Đánh giá tính gây miễn dịch của Vacxin cúm A H5N1 hấp thụ tá chất MF - 59 và Chitosan trên súc vật thí nghiệm

1

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CAIV : Cold-adapted Attenuated Influenza Vaccine
(Vacxin virus cúm sống, nhược độc, thích ứng lạnh)
HA : Hemagglutinin
HA test : Hemagglutinin Assay test
(Phản ứng ngưng kết hồng cầu)
HAU : Hemagglutinin Unit
(Đơn vị kháng nguyên Hemagglutinin)
HI test : Hemagglutinin Inhibition test
(Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu)
HIU : Hemagglutinin Inhibition Unit
(Đơn vị hiệu giá kháng thể kháng hemagglutinin)
MDCK : Mardin-Darby Canine Kedney
(Tế bào thận chó Mardin-Darby)
MHC : Major Histocompatibility complex
(Phức hợp chính hòa hợp mô)
NA : Neuraminidase
SA : Sialic Acid
TIV : Trivalent-inactivated Influenza Vaccine
(Vacxin cúm ba thành phần bất hoạt)
WHO : World Helth Orrganization
(Tổ chức y tế thế giới)

2

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1: Số người nhiễm virus H5N1 và số tử vong từ năm 2003.(Số liệu
tính đến 5-3-2008)
Bảng 1.2: Bộ gen của virus cúm A và các polypeptid tương ứng.

Bảng 1.3: Ưu điểm, nhược điểm của các loại vacxin.
Bảng 1.4: Một số vacxin cúm A/H5N1 trên thế giới (cập nhật 17/10/2006)

Bảng 3.1: Tỷ lệ chuột đáp ứng miễn dịch sau 10 ngày của các nhóm vacxin
cúm A/H5N1.
Bảng 3.2: Tỷ lệ chuột đáp ứng miễn dịch sau 20 ngày của các nhóm vacxin
cúm A/H5N1.
Bảng 3.3: Tỷ lệ chuột đáp ứng miễn dịch sau 30 ngày của các nhóm vacxin
cúm A/H5N1.
Bảng 3.4: Bảng biến thiên hiệu giá đáp ứng miễn dịch của nhóm 1 – Nhóm
vacxin cúm A/H5N1 không hấp phụ tá chất theo thời gian.

Bảng 3.5: Biến thiên đáp ứng miễn dịch của nhóm 2 – Nhóm vacxin cúm
A/H5N1 hấp phụ tá chất MF-59 theo thời gian.
Bảng 3.6: Biến thiên đáp ứng miễn dịch của nhóm 3 – Nhóm vacxin cúm

A/H5N1 hấp phụ tá chất chitosan theo thời gian.
Bảng 3.7: Biến thiên đáp ứng miễn dịch của 3 nhóm vacxin cúm A/H5N1 theo
thời gian.














3

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1: Cấu tạo của virut cúm A/H5N1.
Hình 1.2: Các đường lây nhiễm cúm A/H5N1 trên người.
Hình 1.3: Thành phần vacxin bất hoạt.
Hình 2.2: Kết quả phản ứng xác định hiệu giá kháng thể.
Hình 2.1: Chuột nhắt trắng Swiss làm thí nghiệm.
Hình 2.2: Quy trình tiêm miễn dịch và lấy máu.
Hình 3.1: Biến thiên hiệu giá đáp ứng miễn dịch của nhóm 1-Nhóm vacxin
không hấp phụ tá chất theo thời gian.
Hình 3.2: Biến thiên hiệu giá đáp ứng miễn dịch Nhóm 2-Nhóm vacxin hấp

phụ tá chất MF-59.
Hình 3.3: Biến thiên hiệu giá đáp ứng miễn dịch của Nhóm 3-nhóm vacxin
hấp phụ tá chất chitosan.
Hình 3.4: Biến thiên hiệu giá đáp ứng miễn dịch của 3 nhóm vacxin
theo thời gian.



















4

LỜI MỞ ĐẦU
Trong thế kỷ 20, loài người đã trải qua những đại dịch cúm nghiêm trọng
do virut cúm A gây ra: Cúm Tây Ban Nha 1918-1919, cúm châu Á 1957-1958,
cúm Hồng Kông 1968-1969. Dịch cúm Tây Ban Nha năm 1918 đã giết chết

khoảng 20-50 triệu người trên toàn thế giới. Dịch cúm năm 1957 và 1968, chỉ
riêng ở Mỹ giết chết 0.5-1 triệu người.
Đại dịch cúm xảy ra tác động không nhỏ đến nền kinh tế cũng như các hoạt
động xã hội, sức khỏe, tính mạng của người dân. Vì virut cúm có tỷ lệ đột biến
cao và kháng nguyên bề mặt luôn có xu hướng thay đổi, nên Tổ chức Y tế thế
giới (WHO) cảnh báo: Thời gian tới có thể virut cúm gia cầm H5N1 biến
thành chủng mới có độc lực cao, lây nhiễm từ người sang người và trở thành
hiểm họa của nhân loại. Việc nghiên cứu phát triển vacxin và thuốc kháng
virut là hai biện pháp hữu hiệu nhất để giảm tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong cho tất
cả các quốc gia.
Hiện nay, năng lực sản xuất vacxin phòng cúm trên thế giới chỉ đáp ứng
10% dân số khi đại dịch cúm xảy ra và chưa xác định được loại vacxin nào
hữu hiệu nhất để chống lại tất cả các virut cúm A và các biến thể. Mục tiêu
nghiên cứu hiện nay là sản xuất được vacxin cúm có hiệu giá cao, kinh tế và
đảm bảo an toàn khi sử dụng. Vì vậy, việc thử nghiệm xác định công thức
vacxin khác nhau, các cách hấp phụ tá chất vacxin khác nhau đang được tiến
hành tích cực.
Cùng với các nước châu Á khác, Việt Nam cũng là một trong những nước
bị đại dịch cúm gây thiệt hại nặng nề cho nền kinh tế chăn nuôi gia cầm và ảnh
hưởng nghiêm trọng đến sức khoẻ con người trong những năm gần đây.
Viện Vacxin đã phát triển thành công vacxin cúm A/H5N1 sản xuất trên trứng
gà có phôi, sử dụng tá chất Al(OH)
3
1mg/ml, hiệu quả bảo vệ chưa cao ở nồng
độ kháng nguyên 7 mg HA/liều. Để tìm một loại tá chất thích hợp hơn chúng
tôi tiến hành thực hiện đề tài:
“Đánh giá tính gây miễn dịch của vacxin cúm A/H5N1 hấp phụ tá chất MF-
59 và chitosan trên súc vật thí nghiệm”
 Nội dung nghiên cứu:
Nghiên cứu, so sánh hiệu quả đáp ứng miễn dịch của các nhóm vacxin cúm

A/H5N1 trên chuột nhắt trắng Swiss:
- Vacxin cúm A/H5N1 không hấp phụ tá chất.
- Vacxin cúm A/H5N1 hấp phụ tá chất MF-59.
- Vacxin cúm A/H5N1 hấp phụ Chitosan.
5

















PHẦN I: TỔNG QUAN

6

I.1. TỔNG QUAN VỀ VIRUT CÚM
I.1.1. Đặc điểm chung [17, 23]
Năm 1933, loại virut được xem là tác nhân gây bệnh cúm đã được xác định
và phân lập bởi Sir Christopher Andrewers, Wilson Smith, Sir Patrick Laidlaw.
Virut cúm thuộc họ Orthomyxoviridea, được chia làm 3 type khác nhau:
type A, B và C. Chỉ có virut cúm type A mới được chia thành các phân type
bởi sự biến đổi thường xuyên của các kháng nguyên. Các phân type virut cúm
A khác nhau ở hai vị trí kháng nguyên bề mặt Hemagglutinin (HA) và
Neuramicnidase (NA). Hiện nay người ta phát hiện 16 type kháng nguyên HA
(H
1
-H
16
) và 9 type kháng nguyên NA (N
1
-N

9
).
Từ năm 1959, các virut phân nhóm H5, H7, H9 đã vượt qua ranh giới loài
để gây bệnh cho người. Virut H5N1 gây thể bệnh nặng với tỷ lệ cao 1997,
2003 và các vụ dịch vẫn đang xảy ra bắt đầu từ giữa năm 2003 đến nay.[2]
Bảng 1.1: Số người nhiễm virus H5N1 và số tử vong từ năm 2003
Số liệu tính đến 5-3-2008 [21]
Tên quốc gia Số ca nhiễm H5N1

Số tử vong Tỷ lệ tử vong (%)
Indonesia 129 105 81.4
Việt Nam 105 51 48.6
Ai Cập 16 20 43.5
Trung Quốc 30 20 66.7
Thái Lan 25 17 68.0
Thổ Nhĩ Kỳ 12 4 33.3
Arzerbaijan 8 5 62.5
Campuchia 7 7 100.0
Iraq 3 2 66.7
Lào 2 2 100.0
Dijbutouti 1 0 0.0
Myanmar 1 0 0.0
Nigeria 1 1 100.0
Pakistan 1 1 100.0
Tổng cộng 371 235 63.3

7

I.1.2. Cấu trúc và đặc điểm sinh học [11, 17, 22, 23]
Virut cúm có hình cầu hoặc hình trứng, đường kính trung bình 70-120 nm,

có thể có dạng hình sợi với chiều dài lên đến 1000 nm hay dài hơn phụ thuộc
vào điều kiện tăng sinh và số lượng virut xâm nhập.
Lớp vỏ có lipoprotein có nguồn gốc từ tế bào bội nhiễm. Trên vỏ có những
điểm chồi lên có bản chất là các glycoprotein: Hemagglutinin (H) và
Neuraminidase (N). Mỗi gai dài từ 8-10 nm, cách nhau 8 nm, có khoảng 500
gai H và 100 gai N phủ trên bề mặt virion. Những kháng nguyên bề mặt này
liên quan đến khả năng gây nhiễm trên vật chủ và tạo ra chủng virut mới.
Kháng nguyên H liên quan tới quá trình bám dính của virut vào tế bào. Kháng
nguyên N hỗ trợ cho virut trong quá trình xâm nhập vào tế bào chủ.
Ngoài ra trên bề mặt lớp vỏ còn có các kênh ion chức năng vận chuyển H
+
.
Nằm ngay dưới vỏ lipoprotein là các matrix protein sắp xếp thành khuôn và
chứa bên trong là các ribonucleoprotein và một lượng nhỏ các protein phi cấu
trúc.
Virut cúm A/H
5
N
1
là type virut có kháng nguyên bề mặt là Hemagglutinin
type 5 và Neuraminidase type 1.
Vật liệu di truyền của virut cúm là RNA mạch đơn âm, sợi đối mã tồn tại ở
dạng các phân đoạn RNA độc lập, có kích thước khác nhau và mã hóa cho các
protein khác nhau. Mỗi phân đoạn RNA của virut được bao quanh bởi nhiều
đơn phân Nucleoprotein và gắn với một phức RNA- polymerase. Bộ gen gồm
8 đoạn RNA mạch đơn, xoắn âm, được phân loại theo chức năng của protein
được quy định bởi các đoạn gen.

Hình 1.1. Cấu tạo của virut cúm A/H5N1


8

Bảng 1.2: Bộ gen của virus cúm A và các polypeptid tương ứng [23]
Polypeptide Phân
đoạn
vRNA
Kích
thước
Tên Ký
hiệu
Chức năng
1 2341 Polymerase Pb1 Là tiểu đơn vị của
polymerase
(RNA trancriptase)
2 2341 Polymerase Pb2 Là tiểu đơn vị xúc tác của
polymerase
(RNA transcriptase)
3 2233 Polymerase Pa Là tiểu đơn vị của
polymerase
(RNA transcriptase), tham

gia tổng hợp RNA
4 1778 Hemagglutinin

HA Gắn kết virut vào thụ thể của
tế bào (làm đông máu)
5 1565 Nucleoprotein NP Bao quanh các gen của virut,
là thành phần của phức
phiên mã, vận chuyển RNA
giữa nhân và tế bào
6 1413 Neuraminidase

NA Phóng thích virut
M1 Protein nền, là thành phần
chính của virion
7 1027 Matrix protein
M2 Protein nội màng, kênh ion
NS1 Vận chuyển mRNA ra tế bào
chất, dịch mã, là protein
kháng interferon
8 890 Non structural
protein
NS2 Vận chuyển RNA ra khỏi
nhân






9

I.1.3. Tính chất kháng nguyên [11]
I.1.3.1. Kháng nguyên virut cúm
Hemagglutinin và Neuraminidase là hai kháng nguyên quan trọng nhất
quyết định độc tính của virut cúm.
 Hemagglutinin (HA)
HA là một glycoprotein, dạng hình nấm, nhô ra từ màng lipid của virut,
phía ngoài có tán hình cầu. HA có khả năng gây ngưng kết hồng cầu. Đây là
kháng nguyên quan trọng nhất quyết định đến độc tính của virut cúm nhờ khả
năng nhận biết và gắn vào thụ thể của tế bào chủ.
Kháng nguyên này phụ thuộc:
- Dạng phân tử của sialic acid (SA) trên thụ thể của tế bào vật chủ: N-
acetylneuraminic acid và N-glycolyl neuraminic acid.
- Kiểu liên kết giữa HA và phân tử đường galactose của sialic acid trên thụ
thể tế bào vật chủ: liên kết -2,6 Gal-SA hay liên kết -2,3 Gal-SA.
HA virut cúm ở chim có ái lực liên kết -2,3 Gal-SA; có nhiều ở các tế bào
biểu mô của ruột.
HA virut cúm người có ái lực liên kết -2,6 Gal-SA; có ở các tế bào biểu
mô khí quản.
 Neuraminidase
Neuraminidase (NA) là một glycoprotein, có dạng nút lồi hình cây trên bề
mặt vỏ của virut cúm. NA có 2 phần: phần phía ngoài gồm 4 monomer hình
cầu trên cùng mặt phẳng, phần còn lại là vùng kỵ nước gắn vào màng virut.
NA có chức năng phân cắt sialic acid bằng cắt các liên kết glycoside nối nhóm
keto với D-glactose hoặc D-glactosamine của acid sialic. Phản ứng này cho
phép virut vượt qua lớp niêm dịch để tới được các tế bào biểu mô của đường
hô hấp trong quá trình nhiễm trùng. Đồng thời việc loại bỏ acid sialic của phân
tử NA giúp các virion mới được tổng hợp phóng thích ra ngoài tế bào và gia
tăng khả năng gây nhiễm trùng. Trong 9 phân type NA, cho đến nay chỉ có N
1

,
N
2
được xác định liên quan đến các vụ dịch ở người.
I.1.3.2. Đáp ứng miễn dịch chống virus cúm
Đáp ứng miễn dịch chống virut cúm chủ yếu là đáp ứng miễn dịch dịch
thể, khoảng 1-2 tuần sau lần tiêm thứ nhất, kháng thể HA và NA bắt đầu xuất
hiện trong dịch thể, cao nhất vào tuần thứ 3-4. Nếu bị tái nhiễm, đáp ứng miễn
dịch xảy ra nhanh hơn. Nếu kháng thể kháng HA quyết định kháng nguyên
bảo vệ chống lại sự xâm nhập virut, thì kháng thể kháng NA giúp ngăn chặn số
lượng virut thoát ra khỏi tế bào bị nhiễm, do đó hạn chế sự lây nhiễm. Kháng
10

thể virut cúm có thể tồn tại hàng tháng sau khi được chủng ngừa nhưng hàm
lượng kháng thể bắt đầu giảm dần.
Sự hiện diện của kháng thể kháng HA ở độ pha loãng 1/40 trở lên tương
ứng với khả năng đủ đáp ứng miễn dịch (đối với người lớn tuổi là 1/80).[2]
I.1.4. Khả năng thay đổi cấu trúc kháng nguyên của virus cúm A/H5N1-
nguy cơ bệnh dịch mới [2]
Virut cúm có khả năng đột biến cao và kháng nguyên bề mặt luôn có xu
hướng thay đổi. Chỉ cần những đột biến nhỏ cũng dẫn đến sự biến đổi kháng
nguyên tạo ra chủng cúm mới. Khi đột biến gene xảy ra, kháng nguyên bề mặt
được thay thế bằng một kháng nguyên hoàn toàn mới. Toàn bộ cộng đồng
chưa kịp có đáp ứng miễn dịch đối với phân type virut cúm mới đó.
Ví dụ:
Dịch cúm châu Á (1957-1958): ngày 5/1958 Tổ chức Y tế thế giới (WHO)
ghi nhận phân type kháng nguyên mới H2N2 thay thế cho phân type H1N1 đã
lưu hành trên người gần 4 thập kỷ qua. Đến 1968-1969 dịch cúm Hồng Kông
xảy ra giữa tháng 7/1968 đã ghi nhận phân type mới H3N2 làm tử vong hàng
triệu người.[2]

Heo là vật chủ trung gian có cả hai loại thụ thể -2,3 Gal-SA và -2,6 Gal-
SA. Do đó heo có thể trở thành vật thể trung gian gây lây nhiễm virut cúm ở
chim và người. Điều này dẫn đến sự tái sắp xếp gene xảy ra giữa hai virut
khác nhau hình thành loại virut mới mang gene tái sắp xếp, có thể gây bệnh
trên người.
HA có 16 phân type, trong đó H
1
, H
2
, H
3
liên quan đến đại dịch cúm ở người,
gần đây các type H
7
, H
9
được xác định có khả năng gây bệnh trên người, đặc
biệt là H
5
.

Hình 1.2: Các đường lây nhiễm cúm A/H5N1 trên người
11

Sự biến đổi kháng nguyên virut cúm bao gồm hai dạng [11, 22, 24]
• Sự trôi kháng nguyên (antigenic drift)
Nó xảy ra ở tất cả các type virut cúm. Sự trôi kháng nguyên là sự biến đổi
từ từ kháng nguyên HA và NA trong cùng một phân type do sự tích lũy dần
các đột biến điểm dẫn đến sự biến đổi trình tự amino acid và làm thay đổi vị
trí kháng nguyên của phân tử.

Kết quả hình thành nhiều kiểu kháng nguyên H
và N khác nhau được ghi nhận bằng các ký hiệu H1, H2, H3 v.v. và N1, N2,
N3, v.v. Vì vậy để ký hiệu mỗi loại virut ta dùng một nhóm gồm hai ký hiệu
một từ H và một từ N như: H1N1, H1N2, H2N2, H5N1 Điều đáng lưu ý là
kết quả của biến đổi trôi dạt dẫn đến sự ra đời của chủng virut cúm mới mà
kháng thể đối với các chủng virut trước nó không nhận ra được.
• Sự trượt kháng nguyên (antigenic shift)
Sự trượt kháng nguyên là sự biến đổi hoàn toàn 1 hay cả 2 kháng nguyên
bề mặt xảy ra khi gene mã hóa cho phân type này đuợc thay thế bằng gene mã
hóa của phân type khác. Khi virut cúm nhiễm từ loài này sang loài khác, hoặc
do trộn lẫn sẽ xảy ra sự tái tổ hợp gene của virut cúm ở các loài khác nhau. Ví
dụ: virut cúm A ở người và virut cúm A ở gia cầm, khi xảy ra tái tổ hợp sẽ
hình thành một phân type virut cúm mới có khả năng lây nhiễm cao và lây trực
tiếp từ người sang người. Đó là nguy cơ cho một đại dịch toàn cầu sẽ xảy ra.
Sự trượt kháng nguyên chỉ xảy ra ở virut cúm A vì nó có khả năng gây
bệnh trên nhiều loại vật chủ khác nhau. Các đại dịch cúm châu Á 1957
(H2N2), cúm Hồng Kông 1968 (H3N2) là do virut cúm A trải qua sự trượt
kháng nguyên gây nên
.

Chủng virut cúm gia cầm H5N1 có khả năng gây ra dịch cúm ở người
thông qua hai cơ chế:
- Cơ chế xâm nhiễm: Virut cúm gia cầm H5N1 và virut cúm ở người cùng xâm
nhập vào tế bào trung gian (heo). Ở đó, chúng tái sắp xếp các gene tạo một
dạng virut cúm gia cầm H5 mới có thể lây nhiễm từ người sang người.
- Cơ chế đột biến: Virut cúm gia cầm H5N1 có thể đột biến trực tiếp thành
virut cúm có khả năng lây nhiễm từ người sang người.

Virut H5N1 đang lưu
hành hiện thời được xem là chủng "mới" về mặt kháng nguyên, chúng có khả
năng phát sinh bệnh với mức độ cao ở người và có thể lây nhiễm một cách có
hệ thống ở động vật. Những đặc điểm này có liên quan đến khả năng tăng
cường khả năng phát sinh bệnh.


12

I.1.5. Tổng quan vacxin cúm A/H5N1
I.1.5.1. Các dạng vacxin cúm mùa [3, 23]
• Vacxin bất hoạt ( vacxin chết)
Vacxin chết được bất hoạt bằng formalin. Các chủng thường được nghiên
cứu trên trứng gà có phôi hoặc tế bào thận khỉ.
Hầu hết các loại vacxin cúm hiện nay trên thế giới là vacxin bất hoạt 3
thành phần (kí hiệu TIV) gồm hai chủng cúm A là H1N1, H3N2 và một chủng
virut cúm B. Mỗi liều vacxin chứa 15 µg kháng nguyên mỗi chủng virut thành
phần.[25]
TIV gồm các loại: vacxin toàn thân, vacxin tiểu phần và vacxin kháng
nguyên tinh chế.
- Vacxin toàn phần virut (Whole cell vacxin) là vacxin thế hệ thứ nhất,
sản xuất 1958, bất hoạt virut nguyên vẹn, hiệu quả bảo vệ 75-90%.

- Vacxin tiểu phần virut là vacxin thế hệ thứ hai (1968), cũng được sản
xuất như vacxin toàn thân nhưng các tiểu phần virut như: kháng nguyên bề
mặt, nuclecapsid, các protein được tách bằng chất tẩy (trước đây là ether).
- Vacxin thế hệ thứ ba (1976) là vacxin kháng nguyên tinh chế được sản
xuất từ HA, NA tinh chế, các thành phần khác của virut bị loại bỏ.
Để tăng hiệu quả đáp ứng miễn dịch, hiện nay người ta thêm các tá chất
trong công thức sản xuất vacxin cúm: MF-59, hợp chất nhôm. Đây là hai loại
tá chất duy nhất được cấp phép sử dụng cho vacxin cúm ở Mỹ và Châu Âu.









Vacxin thế hệ Vacxin thế hệ Vacxin thế hệ
I (1958) II (1968) III (1976)

Hình 1.3: Thành phần vacxin bất hoạt


13

• Vacxin sống (vacxin giảm độc lực).
Vacxin sống nhược độc thích ứng lạnh (kí hiệu CAIV) là vacxin dạng
phun, miễn dịch bằng đường mũi, được sản xuất từ chủng virut có đặc tính
thích ứng lạnh do đột biến. Chủng mới sao chép thuận lợi ở 25
0

C nhưng trong
cơ thể người (nhiệt độ 35-37
0
C) virut sẽ bị nhược độc. Vacxin CAIV hiệu quả
cao, miễn dịch liều đơn 0.5 ml và chỉ sử dụng cho người từ 5-49 tuổi. CAIV
được sử dụng ở liên bang Xô Viết cũ trong nhiều năm và tại Mỹ năm 2003
cũng được cấp phép sử dụng.
Những nghiên cứu hiện nay đang tập trung nghiên cứu và sản xuất vacxin
DNA từ các mảnh gene của virut: gen HA, NA, NP, NS…Tuy nhiên vẫn chưa
xác định được loại vacxin nào hữu hiệu nhất để chống lại tất cả các virut cúm
A.
Bảng 1.3: Ưu điểm, nhược điểm của các loại vacxin
Loại vacxin Ưu điểm Nhược điểm
Vacxin giảm
độc lực
Đơn giản, dễ sản xuất
Giá thành rẻ, tương đối ổn
định
Gây miễn dịch kéo dài
Không cần tiêm nhiều lần
Có thể gây ra bệnh nhẹ,
có thể nhiễm virut
Cần phải bảo quản lạnh
để virut không chết

Vacxin bất
hoạt
Đơn giản, dễ sản xuất
Giá thành rẻ, ổn định
Không cần bảo quản lạnh

Khả năng nhiễm virut sống rất
thấp
Cần nuôi tạo lượng
virut lớn, có thể cần tá
chất bổ trợ
Tính miễn dịch có thể
không cao
Có thể tiêm nhắc lại
nhiều lần
Có thể bị nhiễm bệnh
Vacxin DNA Gây ĐƯMD định hướng với
từng phần của virut
Không trở lại thành virut để
lây nhiễm, an toàn
Khả năng nhiễm virut sống rất
thấp
Ổn định, dễ bảo quản
Nghiên cứu phức tạp
hơn, chi phí cao
Cần chất bổ trợ
Tính miễn dịch có thể
không cao
Có thể tiêm nhắc lại
nhiều lần

14


I.1.5.2. Tình hình nghiên cứu và sản xuất vacxin cúm A/H5N1 hiện nay
a. Tình hình sản xuất vacxin cúm trên thế giới [2, 13, 14]

Các loại vacxin cúm hiện nay đều phải thay đổi mỗi năm để phù hợp với
các biến thể virut mới. Do đó, vacxin cũng phải được phân phối đều đặn hàng
năm. Điều này là cần thiết vì cấu trúc bên ngoài của virut cúm biển đổi thường
xuyên và gây ra những đợt bùng phát bệnh cúm mới. Chính vì sự biến đổi
thường xuyên này, virut cúm có thể trốn tránh kháng thể được tạo ra trong đợt
tiêm chủng trước đó. Đó cũng là lý do tại sao mỗi năm chúng ta phải đối mặt
với nguy cơ mắc bệnh cúm. Để phòng ngừa hiện tượng lây nhiễm, chúng ta
cần được tiêm chủng đều đặn loại vacxin tương ứng với dòng virut đang
hoành hành.
Tổ chức Y tế thế giới đang khuyến cáo các nước lựa chọn sản xuất các
loại vacxin cúm sau: vacxin bất hoạt trên trứng gà có phôi và nuôi cấy tế bào;
vacxin sống trên trứng gà có phôi và nuôi cây tế bào; vacxin sống dạng phun
mù, hít qua mũi.
Cũng như vacxin cúm thông thường, công nghệ sản xuất vacxin cúm
A/H5N1 dạng tiêm bắp thuộc các loại sau: vacxin toàn thân tế bào virut,
vacxin mảnh (tiểu phần) vỏ virut và kháng nguyên tinh chế (HA và NA). Tùy
mức đầu tư trang thiết bị, trình độ công nghệ, dự kiến giá thành mà nhà sản
xuất lựa chọn công nghệ phù hợp để sản xuất ra 1 trong 3 loại vacxin trên.
Đa số các nước: Mỹ, Úc, Hungary, Pháp đang phát triển loại vacxin toàn
thân tế bào vì dễ triển khai và bảo đảm có công hiệu cao trên người. Một số
nước đang nghiên cứu vacxin dạng phun nhằm giảm phản ứng phụ và tiện lợi
cho người sử dụng.
Theo tính toán của các chuyên gia, nếu cộng năng lực sản xuất của các nhà
sản xuất vacxin cúm thông thường hiện nay lại cũng chỉ đáp ứng 350 triệu liều
cho nhu cầu 6,5 tỷ người. Rất nhiều nỗ lực đang được tiến hành ở Hoa kỳ và
khắp thế giới để ứng phó với tình huống đại dịch cúm gia cầm sẽ xảy ra. Một
trong những yếu tố quan trọng nhất trong việc kiểm soát bệnh dịch là nghiên
cứu và sản xuất ra một loại vắc xin có hiệu lực cao.

15

Bảng 1.4. Một số vacxin cúm A/H5N1 trên thế giới [20]
Hãng Chủng Loại vacxin Nuôi
cấy
Tá
chất
Liều (µl
HA)
1. Baxter (Cộng
hòa Tiệp Khắc
H5N1
(A/VietNam/
1203/2004)
Bất hoạt
Toàn thân
Virut
Tế
bào
Vero
Al 3.7/7.5/1
5/30/45
2. Biken (Nhật) H5N1
(NIBRG-14)
Bất hoạt toàn
thân virut
Trứng Al 1.7/5/15

3. CLS Limited
(Australia)
H5N1
(NIBRG-14)
Bất hoạt tiểu
phần virut
Trứng Al
3+
30/45
4. Denka Seiken
(Nhật)
H5N1
(NIBRG-14)
Bất hoạt toàn
thân virut
Trứng

Al 1.7/5/15
5.GSK
Biologicals
(Canada và Đức)
H5N1 Bất hoạt toàn
thân virut
Trứng Al 3.8/7.5/1
5/30
6.GSK
Biologicals (Đức)
H5N1 Bất hoạt tiểu
phần virut
Trứng - 15

7.Kaketsuken
(Nhật)
H5N1
(NIBRG-14)
Bất hoạt toàn
thân virut
Trứng Al 1.7/5/15
8.Kitasato
Institute (Nhật)
H5N1
(NIBRG-14)
Bất hoạt toàn
thân virut
Trứng Al 1.7/5/15
9.MedImmune
(Mỹ)
H5N1
(A/VietNam/
1203/2004)
Sống nhược
độc
Trứng - Intranasal

10. Nobilon
International BV
(Nettherlands)
H5N1
(NIBRG-14)
Bất hoạt toàn
thân virut

Tế
bào
Al 3.8/7.5/1
5/30
11. Novartis V&D
(Mỹ)
H5N1
(A/VietNam/
1203/2004)
Kháng
nguyên tinh
chế
Trứng MF59
Al
7.5/15

7.5/15/30
12. Sanofi pasteur
(Pháp)
H5N1
(A/VietNam/
1194/2004-
NIBRG14)
Bất hoạt tiểu
phần virut
Trứng Al 7.5/15/30

16

Các công nghệ sản xuất vacxin cúm A/H5N1 dự tuyển hiện nay [13]

• Công nghệ di truyền “ngược dòng” [14]
Công nghệ gen hiện đại đã tạo ra chủng sản xuất vacxin cúm A/H5N1
NIBRG-14 thích ứng lạnh trên tế bào phôi trứng gà. NIBRG-14 là chủng virut
tái tổ hợp, được tạo ra bằng kỹ thuật di truyền ngược bằng hai chủng virut:
+ Hai gen quyết định kháng nguyên: NA và HA được lấy từ chủng virut
cúm A/Việt Nam/1194/2004 (H5N1). Vùng quyết định độc tính thuộc gen H5
gồm 12 bazơ mã hóa cho 4 acid amin mang tính kiềm đã bị cắt bỏ để làm mất
tính độc.
+ Sáu gen còn lại lấy từ chủng A/PR/8/34 (H1N1) nên vacxin có thể có
tác dụng miễn dịch chéo với cúm thông thường.
• Công nghệ nuôi cấy tế bào
Virut cúm là loại virut tăng sinh theo kiểu nảy chồi (giống virut dại), nên
việc nuôi cấy virut này rất khó thu được số lượng lớn kháng nguyên. Đây
chính là nguyên nhân tạo giá thành cao của loại vacxin này. Phương pháp nuôi
cấy trên trứng gà có phôi vẫn tỏ ra hiệu quả đối với chủng NIBRG-14 khi so
với các phương pháp nuôi cấy trên dòng tế bào khác (VERO, MDPK, PER.C6
và cả chính tế bào màng niệu đệm phôi gà).
• Công nghệ tách lọc
Việc thu virut từ môi trường nuôi cấy bao gồm cả công đoạn phá vỡ tế bào
là những thách thức không nhỏ cho các nhà nghiên cứu hiện nay. Nhiều thiết
bị mới đã được sử dụng cho mục đích này như ly tâm lạnh siêu tốc, lọc chéo
hay ly tâm liên tục. Tuy nhiên, các thiết bị này rất đắt và việc làm chủ từng
loại đòi hỏi trình độ cao về kiến thức và tay nghề của các chuyên viên trong
lĩnh vực sản xuất vacxin.
• Công nghệ tinh chế
Có nhiều phương pháp tinh chế trong sản xuất vacxin virut nói chung như
phương pháp hóa học, vật lý, enzyme. Với vacxin cúm A /H5N1 bất hoạt toàn
thân tế bào có thể sử dụng các thiết bị ly tâm (siêu tốc, phân vùng và liên tục).
Để làm vacxin chỉ có thành phần HA-NA tăng độ an toàn thì phải sử dụng các
phương pháp sắc ký (ái lực, cột hoặc lỏng cao áp).

• Công nghệ hấp phụ
Tá chất hấp phụ phổ biến hiện nay là Al(OH)
3
và AlPO
4
với hàm lượng
giảm xuống thấp nhất tới 0,31mg/ml tương thích hàm lượng 62 µg/liều. Bằng
công thức hấp phụ ấy vacxin sẽ có giá thành thấp mà ít phản ứng phụ, đặc biệt
công hiệu bảo vệ trên người khá cao (78%). Ngoài ra, nhiều nơi đang nghiên
17

cứu sử dụng các tá chất như MF59 – hỗn dịch dầu + nước hay chitosan loại tan
có độ deacetyl trên 94%.
b. Tình hình sản xuất vacxin cúm A/H5N1 cho người tại Việt Nam
Công nghệ sản xuất vacxin cúm thông thường đã có từ 60 năm nay ở các
nước phát triển thuộc châu Âu và Bắc Mỹ, giá luôn ở mức cao nên ít phổ cập
tại các nước đang phát triển. Trước hiểm hoạ mới, WHO kêu gọi các nước
đang phát triển trong đó có Việt Nam sớm phát triển công nghệ sản xuất để
chủ động đối phó với đại dịch. Tại Việt Nam chưa có công nghệ sản xuất
vacxin cúm cho người. Các nhà sản xuất trong nước hiện đang ở giai đoạn
nghiên cứu phát triển sản xuất vacxin cúm A/H5N1 cho người ở quy mô
phòng thí nghiệm với các phương pháp khác nhau.[4]
- Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, từ giữa năm 2004 phát triển kỹ thuật sản
xuất vacxin cúm A/H5N1 cho người trên tế bào thận khỉ tiên phát, hiện nay
viện đã sử dụng chủng NIBRG-14. Vacxin do viện sản xuất đã được nghiệm
thu dưới dạng đề tài cấp nhà nước vào đầu 2007, đang thử nghiệm lâm
sàng.[1]
- Viện Pasteur TPHCM nghiên cứu phát triển các dạng vacxin nuôi cấy trên
tế bào VERO, sử dụng chủng NIBRG-14.[1]
- Viện Vacxin và Sinh phẩm Y tế-Nha Trang nghiên cứu sản xuất vacxin cúm

A/H5N1 cho người trên trứng gà có phôi từ chủng NIBRG-14.[5]
I.2. TỔNG QUAN VỀ TÁ CHẤT
I.2.1. Vai trò tá chất miễn dịch [3, 10, 12, 24]
Tá chất đã được sử dụng trong nhiều thập niên để cải thiện đáp ứng miễn
dịch của kháng nguyên vacxin. Tá chất vacxin làm tăng độ mạnh, tăng tốc độ,
kéo dài đáp ứng miễn dịch đặc hiệu. Thuận lợi của tá chất bao gồm: nâng cao
đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên yếu, làm giảm lượng kháng nguyên cần
thiết cho đáp ứng miễn dịch thành công, giảm số lần tiêm nhắc lại, cải thiện
đáp ứng miễn dịch ở người già, trẻ em và những người suy giảm hệ miễn
dịch.[12]
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng: chất lượng, cường độ đáp ứng miễn dịch
của kháng nguyên vacxin có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố. Chúng bao
gồm: loại và liều lượng tiêm vacxin, thời gian đáp ứng miễn dịch và thời gian
tiêm nhắc lại, con đường gây đáp ứng miễn dịch, và độ tuổi, sức khỏe của
người tiêm vacxin.[10]
Do đó việc lựa chọn tá chất có thể được sử dụng để tối ưu hóa một phản ứng
miễn dịch mong muốn. Những nghiên cứu hiện đại đã chỉ ra rằng: tá chất khác
18

nhau có thể có tác động sâu sắc không chỉ đến độ lớn đáp ứng miễn dịch mà
còn liên quan đến chất lượng của đáp ứng miễn dịch. Việc nghiên cứu tá chất
vacxin đang phát triển nhanh chóng chống lại các bệnh truyền nhiễm, dị ứng,
ung thư nhờ công nghệ trong các lĩnh vực: Hóa sinh phân tích, công nghệ tái
tổ hợp, tinh sạch protein và kết hợp với sự hiểu biết rõ hơn về những cơ chế
đáp ứng miễn dịch, miễn dịch học bệnh lý.[12]
Để đánh giá chất lượng vacxin/tá chất người ta đánh giá tính tương thích
của tá chất với các thành phần có mặt trong vacxin, không có sự giải hấp phụ
trong suốt thời gian bảo quản, những phản ứng phụ do tá chất gây ra. Trước
đây, những tá chất đã được nghiên cứu nhưng không được chấp nhận để tiêm
chủng do sự liên quan đến tính an toàn, tính độc, những tác dụng phụ của tá

chất. Do đó những lợi ích của một tá chất vacxin phải được cân đối để chống
lại nguy cơ của bất kỳ phản ứng đối lập nào cố hữu với nó. Tuy nhiên đối với
nhóm bệnh nhân ung thư, bệnh nguy hiểm, một số vacxin có thể sử dụng tá
chất với một lượng độc có thể chấp nhận được. Sự đánh giá an toàn cuối cùng
của tá chất phải được nghiên cứu trên những cuộc thử nghiệm lâm sàng.[12]
Một số tá chất đã được cấp phép sử dụng cho vacxin tiêm cho súc vật: tá
chất Freund là một trong tá chất có đáp ứng miễn dịch mạnh nhất nhưng
không phù hợp sử dụng cho con người. Mới đây tá chất MF-59 đã được cấp
giấy phép sử dụng tại các nước Châu Âu. Trong những cuộc thử nghiệm lâm
sàng trên quy mô lớn, nhiều tá chất mới đã được phát triển: Lipid
monophosphoryl A, DETOXTM (vách tế bào Mycobacteria), nội độc tố được
tinh sạch từ dòng Salmonella…
I.2.2. Cơ chế hoạt động của tá chất [3]
Cơ chế hoạt động của tá chất cho đến nay vẫn chưa được hiểu biết rõ ràng.
Những hiểu biết về sinh học phân tử và tế bào của các cơ chế làm tăng miễn
dịch của tá chất đang được nghiên cứu rộng rãi để thiết kế các loại vacxin thế
hệ mới, khắc phục các nhược điểm của vacxin cũ.
Kháng nguyên là nhân tố thụ động, trong khi đó tá chất được xem là nhân tố
chủ động điều hòa hoạt động trung gian giữa hệ thống miễn dịch của vật chủ
và vacxin.
Tá chất hoạt động theo cơ chế sau:
- Giới thiệu kháng nguyên vào vị trí thích hợp trong cơ thể.
- Giữ và giải phóng kháng nguyên một cách từ từ khỏi vị trí tiêm ban đầu.
- Tuyển mộ và hoạt hóa các tế bào trình diện kháng nguyên và các tế bào
lympho.
19

- Hoạt hóa bổ thể và làm tăng sự tổng hợp, tiết và gắn các chất điều hòa
miễn dịch do tế bào tiết ra (cytokines).
- Biểu lộ và phóng thích các quyết định kháng nguyên đã được trình diện

trên tế bào APCs cho tế bào T gây độc, tế bào TCD4 nhưng bị hạn chế bởi
phức hợp hòa hợp tổ chức lớp I (MHC I) và phức hợp hòa hợp tổ chức lớp II
(MHC II).
- Chọn lọc và điều hòa miễn dịch dịch thể hay miễn dịch qua trung gian tế
bào, thể hiện qua quá trình xử lý kháng nguyên, trình diện kháng nguyên, kích
thích tiết ra các cytokines.
- Điều hòa sản xuất kháng thể, chất lượng kháng thể, loại kháng thể, tính
đặc hiệu, ái lực của kháng thể.
I.2.3. Những tác động phụ của tá chất [3]
- Gây nhiễm trùng cấp tính hay mãn tính, hình thành các ổ mủ gây đau, các
cục u hay nhọt dai dẳng.
- Làm gia tăng các bệnh tương tự như cúm, gây sốt, nhức đầu, mệt mỏi,
đau cơ và khớp.
- Dị ứng.
- Gây độc lâm sàng các mô và cơ quan.
- Làm gia tăng mẫn cảm cao độ, đưa đến việc viêm khớp tự miễn.
- Phản ứng chéo với kháng nguyên của người như là màng bể cầu thận hay
bao thần kinh, gây ra viêm thận hay viêm màng não.
- Tăng nhạy cảm với tuberculin hoặc các kháng nguyên thử nghiệm trong
da khác.
- Ngăn chặn miễn dịch.
- Gây ung thư.
- Gây quái thai.
- Gây đẻ non.
- Reo rắc các vector sống trong vật chủ gây bệnh, phát tán các vector vào
môi trường và những người khác.

20

I.2.4. Hệ tá chất dùng trong thí nghiệm
I.2.4.1. Tá chất chitosan [6, 8, 16]
Chitosan là một polysaccharide gồm các chuỗi glucosamine và N- acetyl
glucosamine đồng trùng hợp, liên kết với nhau bằng liên kết 1-4 glucoside.
Chitosan thu được bằng cách khử một phần acetyl của chitin có nguồn gốc từ
vỏ động vật giáp xác, vi nấm, vi sinh vật…Khi hòa tan nhóm amine nhận
proton và chuyển mang điện tích dương.
Chitosan là chất rắn, xốp, nhẹ, ở dạng bột màu trắng ngà, không mùi,
không vị. Tính chất của chitosan thay đổi phụ thuộc vào độ deacetyl hóa, pH,
nồng độ ion, trọng lượng phân tử. Chitosan có khả năng kết dính, tạo màng,
tạo gel và độ nhớt cao của dung dịch được xem như là một con đường để kiểm
soát sự giải phóng kháng nguyên. Nhờ những đặc tính đó, gần đây người ta đã
chứng minh rằng: chitosan có khả năng hoạt động làm cải thiện đáp ứng miễn
dịch của cơ thể nhờ khả năng thúc đẩy sự hấp thu đối với các loại vacxin đưa
vào cơ thể qua niêm mạc mũi, và mở rộng sự liên kết của các tế bào nội mô
cho quá trình vận chuyển vacxin. Illum và cộng sự là những người đầu tiên
chứng minh chitosan có khả năng thúc đẩy sự hấp thu qua màng những phân
tử nhỏ, peptid, protein, vacxin toàn thân virut bất hoạt, kháng nguyên lipid,
kháng nguyên glycoprotein. (Illium et al, 2001 Adv Drug Dell V ^ev 51(1-
3):81-96).
Bản thân chitosan một mình không tạo được đáp ứng miễn dịch dịch thể
qua đường mũi hoặc đường tiêm. Gill và cộng sự cho thấy rằng: vacxin ho gà
chứa các thành phần kháng nguyên FHA và độc tố ho gà (PT) hoặc chỉ chứa
FHA được gắn vào chitosan và đưa vào cơ thể qua đường mũi sẽ tạo được
mức IgG đáp ứng ngang bằng khi đưa kháng nguyên vào qua đường phúc

mạc. IgA rất cao trong nước rửa mũi nhưng qua đường tiêm mức IgA không
xác định được. Đối với vacxin cúm gắn chitosan được dùng qua đường mũi
cũng thu được kết quả tương tự khi so sánh với vacxin dùng qua đường tiêm
dưới da. Trong một nghiên cứu khác, vacxin cúm hấp phụ chitosan tạo ra
lượng kháng thể đáng kể trong chuột, có ở cả huyết thanh và lượng IgG sinh
ra. Do đó chitosan có tiềm năng ứng dụng mở rộng cho vacxin DNA dùng qua
đường niêm mạc.(Ill et al, 2001).
Chitosan và các dẫn xuất được sử dụng làm tá chất độ deacetyl hóa phải đạt
75% trở lên. Chitosan sử dụng làm tá chất dưới các dạng vật lý: dung dịch,
dạng bột, dạng đặc biệt hay các hạt nhỏ được tạo ra nhờ các liên kết chéo hoặc
sử dụng các phức hợp đại phân tử mang điện tích trái dấu.
21

Chế phẩm vacxin hấp phụ tá chất chitosan có thể đưa vào cơ thể bằng nhiều
đường khác nhau cả đường miễn dịch cổ điển (tiêm dưới da, tiêm bắp, tiêm
tĩnh mạch) và niêm mạc. Hiện nay chitosan sử dụng làm tá chất cho vacxin sử
dụng bằng xịt qua đường mũi đang nghiên cứu và ứng dụng phổ biến.
I.2.4.2. Hệ tá chất MF-59
MF-59 là hệ nhũ tương dầu trong nước, bao gồm: dầu squalene, chất hoạt
động bề mặt (Tween 80), Span 85. Hệ tá chất MF-59 được phát triển và sản
xuất bởi Chiron, được sử dụng cho vacxin cúm ở Châu Âu trong dịch cúm
2004-2005, hơn một triệu liều đã được phân phối và vacxin được chứng minh
là an toàn, có hiệu quả đáp ứng miễn dịch với vacxin cúm. Nhà sản xuất
Vacxin, Chiron đã và đang sử dụng MF-59 trong vacxin cúm, gọi là Fluad
TM
.
Công ty Novatis (Chiron) đã được cấp bằng chứng nhận (ED 0399843) với tá
chất MF-59 và hơn 120 triệu liều vacxin đã được sử dụng cho dịch cúm mùa
2006-2007 ở châu Âu.[10, 24]
Những nghiên cứu lâm sàng đã chứng minh: MF-59 cải thiện bảo vệ chống

lại virut cúm và làm giảm đáng kể sự lây nhiễm virut trong phổi của chuột.
MF-59 có tác động khả năng ĐƯMD vacxin cúm ở người già, những người
ốm kinh niên và có thể tác động diện rộng đối với những dòng virut không có
trong vacxin. Nó đã được chứng minh có khả năng sinh kháng thể và đáp ứng
miễn dịch tế bào T mạnh hơn so với tá chất nhôm.










Hình 1.4 Sự kết hợp MF-59 với kháng nguyên
Theo Stephenson và cộng sự (2003), Nicholson và cộng sự (2004) MF-59
cho phép duy trì kháng thể và kháng nguyên tăng cường đáp ứng miễn dịch
mạnh hơn so với vacxin không có tá chất. MF-59 cũng tăng cường kháng
nguyên tạo kháng thể trung hòa chéo các virus H5N1 gây bệnh ở người. MF-
59 có tiềm năng mở rộng để sử dụng làm tá chất vacxin an toàn, hiệu quả trên
22

phạm vi rộng của các type vacxin. Đối với con người, MF-59 an toàn và là tá
chất vacxin mạnh đã được cấp phép sử dụng trên 20 quốc gia (Fluad® ).[19]

Mặc dù MF-59 được coi là phụ tá tốt nhất cho bệnh cúm và hứa hẹn những
vacxin mới cho người nhưng cơ chế hoạt động của nó vẫn chưa rõ ràng và hạn
chế của MF-59 là làm đau tại chỗ tiêm, và làm tăng viêm khớp tự miễn ở
những người bị bệnh viêm khớp bẩm sinh. Khi những phân tử Squalene vào

cơ thể qua đường tiêm, thậm chí một lượng nhỏ 10.10
-9
– 20.10
9
nó có thể dẫn
tới phản ứng miễn dịch, viêm khớp tự miễn, phá hoại tế bào da.[18]

23















PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU

24

II.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Thời gian: từ tháng 08-11 năm 2006.
Địa điểm: Phòng Nghiên cứu sinh học phân tử-Viện Vacxin và Sinh phẩm Y
tế, Nha Trang.
II.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu vacxin cúm A/H5N1 hiệu giá 320 HA/ml hấp phụ tá
chất bao gồm các nhóm:
 Nhóm 1: Vacxin cúm A/H5N1 không hấp phụ tá chất.
 Nhóm 2: Vacxin cúm A/H5N1 hấp phụ MF-59.
 Nhóm 3: Vacxin cúm A/H5N1 hấp phụ chitosan.
II.3. VẬT LIỆU
II.3.1. Súc vật thí nghiệm
- Chuột nhắt trắng Swiss, trọng lượng 18-20 g (IVAC).
- Gà trống tơ 6-8 tháng tuổi.

Hình 2.1. Chuột nhắt trắng Swiss làm thí nghiệm
II.3.2. Dung dịch chuẩn và hóa chất
- Dung dịch Al(OH)
3
3 mg/ml.
- Dung dịch TPP- Tripolyphotphate 1mg/ml.
- Bột chitosan: hòa tan trong nước, pH=7-8, trong suốt.
- Tween 80 0.5% v/v
- Span 85 0.5% v/v
- Squalene 5% v/v
- Dung dịch hồng cầu gà 0.5% trong PBS 0.01M.
- Dung dịch Glycerin 0.6% trong nước muối sinh lý.
- Dung dịch Periodat Kali 1/90M.
25

- Dung dịch đệm Phosphate Buffered Saline (PBS) 0.01M, pH 7.2.
- Dung dịch Trypsin 0.4% trong PBS 0.1M.
- Nước muối sinh lý (NaCl 0.9%).
- Dung dịch Alserver
II.3.3. Thiết bị
- Tủ cấy Vi sinh (Woerden- Hà Lan).

- Máy ly tâm lạnh (Mico Centaur OSI).
- Tủ lạnh 2-8
0
C (Sharp, Nhật Bản).
- Tủ lạnh sâu -80
0
C (Sanyo, Nhật Bản)
- Máy khuấy từ (Jenway-Anh).
- Máy đo pH SEIBOLD.
- Tủ ấm (Memmert).
II.3.4. Dụng cụ
- Đầu côn 200 µl, 1000 µl.
- Máng nhựa.
- Micronic tube 1ml.
- Phiến chữ U 96 giếng.
- Pipetman 5-50µl, 20-200 µl, 100-1000 µl.
- Pipetman 8 kênh, 12 kênh (Eppendorf).
- Syringe nhựa 1ml, 3ml.
- Tube nhựa 2ml.
II.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
II.4.1. Quy trình gây miễn dịch
 Quy trình gây miễn dịch
- Gây miễn dịch cho chuột nhắt trắng Swiss, trọng lượng 18-20 g.
- Liều tiêm: 0.2 ml/con (64 HA/con).
- Đường tiêm: tiêm bắp đùi.
- Gây miễn dịch 2 mũi vacxin, mũi thứ nhất cách mũi thứ hai 20 ngày.
- Số lượng súc vật 3 x 30 con/nhóm.