Nghiên cứu ảnh hưởng của việc bổ sung enzyme protamex và tỷ lệ muối đến hàm lượng đạm trong nước mắm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM





TRẦN VĂN THANH


NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA VIỆC BỔ
SUNG ENZYME PROTAMEX VÀ TỶ LỆ MUỐI
ĐẾN HÀM LƯỢNG ĐẠM TRONG NƯỚC MẮM




ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CHẾ BIẾN THỦY SẢN


GVHD: TS. NGUYỄN THỊ MỸ HƯƠNG




Nha Trang, 7/ 2013

LỜI CẢM ƠN

Sau hơn 3 tháng nghiên cứu và thực tập tại phòng thí nghiệm, đến nay, em
đã hoàn thành đồ án tốt nghiệp của mình.
Trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp này, em đã nhận được sự giúp
đỡ nhiệt tình từ các thầy cô giáo trong khoa cũng như bộ môn .
Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn sự hướng dẫn tận tình của cô TS.
Nguyễn Thị Mỹ Hương đã định hướng và tận tình chỉ dẫn em trong suốt quá
trình đề tài cũng như hoàn thành đồ án tốt nghiệp. Ngoài ra, em xin cảm ơn các
thầy cô phụ trách phòng thí nghiệm đã hết sức tạo điều kiện cho em để hoàn
thành nhanh chóng đề tài.
Đồng thời, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các bạn cùng nhóm làm
đề tài đã góp ý giúp đỡ truyền đạt cách làm để mình hoàn thành tốt đề tài.
Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất đến tất cả những
người thân trong gia đình đã hết lòng động viên, tạo điều kiện và giúp đỡ em
trong suốt quá trình học tập cũng như hoàn thành đồ án này.

Nha Trang, tháng 7 năm 2013
Sinh viên thực hiện



TRẦN VĂN THANH




i

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC i

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC CÁC BẢNG iv

DANH MỤC CÁC HÌNH v

MỞ ĐẦU 1

Chương 1.TỔNG QUAN 2

1.1. TỔNG QUAN VỀ CÁ CƠM 2

1.1.1. Các loại cá cơm 2

1.1.2. Tình hình khai thác và sản lượng đánh bắt cá cơm 5

1.1.3. Thành phần hóa học và dinh dưỡng của cá cơm 5

1.2. Phương pháp sản xuất nước mắm cá cơm 6

1.2.1. Phương pháp chế biến nước mắm cổ truyền 6

1.2.2. Phương pháp chế biến nước mắm bằng hóa học 8

1.2.3. Phương pháp chế biến nước mắm bằng vi sinh vật 9

1.3. Tiêu chuẩn chất lượng nước mắm ( TCVN 5107-2003) 10

1.4. Tổng quan về enzyme protease và sự thủy phân bằng enzyme 12

1.4.1. Giới thiệu chung enzyme protease 12

1.4.2. Phân loại Protease 13

1.4.3. Nguồn thu protease vi sinh vật 14

1.4.4. Cơ chế tác dụng của enzyme 15

1.4.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme 16

1.4.6. Một số enzyme thương mại thường được sử dụng trong quá trình thủy phân
protein 18

1.5. Các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về nước mắm và sự thủy
phân bằng enzyme protease 20

1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới về nước mắm và sự thủy phân protein bằng
enzyme 20

1.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước về nước mắm và sự thủy phân protein bằng
enzyme 22

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1. Đối tượng nghiên cứu 24

2.1.1. Cá cơm thường 24

2.1.2. Enzym Protamex 25


ii

2.1.3. Muối 25

2.2. Phương pháp nghiên cứu 26

2.2.1. Xác định thành phần hóa học của cá cơm 26

2.2.2. Bố trí thí nghiệm xác định các biến đổi của thành phần đạm của nước mắm 27

2.2.3. Đánh giá chất lượng sản phẩm nước mắm 29

2.3. Thời gian ngiên cứu 29

2.4. Địa điểm nghiên cứu 29

2.5. Phương pháp phân tích 30

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1. Kết quả xác định thành phần hóa học cá cơm 31

3.2. Kết quả nghiên cứu sự biến đổi hàm lượng đạm trong nước mắm 31

3.2.1. Biến đổi hàm lượng đạm tổng số trong nước mắm 31

3.2.2. Biến đổi hàm lượng đạm acid amin trong nước mắm 32

3.2.3. Biến đổi hàm lượng đạm amoniac trong nước mắm 33

3.3. Chất lượng nước mắm sau 60 ngày lên men 34

3.3.1. Hàm lượng về đạm của nước mắm sau 60 ngày lên men 34

3.3.2. Điểm cảm quan chung của nước mắm 37

3.4. Đánh giá chất lượng của nước mắm có bổ sung enzyme Protamex 1% ở
nồng độ muối 25% 39

3.4.1. Chỉ tiêu cảm quan của nước mắm 39

3.4.2. Chỉ tiêu hóa học của nước mắm 40

3.4.3. Chỉ tiêu vi sinh vật của nước mắm 40

Chương 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 41

4.1. Kết luận 41

4.2. Đề xuất ý kiến 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

PHỤ LỤC

iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Muối/NL: Tỷ lệ muối trên nguyên liệu
Stt : Số thứ tự
h : Giờ
TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam
N
TS
: Đạm tổng số
NH
3
: Đạm amoniac
g : gam
Kg : kilogam
l : lít
N : Niuton
ĐTB : điểm trung bình

iv

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Thành phần hóa học của cá cơm (% theo khối lượng) 5
Bảng 1.2: Thành phần dinh dưỡng của cá cơm 6
Bảng 1.3: Yêu cầu cảm quan của nước mắm 10
Bảng 1.4: Các chỉ tiêu hóa học của nước mắm 11
Bảng 1.5: Chỉ tiêu vi sinh vật của nước mắm 11
Bảng 3.1: Thành phần hóa học của cá cơm 31
Bảng 3.2: Chỉ tiêu cảm quan của nước mắm 39
Bảng 3.3: Chỉ tiêu hóa học của nước mắm 40
Bảng 3.4: Chỉ tiêu vi sinh vật của nước mắm 40

v

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Cá cơm thường 3
Hình 1.2: Cá cơm săng 4
Hình 1.3: Cá cơm Ấn Độ 5
Hình 1.4: Sơ đồ quy trình công nghệ sản phẩm nước mắm cổ truyền 7
Hình 1.5: Sơ đồ quy trình chế biến nước mắm bằng hóa học 8
Hình 1.6: Sơ đồ quy trình chế biến nước mắm bằng phương pháp vi sinh vật 9
Hình 2.1: Cá cơm thường 26
Hình 2.2: Cá cơm đã xay 24
Hình 2.3: Sơ đồ xác định thành phần hóa học của cá cơm 26
Hình 2.4: Sơ đồ xác định biến đổi thành phần đạm của nước mắm 27
Hình 3.1: Biến đổi hàm luợng nitơ tổng số trong nước mắm theo thời gian 31
Hình 3.2: Biến đổi hàm lượng nitơ acid amin trong nước mắm theo thời gian 32
Hình 3.3: Biến đổi hàm lượng nitơ amoniac trong nước mắm theo thời gian 33
Hình 3.4: Hàm lượng nitơ tổng số của nước mắm sau 60 ngày 34
Hình 3.5: Hàm lượng nitơ acid amin trong nước mắm sau 60 ngày 35
Hình 3.6: Hàm lượng nitơ amoniac trong nước mắm sau 60 ngày 36

Hình 3.7: Điểm cảm quan trung bình chung sau 60 ngày 37
Hình 3.8: Nước mắm có bổ sung enzyme Protamex 1% ở nồng độ muối 25% 39



1
MỞ ĐẦU

Sản xuất nước mắm là một thế mạnh của ngành thủy sản nước ta. Hàng
năm, nghề này tiêu thụ khoàng 40-60% tổng số cá đánh bắt được và được chế
biến khắp nơi trên toàn quốc.
Nghề làm nước mắm của nước ta hiện nay đa phần vẫn còn theo phương
pháp truyền thống có nhược điểm là thời gian dài thường từ 6-12 tháng vì vậy
cần rút ngắn thời gian sản xuất nước mắm bằng việc bổ xung thêm enzyme
thương mại.
Trong quá trình sản xuất nước mắm, vấn đề cần quan tâm đó là làm thế
nào để nâng cao hiệu quả sản xuất nhưng vẫn đảm bảo được chất lượng của sản
phẩm nhằm đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng.
Tỷ lệ muối là một yếu tố vô cùng quan trọng ảnh hưởng đến thời gian thủy
phân và chất lượng của nước mắm. Vì nồng độ muối phải đảm bảo có tác dụng
thúc đẩy quá trình thủy phân protein, đồng thời đủ khả năng ức chế sự phát triển
của vi sinh vật.
Ngày nay, việc ứng dụng enzyme trong chế biến thực phẩm đang được
nhiều nhà khoa học quan tâm. Bởi enzyme là chất xúc tác sinh học, đóng vai trò
quan trọng trong chế biến thực phẩm, y học, mỹ phẩm,
Từ những vấn đề cấp thiết trên tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ảnh
hưởng của việc bổ sung enzyme Protamex và tỷ lệ muối đến hàm lượng đạm
trong nước mắm”.

2
Chương 1. TỔNG QUAN

1.1. TỔNG QUAN VỀ CÁ CƠM
1.1.1. Các loại cá cơm
Chủng loại cá cơm rất đa dạng và phong phú gồm nhiều loài khác nhau:
Theo FishBase.org thì họ này bao gồm 16-17 chi và khoảng 139-142 loài.
•
Chi Pseudosetipinna.
•
Phân họ Coiliinae gồm 5 chi và 47 loài
o
Chi Coilia: 13 loài cá lành canh, sống trong môi trường nước mặn
và nước ngọt
o
Chi Lycothrissa: 1 loài
o
Chi Papuengraulis: 1 loài
o
Chi Setipinna: 8 loài
o
Chi Thryssa: 24 loài
•

Phân họ Engraulinae gồm 11 chi và 94 loài
o
Chi Amazonsprattus: 1 loài
o
Chi Anchoa: 36 loài
o
Chi Anchovia: 3 loài
o
Chi Anchiovella: 15 loài
o
Chi Cetengraulis: 2 loài
o
Chi Encrasicholina: 5 loài
o
Chi Engraulis: 7 loài
o
Chi Jurengraulis: 1 loài
o
Chi Lycengraulis: 4 loài
o
Chi Pterengraulis: 1 loài
o
Chi Stolephorus: 19 loài
[
35]
Ở Việt Nam, những loài cá cơm phân bố chính như sau:
1.1.1.1. Cá cơm thường
- Tên tiếng Anh: Commerson’s anchovy
- Tên khoa học: Stolephorus commersonii
- Vùng phân bố: Vịnh Bắc Bộ và vùng biển miền Trung và Nam Bộ

3
- Nguồn nguyên liệu: khai thác
- Mùa vụ khai thác: quanh năm
- Ngư cụ khai thác: lưới vây, kéo, mành
- Kích thước khai thác: 50-70mm
- Dạng sản phẩm: cá khô, làm nước mắm
- Cá cơm là một họ các loài cá chủ yếu sống trong nước mặn (có một số loài
sống trong nước ngọt hay nước lợ), có kích thước nhỏ (chiều dài tối đa là 50cm,
nhưng phổ biến là dưới 15 cm), phổ biến là bơi thành đàn và ăn các loài sinh vật
phù du, chủ yếu là thực vật phù du, trừ một số loài ăn cả cá. Chúng phân bố khắp
thế giới. Cá cơm có thân hình trắng, dài chừng đốt ngón tay. Cá cơm chỉ có vào
mùa nước cạn, khoảng tháng ba âm lịch
[28].


Hình 1.1: Cá cơm thường
1.1.1.2. Cá cơm săng
- Tên tiếng Anh: Spined anchovy
- Tên khoa học : Stolephorus tri
- Nguồn nguyên liệu: khai thác
- Vùng phân bố: Vịnh Bắc Bộ, vùng biển miền Trung và Nam Bộ
- Mùa vụ khai thác: quanh năm
- Ngư cụ khai thác: lưới vây, lưới kéo, mành
- Kích thước khai thác: 40-55mm
- Dạng sản phẩm: đông lạnh tươi , cá khô, làm nước mắm

4
- Đặc điểm hình thái: thân dài, dẹp bên. Đầu tương đối to, mõm ngắn, chiều
dài thân gấp 4,8 lần chiều cao thân và 4,6 lần chiều dài đầu, mắt tương đối to.

Không có màng mỡ mắt, khoảng cách hai mắt rộng. Trên hàm, xương lá mía,
xương khấu cái đều có răng nhỏ. Khe mang rộng, lược mang dài và nhỏ. Vẩy
tròn, nhỏ, dễ rụng, có một vây lưng, khởi điểm nằm ở sau khởi điểm của vây
bụng, trước khởi điểm của vây hậu môn. Thân màu trắng, bên thân có một sạc
chọ màu trắng bạc, các vây màu trắng, riêng vây đuôi màu xanh lục
[30]. [28].


Hình 1.2: Cá cơm săng
1.1.1.3. Cá cơm Ấn Độ
- Tên tiếng Anh: Indian anchovy
- Tên khoa học : Stolephorus indicus
-
Đặc điểm hình thái: Thân dài hình trụ, hơi dẹp bên, đầu tương đối dài.
Mốm tù, chiều dài thân gấp 4,9 – 5,3 lần chiều cao thân và 4,0 – 4,9 lần chiều dài
đầu. Mắt tương đối to, không có màng mỡ mắt, khoảng cách hai mắt rộng, hơi gồ
lên. Mút sau cùng của xương hàm trên dài đến khe mang. Trên hàm, xương lá
mía, xương khấu cái đều có răng nhỏ. Khe mang rộng, lược mang nhiều, mang
giả phát triển. Vẩy tròn, dễ rụng. Có một vây lưng tương đối to, khởi điểm nằm
ngang bằng với điểm giữa của khoảng cách từ vây bụng đến vây hậu môn. Vây
ngực to, vây bụng nhỏ. Thân màu trắng, bên thân có một sọc dài màu trắng bạc,
trên đầu có một chấm màu xanh lục. Vây lưng và vây đuôi màu xanh
[28], [30],
[31].

5

Hình 1.3: Cá cơm Ấn Độ
1.1.2. Tình hình khai thác và sản lượng đánh bắt cá cơm
Theo báo cáo của Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn trong 5 tháng

đầu năm 2012, tổng sản lượng xuất khẩu thủy sản của cả nước đạt 2.067,2 nghìn
tấn, tăng 3,9% so với cùng kỳ năm 2011. Về khai thác thủy sản 5 tháng đầu năm
ước tính đạt gần 1051 nghìn tấn, tăng 3,0% so với cùng kỳ năm 2011, riêng khai
thác biển 5 tháng ước đạt 986 nghìn tấn, tăng 3,2 % so với năm 2011. Trong đó,
sản lượng cá cơm và cá nục chiếm khoảng 60% tổng sản lượng khai thác (khoảng
591,6 nghìn tấn). Tình hình khai thác cá cơm những tháng đầu năm 2013 tiếp tục
trúng đậm mùa cá cơm ở nhiều nơi trên cả nước: Phú Yên, Khánh Hòa, Nghệ An,
Quảng Nam… Riêng ở Nghệ An, theo người dân cho biết, cứ mỗi thuyền ra biển
từ 3-5 ngày có thể thu hoạch được 7-10 tấn cá cơm
[29], [34] .

1.1.3. Thành phần hóa học và dinh dưỡng của cá cơm
Bảng 1.1: Thành phần hóa học của cá cơm (% theo khối lượng)
[4]

Nước Protein Lipid Khoáng
77,4

19,3 1,6 1,3


6
Bảng 1.2: Thành phần dinh dưỡng của cá cơm
[29]

Thành phần dinh dưỡng trong 100g thực phẩm ăn được

Năng lượng Kcal 81
Nước 78,9
Protein 18,5

Lipid 0,7
Thành
Phần
Chính
Tro

g
1,8
Calci 168
Photpho 226
Sắt 1,0
Natri 584

Muối
Khoáng
Kali

mg
133
A 18
B1 0,06
B2 0,07
PP
ug
1,8

Vitamin
C mg 0

1.2. Phương pháp sản xuất nước mắm cá cơm

Hiện nay, nguồn nguyên liệu cá cơm khoảng 40-60% được sử dụng chủ
yếu để sản xuất nước mắm cá cơm thông qua phương pháp sản xuất nước mắm
truyền thống như gài nén hoặc khuấy đảo. Sản phẩm nước mắm tạo ra là một loại
nước chấm quen thuộc của nước ta và không thể thiếu trong mỗi bữa ăn của
người dân Việt với giá trị dinh dưỡng cao và hấp dẫn bởi hương vị đậm đà [32].
1.2.1. Phương pháp chế biến nước mắm cổ truyền
Nguyên lý
Có 3 phương pháp chế biến nước mắm cổ truyền:
 Phương pháp đánh khuấy
- Cho muối nhiều lần
- Cho nước lã
- Đánh khuấy liên tục

7
 Phương pháp gài nén
- Cho muối một lần hoặc nhiều lần
- Không cho nước lã
- Gài nén và không đánh khuấy
 Phương pháp hỗn hợp
- Kết hợp giữa 2 phương pháp gài nén và đánh khuấy
- Lúc đầu thực hiện phương pháp gài nén
- Sau đó thực hiện phương pháp đánh khuấy
Phương pháp
Cá + muối
Ủ (2 ngày)
Lên men (6-12 tháng)
Chượp chín
Chiết rút Nước mắm cốt
Bã chượp
Lên men lần 2 (6-12 tháng) Dịch nước mắm

Chượp
Bã chượp Lên men nhiều lần
Dịch nước mắm
Phối trộn
Nước mắm thành phẩm
Hình 1.4: Sơ đồ quy trình công nghệ sản phẩm nước mắm cổ truyền

8
1.2.2. Phương pháp chế biến nước mắm bằng hóa học
Nguyên lý
Sử dụng hóa chất thường dùng HCl để thủy phân protein thịt cá thành các
acid amin.
Phương pháp Nguyên liệu
Xử lý
Ngâm
Thủy phân
Trung hòa
Lọc và điều chỉnh chất lượng Bã
Thành phẩm Thức ăn gia súc

Hình 1.5: Sơ đồ quy trình chế biến nước mắm bằng hóa học

• Nguyên liệu: các loài thủy sản có đạm như tôm, cua, cá, nghêu, sò và
nước muối cá cũ.
• Xử lý: làm sạch.
• Ngâm: trong dung dịch HCl thời gian một tuần, thỉnh thoảng đánh
khuấy tạo cho nước mắm có màu sắc đẹp và thủy phân một phần protein trong
cá.
• Thủy phân: sử dụng những kiệu, lu có ống sinh hàn đồng thời có thiết
bị đánh khuấy để tránh cháy khét.

 Nồng độ acid sử dụng là HCl 7N.
 Nhiệt độ: cao hay thấp đều có ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm.
Nhiệt độ thích hợp nhất là 100-105
0
C, thủy phân trong thời gian 7-8 giờ.
 Lượng acid: dựa vào nguyên liệu, nếu nguyên liệu có nhiều xương
cứng, nhiều vảy cần lượng acid nhiều.
• Trung hòa: sử dụng Na
2
CO
3
nhiệt độ trung hòa 60-70
0
C, pH= 6,3-6,5.

9
• Lọc và điều chỉnh chất lượng sản phẩm:
 Vớt chất béo nổi phía trên và lọc qua vải để giữ cặn, xương và xác
chưa bị thủy phân.
 Điều chỉnh nồng độ muối về khoảng 20
0
Bé.
 Điều chỉnh nồng độ đạm bằng cách đun ở nhiệt độ 60-70
0
C hoặc phơi
nắng sau đó bổ sung bezoat Na với nồng độ 1%.
 Kéo rút nước mắm qua bã chượp tốt hoặc trộn với nước mắm cốt [32].
1.2.3. Phương pháp chế biến nước mắm bằng vi sinh vật
Nguyên lý
Sử dụng hệ enzym protease trong nấm mốc Aspergilus oryzea để thủy

phân protein thịt cá thành các acid amin ở điều kiện nhiệt độ và môi trường thích
hợp.
Phương pháp
Nguyên liệu
Xử lý
Thủy phân (mốc 3-4%)
Nước lọc Lọc
Dịch thủy phân
Sản phẩm
Hình 1.6: Sơ đồ quy trình chế biến nước mắm bằng phương pháp vi sinh vật
• Xử lý: cá phải rửa sạch bùn, đất, tạp chất, cá to phải cắt nhỏ.
• Thủy phân:
 Mốc: yêu cầu tốc độ sinh trưởng và phát triển nhanh, hình thái khuẩn
ty to và mập, tốt nhất là sau 2 ngày ở nhiệt độ và độ ẩm thích hợp.
 Tỉ lệ giữa mốc và cá từ 3-4% tính theo chế phẩm mốc thô và cá xay
nhỏ, trộn với mốc.
 Nước cho vào 5-10% để vừa đủ ngấm mốc, giúp men hoạt động tốt,
nhiệt độ thủy phân 37-41oC, thời gian 10-15 ngày chượp sẽ chín.

10
 Muối: sử dụng muối có tinh thể nhỏ, màu sáng, độ trắng cao, không
vón cục, không bị chát, lượng muối cho vào 4-6% so với khối lượng
cá.
• Lọc: nước lọc và nước rửa bã bằng 30% so với khối lượng cá. Sau đó:
 Đun sôi: nhỏ lửa có tác dụng khử mùi, vi sinh vật, chất bẩn.
 Thêm muối vào để đạt đến độ mặn nước chấm.
 Kéo rút dịch này qua bả chướp tốt.
Tuy nhiên, phương pháp chế biến nước mắm bằng vi sinh vật cũng tồn tại
nhiều nhược điểm:
• Nước mắm không có hương vị vì thời gian sản xuất ngắn.

• Nước mắm bị chua do tinh bột lên men lactic hoặc do sinh ra acid dễ bay
hơi khi cá bị ươn.
• Đắng do xác vi sinh vật còn tồn tại hoặc do chất lượng của muối kém, có
nhiều ion Ca2+, Mg2+ [32].
1.3. Tiêu chuẩn chất lượng nước mắm ( TCVN 5107-2003)
Các yêu cầu cảm quan của nước mắm được quy định trong Bảng 1.3. [1]
Bảng 1.3: Yêu cầu cảm quan của nước mắm
Yêu cầu Tên chỉ
tiêu
Đặc biệt Thượng hạng Hạng 1 Hạng 2
1.Màu sắc Từ nâu cánh gián đến nâu vàng
2.Độ
trong
Trong, không vẩn đục
3.Mùi Thơm mùi đặc trưng của nước mắm, không có mùi lạ
4.Vị
Ngọt đậm
của đạm, có
hậu vị rõ
Ngọt của đạm,
có hậu vị rõ
Ngọt của đạm,
ít có hậu vị
Ngọt của đạm,
không mặn chát

5.Tạp chất
nhìn thấy
bằng mắt
thường

Không được có


11
Các chỉ tiêu hóa học của nước mắm được quy định trong Bảng 1.4. [1]
Bảng 1.4: Các chỉ tiêu hóa học của nước mắm
Mức chất lượng
Tên chỉ tiêu
Đặc biệt

Thượng
hạng
Hạng 1 Hạng 2
1.Hàm lượng nitơ toàn phần, tính bằng
g/l, không nhỏ hơn
30 25 15 10
2.Hàm lượng nitơ axit amin, tính bằng
% so với nitơ toàn phần, không nhỏ hơn

55 50 40 35
3.Hàm lượng nitơ ammoniac, tính bằng
% so với nitơ toàn phần, không lớn hơn
20 25 30 35
4.Hàm lượng axit, tính bằng g/l theo
axit axetic, không nhỏ hơn
8,0 6,5 4,0 3,0
5.Hàm lượng muối, tính bằng g/l, trong
khoảng
245-280 260-295

Chỉ tiêu vi sinh vật của nước mắm được quy định trong Bảng 1.5. [1]
Bảng 1.5: Chỉ tiêu vi sinh vật của nước mắm
Tên chỉ tiêu Mức tối đa cho phép

1.Tổng số vi sinh vật hiếu khí, số khuẩn lạc trong 1ml 10
5
2.Coliforms, số khuẩn lạc trong 1ml 10
2
3.E. Coli, số khuẩn lạc trong 1ml 0
4.Cl.perfringens, số khuẩn lạc trong 1ml 10
5.S.aureus, số khuẩn lạc trong 1ml 0
6.Tổng số bào tử nấm men và nấm mốc, số khuẩn lạc
trong 1ml
10


12

1.4. Tổng quan về enzyme protease và sự thủy phân bằng enzyme
1.4.1. Giới thiệu chung enzyme protease
Nhóm enzyme protease (peptit-hydrolase 3,4) xúc tác quá trình thủy phân
lên liên kết peptit (-CO-NH-)
n
trong phân tử protein, polypeptit đến sản phẩm
cuối cùng là các acid amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thủy phân
liên kết este và vận chuyển acid amin.
Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức
độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rộng rãi trên nhiều đối tượng từ
vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa…) và động vật
(gan, dạ dày bê…). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có

những đặc điểm khác biệt. Trước hết, hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất
phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình
dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất.
Hầu hết các protease phân cắt protein ở các liên kết đặc hiệu, vì thế có thể
sử dụng các enzyme này theo chiều phản ứng tổng hợp để tổng hợp các liên kết
peptit định trước. Yếu tố tăng cường quá trình tổng hợp bao gồm pH, các nhóm
carboxyl hoặc nhóm amin được lựa chọn để bảo vệ, khả năng kết tủa sản
phẩm,…
Trong cơ thể, protein thực phẩm được phân giải ở bộ máy tiêu hóa bởi các
enzyme phân giải protein. Đầu tiên là pepsin trong dịch dạ dày, sau đó là các
protease được tiết ra ở tuyến tụy và từ các tế bào ở màng nhày thành ruột. Các
acid amin tự do và các peptit ngắn được hấp thụ và đi qua các tế bào hình lông ở
thành ruột. Phần lớn các peptit được hấp thụ bị thủy phân ở các tế bào thành ruột.
Các acid amin được hấp thụ sẽ đi vào gan và sau đó tham gia vào quá trình
chuyển hóa. Quá trình thủy phân protein đóng vai trò quan trọng trong sản xuất
nhiều loại thực phẩm. Quá trình này có thể được thực hiện nhờ chính protease
của thực phẩm đó hay do các protease vi sinh vật được đưa vào trong quá trình
chế biến thực phẩm.
Quá trình thủy phân protein đóng vai trò quan trọng trong sản xuất nhiều
loại thực phẩm. Quá trình này có thể được thực hiện nhờ chính protease của thực

13
phẩm đó hay do các protease vi sinh vật được đưa vào trong quá trình chế biến thực
phẩm [36].
1.4.2. Phân loại Protease
- Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) trong hệ
thống phân loại các nhóm enzyme.
- Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase.
- Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptit, exopeptidase được phân chia
thành hai loại:

• Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptit ở đầu N tự do của chuỗi
polypeptit để giải phóng ra một amino acid, một dipeptit hoặc một tripeptit.
• Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptit ở đầu C của chuỗi
polypeptit và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptit.
- Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn
nhóm:
• Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine
trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc
tác của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin.
Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như: chymotrypsin, trypsin,
elastase. Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như Subtilisin
Carlsberg, Subtilisin BPN. Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng
kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.
• Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt
động. Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin,
một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng. Các cystein proteinase
thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.
• Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin.
Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin,
rennin. Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động
và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.

14
• Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấyở
vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase
thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA
- Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:
• Protease acid: pH = 2 – 4.
• Protease trung tính: pH = 7– 8.
• Protease kiềm: pH = 9 – 11 [36].

1.4.3. Nguồn thu protease vi sinh vật
Trong công nghiệp, protease có thể thu từ nhiều nguồn chủ yếu từ vi sinh
vật như: vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn.
1.4.3.1. Vi khuẩn
Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn,
chiếm 59% lượng enzyme được sử dụng. Protease của động vật hay thực vật chỉ
chứa một trong hai loại endopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả
năng sản sinh ra cả hai loại trên, do đó protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ
chất cao. Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptit trong phân tử
protein.
Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus
subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi
Clostridium. Trong đó, B. subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất. Các
vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính
và kiềm yếu.
Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5 –
8) và có khả năng chịu nhiệt thấp. Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân
protein thực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh
dưỡng. Các protease trung tính có khả năng ái lực cao đối với các amino acid ưa
béo và thơm. Chúng được sinh ra nhiều bởi B. subtilis, B.mesentericus, B.
thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium.
Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng
phân tử từ 20.000-30.000. Ổn định trong khoảng pH 6 – 12 và hoạt động trong
khoảng pH rộng 7– 12 [36].

15
1.4.3.2. Nấm mốc
Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được
ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A.
terricola, A. fumigatus, A. saitoi, Penicillium chysogenum… Các loại nấm mốc

này có khả năng tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trung tính. Nấm mốc
đen tổng hợp chủ yếu các protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5 – 3.
Một số nấm mốc khác như: A. candidatus, P. cameberti, P.
roqueforti…cũng có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử
dụng trong sản xuất fomat [36].
1.4.3.3. Xạ khuẩn
Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi
khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả
năng tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S. fradiae, S. trerimosus
Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là pronase (Nhật) được tách
chiết từ S. grieus, enzyme này có đặc tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy phân
tới 90% liên kết peptit của nhiều protein thành amino acid. Ở Liên Xô (cũ),
người ta cũng tách được chế phẩm tương tự từ S. grieus có tên là protelin. Từ S.
fradiae cũng có thể tách chiết được keratinase thủy phân karetin. Ở Mỹ, chế
phẩm được sản xuất có tên là M-Zim dùng trong sản xuất da. Protease từ S.
fradiae cũng có hoạt tính elastase cao, do đó chúng được dùng trong công nghiệp
chế biến thịt. Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi
sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa
dạng [36].
1.4.4. Cơ chế tác dụng của enzyme
Enzyme thường tác động vào cơ chất theo phương trình phản ứng sau:
E + S ES P + E
Trong đó: E: enzyme
S: cơ chất
ES: phức hợp enzyme – cơ chất
P: Sản phẩm
Enzyme có tác dụng và chuyển hóa cơ chất chuyển qua ba giai đoạn:

16
Giai đoạn 1: enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức

hợp enzyme – cơ chất (ES) không bền, phản ứng xảy ra nhanh và đòi hỏi năng
lượng thấp, các liên kết yếu tạo thành giữa enzyme và cơ chất trong phức hợp ES
là: tương tác tĩnh điện, liên kết Hydrogen, liên kết Vandecvan.
Giai đoạn 2: là giai đoạn tạo phức chất hoạt hóa xảy ra sự biến đổi cơ
chất, dưới tác dụng của một số nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme
làm cho cơ chất từ chỗ không hoạt động trở thành hoạt động.
Giai đoạn 3: là giai đoạn tạo sản phẩm của phản ứng và giải phóng
enzyme. Đây là giai đoạn cuối của quá trình phản ứng từ cơ chất sẽ hình thành
sản phẩm và enzyme được giải phóng ra dưới dạng tự do ban đầu
[3].

1.4.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme
1.4.5.1. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme
Khi nồng độ enzyme thấp, lượng cơ chất lớn, vận tốc phản ứng thủy phân
phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme. Khi nồng độ enzyme tăng, đạt tới giá
trị tới hạn thì nồng enzyme tăng tiếp, tốc độ phản ứng tăng chậm, thậm chí không tăng.
1.4.5.2. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
Khi lượng cơ chất ít, nếu tăng nồng độ cơ chất, tốc độ phản ứng thủy phân
tăng nhưng không tăng vô hạn mà khi nồng độ cơ chất tăng quá giới hạn cho
phép, vận tốc phản ứng enzyme có thể giảm.
1.4.5.3. Ảnh hưởng của các chất kìm hãm
Chất kìm hãm hay còn gọi là các chất ức chế là những chất mà khi trong
phản ứng có sự hiện diện của chúng, enzyme có thể bị giảm hoặc mất hoạt tính.
Các chất này có thể là các ion, các phân tử vô cơ, hữu cơ. Các chất kìm hãm
thuận nghịch hoặc không thuận nghịch, cạnh tranh hoặc không cạnh tranh.
Người ta đã xác định được với từng loại enzyme, chất kìm hãm là những
chất gì, cơ chế kìm hãm của từng chất, mức độ kìm hãm… khi sử dụng enzyme
vào từng quá trình thủy phân cụ thể, ta cần phải biết rõ các chất kìm hãm của nó
để điều chỉnh phản ứng

[3].
1.4.5.4. Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa
Các chất hoạt hóa là những chất có tác dụng làm tăng tính hoạt tính
enzyme. Các chất này có bản chất hóa học khác nhau, có thể là ion kim loại,

17
anion hoặc các chất hữu cơ. Tuy nhiên, các chất hoạt hóa chỉ có tác dụng trong
giới hạn nồng độ xác định. Khi dùng quá nồng độ cho phép, hoạt độ của enzyme
sẽ giảm. Cơ chế của sự kích hoạt có thể là do các chất trên trực tiếp kết hợp với
enzyme, làm thay đổi cấu trúc không gian của nó theo hướng có lợi cho hoạt
động xúc tác của enzyme, hoặc có thể tác động gián tiếp như loại trừ các yếu tố ức
chế ra khỏi môi trường [10].
1.4.5.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Enzyme có bản chất protein nên kém bền với nhiệt, chúng chỉ có tác dụng
xúc tác trong một khoảng nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ làm chúng bị biến tính.
Trong khoảng nhiệt độ đó, khi nhiệt độ tăng, tốc độ phản ứng tăng. ảnh hưởng
của nhiệt độ (trong khoảng nhiệt độ giới hạn biến tính) đến tốc độ phản ứng thủy
phân bằng enzyme được đặc trưng bởi hệ số:

Với:
K
t
: Hằng số tốc độ phản ứng tại nhiệt độ t
K
t+10
: Hằng số tốc độ phản ứng tại nhiệt độ t + 10
0
C
Vùng nhiệt độ tạo cho enzyme có hoạt độ cao nhất gọi là vùng nhiệt độ
thích hợp của enzyme, trong đó có một giá trị mà ở đó, hoạt độ của enzyme đạt

cực đại, gọi là nhiệt độ tối thích. Với đa số enzyme, vùng nhiệt độ thích hợp là 40
– 50
0
C. Nhiệt độ làm cho enzyme mất hoàn toàn hoạt tính thường gọi là nhiệt độ
tới hạn. Đa số enzyme có nhiệt độ tới hạn khoảng 70
0
C, với các enzyme bền
nhiệt, nhiệt độ thích hợp có thể cao hơn nhiều.

Với từng enzyme, nhiệt độ thích hợp có thể thay đổi khi có sự thay đổi
pH, cơ chất, thời gian phản ứng….[10].
1.4.5.6. Ảnh hưởng của pH môi trường
pH có ảnh hưởng mạnh mẽ đến quá trình thủy phân vì nó ảnh hưởng đến
mức độ ion hóa cơ chất, ion hóa enzyme và đến độ bền của protein – enzyme. Đa
số enzyme bền trong khoảng pH = 5 – 9 và độ bền của chúng tăng lên khi có cơ
chất, ion Ca
++
….
Với nhiều enzyme protease, pH thích hợp ở vùng trung tính, nhưng cũng
có một số enzyme có pH thích hợp rất thấp hoặc rất cao.

18
Với từng enzyme, giá trị pH không cố định mà phụ thuộc vào nhiều yếu
tố khác như: nhiệt độ, cơ chất, dung dịch đệm [10].
1.4.5.7. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân
Thời gian thủy phân bởi enzyme dài, ngắn khác nhau tùy thuộc vào nồng
độ các chất trong nguyên liệu, mức độ nghiền nhỏ vật liệu. Nồng độ dịch hỗn
hợp, các điều kiện pH, nhiệt độ… Thời gian thủy phân cần đủ dài để enzyme
phân cắt các cơ chất [10].
1.4.5.8. Ảnh hưởng của lượng nước

Với phản ứng thủy phân bởi enzyme thì nước vừa là môi trường để phân
tán enzyme và cơ chất, lại vừa trực tiếp tham gia phản ứng. Nước có ảnh hưởng
đến tốc độ và chiều hướng của phản ứng thủy phân bởi enzyme. Vì thế, nước là
một yếu tố điều chỉnh phản ứng thủy phân bởi enzyme, nó có thể tăng cường
hoặc ức chế các phản ứng do enzyme xúc tác [10].
1.4.6. Một số enzyme thương mại thường được sử dụng trong quá trình
thủy phân protein
1.4.6.1. Papain
Papain là một Cystein protease có ngồn gốc từ nhựa trái đu đủ. Papain
thủy phân protein thành các polypeptide và các amino peptit, nó đóng vai trò vừa
như endoprotease vừa như exopeptidase.
Papain là enzyme chịu được nhiệt độ tương đối cao. Ở dạng nhựa khô
papain không bị biến tính trong 3 giờ ở 100
0
C. Ở dạng dung dịch, papain bị mất
hoạt tính sau 30 phút ở 82,5
0
C và nếu tăng nhiệt độ trên 100
0
C thì sẽ mất hoàn
toàn hoạt tính kể cả khi thêm lượng lớn chất hoạt hóa vào dung dịch vì cấu trúc
tâm hoạt động của enzym đã bị phá hủy hoàn toàn.
- Điều kiện hoạt động tối ưu:
• Hoạt động thích hợp trong khoảng pH = 5,7-7,0
• Nhiệt độ: 50-57
0
C [7].
1.4.6.2. Bromelain
Bromelain là một Cystein protease, bromelain có trong toàn bộ cây dứa,
nhưng nhiều nhất là trong quả dứa. Bromelain thuộc nhóm endoprotease có khả