ngày
Mầu rơm ra
•
sau thu hoạch
30 ngày
Mầu rơm ra
#
sau thu hoach
•
45 ngày
25
1
3 2
30 2
4
5
35 3
4
5
40
5 6 8
Tổng số chủng
11 17 20
Kêt quả bảng 3.1 cho thây, trong rơm rạ có chứa săn rât nhiêu các nhóm vi
sinh vật có khả năng chuyển hoá cơ chất trên bề mặt giấy lọc. Bảng số liệu cũng cho
thấy số lượng chủng vi sinh vật phân lập được tăng dần theo thời gian lưu ngoài tự
nhiên, kết quả cũng cho thấy số chủng vi sinh vật phân lập được ở điều kiện nhiệt

độ 40°c là nhiều nhất.
Với mục đích tuyển chọn những chủng vi sinh vật có khả năng phân giải
xenlulozơ cao, đề tài tiếp tục đánh giá hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật
đã phân lập được theo phương pháp khuyếch tán trên thạch đĩa. Các chủng vi sinh
vật tuyển chọn được nhân sinh khối trên môi trường dịch thể ở nhiệt độ 28-30°C và
được lắc trên máy lác với tốc độ 150 vòng/phút. Hoạt tính sinh học của các chủng vi
sinh vật có hoạt tính cao được thể hiện ở bảng 3.2.
I Dr/
Bảng 3.2. Hoạt tính phân giải xenluloza của các chủng vi sinh vật
STT
Kí hiêu
•
chủng
Nguồn gốc
Mật độ tế bào
(CFƯ/ml)
Đường kính vòng
phân gỉảỉ
(D-d) cm
1
Gi
Thanh Oai
6,50.10®
1,2
2
g 2
Thanh Trì
5,66. 106 2,6
3
Ư,

Đan Phượng
6,44. 105
2,4
4
Ư2
Văn Điển
8,86. 106
2,0
5
1 Ư 3
Thanh Oai 6,47. 106
1,1
6
Ư4
Đan Phượng
8,33. 106
1,5
7
Ư5
Đan Phượng
3,28.10s
1,8
8
Ư6
Thanh Oai 7,55. 107 0,5
9
ư 7
Văn Điển
6,12. 107
0,9

(D): Đường kính vòng phân giải
(d): Đường kính lỗ đục
Kết quả đánh giá cho thấy: bằng phương pháp khuyếch tán trên thạch đĩa, đề
tài đã lựa chọn được 9 chủng vi sinh vật có vòng phân giải xenluloza, trong đó có 2
chủng vi sinh vật kí hiệu G2 và ƯỊ có hoạt tính phân giải xenlulozơ cao nhất, sổ liệu
bảng 7 cho thấy đường kính vòng phân giải của chủng Ơ2 là 2,6 cm và chủng ƯJ là
2,4 cm. Để phục vụ cho mục đích của khoá luận, đề tài đã lựa chọn chủng G2 và ƯỊ
cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.2. Phân lập và tuyển chọn một số vsvcó hoạt tính phân giải tinh bộí
Từ các mẫu rơm rạ, đề tài đã tiến hành phân lập các chủng vi sinh vật phân
giải tinh bột trong các điều kiện nhiệt độ nuôi cấy khác nhau. Kết quả phân lập được
thể hiện ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả phân lập các chủng vi sinh vật
Nhiêt đô phân
lập (ÒC)
ề
Số lượng chủng vi sinh vật
Mầu rơm ra
•
sau thu hoach
•
15 ngày
Mau rơm ra
•
sau thu hoạch
30 ngày
Mau rơm ra
•
sau thu hoach
•

45 ngày
25
2
2
3
30
4 6
7
18
35
1
3
2
40
2
2
3
Tổng số chủng
9
13
15
Kêt quả phân lập cho thấy, trong rơm rạ chứa sẵn rất nhiều các nhóm vi
sinh vật có khả năng chuyển hóa cơ chất trên môi trường chứa tinh bột. Bảng số liệu
cũng cho thấy số lượng chủng vi sinh vật có khả năng chuyển hóa tinh bột phân lập
được tăng dần theo thời gian lưu ngoài tự nhiên và số chủng vi sinh vật phân lập
được ở điều kiện nhiệt độ 30°c là nhiều nhất.
Tuyển chọn
Với mục đích tuyển chọn những chủng vi sinh vật có khả năng phân giải tinh
bột cao, đề tài tiếp tục đánh giá hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật đã phân
lập được theo phương pháp khuếch tán trên thạch đĩa. Các chủng vi sinh vật tuyển

chọn được nhân sinh khối trên môi trường dịch thể ở nhiệt độ 28-30°C và được lắc
trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút). Hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh
vật có hoạt tính cao được thể hiện ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Hoạt tính phân giải tinh bột của các chủng vi sinh vật
STT
Kí hỉêu
•
chủng
Nguồn gốc
Mật độ tế bào
(CFƯ/ml)
Đường kính vòng
phân giải
(D-d) cm
1
Bi
Đan Phượng
6,50.10*
2,5
2 b 2
Đan Phượng
5,66. 106
0,5
3
b 3
Thanh Trì
6,44. 105
1,9
4
b 4

Thanh Oai
8,86. 106
1,6
5
b 5
Đan Phượng
6,47. 106 2,8
Kết quả đánh giá cho thấy: bằng phương pháp khuy ếch tán trên thạch đĩa đề
tài đã lựa chọn được 5 chủng vi sinh vật có vòng phân giải tinh bột, trong đó có 2
chủng vi sinh vật kí hiệu Bi và B5 có hoạt tính phân giải tinh bột cao nhất, số liệu
bảng 3.4 cho thấy, đường kính vòng phân giải của chủng E*! là 2,5 cm và chủng B5
là 2,8 cm. Để phục vụ cho mục đích của luận văn, đề tài đã lựa chọn chủng Bị và B5
cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.3. Một số đặc điểm sinh học của các chủng đã lựa chọn
19
Để đánh giá đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng vi sinh vật tuyển
chọn, đê tài đã tiên hành quan sát quá trình sinh trưởng và phát triển của chúng khi
được nuôi cây trên môi trường thạch và môi trường dịch thể tương ứng.
+ Chung G2I khuan lạc tron, có màu trăng đục, bê mặt nhẵn, không mùi, sau
4 ngay nuoi cay khuan lạc co đường kính 1,2-2 mm. Khi nuôi cấy lắc cho dịch sinh
khoi sanh, đục, nhicu bọt, khi nuoi cây tĩnh thì tạo váng trên bê mặt dịch thể
+ Chủng Ui: khuẩn lạc có màu tráng sáng, không trong suốt, bề mặt nhăn
long xam, mui hoi, khuân lạc ăn sâu vào bê mặt thạch, sau 4 ngày nuôi cấy khuẩn
lạc co đương kính từ 1,5-2,3 mm. Khi nuôi cây trên máy lắc trong môi trường dịch
the tạo thành các hạt nhỏ, dịch môi trường trong theo thời gian nuôi cấy, khi nuôi
cấy tĩnh thì tạo váng trên bề mặt môi trường dịch thể.
+ Chủng Bị: khuẩn lạc màu trắng sữa, bề mặt trơn nhẵn, mùi thơm dịu, sau 3
ngày nuôi cấy khuẩn lạc có đường kính từ 1,5-2,1 mm. Khi nuôi cấy lắc trong môi
trường dịch thể cho dịch đục và mùi chua, khi nuôi cấy tĩnh thì tạo váng trên bề mặt
môi trường.

+ Chủng B5: khuẩn lạc màu tráng đục, khuẩn lạc tròn, không mùi, sau 3 ngày
nuôi cấy khuẩn lạc có đường kính từ 1,3-2,2 mm. Khi nuôi cấy lắc trên môi trường
dịch thể tạo dịch đục, nhiều bọt khí. Khi nuôi cấy tĩnh thì tạo váng trên môi trường
dịch thể.
3.2. Điều kiện sinh trưởng và phát triển của các chủng vi sinh vật
3.2.1. Anh hưởng của nhiệt độ
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình sinh trưởng và
phát triển của chủng vi sinh vật được thể hiện trong bảng 3.5.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng và phát triển của
vsv
Nhiệt độ (°C)
Mât đô tế bào CFƯ/mI
• •
G2
UI BI B5
25
8,20.105
5,21.1 o4
6,47.107
8,62.107
30
9,42.10*
8,56.106
7,24.10*
4,60.10®
35 5,84.107
2,06.107 5.12.107
2,92.105
20
40

2,38.10s
5,43.108 3,06.105 2,48.103
45
6,24.105
7,20.108
4,45.105
8,56.1 o2
50
7,42.103
8,22.107
3,46.103
6,42.102
55 3,83.102
5,82.106
2,84.102
1,78.1 o2
Bảng kêt quả cho thây, chủng G2 và Bi và B5 đêu có khả năng phát triên tôt
nhất tại nhiệt độ 30°c, chủng G2 đạt mật độ 9,42.108 CFƯ/ml, chủng B] đạt 7,24.108
CFƯ/ml và chủng B5 đạt 4,60.108 CFƯ/ml, trong khi đó chủng ƯỊ phát triển mạnh ở
nhiệt độ 40-50°C, tại nhiệt độ 45°c chủng UI đạt mật cao nhất là7,20.108 CFƯ/ml.
Điều này chứng tỏ rằng các chủng G2, B]Và B5 là các thuộc nhóm vi sinh vật ưa ấm
và chủng ƯỊ thuộc nhóm vi sinh vật ưa nhiệt.
3.2,2. Ảnh hưởng của pH
pH là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và
phát triển của vsv. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến quá trình sinh
trưởng và phát triển của 4 chủng v sv được thể hiện trong bảng 3.6.
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng và phát triển của v sv
pH
Mât đô tế bào CFƯ/mI
• •

Ơ2
u, B,
b 5
4,0
2,60.103
2,49.103
2,32.103
3,41.1 o3
5,0
2,48.1 o3
4,15.103
6,40.105
4,38.105
6,0
2,64.104
1,57.1 o4
7,61.1 o6
3,54.106
7,0
4,56.108
7,42.107
5.98.108
6,70.10®
8,0
6,84.107
5,14.10s
8,20.107
2,12.1 o7
Kết quả bảng 3.6 cho thấy, các chủng vi sinh vật có khả tồn tại trong dải pH
từ 4 0 - 8,0. Kết quả cho thấy chủng G2, Bi và B5 có khả năng sinh trưởng và phát

triển thích hợp trong môi trường pH = 7,0. Trong khi đo chung U] co kha nang sinh
trưởng và phát triêĩì tôt trong điêu kiện pH kiêm, trong đieu kicn pH — 8,0 chung UI
đạt mật độ cao nhất là 5,14.1 o8
• • •
3.2.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Để đánh giá khả năng phát triển của các chủng vi sinh, đề tài tiến hành kiểm
tra mât đô vi sinh vật ở các thời điểm khác nhau. Kết quả được thể hiện trong bảng
• •
21