Nghiên cứu thử nghiệm sản xuất thu Oligosaccharide từ Carrageenan của rong sụn Kappahycus alvarezli (Doty) bằng enzyme Termamayl 120L

TRẦN THỊ HỒNG DIỆU

NGHIÊN CỨU THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT
THU OLIGOSACCHARIDE TỪ CARRAGEENAN CỦA
RONG SỤN Kappaphycus alvarezii(Doty) DOTY
BẰNG ENZYME TERMAMYL 120 L

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM


GVHD: TS. ĐỖ VĂN NINH



Nha Trang, 07/2013
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM



`

i
LỜI CẢM ƠN

Trƣớc hết em xin cảm ơn đến Ban giám hiệu trƣờng Đại Học Nha Trang, Ban
chủ nhiệm Khoa Công Nghệ Thực Phẩm lòng biết ơn, niềm tự hào đã đƣợc học tập
tại trƣờng trong những năm qua.
Sự biết ơn sâu sắc đến: TS. Đỗ Văn Ninh, ThS. Bùi Huy Chích đã tận tình
hƣớng dẫn và động viên em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Các thầy cô ở phòng thí nghiệm: công nghệ thực phẩm, công nghệ sinh hoc,
công nghệ chế biến, công nghệ lạnh đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành
tốt đề tài.
Bên cạnh đó em cũng xin cảm ơn các bạn cùng lớp, các bạn ở trong khoa và
gia đình đã đóng góp ý kiến và giúp đỡ em rất nhiều.
Trong quá trình làm đề tàivà báo cáo có gì thiếu xót em rất mong sự góp ý của
thầy cô và các bạn để bài báo cáo đƣợc hoàn chỉnh hơn.
Em xin chân thành cảm ơn.
Khánh Hòa, ngày tháng năm 2013
Sinh viên

Trần Thị Hồng Diệu



`

ii
MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v
DANH MỤC BẢNG BIỂU vi
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ vii
MỞ ĐẦU 1
Chƣơng 1 TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3
1.1.Giới thiệu về rong sụn. 3
1.2.Tổng quan về Car 5
1.2.1.Cấu tạo của Car 5
1.2.2.Tính chất lý hóa của Car 8
1.2.2.1.Tính chất của một polymer 8
1.2.2.2.Nhiệt độ nóng chảy 9
1.2.2.3.Sự tạo gel và keo hóa (gelation) 9
1.2.2.4.Tính bền axit 9
1.2.2.5.Tính tan 9
1.2.2.6.Tính hấp thụ hồng ngoại và màu 11
1.2.2.7.Thủy phân và sự metyl hóa xác định công thức cấu tạo của Car 11
1.2.2.8.Độ nhớt 11
1.3.Giới thiệu về Oligocar. 12
1.3.1.Cấu tạo của Oligocar. 12
1.3.2.Tính chất của Oligocar 12
1.3.3.Các nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về Oligocar 12
1.3.3.1.Nghiên cứu trong nƣớc. 12
1.3.3.2.Nghiên cứu ngoài nƣớc 13
1.4.Thủy phân polysaccharide bằng enzyme 14

1.4.1.Cơ chế thủy phân polysaccharide bằng enzyme 14
1.4.2.Các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu quả của phản ứng thủy phân 15
1.4.2.1.Ảnh hƣởng của nồng độ enzyme 15
1.4.2.2.Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất 15
`





iii
1.4.2.3.Ảnh hƣởng của nhiệt độ 16
1.4.2.4.Ảnh hƣởng của pH 16
1.4.2.5.Ảnh hƣởng của các chất kiềm hãm 17
1.4.2.6.Ảnh hƣởng của các chất hoạt hóa 18
CHƢƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 19
NGHIÊN CỨU 19
2.1.Vật liệu dùng trong nghiên cứu 19
2.1.1.Car thu nhận từ rong sụn kappaphycus alvarezii 19
2.1.2.Enzyme Termamyl (Te). 20
2.2.Các loại hóa chất và dụng cụ, thiết bị sử dụng trong thí nghiệm. 20
2.3.Xử lý số liệu 20
2.4.Phƣơng pháp nghiên cứu 20
2.4.1.Nghiên cứu động học của phản ứng enzyme 21
2.4.1.1.Ảnh hƣởng của pH 21
2.4.1.2.Ảnh hƣởng của nhiệt độ 21
2.4.1.3.Xác định độ bền nhiệt của enzyme 21
2.4.1.4.Xác định ảnh hƣởng của các ion kim loại 22
2.4.2.Xác định điểm đẳng điện của enzyme 22
2.4.3.Sơ đồ bố trí thí nghiệm 22

2.4.4.Nghiên cứu các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân Car 23
2.4.4.1.Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme thủy phân thích hợp 25
2.4.4.2.Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định pH thủy phân thích hợp 26
2.4.4.3.Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác nhiệt độ thủy phân thích hợp 27
2.4.4.4.Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ Car thủy phân thích hợp 28
2.4.4.5.Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian thủy phân thích hợp 29
CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 30
3.1.Kết quả xác định độ hòa tan của Car nguyên liệu 30
3.2.Chế phẩm enzyme Te 120L 30
3.3.Kết quả nghiên cứu động học của phản ứng enzyme 30
`





iv
3.3.1.Ảnh hƣởng của pH 30
3.3.2.Ảnh hƣởng của nhiệt độ 31
3.3.3.Kết quả xác định độ bền nhiệt của enzyme 32
3.3.4.Kết quả xác định ảnh hƣởng của các kim loại 33
3.4.Kết quả xác định điểm đẳng điện của enzyme 34
3.5.Kết quả xác định chế độ thủy phân thích hợp. 35
3.5.1.Kết quả xác định nồng độ enzyme thích hợp 35
3.5.2.Kết quả xác định pH thủy phân thích hợp 36
3.5.3.Kết quả xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp 38
3.5.4.Kết quả xác định nồng độ Car thủy phân thích hợp. 39
3.5.5.Kết quả xác định thời gian thủy phân thích hợp. 40
3.6.Kết quả xác định khối lƣơng phân tử trung bình của Oligocar bằng phƣơng
pháp đo độnhớt 42

3.8.Đề xuất quy trình sản xuất oligocarrageenan từ thủy phân carrageenan của
rong sụn bằng enzyme Termamyl 120 L. 45
3.9.Đánh giá một số tính chất của chế phẩm của Oligocar thu đƣợc theo quy trình
sản xuất 47
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 48
1.Kết luận 48
2.Đề xuất ý kiến: 48
PHỤ LỤC 1
PHỤ LỤC 2

`





v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Car Carrageenan
đvC Đơn vị Cacbon
FOB Free On Board
h Giờ
NF BP National Formulary British Pharmacopoeia
Oligocar Oligocarrageenan
TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam
Te Enzyme Termamyl 120L
USD United States Dollar

`





vi
DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1. Tính chất đặc trƣng của các loại Car 10
Bảng 3.2. Độ bền nhiệt của enzyme Te 120 L 33
Bảng 3.3. Điểm đẳng điện của enzyme Te 120L 34










`

vii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Rong sụn Kappaphycus alavezii (Doty) Doty. 3
Hình 1.2. Cấu trúc của Car với luân phiên liên kết của 1,3 β-D-galactose pyranose
và 1,4 α-D-galactose pyranose 5
Hình 1.3. Ảnh hƣởng của nồng độ enzyme đến tốc độ phản ứng. 15
Hình 1.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng. 16
Hình 1.5. Ảnh hƣởng của pH đến tốc độ phản ứng 17
Hình 1.6. Ảnh hƣởng của chất kìm hãm cạnh tranh đến tốc độ phản ứng. 17
Hình 2.1.Car đƣợc sản xuất từ rong sụn kappaphycus alvarezii (Doty) Doty 19
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 23
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme thủy phân Car 25
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định pH thủy phân Car 26
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thủy phân Car 27
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ Car thủy phân 28
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian thủy phân Car 29
Bảng 3.1 : Hàm lƣợng protein, hoạt độ và hoạt tính riêng của enzyme Te 120L 30
Hình 3.1. Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính enzyme Te 120L 31
Hình 3.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ hoạt tính đến enzyme Te 120L 32
Hình 3.3. Ảnh hƣởng của các ion kim loại đến hoạt độ của enzyme Te 120L 33
Hình 3.4. Ảnh hƣởng của tỷ lệ enzyme đến mức độ thủy phân Car 35
Hình 3.5. Ảnh hƣởng của pH đến mức độ thủy phân Car 37
Hình 3.6. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến mức độ thủy phân Car 38
Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nồng độ Car đến mức độ thủy phân Car 40
Hình 3.8. Ảnh hƣởng của thời gian đến mức độ thủy phân (h) 41
Hình 3.9. Sự phụ thuộc độ nhớt riêng vào nồng độ của Oligocar 43
Hình 3.10. Độ hòa tan của Oligocar 44
Hình 3.11. Quy trình sản xuất Oligocar. 45

Hình 3.12. Oligocar thu nhận từ thủy phân Car của rong sụn Kappaphycus alvarezii
(Doty) Doty theo phƣơng pháp sử dụng enzyme Te 120L 47
`





1
MỞ ĐẦU

Rong sụn là loại rong biển đƣợc biết đến từ lâu và Car thu nhận đƣợc từ rong
sụn đƣợc sử dụng rất rộng rãi trong mọi lĩnh lực sản xuất và đời sống tại nhiều nƣớc
trên thế giới. Riêng với nƣớc ta, rong sụn cũng nhƣ Car còn là đối tƣợng mới, từ
năm 1993 ngành trồng rong và nấu chiết các hợp chất từ rong bắt đầu phát triển
nhƣng vẫn chƣa tạo thành thế mạnh.
Mấy năm gần đây, một số nhà khoa học tại một số cơ quan nghiên cứu và đào
tạo đã quan tâm nghiên cứu chế biến rong sụn và ứng dụng Car vào sản xuất sản
phẩm mới. GS. TS Trần Thị Luyến và công sự ở Phòng thí nghiệm bộ môn Công
nghệ Thực Phẩm – Trƣờng Đại học Nha Trang là nơi dẫn đầu về nghiên cứu trồng
và tách chiết Car tinh chế và bán tinh chế đạt tiêu chuẩn quốc tế NF BP 1978, ứng
dụng trong sản xuất giò chả, đồ hộp nƣớc uống, thạch dừa, nghiên cứu bổ sung Car
vào surimi để cải thiện tính chất chức năng của surimi và sản phẩm mô phỏng từ
surimi, TS.Đống Thị Anh Đào, đã nghiên cứu thu nhận Car từ rong sụn
(Kappaphycus alverezii) ở biển Ninh Thuận
Hiện nay, ngoài Car thì Oligocar là sản phẩm thủy phân từ Car cũng đã đƣợc
nghiên cứu và bƣớc đầu đƣa vào ứng dụng trong sản xuất các sản phẩm thực phẩm
nhƣ giò lụa, trà uống hòa tan với những đặc tính sinh học cũng nhƣ khả năng hòa
tan, khả năng tạo gel tốt hơn so với Car. Vì vậy em đã chọn đề tài: “Nghiên cứu
thử nghiệm sản xuất thu Oligosaccharide từ Carrageenan của rong

sụnKappaphycus alvarezii (Doty) Doty bằng enzyme Termamyl 120 L”, để
nghiên cứu sản xuất ra các loại sản phẩm chức năng mới, có lợi cho sức khỏe con
ngƣời.
Mục tiêu của đề tài
Bƣớc đầu thử nghiệm sử dụng enzyme Termamyl 120L để thủy phân Car
thành Oligocar từ rong sụn Kappaphycus alvavezii (Doty) Doty.
`





2
Nội dung của đề tài.
1. Xác định chế độ thủy phân carrageenan bằng enzyme Termamyl 120 L (nồng
độ Car, tỷ lệ enzyme, pH của môi trƣờng thủy phân, nhiệt độ thủy phân, thời gian
thủy phân).
2. Đề xuất quy trình sản xuất Oligocarrageenan từ Carrageenan của rong sụn
Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty bằng enzyme Termamyl 120L









`

3
Chƣơng 1 TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1. Giới thiệu về rong sụn.
Rong sụn thuộc ngành Tảo hồng (Rhodophyta), Ngành phụ Rhophytina, Lớp:
Florideophyceae, Lớp phụ: Rhodymeniophycidae, Bộ: Gigartinales, Họ:
Areschougiaceae, Giống: Kappaphycus, Loài: bao gồm các loại alvarezii, cottonii,
interme, procrusteanum, striatum. Trong đó loài Kappaphycus alvarezii (Doty)
Doty là loại có sản lƣợng cao nhất.


Hình 1.1. Rong sụn Kappaphycus alavezii (Doty) Doty.
`





4
Từ tháng 3/1993 chƣơng trình hợp tác về khu hệ và nguồn lợi rong biển kinh
tế Việt Nam giữa phân viện Vật liệu Nha Trang (nay là Viện nghiên cứu và Ứng
dụng Công nghệ Nha Trang) và Nhật Bản, Phân viện vật liệu Nha Trang đã tiến
hành du nhập rong sụn giống, nghiên cứu nhân giống và thử nghiệm nuôi trồng
rong sụn tại vùng biển Nam Trung bộ nƣớc ta. Từ nguồn gốc giống ban đầu này, từ
cuối năm 1993 các nhà khoa học thuộc Phân viện vật liệu Nha Trang do Ông
Huỳnh Quang Năng phụ trách đã trồng thử nghiệm rong sụn tại các vùng ven biển

của tỉnh Khánh Hoà và Ninh Thuận. Qua thử nghiệm cho thấy, rong sụn hoàn toàn
thích nghi với điều kiện tự nhiên ở nƣớc ta. [4]
Ngoài ra, một số nhà khoa học thuộc Viện Nghiên cứu Hải sản Hải Phòng do
PGS.TS. Nguyễn Xuân Lý chủ trì cũng đã tiến hành nghiên cứu trồng thử nghiệm
rong sụn ở vùng biển phía Bắc (chủ yếu là vùng biển Hải Phòng). Kết quả thử
nghiệm cho thấy rong sụn có thể sinh trƣởng và phát triển tốt ở vùng biển phía Bắc
vào mùa xuân- hè sang thu, không có kết quả tốt về mùa đông, hàm lƣợng và chất
lƣợng Car trong rong sụn không cao bằng rong sụn trồng các tỉnh phía Nam.
Hiện nay, nghề nuôi trồng rong sụn phát triển ở các tỉnh: Ninh thuận, Khánh
Hòa, Phú Yên, Bình Định, Kiên Giang và hiện đang là đối tƣợng nuôi đƣợc nhiều
tỉnh ven biển miền Trung từ Nghệ An trở vào quan tâm. Đến nay, nuôi rong trở
thành một nghề mới bổ sung vào các nghề nuôi trồng thủy hải sản của Việt Nam,
góp phần tạo công việc làm cho hàng ngàn lao động. Rong trở thành cây “xóa đói
giảm nghèo” do kỹ thuật nuôi trồng đơn giản, chi phí đầu tƣ ban đầu để nuôi rong
sụn thấp, chỉ khoảng 10 triệu đồng Việt Nam/ ha mặt nƣớc. Thời gian sinh trƣởng
ngắn nên rong sụn cho thu hoạch chỉ trong vòng 2-3 tháng thả nuôi, với thu nhập
vào khoảng 30-60 triệu đồng/ha mặt nƣớc/ năm. Nhƣ vậy, hiệu quả kinh tế của nghề
trồng rong sụn không nhỏ.
Chất lƣợng của rong sụn Việt Nam hoàn toàn đáp ứng yêu cầu của thị trƣờng
thế giới cho công nghiệp sản xuất Kappa-Carrageenan. Từ giữa năm 2003 đến cuối
năm 2004, sản lƣợng rong sụn xuất khẩu đã đạt khoảng 1.000 tấn khô (chủ yếu do
`





5
các công ty ở Ninh Thuận, Khánh Hòa, Phú Yên xuất khẩu), 6 tháng đầu năm 2005,
sản lƣợng tăng vọt lên khoảng 2.000 tấn khô, giá xuất khẩu cũng tăng 50 USD, lên

700 USD/ tấn FOB.[19]
1.2. Tổng quan về Car
1.2.1. Cấu tạo của Car
Car có cấu trúc chung là một polymer mạch thẳng với liên kết luân phiên của
β-D-galactose pyranose qua liên kết 1,3 và α-D-galactose pyranose qua liên kết 1,4.
Các liên kết ở vị trí số 3 xuất hiện ở các gốc có 2 và 4 sulphate hoặc không có
sulphate trong khi liên kết ở vị trí số 4 ở các gốc có 2 sulphate, gốc 2,6 disulphate,
gốc 2,6 anhydro và 3,6 anhydro-2- sulphate. Hợp chất cấu tạo của Car gồm có D-
galactose (17÷31%) còn L-galactose chiếm một lƣợng rất nhỏ. Do đó Car tạo thành
chủ yếu bởi các mạch poly D-galactose bị sulphate hóa có phân tử lƣợng 500-700
đvC. [11]


Hình 1.2. Cấu trúc của Car với luân phiên liên kết của 1,3 β-D-galactose
pyranose và 1,4 α-D-galactose pyranose
Các công trình nghiên cứu bằng phƣơng pháp cộng hƣởng từ hạt nhân cho
thấy Car có nhiều cấu trúc hóa học khác nhau, do đó phân loại theo cấu trúc hóa học
có các loại Car sau: mu, kappa, nu,iota, lamda, theta và xi. Các loại này chỉ khác
nhau ở mức độ sulphate hóa, vị trí sulphate hóa, mức độ dehydrate hóa của chuỗi
polysaccharide. Cấu trúc của chúng đều có những thành phần về số lƣợng sulphate
`





6
của Car chiếm 18÷40% phân tử Car. Khối lƣợng phân tử của đại phân tử Car từ 10
5
đến 10

6
phụ thuộc vào nguồn gốc nguyên liệu và quá trình tách chiết.[20]
Car tự nhiên từ các loài rong khác nhau có thể là hỗn hợp khác nhau của các
loại Car trên. Ngƣời ta phân chia hai nhóm chính: nhóm 1 chứa các loại mu, nu,
kappa, iota và các dẫn xuất của chúng. Các Car này tạo gel với ion K
+
hoặc có thể
xử lý kiềm để có tính chất tạo gel, chúng có đặc điểm là gốc đƣờng có liên kết 1,3
hoặc là không có nhóm sulphate hóa ở vị trí C
4
. Nhóm thứ 2 là lamda,xi, theta và
các dẫn xuất của chúng. Chúng không có khả năng tạo gel ngay cả trƣớc và sau khi
xử lý kiềm. Đặc trƣng của cấu trúc này là cả hai gốc đƣờng liên kết 1,4 và 1,3 đều
có nhóm sulphate ở vị trí C
2
. Ngoài ra thành phần của Car gồm có H
2
SO
4
, Ca
2+
và
3,6 anhydro-D-galactose. Dạng tồn tại của Car trong rong đỏ có gắn với Ca
+2
, K
+
,
Na
+
nhƣ: R=(OSO

3
)
2
Ca hoặc R-OSO
3
Na, ROSO
3
K (R là gốc polysaccharide). Hàm
lƣợng SO
3
-2
cũng ảnh hƣởng dến sức đông của Car. [11]
Về cơ bản Car có 3 loại khác nhau là: kappa Car, lamda Car, iota Car. Trong
đó kappa Car chiếm thị phần lớn nhất (80%). Mu va Nu là chất ban đầu tổng hợp
nên kappa và iota, việc chuyển đổi này là do enzyme dekinkase có trong rong biển
hay trong quá trình sản xuất khi dùng xúc tác để loại nhóm 6 sulphate.[11]
 Kappa-Carrageenan:
Là một loại polymer mạch ngắn xen kẽ giữa D-galactose-4-sulphate (GalS) và
3,6 anhydro D-galactose (Gal A). Cấu trúc phân tử của kappa Car là vòng xoắn kép
bậc III.


`





7
 Iota- Carrageenan:

Cũng giống nhƣ kappa nhƣng gốc 3,6-anhydro-galactose lại ở vị trí cacbon số
2. Iota là Car có nhóm sulphate nhiều nhất trong mạch phân tử, cấu trúc là vòng
xoắn kép bậc II. Gel iota có tính đàn hồi.


 Lambda-carrageenan:
Trong mạch phân tử các đơn vị monomeric đƣợc nối xen kẽ với nhau, các đơn
vị gồm: D-galactose-2-sulphate(1,3) và D-galactose-2,6-disulphate nối xen kẽ với
nhau.


Các phân đoạn đều có tính đa phân tán, nhƣng chúng chỉ khác nhau thành
phần sulphate ester và gốc quay quang. Lambda-carrageenan có khối lƣợng phân tử
cao và mạch dài hơn kappa-carrgeenan. Thành phần của phân đoạn cũng phụ thuộc
vào nhiệt độ tách chiết và loại rong nguyên liệu. [10], [20]
`





8
1.2.2. Tính chất lý hóa của Car
1.2.2.1. Tính chất của một polymer
 Khử trong môi trƣờng kiềm
Trong môi trƣờng kiềm có tác dụng khá mạnh đến cấu tạo hóa học của Car.
Dƣới tác dụng của môi trƣờng kiềm, nhóm (HOSO
3
-
) bị khử dần tùy thuộc vào mức

độ khử (HOSO
3
-
) sẽ tạo nên cấu trúc khác nhau và tạo nên các loại Car khác
nhau.[11], [20], [21]
 Mu-Car đƣợc khử trong môi trƣờng kiềm tạo ra kappa-carrageenan.
.

 Nu-Car đƣợc khử trong môi trƣờng kiềm tạo ra iota- Car.



 Trong môi trƣờng kiềm lambda-Car biến đổi thành theta-Car.

`





9
 Phản ứng tạo tủa
Car là một polymer mang điện âm nên tủa trong các đại phân tử mang điện
tích điện dƣơng nhƣ: metylen xanh, safranine, mauvine, những phẩm mầu azo và
thiazo khác, tính chất này giống nhƣ một vài alkaloid và protein. Ngoài ra, Car còn
tủa trong cồn (cồn đóng vai trò là tác nhân dehydrate hóa).
 Sự trƣơng nở
Car hút nƣớc mạnh và sự hút nƣớc kèm theo sự trƣơng phồng đáng kể tạo
thành gel theo thời gian tiếp xúc với dung môi. Car là cao phân tử (polysaccharide)
có cực nên trƣơng nở trong dung môi có cực (nƣớc).

1.2.2.2. Nhiệt độ nóng chảy
Nhiệt độ nóng chảy của gel Car thấp hơn nhiều so với Agar. Gel Car 3% nóng
chảy ở 27- 30
0
C, gel Car 5 % nóng chảy ở 40- 41
0
C.
1.2.2.3. Sự tạo gel và keo hóa (gelation)
Khả năng keo hóa của Car nằm trung gian giữa Agar, gelatin và gần giống
gelatin hơn. Sự hình thành gel của dung dịch Car là một quá trình nhiệt thuận
nghịch. Khi nhiệt độ cao hơn giá trị nhiệt độ của gel thì gel sẽ tan chảy (cân bằng bị
phá vỡ). Tuy nhiên, khoảng cách nhiệt từ trạng thái tạo gel đến tan chảy là một giá
trị không đổi. Một thí nghiệm cho biết giá trị này khoảng 5-22
0
F. Khả năng hình
thành gel Car phụ thuộc vào nhiệt độ và nồng độ dung dịch. Nồng độ của dung dịch
tạo gel và nhiệt độ tạo gel phụ thuộc vào loại và số lƣợng muối có mặt trong dung
dịch. Ngoài ra, tính chất tạo gel còn phụ thuộc chủ yếu vào loài rong, độ nhớt và
phụ thuộc rất lớn vào công nghệ sản xuất, sự hình thành và phân bố các gốc
galactose trong mạch polymer. [11]
1.2.2.4. Tính bền axit
Hệ pH thấp cùng với sự tác dụng của nhiệt độ thì sự thủy phân xảy ra nhanh hơn.
1.2.2.5. Tính tan
Car tan trong anhydrous hydrazine, ít tan trong formamide và methyl
sulfoxide, không tan trong dầu và dung môi hữu cơ. Car tan trong nƣớc, đặc biệt là
nƣớc nóng, tuy nhiên tính tan của nó phụ thuộc vào loại Car.
`

10
Bảng 1.1. Tính chất đặc trưng của các loại Car
Môi trƣờng

-Car

-Car

-Car
Nƣớc nóng
Tan ở nhiệt độ trên
70
o
C
Tan ở nhiệt độ trên
70
o
C
Tan

Nƣớc lạnh
Tan trong dung dịch
muối Na
+
. Không tan
trong dung dịch muối
K
+

, Ca
2+

Tan trong dung dịch
muối Na
+
.

Tan
Sữa nóng
Tan
Tan
Tan
Sữa lạnh
Không tan trong dung
dịch muối Na
+
, K
+
,
Ca
2+
nhƣng trƣơng
nở rõ ràng
Không tan
Tan
Dung dịch đƣờng
có nồng độ cao
Tan khi nóng
Tan

Tan khi
nóng
Dung dịch muối
có nồng độ cao
Không tan
Không tan
Tan khi
nóng
Dung môi hữu cơ
Không tan
Không tan
Không tan

`





11
1.2.2.6. Tính hấp thụ hồng ngoại và màu
Dung dịch Car là một chất hữu cơ, nên có khả năng hấp thụ hồng ngoại cho
phổ có bƣớc sóng trong phạm vi nhất định phụ thuộc vào loại và thành phần của
Car. Dựa vào tính chất này ngƣời ta có thể đƣợc Car thuộc loại lamda-, iota-, kappa-
, Các loại polysaccharide thƣờng cho bƣớc sóng ở vùng hồng ngoại trong khoảng
1000- 1100 cm
-1
. Với các loại Car tạo gel thì cho đỉnh hấp thụ cực đại (đỉnh hấp thụ
trong khoảng rộng) ở 1065 cm
-1

, loại không tạo gel ở vùng 1020 cm
-1
.
1.2.2.7. Thủy phân và sự metyl hóa xác định công thức cấu tạo của Car
Dung dịch Car ít bị thủy phân ở môi trƣờng pH=9 và pH=7, dung dịch muối
Natri carrageenan bị thoái hóa do phân tử Car bị đứt liên kết 3,6- anhydro galactose.
Và từ phản ứng xác định tính thủy phân kiềm của nhóm ester sulphate của Car đã
nói lên cấu trúc của Car có nhóm ester sunphate gắn ở C
4
trong gốc galactose. Car
mà đặc biệt là phần đoạn kappa-carrageenan sẽ thủy phân bởi enzyme
pseudomonate carrageenan hay kappa-carovora. Khi kappa-carrageenan, lamda-
carrageenan bị thủy phân bởi enzyme này thì độ nhớt của dung dịch giảm rất nhiều
và làm tăng khả năng khử, tạo ra các sản phẩm thuộc dãy đồng đẳng của
Oligosaccharide sulphate, 3-6-(3,6-anhydro-α,D-galactose pyranose)-D-galactose-
4,6-sulphate (neocarrabiose-4-o-sulphate).
Car bị metyl hóa tạo ra các dẫn xuất metyl nhƣ 2,3,4,6-tetra-metyl-D(L)-
galactose hoặc 2,4,6-tri-metyl-D(L)-galactose và dựa vào đặc tính này mà ngƣời ta
đã xác định thành phần cấu trúc của nó.
1.2.2.8. Độ nhớt
Độ nhớt của dung dịch Car phụ thuộc rất lớnvào độ dài mạch polymer tức là
phân tử lƣợng, tiếp đến là nồng độ dung dịch và các yếu tố khác. Trong đó các yếu
tố trên phải kể đến là sự có mặt của các muối trong dung dịch. Độ nhớt dung dịch tỷ
lệ thuận nồng độ dung dịch và tỷ lệ nghịch với nhiệt độ.
Từ các dẫn liệu trên cho thấy: thành phần, cấu tạo tính chất cơ bản của Car
đã được nhiều nhà khoa học của nhiều nước nghiên cứu và trình bày có hệ thống.
`

12
Các tính chất của Car cho thấy đây là một hợp chất hữu cơ tự nhiên có nhiều tính
chất công nghệ quý giá như khả năng đồng tạo gel, khả năng thay đổi độ nhớt của
dung dịch, khả năng thay đổi độ chắc và tính chất cơ lý của thực phẩm khi có mặt
Car. Ngoài ra Car còn giá trị như một chất xơ thực phẩm, có thể dùng để sản xuất
thực phẩm chức năng rất tốt hoặc có thể dùng sản xuất chế phẩm y dược.
1.3. Giới thiệu về Oligocar.
1.3.1. Cấu tạo của Oligocar.
Oligocar có cấu tạo giống nhƣ Car nó chỉ bị cắt ngắn mạch hơn tạo nên các
sản phẩm thuộc dãy đồng đẳng của Oligosaccharide sulfate.
Car mà đặc biệt là phần đoạn κ-Car sẽ bị thủy phân bởi enzyme Pseudomonate
Car hay κ- carova. Khi Car (κ-,λ- ) bị thủy phân bởi enzyme này thì độ nhớt của
dung dịch giảm rất nhiều và làm tăng khả năng khử, tạo các sản phẩm thuộc dãy
đồng đẳng của Oligosaccharide sulfate,3-6-(3,6-anhydro-α-D-galactosepyranose)-
D-galactose-4-6-sulphate(neocarrabiose-4-o-sulphate).
1.3.2. Tính chất của Oligocar
Do bản chất là Car nên nó có đầy đủ tính chất của Car. Tuy nhiên, các tính chất
đƣợc thể hiện tốt hơn, khả năng hòa tan tốt hơn, hoạt tính sinh học thể hiện cao hơn.
1.3.3. Các nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về Oligocar
1.3.3.1. Nghiên cứu trong nước.
Do có các tính chất vật lý và hóa học đặc biệt, Car cũng nhƣ oligocar đƣợc
ứng dụng nhiều trong lĩnh vực thực phẩm và phi thực phẩm. Trong công nghệ thực
phẩm, Oligocar đƣợc sử dụng với vai trò là chất phụ gia có tính ƣu việt để điều
chỉnh độ đặc, tạo gel, ổn định, phân tán, trong việc chế biến ra các loại thực phẩm
hấp dẫn, giá trị.
Năm 2008-2009, các nhà khoa học thuộc Viện Hóa Học, Viện Khoa Học và
Công nghệ Việt Nam, đứng đầu là GS, TSKH Trần Đình Toại đã tiến hành nghiên
cứu đề tài :”Nghiên cứu điều chế Carrageenan Oligosaccharide có hoạt tính sinh

học cao bằng phƣơng pháp enzyme thủy phân để sử dụng trong bảo quản và chế
biến thực phẩm”. Kết quả cho thấy rằng, Car và Oligocar khi làm chất phụ gia chế
`





13
biến, bảo quản thực phẩm làm tăng độ cứng giò, tinh bột và ức chế sự phát triển vi
sinh vật trên sản phẩm mà vẫn giữ đƣợc màu sắc và mùi vị của sản phẩm. So sánh
với Car và hàn the thì Oligocar cho kết quả tốt hơn, Car với hàm lƣợng thích hợp
0,5%, Oligocar với hàm lƣợng thích hợp 0,3% cho hiệu ứng chế biến và bảo quản
tƣơng đƣơng với hàn the 0,5%. Car và Oligocar là chất lành tính có thể sử dụng làm
phụ gia chế biến, bảo quản thực phẩm thay hàn the. Các phụ gia chế biến, bảo quản
mới này có hiệu ứng tốt hơn hàn the, đồng thời có ƣu điểm hơn là không độc hại đối
với con ngƣời . [6], [12]
Bùi Huy Chích, Trƣờng Đại học Nha Trang đã nghiên cứu và ứng dụng
Oligocar vào sản xuất trà uống hòa tan. Sau quá trình nghiên cứu ông đã đƣa ra
đƣợc các thông số thích hợp cho quá trình thủy phân Car từ rong sụn Kappaphycus
alvarezii (Doty) Doty. Với chế độ thủy phân đó thì thu đƣợc Dexcar có khối lƣợng
phân tử trung bình là 51.885 Da, độ các chỉ tiêu về hàm lƣợng kim loại nặng và vi
sinh cho thấy Dexcar có thể sử dụng an toàn trong thực phẩm. [2]
Như vậy đối với nước ta, rong sụn cũng như Car còn là đối tượng mới, chưa
được nghiên cứu và sử dụng nhiều. Do vậy, cần đẩy mạnh nghiên cứu ứng dụng
Car trong các ngành công nghiệp như thực phẩm, y dược, chế biến các loại thực
phẩm chức năng
1.3.3.2. Nghiên cứu ngoài nước
Theo kết quả nghiên cứu của Ni Min – Feng và cộng sự năm 2008, enzyme
thủy phân Carrageenan thông qua sự thoái hóa liên kết β-1,4 glycoside của

Carrageenan để sản xuất Carrageenan Oligosaccharides. Trong những năm gần nay,
các nghiên cứu cho thấy Oligosaccharides Carrageenan chống khối u, điều hòa
miễn dịch và chống đông máu. Hoạt động dƣợc lý của Carageenan đƣợc dự kiến trở
thành một thế hệ mới của thuốc biển. Enzyme thủy phân Carrageenan không chỉ
nhƣ là một công cụ chuẩn bị Oligosaccharides Carrageenan mà còn giúp nghiên cứu
cấu trúc Carrageenan.
`





14
Jorge Castro, Jeannette Vera, Alberto Gonza´ lez, Alejandra moenne (2011)
đã nghiên cứu cho thấy rằng Oligocar có khả năng kích thích quang và tăng sinh
khối cây thuốc lá.
Jing Ji, Ling-chong Wang, Hao Wu (Corresponding author) & He-Mi Luan
(2011) đã nghiên cứu và kết luận các Oligosaccharides biển có hoạt động sinh học
và ứng dụng tiềm năng trong các loại thuốc khác nhau [18] :
Oligosaccharides có thể không trực tiếp giết chết khối u nhƣng làm cũng làm
suy yếu hệ thống hỗ trợ dinh dƣỡng của khối u bằng cách nhắm mục tiêu vào các
mạng lƣới mạch máu khối u, kích hoạt hệ thống miễn dịch.
Oligosaccharides ảnh hƣởng đến khả năng miễn dịch tế bào, miễn dịch dịch
thể và có tác dụng chữa bệnh đáng tin cậy về các bệnh tự miễn dịch nhƣ viêm khớp
dạng thấp.
1.4. Thủy phân polysaccharide bằng enzyme
1.4.1. Cơ chế thủy phân polysaccharide bằng enzyme
Sự thủy phân tƣơng tự nhƣ phân giải tinh bột thành glucose, maltose hay
dextrin. Bản chất của các phản ứng enzyme khi có sự tham gia xúc tác của các enzyme,
các cơ chất sẽ đƣợc hoạt hóa và làm thay đổi tính chất hóa học của cơ chất, kết quả sau

phản ứng tạo ra sản phẩm của phản ứng. Dƣới tác dụng của enzyme cơ chất không chỉ
làm thay đổi cấu trúc hóa học mà còn thay đổi tính chất hóa học. [15]
Oligosaccharide là nhóm glucide cấu tạo bởi sự liên kết của một ít
monosaccharide. Vì vậy phân tử lƣợng của chúng không lớn lắm và chúng còn giữ
đƣợc một số chất nhƣ các đƣờng đơn giản. Chúng dễ hòa tan trong nƣớc và dễ kết
tinh. Khi thủy phân bằng enzyme tƣơng ứng sẽ làm đứt các liên kết glucide giữa các
monosaccharide.
Quá trình xúc tác enzyme xảy ra theo 3 giai đoạn:
- Giai đoạn1:
Enzyme kết hợp với cơ chất bằng những liên kết yếu, nhờ đó sẽ tạo ra phức hệ
enzyme-cơ chất. Phức hệ này thƣờng không bền. Phản ứng này xảy ra rất nhanh và
đòi hỏi ít năng lƣợng.
`





15
- Giai đoạn 2:
Khi cơ chất tạo phức với enzyme sẽ bị thay đổi cả cấu hình không gian, cả về
mức độ bền vững các liên kết. Kết quả là các liên kết bị phá vỡ và tạo ra sản phẩm.
- Giai đoạn 3:
Đây là giai đoạn cuối cùng, sản phẩm quá trình phản ứng đƣợc tạo thành và
tách ra khỏi enzyme.
 Sơ đồ tổng quát quá trình xúc tác của enzyme:
E + S ↔ ES → E + P
1.4.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu quả của phản ứng thủy phân
1.4.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme
Trong điều kiện thừa cơ chất tốc độ phản ứng phụ thuộc vào nồng độ enzyme:

Khi thừa cơ chất thì nồng độ enzyme tăng vận tốc phản ứng cũng tăng. Khi
nồng độ enzyme bão hòa với nồng độ cơ chất thì nồng độ enzyme tăng vận tốc phản
ứng không thay đổi.


Hình 1.3. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến tốc độ phản ứng.
1.4.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
Trong các phản ứng do enzyme xúc tác trƣớc hết tạo thành phức hệ giữa
enzyme và cơ chất, sau đó phức này chuyển hóa tiếp tạo thành sản phẩm cuối cùng
và enzyme tự do. Enzyme lại tiếp tục kết hợp với phân tử cơ chất khác.
`





16


E+S ES E+P


Khi nồng độ cơ chất thấp thì tốc độ phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ cơ chất.
Khi nồng độ cơ chất lớn hơn nhiều thì tốc độ đạt cực đại.
1.4.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Ngƣời ta sử dụng hệ số nhiệt Q
10
để biểu thị ảnh hƣởng của nhiệt độ đến tốc
độ phản ứng.
Cứ tăng 10

0
C thì tốc độ phản ứng sẽ tăng lên từ 1,5 đến 2 lần nếu trong
khoảng nhiệt độ thích hợp.
Trong khoảng nhiệt độ tối ƣu tốc độ phản ứng tăng nhanh. Sau đó nếu tăng
quá nhiệt độ tối ƣu thì enzyme bị biến tính làm cho tốc độ phản ứng có xu hƣớng
giảm xuống.

Hình 1.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng.
1.4.2.4. Ảnh hưởng của pH
pH môi trƣờng ảnh hƣởng tới mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và đặc biệt ảnh
hƣởng đến độ bền của enzyme.
Nhiều enzyme hoạt độ rất mạnh ở pH trung tính nhƣng cũng nhiều enzyme
hoạt động mạnh ở pH kiềm và axit.
V
1
k
1

V
2
k
2

V
3
k
3

`

17

Hình 1.5. Ảnh hưởng của pH đến tốc độ phản ứng
1.4.2.5. Ảnh hưởng của các chất kiềm hãm
 Chất kìm hãm cạnh tranh
Là những chất có công thức cấu tạo gần giống với cơ chất hoặc gần giống với
coenzyme của enzyme. Khi thêm vào phản ứng enzyme nó chiếm chỗ phần cơ chất
hoặc phần coenzyme, dẫn đến làm enzyme ở trạng thái không hoạt động. Do đó,
làm giảm tốc độ phản ứng.
K
p
là hằng số tốc độ khi có chất ức chế, với:
V=V
max
khi K
p
/[S]= 0. Suy ra [S] lớn hơn rất nhiều so với K
p
[[S]>> [I]
Vì vậy, muốn mất ức chế làm cho vận tốc tăng lên thì ta tăng nồng độ cơ chất
hơn rất nhiều so với chất kìm hãm.


Hình 1.6. Ảnh hưởng của chất kìm hãm cạnh tranh đến tốc độ phản ứng.