Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và khả năng gây đáp ứng miễn dịch trên gà đẻ trứng của chủng vi khuẩn Streptococcus iniae phân lập từ cá chẽm

i

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG
o0o



NGÔ THỊ GIANG


NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNG
GÂY ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH TRÊN GÀ ĐẺ TRỨNG CỦA CHỦNG
VI KHUẨN Streptococcus iniae PHÂN LẬP TỪCÁ CHẼM


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

GVHD : ThS. NGUYỄN THỊ KIM CÚC
Ths. LÊ NHÃ UYÊN


Nha Trang, tháng 07 năm 2013
i

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang

LỜI CẢM ƠN

Thực tập tốt nghiệp thật sự là cơ hội quan trọng để sinh viên nói chung, sinh
viên chuyên ngành Công nghệ Sinh học nói riêng có thể tiếp cận thực tế nghề
nghiệp, rèn luyện phương pháp nghiên cứu khoa học và hoàn thiện những kỹ năng
thực hành cần thiết trước khi rời khỏi giảng đường đại học. Những kiến thức đúc
kết được sẽ là bước đệm vững chắc, hỗ trợ cho công việc thực tế sau này.
Trong thời gian hoàn thành đồ án tốt nghiệp, ngoài những cố gắng của bản
thân, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của nhiều cơ quan và cá nhân. Với tất cả sự chân
thành và lòng biết ơn sâu sắc tôi xin được gửi lời cảm ơn tới:
Thạc sĩ Nguyễn Thị Kim Cúc và Thạc sĩ Lê Nhã Uyên – giáo viên hướng dẫn,
những người đã định hướng và chỉ bảo tận tình trong suốt thời gian thực hiện đề tài
tốt nghiệp. Cám ơn cô đã giúp cho em có định hướng tốt về cách tư duy khoa học
và học hỏi được nhiều kinh nghiệm nghiên cứu quý giá.
Chị Nguyễn Minh Nhật đã tạo mọi điều kiện cho tôi được học hỏi và thực hiện
đề tài tại Trung tâm Thí nghiệm - Thực hành, Trường Đại học Nha Trang.
Quý thầy cô giáo chuyên ngành Công nghệ Sinh học đã trang bị cho em những
kiến thức cần thiết để làm khóa luận này.
Tôi xin được cảm ơn những người bạn thân yêu của lớp 51CNSH. Tôi đã học
hỏi được nhiều điều từ các bạn trong suốt những năm qua. Tình cảm này tôi sẽ mãi
luôn trân trọng.
Cuối cùng, con xin được gửi lời tri ân sâu sắc nhất đến gia đình. Cám ơn cha
mẹ và anh chị đã luôn bên cạnh động viên con lúc khó khăn và giúp con nên người.
Tôi xin chân thành cám ơn!
Nha Trang, tháng 07 năm 2013
Sinh viên thực hiện

Ngô Thị Giang

ii

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC ii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v
DANH MỤC BẢNG vi
DANH MỤC HÌNH vii
LỜI MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1 Tổng quan về tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới và Việt Nam 3
1.1.1 Tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới 3
1.1.2 Tình hình nuôi cá chẽm ở Việt Nam 3
1.2 Các bệnh thường gặp trên cá chẽm 4
1.2.1 Bệnh do vi khuẩn 4
1.2.2 Bệnh do kí sinh trùng 4
1.2.3 Bệnh do virus 5
1.3 Bệnh do vi khuẩn Streptococcus iniae gây ra trong nuôi trồng thủy sản 5
1.3.1 Tình hình dịch bệnh Streptococcus iniae trong nuôi trồng thủy sản 5
1.3.2 Bệnh do vi khuẩn Streptococcus iniae gây ra trên cá chẽm 6
1.4 Dấu hiệu bên ngoài và giải phẫu bệnh lý bên trong cá chẽm bệnh do
Streptococcosis iniae gây ra 7
1.5 Một số đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn Streptococcus iniae 8
1.6 Biện pháp phòng trị bệnh trên cá chẽm do vi khuẩn Streptococcus iniae gây ra 10
1.7 Tổng quan về đáp ứng miễn dịch ở gà 11
1.7.1 Nguyên lý tạo kháng thể lòng đỏ trứng 11
1.7.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo miễn dịch ở gà 13
1.7.2.1 Kháng nguyên 13
1.7.2.2 Liều lượng tiêm 15

1.7.2.3 Vị trí tiêm 15
1.7.2.4 Số lần tiêm và khoảng cách giữa các lần tiêm 15
iii

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang

1.7.2.5 Tá dược 16
1.7.2.6 Các nhân tố khác 17
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 19
2.2 Vật liệu nghiên cứu 19
2.2.1 Cá chẽm Lates calcarifer 19
2.2.2 Gà mái đẻ trứng 19
2.2.3 Chủng vi khuẩn…………………………………………… …………….19
2.3 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 20
2.4 Phương pháp nghiên cứu 20
2.4.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn 20
2.4.2 Định danh vi khuẩn 21
2.4.3 Xác định độ nhạy kháng sinh của chủng Streptococcus iniae phân lập 23
2.4.4 Phương pháp điện di SDS-PAGE 24
2.4.5 Phương pháp gây miễn dịch trên gà bằng vi khuẩn S. iniae bất hoạt 29
2.4.6 Tách chiết và tinh sạch IgY lòng đỏ trứng gà bằng phương pháp Polson 31
2.4.7 Phương pháp Bradford .32
2.4.8 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 33
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34
3.1 Nghiên cứu đặc điểm của các chủng vi khuẩn Streptococcus iniae phân lập từ cá
chẽm 34
3.1.1 Các dấu hiệu bệnh lý 34
3.1.2 Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập 35
3.1.3 Đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập 36

3.1.4 Kết quả giải trình tự gen 16S-rDNA của các chủng vi khuẩn phân lập 40
3.1.5 Xác định độ nhạy kháng sinh của chủng Streptococcus iniae 40
3.1.6 Kết quả phân tích protein của S. iniae bằng điện di SDS - PAGE 42
3.2 Xác định khả năng sử dụng vi khuẩn S. iniae bất hoạt làm kháng nguyên cho việc sản
xuất kháng thể lòng đỏ trứng 43
iv

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang

3.2.1 Tính vô khuẩn của kháng nguyên bất hoạt 43
3.2.2 Đường cong đáp ứng miễn dịch ở gà (kết quả nồng độ IgY qua các tuần đáp
ứng miễn dịch) 43
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 47
Kết luận 47
Kiến nghị 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO 48
PHỤ LỤC

v

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ANOVA Analysis Of Variance
API 20 Strep Kit định danh các loài streptococci và enterococci
APS Ammonium Persulfate
BA Blood agar
BSA Bovine Serum Albumin
FCA Freund’s Complete Adjuvant.
FIA Freund’s Incomplete Adjuvant
h Giờ
IgY Egg - Yolk Immunoglobulin
NA Nutrient Agar
OD Optical Density
PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis
PBS Phosphate Buffered Saline
PEG Polyethylene Glycol
SDS Sodium Dodecyl Sulfate
TEMED N,N,N,N’– Tetramethylethylenediamine
TSA Trypticase Soy Agar
TSB Trypticase Soy Broth

vi

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Một số đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Streptococcus iniae 9
Bảng 2.1 Thành phần và các dung dịch điện di protein 28
Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm gây tạo miễn dịch trên gà đẻ trứng 30
Bảng 2.3 Phương pháp pha dung dịch BSA dựng đường chuẩn 32
Bảng 3.1 Một số đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập từ cá chẽm 38
Bảng 3.2 Độ nhạy cảm kháng sinh của chủng vi khuẩn S. iniae phân lập từ các
chẽm nuôi tại Cam Ranh – Khánh Hòa 41
Bảng 3.3 Nồng độ IgY tinh sạch từ lòng đỏ trứng ở các tuần sau khi gây miễn dịch
44
Bảng 3.4 ANOVA kiểm định kết quả đáp ứng miễn dịch giữa nhóm gà miễn dịch và
nhóm gà đối chứng 45











vii

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Quá trình hình thành kháng thể sau khi tiêm kháng nguyên 12
Hình 1.2 Tóm tắt kháng thể lòng đỏ trứng được tạo ra bởi miễn dịch thụ động trong
gia cầm 13
Hình 2.1 Gà mái đẻ trứng ISA-Brown 19
Hình 2.2 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 20
Hình 2.3 Cá chẽm Lates calcarifer 21
Hình 2.4 Bộ điện di SDS – PAGE (Bio-Rad)……………………… ……………24
Hình 2.5 Sự hình thành polymer hóa của acrylamide 26
Hình 2.6 Mô hình gel điện di (SDS-PAGE) 27
Hình 3.1 Cá chẽm nhiễm Streptococcus iniae 34
Hình 3.2 Hình dạng khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập trên cá chẽm 35
Hình 3.3 Hình thái vi khuẩn nhuộm Gram 36
Hình 3.4 Hình dạng khuẩn lạc và tế bào của vi khuẩn Streptococcus iniae phân lập
được trên cá chẽm 37
Hình 3.5 Kết quả SDS-PAGE protein của vi khuẩn Streptococcus iniae 42
Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn tương quan giữa nồng độ IgY qua các tuần đáp ứng miễn dịch
44
1

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang

LỜI MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, khi nghề nuôi tôm sú đi vào giai đoạn thoái trào,
thật sự đã tạo một bước ngoặt lớn đối với nghề nuôi cá đặc biệt là cá chẽm. Với
nhiều ưu điểm như tốc độ sinh trưởng khá nhanh, dễ nuôi, năng suất nuôi cao và có
giá trị kinh tế, cá chẽm đã dần là đối tượng nuôi quan trọng ở nhiều vùng của nước

ta. Sự phát triển nghề nuôi cá chẽm gia tăng nhanh chóng cả về quy mô và diện tích
nhưng lại thiếu sự quản lý, quy hoạch cũng như không chú ý đảm bảo yếu tố môi
trường là những điều kiện để dịch bệnh bùng phát, gây thiệt hại lớn đến sản lượng
thu hoạch và nguồn thu kinh tế thủy sản trong thời gian qua.
Trong số các bệnh thường gặp ở cá chẽm (Lates calcarifer) có thể kể đến bệnh
Streptococcosis do các chủng vi khuẩn Streptococcus gây ra. Chúng là những vi
khuẩn hình cầu, có đường kính lên đến 1,5 µm, các tế bào thường ghép với nhau tạo
thành chuỗi liên cầu khuẩn. Những liên cầu khuẩn này thuộc vi khuẩn Gram (+),
không sinh bào tử, không di động và tác động của chúng gây ra thiệt hại rất lớn đến
nghề nuôi cá biển trên thế giới, cũng như tại Việt Nam. Vì vậy, việc nghiên cứu các
chủng vi khuẩn Streptococcus để điều trị bệnh cho cá là điều cần thiết.
Cho đến nay, các biện pháp phòng và chữa bệnh chủ yếu vẫn là sử dụng thuốc
sát trùng, kháng sinh và gần đây là vaccine. Tuy nhiên, thuốc sát trùng thường để lại
hậu quả nghiêm trọng về môi trường. Bên cạnh đó, thuốc kháng sinh cũng có nguy
cơ dẫn đến phá vỡ hệ vi khuẩn chính trong môi trường và có thể để lại dư lượng
trong cá, tạo ra những tác động tiềm ẩn gây nguy hại cho môi trường và con người.
Việc sử dụng vaccine tuy an toàn với con người và môi trường nhưng nó chỉ mang
tính phòng bệnh mà không mang tính chữa bệnh. Trước tình hình đó, cần có các chế
phẩm sinh học không độc, chứa những thành phần có tác dụng ức chế và tiêu diệt
đặc hiệu mầm bệnh gây bệnh. Công nghệ sản xuất kháng thể IgY ở gà đã được
chứng minh có khả năng đáp ứng được các yêu cầu trên do kháng thể IgY từ máu gà
mái được chuyển qua và tích tụ trong lòng đỏ trứng của chúng, nên chỉ cần gây
miễn dịch cho gà mái và thu hoạch trứng có kháng thể. Hơn thế, việc sử dụng kháng
thể trứng gà (IgY) còn cho rất nhiều ưu điểm như dễ dàng thu nhận dựa trên việc
2

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang

thu nhận trứng gà, việc sản xuất IgY rất thuận lợi và kinh tế vì chi phí cho nuôi gà
thấp mà năng suất sản sinh kháng thể rất cao.

Trên thế giới, đã có các nghiên cứu công bố ứng dụng của kháng thể lòng đỏ
trứng (IgY) trong việc phòng và trị bệnh Streptococcosis, nhưng ở Việt Nam việc
ứng dụng kháng thể trứng gà (IgY) trong trị bệnh Streptococcosis vẫn còn rất mới.
Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và khả
năng gây đáp ứng miễn dịch trên gà đẻ trứng của chủng vi khuẩn Streptococcus
iniae phân lập từ cá chẽm”.
Mục tiêu của đề tài:
Nghiên cứu đặc điểm của vi khuẩn Streptococcus iniae gây bệnh ở cá chẽm
nuôi và xác định khả năng sản sinh kháng thể lòng đỏ trứng IgY của gà được miễn
dịch với vi khuẩn S. iniae bất hoạt.
Các nội dung chính của đề tài:
1. Phân lập và xác định một số đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn S. iniae từ cá
chẽm
2. Phân tích protein của chủng vi khuẩn S. iniae phân lập được
3. Xác định khả năng sử dụng vi khuẩn S. iniae bất hoạt làm kháng nguyên cho
việc sản xuất kháng thể lòng đỏ trứng
Vì thời gian thực hiện đề tài có hạn, kiến thức còn hạn chế và bước đầu làm
quen với phương pháp nghiên cứu khoa học nên đồ án khó tránh khỏi những sai sót.
Kính mong các thầy cô cùng bạn đọc đóng góp ý kiến để đồ án được hoàn thiện
hơn.







3

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan về tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới và ở Việt Nam
1.1.1 Tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới
Do giá trị dinh dưỡng cao, nhu cầu thị trường ngày càng mở rộng và là loài
phân bố rộng lại dễ nuôi đã làm cho cá chẽm trở thành một loài có giá trị kinh tế
quan trọng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới thuộc Châu Á Thái Bình Dương. Kỹ
thuật nuôi cá chẽm được phát triển lần đầu tiên ở phòng thí nghiệm Songkhla
Marine (Thái Lan) từ những năm đầu của thập niên 1970. Đến năm 1973 họ đã đạt
được thành công bằng việc sử dụng đàn cá bố mẹ thành thục được bắt ngoài tự
nhiên cho thụ tinh nhân tạo. Tiếp đó kỹ thuật sinh sản nhân tạo được cải tiến và đạt
được thành công, đến năm 1975 họ đã sử dụng đàn cá bố mẹ thành thục trong điều
kiện nuôi cho sinh sản thành công và hoàn thiện các giai đoạn phát triển của vòng
đời cá chẽm trong điều kiện sinh sản nhân tạo. Sau đó, kỹ thuật này được sử dụng
rộng dãi tại các trạm thủy sản và các trạm sản xuất tư nhân khác. Năm 1977, Trạm
Thủy Sản Rayong sử dụng hormone kích thích sinh sản nhân tạo thành công. Sau đó
quy trình sản xuất giống cá chẽm được phát triển rộng và là sản phẩm thương phẩm
của nhiều nước: Thái Lan, Malaysia, Singapore, Indonesia, Hồng Kông, Đài Loan
trong các ao nước lợ, nước ngọt cũng như nuôi trong lồng ở ven biển. Gần đây, kỹ
thuật nuôi cá chẽm được phát triển ở một số quốc gia như Mỹ, Hà Lan và Anh [21].
1.1.2 Tình hình nuôi cá chẽm ở Việt Nam
Ở nước ta, cá biển được nuôi ở cả 3 vùng biển phía Bắc, vùng Nam Trung
Bộ và vùng phía Nam. Các loài nuôi chính là loài cá mú (Epinephelus), cá giò
(Rachycentron canadum), cá hồng đỏ (Lutjanus erythropterus), cá tráp đen
(Rhabdosargus sarba) và cá chẽm (Lates calcarifer). Trong đó, cá chẽm là loài rộng
muối có khả năng chống chịu tốt với những biến động của môi trường. Ở Việt Nam,
cá chẽm được xem như là đối tượng nuôi thay thế cho diện tích nuôi tôm không
hiệu quả ở một số địa phương ven biển ở nước ta. Tuy nhiên, hiện nay chưa có số
liệu thống kê cụ thể về sản lượng cũng như diện tích nuôi cá chẽm ở nước ta, nhưng
4

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang

qua thông tin từ các báo cáo cho thấy cá chẽm được nuôi ở nhiều nơi như Cam
Ranh (Khánh Hòa), Hương Trà (Thừa Thiên Huế), Hà Tĩnh, Bình Định, Cà Mau.
1.2 Các bệnh thường gặp trên cá chẽm
1.2.1 Bệnh do vi khuẩn
Bệnh vibriosis: Vibriosis là bệnh gây nên bởi các vi khuẩn thuộc giống Vibrio,
gây bệnh trên rất nhiều loài cá biển. Khi nhiễm Vibrio, màu sắc cơ thể cá trở nên
tối, cá chán ăn, có vết loét đỏ trên cơ thể, tích dịch ở bụng, bơi bất thường, mắt đục,
bụng có màu đỏ. Bên trong, cơ thể thấy các vùng hoại tử và xuất huyết ở thận, gan
và lách [1].
Bệnh vi khuẩn nhiễm trùng máu xuất huyết: Gây ra bởi Aeromonas spp.,
Pseudomonas sp Các vi khuẩn này thường nhiễm ở cá nước ngọt, làm cá bị xuất
huyết đỏ ở da, lờ đờ, cá biếng ăn, tích dịch ở bụng, mang nhợt nhạt. Bệnh thường
xuất hiện khi môi trường xấu, da bị tổn thương [1].
Bệnh vi khuẩn ở da: Do Aeromonas sorbia, Aeromonas hydorphila, Vibrio
harveyi, Vibrio alginolyticus gây nên, làm cá bị lở loét không đều, mất vảy. Bệnh
thường xảy ra khi môi trường xấu, da bị tổn thương.
Bệnh hoại tử viêm ruột và mưng mủ: Hội chứng hoại tử viêm ruột mưng mủ,
xuất hiện một cách định kỳ ở các trại nuôi cá chẽm. Hội chứng này ảnh hưởng đến
cá cỡ nhỏ tới các cá thể thành thục, gặp ở cá nước ngọt và nước mặn. Người ta phân
lập được Vibrio harveyi và Photobacterium damselae subsp. damselae trên cá bị
bệnh này. Cá bị bệnh thường bụng phình, hôn mê và chết. Điểm đặc trưng của bệnh
là mùi của cá sắp chết hoặc mới chết giống mùi của cá đã chết một ngày, khoang
bụng bị xưng phồng bởi một lượng lớn dịch thủy phân [1].
Bệnh streptococcosis: Streptococcosis là bệnh rất nghiêm trọng, tác nhân
chính của bệnh là Streptococcus iniae. Bệnh có thể xảy ra ở cả cá chẽm nuôi nước
ngọt lẫn nước mặn và kết quả làm cho cá chết với tỷ lệ cao [1], [23].
1.2.2 Bệnh do kí sinh trùng

Bệnh trypanosomosis: là bệnh gây ra bởi Trypanosoma sp Dấu hiệu bệnh là
cá bị hôn mê, mất tập trung, mù mắt và chết. Mắt cũng có thể bị lồi và bị xuất huyết
5

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang

bên trong, đồng thời xuất hiện vùng lở loét xuất huyết và vùng ăn mòn trên da. Bên
trong, thận căng to và tình trạng thiếu máu xảy ra, kết quả làm cho cá chết với tỷ lệ
cao [1].
Bệnh Piscinoodiniasis: Tác nhân gây bệnh là Piscinoodiniasis sp. bệnh thường
gặp ở cá chẽm nuôi nước ngọt. Bệnh xảy ra ở cá nhỏ thì có các vết mờ hoặc màu
xanh bạc, ở cá lớn hơn thì có các mảng nổi trên bề mặt da và có các vết lở loét, nắp
mang hoạt động mạnh, mang tiết dịch và có màu xanh đen [23].
Bệnh Amyloodiniasis: Tác nhân chính là do Amyloodinium ocellatum thường
gặp ở cá chẽm nuôi biển. Bệnh thường xuất hiện khi nhiệt độ thấp và nhiệt độ giảm
đột ngột [23].
Bệnh sán lá da: Gây ra bởi Neobenedinia melleni, Gyrodactylus spp Dấu hiệu
chính của bệnh là mắt mờ, xuất hiện các mảng trắng trên da, lở loét trên da. Bệnh
thường xảy ra ở điều kiện độ mặn cao và nhiệt độ nước thấp [1].
1.2.3 Bệnh do virus
Ở cá chẽm, đã phát hiện được hai virus gây bệnh chính là:
Bệnh virus gây hoại tử thần kinh VNN (Viral Nervous Necrosis): Tác nhân
gây bệnh là nhóm Nodavirus cá. Đặc điểm của bệnh là virus làm thoái hóa các
nơron thần kinh trong hệ thần kinh trung ương và võng mạc. Vì vậy, khi bị nhiễm
virus, cá ở trạng thái mất cân bằng, cơ không kiểm soát được và loạn chức năng thị
giác [1].
Bệnh lymphocytis: Do Iridovirus gây nên. Bệnh làm cho cá xuất hiện các mụn
cóc trên da, vây, thông thường chỉ gây chết nếu xâm nhiễm nhiều và kết hợp với
điều kiện môi trường xấu, giai đoạn cá ấu niên thường dễ mắc bệnh hơn cá trưởng
thành [23].

1.3 Bệnh do vi khuẩn Streptococcus iniae gây ra trong nuôi trồng thủy sản
1.3.1 Tình hình dịch bệnh Streptococcus iniae trong nuôi trồng thủy sản
Streptococcosis là một bệnh truyền nhiễm xảy ra không chỉ ở cá nước ngọt, cá
nước mặn, trong các trại nuôi mà còn thấy ở ngoài tự nhiên. Các chủng Streptococci
gây ra bệnh ở động vật thủy sản là: Lactococcus garvieae, Streptococcus parauberis
6

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang

và Streptococcus iniae. Trong đó, Streptococcus iniae được coi là tác nhân chính
gây bệnh ở động vật thủy sản.
Streptococcus iniae được phân lập đầu tiên vào năm 1976 trên cá heo nước ngọt
vùng Amazon Inia geoffrensis, đến năm 1979 thì phát hiện đầu tiên trên cá nuôi, loài cá
nhiễm bệnh là cá Yellowtail seriola spp. ở Nhật Bản. Streptococcus iniae được xem là
tác nhân gây bệnh trên nhiều ký chủ khác nhau, theo thống kê đến năm 2007 trên thế
giới đã có trên 27 loài cá nước ngọt và nước mặn nhiễm bệnh do vi khuẩn này gây ra.
Các đối tượng nuôi nước mặn được báo cáo thấy xuất hiện như: Yellowtail seriola spp.,
cá bơn ở Nhật Bản Paralichthys olivaceus, cá đù đỏ Sciaenops ocellatus ở Israel, gần
đây là cá chẽm Lates calcarifer ở Australia và cá giò Rachycentron canadum. Bệnh
cũng xảy ra ở một số loài cá nước ngọt như: cá rô phi Oreochromis niloticus x O.
aureus, cá hồi Oncorhynchus mykis. Các quốc gia được thông báo chịu ảnh hưởng
nặng nề bệnh do Streptococcus iniae gây ra như Nhật Bản, Irasel, Mỹ, Australia [9],
[13], [17]. Ở Việt Nam các nghiên cứu về bệnh do Streptococcus iniae gây ra trên đối
tượng thủy sản chưa nhiều, có thấy báo cáo nghiên cứu của Hich và Duzng (2011) về
phân lập được vi khuẩn này trên cá chẽm nuôi ở Khánh Hòa và báo cáo Streptococcus
iniae gây bệnh xuất huyết ở cá rô phi [3], [12].
1.3.2 Bệnh do vi khuẩn Streptococcus iniae gây ra trên cá chẽm
Bệnh do Streptococcus iniae gây ra trên cá chẽm Lates calcarifer được thông
báo xảy ra từ rất sớm vào giữa những năm 1980, Singapore là quốc gia đầu tiên báo
cáo sự xuất hiện bệnh trên cá chẽm, bệnh cũng được thông báo đồng thời trên cá dìa

(Singanus canaliculatus). Tuy nhiên, dịch bệnh gây chết trên cá dìa rất cao nhưng
với cá chẽm tỉ lệ gây chết rất thấp [9], [21].
Trung quốc là nước thứ hai thông báo về bệnh Streptococcosis trên cá chẽm
với tỷ lệ chết từ 16,7 – 32,6 %, tuy nhiên chưa xác định được loài Streptococcus gây
bệnh [9].
Từ năm 1992, Australia thông báo S. iniae gây bệnh vào mỗi mùa hè với thiệt
hại khoảng 8-15% sản lượng cá chẽm nuôi lồng trên biển hàng năm, có thể lên đến
70% khi bệnh bùng phát dữ dội [9], [21].
7

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang

Vào năm 2003 và 2004, Streptococcus iniae cũng được thông báo gây tác
động nghiêm trọng đến nghề nuôi cá chẽm ở khu vực phía Nam Thái Lan [19].
Năm 1992, Úc thông báo về tác nhân gây bệnh liên cầu khuẩn trên cá chẽm
nuôi, trong thời gian rất ngắn số lượng cá chết tăng lên và tác nhân này được xem
như loài vi khuẩn quan trọng nhất ảnh hưởng đến chất lượng nuôi cá chẽm ở
Queensland [9].
1.4 Dấu hiệu bên ngoài và giải phẫu bệnh lý bên trong cá chẽm bệnh do
Streptococcus iniae gây ra
Dấu hiệu điển hình do Streptococcus iniae gây ra trên cá chẽm, gồm có: Màu
sắc đen tối, cá có biểu hiện bơi lội không bình thường, mắt cá lồi và đục, xuất huyết
ở các vây và xương nắp mang. Các vết xuất huyết lan rộng thành lở loét, nhưng các
vết loét thường nông hơn các bệnh có lở loét khác. Cá bị bệnh vận động khó khăn,
bơi không định hướng hay có hình thức bơi xoắn [1].
Bên trong cơ thể cá bệnh có sự tổn thương nội quan, như: Ở thận, vi khuẩn
được tìm thấy trong mô và trong các tế bào máu ở tiền thận, trong cầu thận và
những tế bào biểu mô ống thận. Ở lách, vi khuẩn xuất hiện thành từng đám ở màng
ngoài lách và trong những tế bào máu ở khu vực của lách. Đó là lý do dẫn đến sự
tăng lên về thể tích tại hai cơ quan thận và lách. Tại một số cơ quan khác: vi khuẩn

xuất hiện nhiều tại các mao mạch ở mô gan, cấu trúc gan xuất hiện nhiều không
bào, xung huyết và thoái hóa một số khu vực. Ở ruột, vi khuẩn xuất hiện trong
thành ruột, trong mạch máu dưới biểu mô và lớp nhầy trên bề mặt biểu mô ruột. Tại
não, vi khuẩn xuất hiện ở khu vực màng não, hốc não và một số tế bào máu trong
não; mô não có hiện tượng xung huyết nghiêm trọng. Tại mắt, vi khuẩn xuất hiện
trên lớp nhân ngoài của võng mạc mắt; dẫn đến mắt cá bị đục và lồi. Thường thì sự
tổn thương nội quan này là lý do gây chết ở cá, với tỷ lệ gây chết rất cao. Trường
hợp này gọi bệnh ở dạng cấp tính. Tuy nhiên, bệnh có thể xảy ra ở thể nhẹ (mãn
tính), chỉ có một vài nốt xuất huyết trên thân mà không có hiện tượng thương tổn
nội tạng, ở dạng này tỷ lệ chết cá rất thấp, chỉ chiếm 1% [3], [22].

8

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang

1.5 Một số đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn
Streptococcus iniae
Streptococcus iniae là một loài vi khuẩn thuộc giống Streptococcus.
Streptococcus gồm vài loài được xác định là tác nhân gây bệnh trên nhiều ký
chủ, bao gồm: Streptococcus difficile, S. parauberis, S. iniae. Ngoài ra còn
một số loài vi khuẩn có quan hệ họ hàng gần gũi với Streptococcus và cũng
gây ra các triệu chứng bệnh tương tự như: Lactococcus garvieae,
Lactococcus piscium và Vagococcus salmoninarum. Tất cả chúng gây ra hội
chứng bệnh có tên là bệnh do liên cầu khuẩn (Streptococcosis) [9].
Streptococcus iniae cùng với vi khuẩn Lactococcus garvieae là những
tác nhân gây bệnh chủ yếu của bệnh Streptococcosis ở cá, theo ước tính nó
là nguyên nhân gây ra 50% số cá chết trong tháng đầu của vụ nuôi và tới
80% số cá nuôi bị tổn thất khi kết thúc vụ nuôi, đặc biệt nghiêm trọng nếu
bệnh xảy ra vào những tháng mùa lạnh.
Streptococcus iniae có dạng hình cầu, có thể đứng riêng lẻ, thành từng cặp

hoặc tạo thành chuỗi dài. Vi khuẩn S. iniae bắt màu Gram dương, phát triển
tốt trên môi trường thạch TSA, BHI, Muller - Hinton và thạch máu cừu.
Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp từ 25 - 28
0
C. Sau 24 - 48h nuôi cấy, vi khuẩn
tạo thành khuẩn lạc nhỏ, màu trắng đục. Một số chủng cho khuẩn lạc trong
suốt có tính nhầy sau 24h nuôi cấy. Trên môi trường thạch máu, khuẩn lạc
tạo vòng dung huyết beta nhỏ, trong suốt. Vi khuẩn không phát triển ở điều
kiện pH 9,6; NaCl 6,5%; nhiệt độ 10
0
C và 45
0
C [9], [10], [20].
S. iniae lên men đường mannitol, ribose và không lên men lactose,
raffinose, arabinose. Về đặc điểm sinh hóa S. iniae cho phản ứng catalase,
Oxydase, VP Và Indol âm tính [9]. Dựa theo các nghiên cứu trước đó, các
đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Streptococcus iniae được thể hiện trong
Bảng 1.1.


9

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang

Bảng 1.1 Một số đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Streptococcus iniae [9], [20]
Đặc điểm
Perera
và các
cộng sự
(1994)

Pier
và các
cộng sự
(1976)
Carson
và các
cộng sự
(1993)
Stoffregen

và các
cộng sự
(1995)
Nhuộm Gram
+ + + +
Hình dạng tế bào Cầu, liên
cầu
Cầu, liên
cầu
Cầu, liên
cầu
Cầu, liên
cầu
Sinh Catalase - - - -
Sinh Oxidase - - - -
Voges Proskauer (VP)
- - ND -
Dung huyết (5% máu cừu) β β ND β
Môi trường BHIA + + +
TSA + + +

TSB + + +
BA + + +
Nhiệt độ sinh
trưởng
10
0
C + + + ND
27
0
C +
35
0
C +
NaCl 6,5% - + +
Hippurate (HIP) - - - -
Esculin (ESC) - + + +
Pyrrolidonyl acrylamidase ND +
α–Galactosidase (α-GAL) ND ND
β-Glucuronidase (β-GUL) ND ND
β – Galactosidase (β-
GAL)
ND ND
Alkalin Phosphatase
(PAL)
ND ND
Leucine Aminopeptidase
(LA)
ND ND
L-arginie (ADH) + ND + ND
D-ribose (RIB) ND ND

L-arabibose (ARA) - - - -
D-manitol (MAN) + + + +
D-sorbitol (SOR) - - - -
D-lactase - - - -
D-trehalose + + + +
Inulin - - - -
D-raffinose - - - -
Starch (AMD)
+ + ND
Glycogen (GLYG)
- - ND
10

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang

1.6 Biện pháp phòng trị bệnh trên cá chẽm do vi khuẩn Streptococcus iniae
gây ra
Trong quá trình nuôi thì việc phòng bệnh rất quan trọng vì tránh được rủi ro
lớn cho người nuôi. Việc phòng bệnh được thực hiện như sau:
- Luôn giữ môi trường ao nuôi sạch, tránh ô nhiễm làm cá dễ bị nhiễm bệnh
- Sử dụng thức ăn tươi hoặc thức ăn hỗn hợp qua chế biến, không cho ăn thức ăn
ôi thiu, ươn
- Định kỳ thay nước ao nuôi, khoảng 10 – 15 ngày/lần hoặc 2 tháng dùng thuốc
tím (K
2
MnO
4
) với nồng độ 1 – 5 ppm phun xuống ao với thời gian 20 -30 phút
- Khi phát hiện cá có dấu hiệu bệnh, cần vớt cá nuôi cách ly để có biện pháp xử lý
phù hợp

- Tất cả cá bị bệnh, bị chết đều phải vớt lên và xử lý tiệt trùng, không vứt bừa bãi
trách tạo sự lây lan nguồn bệnh cho ao khác
Việc phòng bệnh chỉ giúp giảm nguy cơ mắc bệnh, nhưng khi trong môi
trường nuôi có tác nhân gây bệnh và gặp điều kiện thuận lợi cho nó thì tác nhân gây
bệnh sẽ phát triển rất mạnh và làm gia nguy cơ mắc bệnh cho vật nuôi. Hiện nay
biện pháp chủ yếu vẫn đang được dùng để tiêu diệt vi khuẩn trong môi trường nuôi
là sử dụng thuốc kháng sinh. Một số loại kháng sinh được dùng để tiêu diệt vi
khuẩn Streptococcus iniae gây bệnh trên cá như:
 Dùng Erythromycine: trộn vào thức ăn từ 3 - 7 ngày, dùng 2-5 g/100 kg cá/ngày.
Có thể phun xuống ao với nồng độ 1 - 2 ppm sau đó qua ngày thứ 2 trộn vào thức
ăn 4 g/100 kg cá, từ ngày thứ 3 - 5 giảm bớt 1/2.
 Dùng Minoxin - FH: là dung dịch kháng sinh thế hệ mới, với phổ kháng khuẩn
rộng chuyên dùng để phòng ngừa và điều trị các bệnh xuất huyết, phù mắt, hoại
tử gan do Streptococcus sp.
Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc kháng sinh gây ảnh hưởng trực tiếp đến sức
khỏe người sử dụng, ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm do dư lượng hóa chất vẫn
còn trong sản phẩm. Hơn thế, sử dụng kháng sinh còn ảnh hưởng đến chất lượng
nước và bùn đáy ao, tác động đến cấu trúc và tính đa dạng sinh học. Tồn lưu trong
11

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang

môi trường tác động đến hệ vi sinh vật trong môi trường và đưa đến các dòng vi
khuẩn kháng thuốc.
Ngoài thuốc kháng sinh, hiện nay trên thị trường cũng đã có Vaccine để phòng
bệnh Streptococcosis do Streptococcus iniae gây bệnh. Tuy nhiên, việc sử dụng
Vaccine gây ảnh hưởng lớn đến tính kinh tế, hơn nữa nó chỉ có tác dụng phòng
bệnh và khi trong ao nuôi có sự xuất hiện bệnh thì việc sử dụng vaccine không còn
hiệu quả.
Do đó, việc sử dụng chế phẩm sinh học nhằm hạn chế tối đa sử dụng kháng

sinh trong việc phòng và trị bệnh thủy sản là khuynh hướng đúng nhằm tránh tạo ra
các dòng vi khuẩn kháng thuốc ảnh hưởng đến sức khỏe vật nuôi và con người.
Trên thế giới, ứng dụng của công nghệ sản xuất kháng thể IgY ở gà đang được rất
nhiều các nhà nghiên cứu quan tâm và đã có báo cáo công bố về ứng dụng kháng
thể lòng đỏ trứng IgY trong việc phòng và trị bệnh Streptococoosis [18].
1.7 Tổng quan về đáp ứng miễn dịch ở gà
1.7.1 Nguyên lý tạo kháng thể lòng đỏ trứng
Gà mái bảo vệ thế hệ con bằng cách truyền kháng thể sang thông qua giai
đoạn sớm của trứng. Như vậy, gà mới nở được bảo vệ bởi cơ chế miễn dịch thụ
động cho đến khi hệ thống miễn dịch của chính chúng phát triển một cách đầy đủ.
Tương tự như động vật hữu nhũ, ở gà khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể,
kháng thể chưa được sinh ra ngay lập tức mà phải sau một thời gian tiềm tàng (thời
gian ngắn hay dài phụ thuộc nhiều vào kháng nguyên, lần kháng nguyên xâm nhập
lần đầu hay lần 2, lần 3…). Sau đó kháng thể mới được sinh ra, lượng kháng thể
tăng dần đạt mức cao nhất sau 2 – 3 tuần, rồi lượng kháng thể có thể giảm hoặc mất
đi (Hình 1.1).
Kháng nguyên vào cơ thể lần đầu gây đáp ứng miễn dịch gọi là đáp ứng miễn
dịch thứ cấp hay miễn dịch tiên phát. Kháng nguyên vào cơ thể lần hai, đáp ứng
miễn dịch gọi là đáp ứng miễn dịch thứ cấp hay miễn dịch thứ phát.

12

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang


Hình 1.1 Quá trình hình thành kháng thể sau khi tiêm kháng nguyên [3]
Khi kháng nguyên vào lần 2 thời gian tiềm tàng ngắn hơn, lượng kháng thể
sản xuất ra nhiều hơn và thời gian xuất hiện kháng thể sớm hơn. Sự khác biệt của
đáp ứng miễn dịch sơ cấp và thứ cấp là do vai trò của các tế bào nhớ miễn dịch
lympho bào T “nhớ”, lympho B “nhớ”. Ở miễn dịch thứ phát các tể bào “nhớ”

miễn dịch phát triển nhanh và mạnh tạo ra một lớp tế bào sản xuất kháng thể đặc
hiệu vì thế kháng thể xuất hiện sớm hơn, cường độ đáp ứng miễn dịch dài hơn,
mạnh hơn.
Kháng thể ở gà gồm có ba loại: IgA, IgM và IgY. Khi trứng gà vẫn còn
trong buồng trứng, gà mái tiến hành chuyển kháng thể vào trứng theo cơ chế sau:
IgA và IgM (nồng độ khoảng 0,15 và 0,7 mg/mL) được tiết ra cùng với những
protein khác là thành phần của lòng trắng trứng gà tại vòi trứng. Trong khi đó,
IgY trong huyết thanh ở nồng độ khoảng 25 mg/ml được chuyển một cách đặc
hiệu sang màng lòng đỏ vào trong lòng đỏ trong suốt quá trình phát triển. Vì
receptor đặc hiệu cho việc chuyển IgY xuất hiện trên bề mặt của màng lòng đỏ.
Ở gà con mới nở, IgY được tìm thấy trong máu, còn IgA và IgM trong đường
tiêu hóa.
13

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang


Hình 1.2 Tóm tắt kháng thể lòng đỏ trứng được tạo ra bởi miễn dịch thụ động trong
gia cầm [11]
Dựa trên các nguyên lý này, muốn thu kháng thể đặc hiệu thì tiến hành gây
miễn dịch trên gà mái. Sau khi bị tiêm kháng nguyên thì gà mái sẽ tự động tạo ra
IgY đặc hiệu cho kháng nguyên quan tâm. IgY đặc hiệu này sẽ được chuyển vào
trong lòng đỏ trứng gà. Tiến hành thu nhận lòng đỏ trứng của gà miễn dịch sẽ thu
được kháng thể đặc hiệu mong muốn (Hình 1.2).
1.7.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo miễn dịch ở gà
1.7.2.1 Kháng nguyên
Tất cả các chất sinh miễn dịch đều là kháng nguyên, song một số chất được
coi là kháng nguyên nhưng không gây đáp ứng miễn dịch. Ví dụ hapten là các chất
có khối lượng phân tử thấp có thể gắn với kháng thể đặc hiệu nhưng bản thân nó
không kích thích tạo kháng thể. Hapten bao gồm các phân tử đường, axit amin, các

polyme nhỏ và nhiều loại kháng sinh.
Để là một chất sinh miễn dịch bắt buộc phải thỏa mãn ba yếu tố sau đây:
14

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang

 Tính lạ: Chất được gọi là kháng nguyên trước hết phải là một chất lạ với cơ
thể, bởi vì bình thường cơ thể không đáp ứng bảo vệ với các chất của bản thân.
Chất càng lạ với cơ thể bao nhiêu, khả năng kích thích tạo kháng thể càng
mạnh bấy nhiêu.
 Khối lượng phân tử lớn: Nhìn chung kháng nguyên có khối lượng phân tử lớn
hơn 10000 Da. Nếu < 1000 Da (penicilin, progesteron, aspirin…) thì không có
tính sinh miễn dịch. Từ 1000 đến 6000 Da (insulin) có thể có hoặc không có
khả năng đáp ứng miễn dịch.
 Cấu trúc phân tử phức tạp: Một chất có tính sinh miễn dịch phải là chất có cấu
trúc hóa – lí tương đối phức tạp. Các chất có cấu trúc càng phức tạp thì tính
sinh miễn dịch càng cao.
Kháng nguyên có thể hiện diện với hệ thống miễn dịch là phức hợp kháng
nguyên (ví dụ: vi khuẩn, virus và kí sinh vật) hay là kháng nguyên đơn giản (ví dụ:
protein hay polysaccharide). Proteins được nhận diện là kháng nguyên hiệu quả bởi
vì cấu trúc và sự khác biệt xuất hiện giữa các loài và các cá thể. Peptide (khối lượng
phân tử thấp dưới 10 kDa) có thể được sử dụng là kháng nguyên, nhưng nó nên
được kết hợp với chất mang (ví dụ bovine serum albumin hay keyhole limpet
haemocyanin). Kháng nguyên polysaccharide cũng hiệu quả. Tuy nhiên, lipid và
nucleic acid không thể là kháng nguyên nếu chúng không được bắt cặp với protein
hay polysaccharide [11].
Sự liên kết giữa kháng nguyên với kháng thể hay giữa kháng nguyên với tế
bào lympho luôn mang tính đặc hiệu cao. Kháng thể hay tế bào lympho không phải
liên kết với toàn bộ phân tử kháng nguyên mà chỉ với những phần nhất định của
kháng nguyên, gọi là quyết định kháng nguyên hay epitope. Phần tương ứng với nó

trên mỗi kháng thể gọi là vị trí kết hợp kháng nguyên hay paratope. Phần tương ứng
với quyết định kháng nguyên nằm trên tế bào lympho gọi là thụ thể. Kích thước của
epitope khoảng 7 x 12 x 35 A
o
gồm 5 - 7 axit amin. Một kháng nguyên có nhiều
epitope khác nhau sẽ tạo thành nhiều dòng kháng thể khác nhau tương ứng với từng
epitope.
15

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang

1.7.2.2 Liều lượng tiêm [11]
Liều lượng của kháng nguyên ảnh hưởng rất nhiều đến đáp ứng miễn dịch.
Quá nhiều hay quá ít kháng nguyên có thể dẫn đến sự giảm bớt, độ nhạy, sức chịu
và những đáp ứng không mong muốn khác. Behn và cộng sự (1996) đạt được những
kết quả tốt hơn khi tiêm vào gà với 0,1 mg của IgG chuột, thay vì 1,0 mg.
Schwarzkof và cộng sự (2000) thấy rằng việc tiêm nồng độ kháng nguyên trong
khoảng giữa 10 µg và 1 mg tạo ra đáp ứng miễn dịch tốt, và điều này cũng được báo
cáo bởi các nhà khoa học khác.
Liều lượng tiêm phù hợp phụ thuộc rất nhiều vào loại kháng nguyên. Nếu
kháng nguyên là protein thì lượng protein khoảng 10 - 100 µg protein nên được sử
dụng.
1.7.2.3 Vị trí tiêm
Có nhiều cách tiến hành thực hiện miễn dịch như là tiêm trong tĩnh mạch; tiêm
ở bụng; tiêm dưới da. Tiến trình tiêm trong tĩnh mạch không được khuyến khích
dùng và không thể sử dụng cho kháng nguyên đặc biệt hay tá dược đặc biệt. Vì mục
đích thực nghiệm và lý do kinh tế, gà thường được tiêm vào trong cơ ngực. Trong
phòng thí nghiệm, gà có thể tiêm vào dưới da cổ, dưới da cánh. Với động vật còn
non, thích hợp cho việc tiêm vào trong cơ của cơ ngực, bởi vì tiêm dưới da thường
khó thực hiện hơn và có thể gây ra stress. Việc tiêm vào trong cơ dưới chân cần

tránh, vì chúng có thể dẫn đến việc đi khập khiễng [4].
Gần đây, phương pháp miễn dịch bằng đường miệng cũng thu hút nhiều sự
chú ý. Mặc dù khả năng kích thích theo miễn dịch theo đường miệng là thấp hơn
nhiều so với phương pháp tiêm. Tuy nhiên, miễn dịch bằng đường miệng thường
được xem là bớt gây đau hơn cho động vật, và được xem là sự tiến bộ trong các
phương thức miễn dịch tạo kháng thể. Phương pháp này được thực hiện bằng cách
đưa hỗn hợp kháng nguyên và tá dược qua đường miệng và qua đường mũi họng.
1.7.2.4 Số lần tiêm và khoảng cách giữa các lần tiêm
Tổng số lần tiêm phụ thuộc vào loại và liều lượng kháng nguyên, cũng như tá
dược được sử dụng. Trong mọi trường hợp, phải có ít nhất hai lần miễn dịch. Nếu
16

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang

lượng kháng thể bắt đầu giảm thì nên gây tạo miễn dịch để duy trì kháng thể đặc hiệu
luôn ở mức độ cao. Kháng thể lòng đỏ nên được kiểm tra sau 14 ngày của lần miễn
dịch sau cùng. Nếu lượng kháng thể quá thấp, sẽ tiếp tục thực hiện lại việc tiêm.
Thường những kết quả báo cáo cho thấy khoảng cách lần tiêm thứ nhất và thứ hai và
những lần tiêm tiếp theo nên tiến hành sau 2 đến 4 tuần sẽ cho hiệu quả cao [11].
1.7.2.5 Tá dược
Tác dụng của tá dược
Khái niệm tá dược được nghĩ ra bởi Ramon năm 1925. Những chất được sử
dụng đầu tiên là tinh bột, agar và saponin là tá dược cơ bản. Tá dược là chất kích
hoạt miễn dịch có tác dụng củng cố việc sản xuất của kháng thể đa dòng. Mặc dù sự
kích hoạt này diễn ra độc lập với loại kháng nguyên và vì vậy không đặc hiệu,
nhưng nó làm tăng chất lượng và tính đặc hiệu của đáp ứng miễn dịch. Con đường
chính xác trong đó thể hiện hoạt động của chúng chưa được hiểu rõ toàn bộ. Chúng
làm tăng cả đáp ứng miễn dịch dịch thể và tế bào và tạo ra nhớ miễn dịch. Tá dược
kéo dài sự giải phóng của kháng nguyên vì vậy tạo nên hiệu quả cũng như tạo nên
kích thích nội bộ sau khi miễn dịch.

Tá dược có thể ảnh hưởng toàn bộ hay một phần lên thành phần trong suốt đáp
ứng miễn dịch. Tế bào T bị kích hoạt muramyldipeptide (MDP) là một thành phần
của thành tế bào của mycobacteria có tiềm năng tạo miễn dịch mạnh. Mặt khác tế
bào B được kích hoạt mạnh bằng lipopolysaccharide [4].
Điểm bất lợi của việc sử dụng tá dược được chứng minh là có tác dụng phụ,
nên những nghiên cứu mở rộng tìm kiếm chất thay thế bắt đầu. Những tác dụng phụ
sau đây có thể ít hoặc không có: Sự đau u hạt dẫn đến sưng viêm có thể dẫn đến sự
di căn; Tác động gây ung thư ngẫu nhiên; Nguy cơ gây ra dị ứng trong trường hợp
sử dụng lặp lại; Tác động ngược lên chất lượng thịt nếu sử dụng động vật trang trại.
Tá dược Freund (Freund adjuvant)
Ngày nay, có rất nhiều loại tá dược được sản xuất. Tuy nhiên, trong số này tá
dược Freund vẫn được sử dụng nhiều nhất. Tá dược Freund có hai dạng là hoàn
toàn (FCA) và không hoàn toàn (FIA). Tuy FCA làm tăng hiệu quả miễn dịch tốt
17

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang

hơn FIA nhưng cũng dễ gây ra phản ứng phụ hơn ví dụ gây viêm tại vùng mô tiêm.
Vì vậy, một số nghiên cứu thích sử dụng kết hợp hai loại tá dược: FCA cho lần
miễn dịch nguyên phát và FIA cho lần miễn dịch thứ phát [11].
Tá dược Freund dạng hoàn toàn (FCA) là hệ nhũ hóa dầu trong nước, bao
gồm: dầu khoáng, mannide mono-oleate, và Mycobacterium tuberculosis đã giết
chết bởi nhiệt (hay M. butycium) hay một số thành phần của vi sinh vật này. FCA là
tá dược kích hoạt cả miễn dịch thể dịch và miễn dịch tương tác tế bào. FCA thường
phản ứng mạnh vì dầu khoáng không thể chuyển hóa và thành phần vi nấm có thể
tạo ra một vài phản ứng viêm. Nồng độ của vi nấm thay đổi lớn trong FCA thương
mại. Về phần này, cần chú ý rằng nếu nồng độ của vi nấm mà ít hơn 0,5 mg/ml thì
kết quả phản ứng xưng viêm sẽ ít nghiêm trọng hơn.
Tá dược Freund dạng không hoàn toàn (FIA) có thành phần giống như FCA
nhưng không có tế bào vi nấm hay thành phần tế bào. FIA thì ít hiệu quả hơn so với

FCA trong việc tạo ra kháng thể cao hơn và tạo giữ miễn dịch tương tác tế bào. FIA
thường được dùng cho các lần miễn dịch thứ phát.
1.7.2.6 Các nhân tố khác
Barua (2000) xác định hiệu quả của tuổi và việc xử lý estrogen lên nồng độ
IgY trong lòng đỏ trứng gà Gallus domesticus. Nồng độ IgY trong gà mới đẻ trứng
cao hơn gà đẻ trứng già. Do cá thể trưởng thành hệ thống cơ quan, tế bào miễn dịch
hoàn thiện cho đáp ứng miễn dịch mạnh và lượng kháng thể sinh ra nhiều hơn. Khi
cá thể già cơ quan miễn dịch suy giảm làm giảm đáp ứng miễn dịch tế bào nên
lượng kháng thể tạo ra giảm [2].
Li (1998) so sánh trọng lượng của lòng đỏ và lòng trắng với phần trăm gà sản
xuất hằng ngày và kháng thể lòng đỏ (IgY) sản xuất ở Single-Comb White Leghorn
(SCWL) và Rhode Island Red (RIR) được miễn dịch với huyết thanh albumin của
bò (BSA). Phần trăm của tổng IgY cũng như kháng thể đặc hiệu cho BSA được sản
xuất ra trong trứng là tương đương nhau. Tuy nhiên, gà SCWL sản xuất ra trứng có
khối lượng lòng đỏ cao hơn và phần trăm gà đẻ trong ngày cao hơn [4].