Nghiên cứu thu nhận Theobromin thô từ vỏ quả ca cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TR















 CAO




Chuyên Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Nha Trang, năm 2013

ii
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TR















 CAO




Chuyên Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

GVHD: ThS. 





Nha Trang, năm 2013
i



Họ và tên sinh viên: Nguyễn Hữu Tuấn
MSSV: 51131851
Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm
Tên đề tài: 













Nha Trang, ngày tháng năm 2013

GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN
(Ký và ghi rõ họ tên)

ii
LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Nhà trƣờng, Ban Chủ nhiệm
khoa Công nghệ Thực phẩm, phòng Khoa học Công nghệ đã xét duyệt cho phép em
đƣợc thực hiện đề tài nghiên cứu khoa học: “Nghiên cứu thu nhận Theobromin thô
từ vỏ quả ca cao”. Sau hơn 12 tháng (từ tháng 5 năm 2012 đến tháng 5 năm 2013)
thực hiện nghiên cứu dƣới sự hƣớng dẫn hết sức tận tình của Thầy Nguyễn Văn
Tặng em đã hoàn thành đề tài nghiên cứu và cùng với đồ án tốt nghiệp này.
Em xin trân trọng cám ơn thầy Nguyễn Văn Tặng đã hết lòng hƣớng dẫn,
truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm, luôn động viên em những lúc khó khăn
nhất để em có thể vƣợt qua và hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học và đồ án
tốt nghiệp này.
Em xin chân thành cảm ơn quý các thầy cô khoa Công nghệ Thực phẩm
đã truyền đạt cho em kiến thức và nhiều lời khuyên quý báu trong suốt thời gian
học tập tại trƣờng.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô Trung tâm Thí nghiệm– thực hành,
các thầy cô quản lý các phòng thí nghiệm đã quan tâm, hỗ trợ và tạo điều kiện
thuận lợi nhất để em thực hiện nghiên cứu của mình tại các phòng thí nghiệm.
Em chân thành cảm ơn sự động viên giúp đỡ của gia đình và tất cả các bạn.
Trong suốt thời gian thực hiện nghiên cứu tại các phòng thí nghiệm Trƣờng
Đại học Nha Trang, mặc dù gặp rất nhiều khó khăn, thử thách nhƣng đƣợc sự giúp
đỡ, ủng hộ, động viên của gia đình, thầy cô, bạn bè đã giúp em hoàn thành đề tài
của mình.
Nha trang, tháng 6 năm 2013
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Hữu Tuấn

iii


 ii
 iii
 v
 vi
 vi
 1
 2
1.1  2
1.1.1  2
1.1.1.1 Nguồn gốc và đặc điểm hình thái của cây ca cao 2
1.1.1.2 Phân loại giống 3
1.1.1.3 Thu hái và chế biến 5
1.1.1.4 Cấu tạo và thành phần của quả ca cao 6
1.1.1.5 Tình hình sản xuất và tiêu thụ ca cao trên thế giới 7
1.1.1.6 Tình hình sản xuất ca cao trong nƣớc 7
1.1.2  8
1.1.2.1 Tính chất hóa học và lý học 8
1.1.2.2 Tính dƣợc lý 9
1.1.2.3 Các phƣơng pháp định lƣợng Theobromin 9
1.1.3  11
1.1.3.1 Bản chất của quá trình trích ly 11
1.1.3.2 Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình trích ly 13
1.1.3.3 Phân loại các phƣơng pháp trích ly 15

1.1.3.4 Lựa chọn dung môi cho quá trình trích ly 15
1.2   16
1.2.1  16
1.2.2  19
:  22

iv
2.1  22
2.2  22
2.2.1  22
2.2.2  22
2.2.2.1 Quy trình nghiên cứu dự kiến 22
2.2.2.2 Thuyết minh quy trình 22
2.2.2.3 Bố trí thí nghiệm 24
a. Bố trí thí nghiệm xác định thành phần khối lượng và thành phần hóa
học của vỏ quả ca cao 24
b. Bố trí thí nghiện lựa chọn dung môi trích ly 25
c. Bố trí thí nghiệm lựa chọn thời gian trích ly 27
d. Bố trí thí nghiệm xác định số lần trích ly 27
2.2.2.4 Phƣơng pháp phân tích HPLC-UV . 29
2.3
Png pháp x lý s li
u
30
 31
3.1  31
3.2  32
3.3 Kt  xác  dung môi  Theobromin thô t   ca c
a
o 33

3.4  35
3.5  37
3.5.1  37
3.5.3  37
3.5.3 ca cao: 38
 39
4.1  39
4.2  39
 40
 44

v



STT

TRANG
1
Hình 1.1 Cây ca cao
2
2
Hình 1.2 Giống Criollo
4
3
Hình 1.3 Giống Forastero
4
4
Hình 1.4 Giống Trinitario
5

5
Hình 1.5 Cấu tạo giải phẫu của quả ca cao
6
6
Hình 1.6 Công thức cấu tạo của Theobromin
8
7
Hình 1.7 Sơ đồ quy trình dự kiến chiết xuất Theobromin thô từ vỏ quả ca cao
23
8
Hình 1.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thành phần khối lƣợng
và thành phần hóa học của vỏ quả ca cao
25
9
Hình 1.9 Sơ đồ bố trí thí nghiện lựa chọn dung môi trích ly
Theobromin thô từ vỏ quả ca cao
26
10
Hình 1.10 Sơ đồ bố trí thí nghiệm lựa chọn thời gian trích ly
Theobromin thô từ vỏ quả ca cao
28
11
Hình 1.11 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định số lần trích ly
29
15
Đồ thị 2.1 Xây dựng đƣờng chuẩn Theobromine.
32
16
Đồ thị 2.2 Sắc ký đồ Theobromine của mẫu chuẩn.
33

17
Đồ thị 2.3 Sắc ký đồ Thebromine của mẫu phân tích.
33
18
Đồ thị 2.4 Kết quả lựa chọn dung môi.
34
19
Đồ thị 2.5 Kết quả xác định thời gian, số lần trích ly.
35
24
Hình 2.1 Sơ đồ quy trình chiết xuất Theobromin thô từ vỏ quả ca cao.
38







vi


STT

TRANG
1
Bảng 1.1 Thành phần hóa học của lớp vỏ cứng (shell).
6
2
Bảng 1.2 Thành phần hóa học của lớp vỏ thịt (pulp).

6
3
Bảng 2.1 Thành phần khối lƣợng của quả ca cao tƣơi.
31
4
Bảng 2.2 Thành phần hóa học của vỏ quả ca cao.
31
5
Bảng 2.3 Chi phí sản xuất 20g Theobromin thô từ vỏ quả ca cao.
38
6
Bảng 2.4 Kết quả phân tích Theobromin bằng phƣơng pháp
HPLC-UV lựa chọn dung môi trích ly.
44
7
Bảng 2.5 Kết quả phân tích Theobromin bằng phƣơng pháp HPLC-
UV lựa chọn thời gian và số lần trích ly.
44



- HPLC: High-Performance Liquid Chromatography
- HPLV-UV: High-Performance Liquid Chromatography with Ultraviolet
- L: lít
- NIRS: Near Infrared Reflectance Spectroscopy
- UIPAC: International Union of Pure and Applied Chemistry
1


1. 

Trong công nghiệp sản xuất ca cao thì chỉ có hạt ca cao là nguồn ca cao
thƣơng mại, còn vỏ ca cao thì thải bỏ ra môi trƣờng bên ngoài, gây ô nhiễm môi
trƣờng, tác động xấu đến đời sống con ngƣời. Hơn nữa, cây ca cao là công nghiệp
có giá trị kinh tế cao, do đó nhu cầu sản xuất hạt ca cao ngày càng tăng thì lƣợng
phế phẩm thải ra môi trƣờng ngày càng nhiều dẫn đến vấn đề ô nhiễm môi trƣờng
ngày càng tăng lên.
Trong vỏ ca cao có chứa chất Theobromin, chất có khả năng làm tăng sức
chịu đựng của tim, điều hoà huyết áp, tăng cƣờng hoạt động của hệ tuần hoàn,
chúng đƣợc tìm thấy trong hợp chất chữa bệnh tim cho ngƣời, đƣợc ứng dụng nhiều
trong y học.
Do đó, nghiên cứu thu hồi Theobromin từ phế liệu vỏ quả ca cao để thu
Theobromin ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, hạn chế sự ô nhiễm môi trƣờng
và nâng cao giá trị sử dụng cho cây ca cao là vấn đề có tính rất cấp thiết hiện nay.
2. :
Nghiên cứu xây dựng quy trình tách chiết Theobromin thô từ phế liệu vỏ quả
ca cao để thu đƣợc sản phẩm Theobromin ứng dụng trong thực phẩm nhằm khai thác
một cách triệt nguồn nguyên liệu quả ca cao, tận dụng nguồn phế thải vỏ ca cao, hạn
chế sự ô nhiễm và bảo vệ môi trƣờng, nâng cao giá trị sử dụng cho cây ca cao.
3. :
 Xây dựng quy trình dự kiến thu nhận Theobromine thô từ vỏ quả ca cao.
 Xác định thành phần khối lƣợng của quả ca cao và thành phần hóa
học cơ bản của vỏ quả ca cao.
 Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình trích ly Theobromine
từ vỏ quả ca cao.
 Đề xuất quy trình thu nhận Theobromine thô từ vỏ quả ca cao
 Sơ bộ tính chi phí sản xuất 20g Theobromin thô từ vỏ quả ca cao.

2
 
1.1 :

1.1.1 ca cao [3], [4], [12], [16], [38]
1.1.1.1 hình thái ca cao:
a) 
Tên khoa học: Theobroma ca cao, theo hệ thống đƣợc phân loại thuộc họ
Trôm (Sterculiceae), theo phân loại của hệ thống APG II thì thuộc phân họ
Byttnerivideae thuộc họ Cẩm quỳ (Mavalceae). Cây ca cao có nguồn gốc ở vùng
Amazone, trung tâm châu Mỹ. Ngƣời Aztec và Maya đã tìm thấy và sử dụng nó.

Hình 1.1 Cây ca cao
Christopher Colombus khám phá ra hạt ca cao ở Châu Mỹ vào năm 1502.
Hernando cortes đã mang rất nhiều ca cao về Tây Ban Nha vào năm 1958.
Những nƣớc trồng ca cao chủ yếu trên thế giới:
- Châu Phi: Bờ Biển Ngà, Ghana, Nigeria, Uganda…
- Châu Mỹ: Brazil, Cameroon, Ecuador…
- Châu Á: Indonexia, Malaysia, Việt Nam…
Ở Việt Nam ca cao du nhập vào rất sớm, theo các nhà truyền giáo phƣơng
tây. Việt Nam trồng ca cao đầu tiên là ở Quảng Ngãi, nhƣng đến năm 2004 thì Đắc
Lắc là nơi có diện tích trồng ca cao lớn nhất nƣớc (990 ha). Do cây ca cao không
3


chịu nắng nên mô hình trồng ca cao thƣờng trồng xen kẽ với những cây ngắn ngày,
dài ngày khác để che nắng.
Hiện tại cây đƣợc trồng rộng rãi ở nhiều nơi, vùng Tây nguyên vẫn đƣợc
đánh giá là có điều kiện lý tƣởng nhất cho phát triển cây ca cao. Ở đây theo nghiên
cứu thống kê thì cây ra hoa cho quả quanh năm, sản lƣợng bình quân đạt 3kg hạt
khô/ cây 5 tuổi. Tuy nhiên, hiện tại ở Việt Nam cây ca cao chƣa đƣợc phát triển
rộng rãi do quy hoạch không tập trung, kỹ thuật xử lý sau thu hoạch cũng phức tạp,
phải ủ lên men nên ngƣời dân ngại trồng.
Khoảng năm 2002 tổ chức Succes Alliance có dự án phát trển cây ca cao mà

khởi đầu từ Bến Tre. Đến năm 2006 chuyến hàng xuất khẩu hạt ca cao đƣợc xuất
hiện dù sản lƣợng vẫn còn thấp.
b) 
Là loại cây thuộc có tán thuộc tầng trung bình, sống dƣới bóng những cây cổ
thụ, chiều cao của cây có thể cao tới 11m, rễ ca cao thuộc loại rễ chùm nên
không ăn sâu vào lòng đất. Loại đất thích hợp nhất cho cây ca cao là mùn xốp.
Cây có thể sống tới 15 -20 năm, sau ba năm cây bắt đầu ra hoa, kết trái và cho
trái quanh năm. Trái ca cao đâm ra trực tiếp từ thân hoặc từ những cành lớn. Cây
cho sản lƣợng cao nhất khi cây khoảng 9 – 10 tuổi, cây mang lại khoảng 20 –
30 trái/năm, năm đƣợc mùa có thể lên đến 50 trái/năm. Trái ca cao khi chƣa chín
có màu xanh, khi trái chín có màu vàng, dáng bầu dục thuôn dài, có chiều dài
khoảng 15 tới 25cm và đƣờng kính khoảng 7 – 10cm. Trong mỗi trái có 5 dãy
hạt, mỗi dãy khoảng 25 tới 50 hạt.
1.1.1.2 P
 riollo:
Đây là loài cây ca cao nguyên thủy của ngƣời Mayas ở Mêxico, đƣợc mệnh
danh là “công chúa của các loài ca cao” do hƣơng vị thơm ngon tinh tế đặc biệt của
nó. Giờ đây nó đƣợc trồng ở cả Venezuela, Madagasca, Indonesia.
Năng suất thấp và khả năng kháng sâu bệnh kém nhƣng chất lƣợng hạt ca cao là
tốt nhất có thể làm ra loại Chocolate ngon nhất, thị phần 5% trên thị trƣờng ca cao.

4
Nhị hoa màu hồng nhạt, quả màu đỏ hoặc xanh trƣớc khi chín, khi chín màu
đỏ sẫm, hình dáng dài, dƣới rất nhọn, mang 10 khía đều nhau có khi phân thành 2
nhóm xen kẽ.


 
Đƣợc trồng nhiều ở Brazil, Ghana…Loại ca cao này giàu chất béo và có mùi
hơi hăng. Nó dễ trồng sản lƣợng lại cao lên đến 90% lƣợng ca cao này đƣợc để sản
xuất Chocolate. Ở Việt Nam trồng chủ yếu giống này.

Hình 1.3 
Chất lƣợng trung bình, năng suất khá cao và kháng sâu bệnh, chiếm 80% thị
trƣờng ca cao.
5


Nhụy hoa màu tím, quả màu xanh lá cây, vàng khi chín, hình dài, nhọn, ít
khía, mặt trơn, phôi nhũ tƣơi, màu đỏ đậm. Hạt hơi lép, tử diệp có màu đỏ đậm, lúc
tƣơi có vị hơi đắng, 30 – 60 hạt/quả.
 
Loài ca cao đặc trƣng cho vùng Tây bán cầu có xuất xứ từ Trinidat.
Năng suất cao và khả năng kháng bệnh tốt, đây là giống có chất lƣợng trung bình.
Thị phần 10 – 15%.
Là loại ca cao đƣợc lai tạo từ 2 giống: Criollo và Frastero nên có đặc điểm trung
gian. Phôi nhũ màu tím nhạt, quả dẹp, quả có rãnh sâu không rõ nét, chứa nhiều hơn
40 hạt/quả.

Hình 1.4 
1.1.1.3 
Chỉ thu hoạch khi trái đã đạt độ chín kỹ thuật, là lúc trái có màu vàng hoặc
đỏ cam tùy theo giống. Trái chín thuận lợi cho việc lên men, hàm lƣợng bơ trong
hạt cao và có hƣơng thơm tốt nhất. Không nên để quá muộn vì hạt có thể nảy mầm

bên trong trái, bị hƣ do sâu bệnh, chuột, sóc phá hoại. Còn nếu hái quá sớm thì có
thể làm cho năng suất thấp, khó bóc hạt và chất lƣợng không cao.
Đối với những trái ngang tầm tay ta dùng dao cắt, còn những trái cao hơn thì
dùng những dụng cụ hái trái để hái. Cắt cuống trái bằng kéo tỉa cành hoặc dao bén.
Cần lƣu ý rằng kéo lƣỡi càng bén thì càng ít tạo vết thƣơng cho cây. Tránh va chạm
lƣỡi cắt vào thân cây vì sự va chạm gây trầy xƣớc, làm tổn thƣơng đệm hoa sẽ ảnh
hƣởng xấu tới sự ra hoa kết trái ở các vụ sau.

6
1.1.1.4 ca cao:
Quả ca cao đƣợc cấu tạo từ 4 phần gồm: Lớp vỏ cứng bên ngoài cùng, tiếp
theo là lớp vỏ nhầy màu trắng bao quanh hạt, kế đó là lớp vỏ trấu và hạt nằm
trong cùng.











g 1.1 

Thành phần
Hàm lượng (%)
Độ ẩm
10,0

Chất béo
3,0
Protein
13,5
Chất xơ
16,5
Tannin
9,0
Peptosan
6,0
Tro
6,5
Theobromin
0,75

1.2 

Thành phần
Hàm lượng (%)
Độ ẩm
79,7-88,5
Abumiloit, chất chát
0,5-0,7
Glucozo
8,3-13,1
Saccaroza
0,4-0,9
Axit bay hơi (axit tatric)
0,2-0,4
Fe

2
O
3
0,03
Chất khoáng ( K, Na, Ca, Mg)
0,40



7


1.1.1.5 
a) 
Ca cao đƣợc trồng trên 50 nƣớc trên thế giới, chủ yếu là ở Tây Phi, trung tâm
và Nam Mỹ và châu Á. Tuy vậy, sản lƣợng chính chỉ tập trung ở một số nƣớc,
khoảng 70% sản lƣợng thế giới đƣợc sản xuất từ 3 nƣớc Bờ Biển Ngà, Ghana và
Indonesia. Bờ Biển Ngà là nƣớc sản xuất ca cao lớn nhất thế giới, sản lƣợng niên vụ
2010/2011 đạt 1.56 triệu tấn (chiếm 40% tổng sản lƣợng cung cấp trên toàn cầu).
Ghana đạt mức sản lƣợng 955.000 tấn. Trong năm 2011, sản lƣợng cacao của
Indonesia đạt khoảng 435.000 tấn.
- Châu Phi gồm có Bờ Biển Ngà (Côtđivoa), Ghana, Nigieria, Uganđa.
- Châu Mỹ gồm có Brazil, Cameroon, Ecuador.
- Châu Á gồm có Inđônêsia, Maylasia, Việt Nam.
b) 
Mặc dù ca cao đƣợc sản xuất chủ yếu ở các nƣớc đang phát triển nhƣng nó
lại đƣợc tiêu thụ chủ yếu ở châu Âu (Anh, Đức, Pháp, Nga, Ý, Tây Ban Nha, Bỉ, Hà
Lan), Bắc Mỹ (Brazil, Mexico, Canada) và châu Á (Nhật). Trong đó, các nƣớc Mỹ
La Tinh xuất khẩu ca cao vào Mỹ, các nƣớc châu Phi bán ca cao chủ yếu vào châu
Âu còn châu Á nhập khẩu ca cao từ Inđônêsia, Maylasia, Ecuador hoặc các nƣớc

Bắc Mỹ.
1.1.1.6 
[40]
:
Việt Nam có điều kiện địa lý thuận lợi cho việc trồng cây ca cao, Chính phủ
Việt Nam có chính sách hỗ trợ các hộ nông dân trồng cây ca cao và đƣợc các tổ
chức quốc tế giúp đỡ về mặt kỹ thuật. Các tỉnh trồng nhiều ca cao là Bến Tre, Đăk
Lăk, Tiền Giang, Bình Phƣớc, Quảng Ngãi, Cần Thơ.
Theo VCC, kế hoạch sản xuất ca cao đến cuối năm 2011 đạt 26.732 ha, tăng
thêm 6.143 ha so với thời điểm hiện tại và dự báo đến năm 2015 diện tích ca cao
trên cả nƣớc sẽ đạt 53.580 ha. Tuy nhiên trong số liệu này vẫn còn nhiều tỉnh có ý
định phát triển ca cao nhƣng chƣa có kế hoạch và chỉ tiêu diện tích cụ thể.

8
Báo cáo tại hội nghị cho thấy từ năm 2010 đến nay giá ca cao luôn ở mức
cao và khá ổn định, bình quân trên 50.000 – trên 60.000 đồng/kg hạt khô, làm tăng
thu nhập cho ngƣời nông dân trồng ca cao từ 15 – 20 triệu đồng/ha. Đối với các hộ
nông dân có đầu tƣ thâm canh, thu nhập từ ca cao có thể đạt mức 60 – 70 triệu
đồng/ha. Ngoài ra, thu nhập từ sản lƣợng các cây trồng xen với ca cao nhƣ dừa,
điều, cây ăn trái khác… cũng góp phần đáng kể nâng cao hiệu quả kinh tế trong sản
xuất của nông dân trồng ca cao.
Thị trƣờng thu mua ca cao tại Việt Nam hiện nay đang có rất nhiều doanh
nghiệp trong và ngoài nƣớc tham gia thu mua.
Thị trƣờng trong nƣớc có các công ty thu mua ca cao nhƣ: Phạm Minh,
Thành Hƣng Thịnh, Phú Bình, Thảo Li, Thành Đạt, Nguyên Lộc, Trọng Đức, Cao
Nguyên Xanh, Ca cao A1…
Thị trƣờng nƣớc ngoài nhƣ: Cargill, Armazaro, Olam, Touton, Grand
Place… với sự tham gia thu mua hạt ca cao của nhiều công ty đã tạo nên một thị
trƣờng cạnh tranh, từ đó tạo tâm lý an tâm cho ngƣời nông dân mạnh dạn đầu tƣ mở
rộng diện tích trồng mới ca cao.

1.1.2 T [3], [6], [8], [18], [25], [26], [29], [33].
1.1.2.1 
 Công thức phân tử: C
7
H
8
N
4
O
2
.
 Công thức cấu tạo:




Hình 1.6    Theobromin
Tên UIPAC: 3,7-dihydro-3,7-dimethyl-H-purine-2,6-dione:
Tên thông thƣờng: 3,7 Dimethylxanthine
9


Theobromine thuộc nhóm alkaloit, là nhóm hợp chất hữu cơ, phân tử có
nhân dị vòng và có tính kiềm hoặc lƣỡng tính, nitơ trong phân tử alkaloid tạo nên
đặc tính cơ bản của loại hợp chất này.
Là thành phần đặc trƣng của ca cao, chiếm khoảng 1,5 – 1,7 % so với khối
lƣợng của hạt.
Theobromine không những có trong hạt mà còn có trong vỏ quả ca cao, hàm
lƣợng của nó chiếm từ 0,5-1,0%.
Theobromine ở dạng tinh thể bé, màu trắng, có vị đắng, bắt đầu thăng hoa ỏ

nhiệt độ 308
0
C.
Độ tan: tan trong nƣớc (1,0g/2L), trong nƣớc sôi (1,0g/0,15L) và trong
etanol 95% (1,0g/2,2L), rất ít tan trong cloroform (1,0g/6L), hầu nhƣ không hòa tan
trong benzene, diethyl ether và carbon tetrachloride.
1.1.2.2 
Theobromine đƣợc sử dụng trong điều trị sƣng và phù nề. Theobromine cũng
đƣợc sử dụng nhƣ một thuốc lợi tiểu và một chất kích thích tự nhiên tim mạch, tăng
lƣu lƣợng oxy đến các vùng khác nhau trong cơ thể. Cải thiện lƣu lƣợng máu, kích
thích chức năng nhận thức và cải thiện trí nhớ. Theobromin góp phần quan trọng
trong việc điều trị hen suyễn.
1.1.2.3  Theobromin:
 
Dùng các chất kết tủa khác nhau (thuốc thử: HgI
2
+KI hoặc dung dịch
I
2
trong KI) để chuẩn độ. Ví dụ: Cho dung dịch chứa I
2
vào dung dịch chứa
alkaloid trong môi trƣờng trung tính hoặc axit yếu, I
2
tạo thành kết tủa với
alkaloid. Chuẩn độ lƣợng I
2
dƣ bằng dung dịch Na
2
S

2
O
3
với chỉ thị là hồ tinh
bột.
[6],[11]

Phản ứng với bạc nitrat (AgNO
3
): Theobromine thu đƣợc sau khi trích
ly cho phản ứng với bạc nitrat tạo thành muối bạc và axit nitric, chuẩn độ
axit sinh ra bằng NaOH 0,1N với chỉ thị phenolphthalein 1% cho đến khi

10
xuất hiện màu hồng bên, đọc thể tích NaOH 0,1N, rồi tính lƣợng
Theobromin có trong mẫu phân tích.
[10],[11]

Theobromin + AgNO
3
-> Theobromin-Ag + HNO
3
.
 Png pháp  UV- Vis
[21], [31]

Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ điện tử vùng tử ngọai (UV) và khả kiến
(Vis) đƣợc áp dụng để xác định định tính (nhận biết chất), xác định định lƣợng,
xác định cấu trúc, nghiên cứu phức chất (xác định thành phần, hằng số bền), hệ
số hấp thụ phân tử.

Là chiếu chùm tia đơn sắc với một dãy các bƣớc sóng qua dung dịch chất
hấp thụ ánh sáng, khi đó các cấu tử trong dung dịch sẽ hấp thụ chọn lọc một số
tia ở những bƣớc sóng khác nhau tùy theo cấu trúc của mỗi chất.
Bộ phận phân tích và hiển thị kết quả cho ta biết các thông tin về cực đại
hấp thụ và hiển thị các phổ đồ hấp thụ điện tử của các cấu tử trong dung dịch cần
phân tích. Nếu kết quả cho thấy cực đại hấp thụ và cƣờng độ quang phổ hấp thụ
điện tử, của mẫu thử và mẫu chuẩn gần giống nhau trong khoảng bƣớc sóng nhất
định, ta có thể định tính đƣợc các mẫu nghiên cứu dựa trên mẫu chuẩn.
Ban đầu xây dựng đƣờng chuẩn từ Theobromin chuẩn, sau đó lấy mẫu
cần phân tích Theobromin đi đo đọ hấp thụ ở bƣớc sóng 276nm hoặc 310nm.
Từ đƣờng chuẩn suy ra hàm lƣợng Theobromin.
 PHPLC):
[9], [13], [14], [15], [27]

Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-
1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phƣơng pháp sắc ký cột cổ điển. HPLC
là một phƣơng pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa
trong cột là chất rắn đã đƣợc phân chia dƣới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng
phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã đƣợc biến bằng liên kết hóa
học với các nhóm chức hữu cơ. Phƣơng pháp này ngày càng đƣợc sử dụng
rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lƣợng tốt,
thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt.
11


Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) đƣợc sử dụng để phân
tích Theobromin, Theophyllin và Cafein ở bƣớc sóng 274nm.
 PHPLC-UV)
Phƣơng pháp HPLC-UV nguyên tắc thực hiện tƣợng tự nhƣ HPLC, tuy
nhiên nhờ có sự kết hợp với tia cực tím UV cho nên thời gian phát hiện nhanh

hơn, cho hình ảnh quang phổ Theobromin rõ nét hơn, dựa vào điều đó giúp
cho việc tính toán hàm lƣợng Theobromin chính xác hơn, độ tin cậy cao hơn
HPLC.
[23],[30]

  (NIRS)
Là phƣơng pháp rất hiện đại thƣờng dùng để xác định hàm lƣợng
Theobromnin và Cafein trong mẫu phân tích, cho kết quả chính xác trong
thời gian ngắn, có tiến hành phân tích nhiều mẫu cùng một lúc.
[20]
1.1.3 heobromin [1], [2]
1.1.3.1 
Bản chất của quá trình trích ly là sự rút chất hòa tan trong chất lỏng hay
chất rắn bằng một chất hòa tan khác (gọi là dung môi) nhờ quá trình khếch tán
giữa các chất có nồng độ khác nhau.
Trích ly chất hòa tan trong chất lỏng là trích ly lỏng, còn trích ly chất hòa
tan trong chất rắn là trích ly chất rắn.
Bản chất của quá trình trích ly là quá trình khuếch tán phân tử và quá trình
khuếch tán đối lƣu.
 
Khuếch tán phân tử là quá trình dịch chuyển hỗn độn lẫn nhau giữa các phân tử
của các chất khác nhau.
Sự khuếch tán phân tử là dựa vào động học bên trong của các phân tử, hay còn
là sự chuyển động nhiệt tuân theo định luật Fick:




dS = - D * F * * d
dc

dx

12
Trong đó
F: diện tích tiếp xúc với chất cần thiết và dung môi
: Gradien nồng độ
D là hệ số khuếch tán.
Hệ số khuếch tán D là lƣợng vật chất đi qua một đơn vị diện tích trong một
đơn vị thời gian khi Gradien nồng độ bằng 1. Hệ số khuếch tán thay đổi theo
nhiệt độ, độ nhớt của dung môi và độ lớn của phân tử, có thể dùng công thức
của Anhxtanh để biểu thị: D = -KT/(6π.r.M)
Trong đó:
K: Hằng số khuếch tán
M: Độ dính của chất môi giới (dung môi)
T: Nhiệt độ tuyệt đối
r: Bán kính phân tử khuếch tán
 
Là hình thái di chuyển của vật chất trong dung dịch trong phạm vi nhỏ.
Sự khuếch tán đối lƣu chịu tác động chủ yếu của sự chệch lệch nồng độ. Nồng
độ càng lớn thì hiệu suất di chuyển từ vùng nồng độ cao tới vùng nồng độ thấp
càng lớn. Quá trình này chủ yếu là sự chuyển động của phân tử chất tan trên bề
mặt vật liệu vào dung môi và ngoại lực bên ngoài.
Trong quá trình trích ly thì 2 quá trình khuếch tán này xảy ra song song
nhau. Sự di chuyển vật chất trong khuếch tán phân tử dựa trên động năng của
chuyển động nhiệt còn khuếch tán đối lƣu sự di chuyển dựa vào lực tác động
bên ngoài.
Từ phƣơng trình khuếch tán trên cho thấy tốc độ của quá trình khuếch tán
chịu ảnh hƣởng của nhiều yếu tố: nhiệt độ, độ nhớt của môi trƣờng khuếch tán
(dung môi), thời gian khuếch tán, tốc độ khuấy đảo….
Nhƣ vậy, muốn tăng hiệu quả của quá trình khuếch tán chỉ cần tác động

vào nhiệt độ khuếch tán, thời gian khuếch tán, tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu…
13


1.1.3.2 
 
 Khi tỉ lệ dung môi/nguyên liệu thấp thì lƣợng chất trích ly vào dung môi
thấp, kéo dài thời gian trích ly làm giảm chất lƣợng của sản phẩm.
 Khi tỉ lệ dung môi/nguyên liệu tăng thì sẽ tạo sự chêch lệch nồng độ lớn,
lƣơng chất trích ly tăng do đó thời gian trích ly giảm. Tuy nhiên, nếu tỉ lệ
dung môi/nguyên liệu cao quá thì hiệu quả trích ly không tăng thêm nữa mà
lại hao tổn dung môi, giảm hiệu quả kinh tế.
 Do đó cần chọn tỉ lệ dung môi/nguyên liệu phù hợp với quá trình trích ly để
đảm bảo hiệu suất trích ly, chất lƣợng sản phẩm và hiệu quả kinh tế.
 
Các loại dung môi khác nhau sẽ phù hợp với việc trích ly các thành phần
khác nhau vì chúng khác nhau về độ phân cực, độ nhớt và sức căng bề mặt.
Các yếu tố này đều làm ảnh hƣởng đến hiệu quả trích ly.
 :
Dung môi ít phân cực thì dễ hòa tan các chất không phân cực và khó hòa tan các
nhóm chất có nhiều nhóm phân cực. Ngƣợc lại, dung môi phân cực mạnh thì dễ
hòa tan các chất có nhiều nhóm phân cực và khó hòa tan các chất ít phân cực.
 
 Dung môi không phân cực: ete dầu hỏa, xăng, hexan, heptan, bezene….
 Dung môi phân cực yếu và vừa: cloroform, diclorethane, axeton, etylaxetat….
 Dung môi phân cực mạnh: nƣớc, glyxerin, các loại cồn có mạch cacbon ngắn
(metanol, etanol, isopropanol….)
Trong các yêu cầu và lựa chọn dung môi, khả năng hòa tan các chất
cần trích ly là quan trọng nhất. Khả năng hòa tan lại liên hệ chặt chẽ với độ
phân cực của dung môi:

 Các chất có nhiều nhóm chức: -OH, -COO, -CHO, -CO, -NH
2
, -CONH
2
…
thƣờng dễ tan trong các dung môi phân cực.

14
 Các chất có nhiều nhóm kỵ nƣớc nhƣ : -CH
3
, -C
2
H
5
, các nhóm đồng đẳng…
thƣờng dễ tan trong các dung môi không phân cực.
 :
Dung môi có độ nhớt càng thấp hoặc sức căng bề mặt càng nhỏ thì dễ thấm
vào nguyên liệu, tạo điều kiện thuân lợi cho quá trình trích ly và ngƣợc lại.
 
Khi nhiệt độ tăng thì lƣợng chất khuếch tán vào dung môi tăng, do đó tạo
điều kiện thuận lợi cho quá trình trích ly. Tuy nhiên khi nhiệt độ tăng quá thì
gây bất lợi cho quá trình trích ly trong một số trƣờng hợp sau:
 Đối với tạp chất: khi nhiệt độ tăng, không chỉ độ tan của hoạt chất tăng mà
độ tan của tạp chất cũng đồng thời tăng theo làm cho dịch chiết bị lẫn nhiều
tạp. Khi nhiệt độ tăng là cho các thành phần tinh bột, pectin thủy phân, độ
nhớt của dung dịch tăng lên gây khó khăn cho quá trình trích ly, tinh chế.
 Đối với dung môi dễ bay hơi có nhiệt độ sôi thấp: khi tăng nhiệt độ thì dung
môi dễ bị hao hụt, một số dung môi có tính độc thì rất nguy hiểm. Do đó
thiết bị phải kín và có bộ phận hồi lƣu dung môi.

 Đối với các hợp chất kém bền ở nhiệt độ cao thì dễ bị phân hủy, tồn tại trong
dung môi, ảnh hƣởng đến chất lƣợng của sản phẩm.
Từ những phân tích trên ta nên chọn nhiệt độ trích ly sao cho phù hợp nhất.
 
Khi bắt đầu trích ly, các chất có phân tử lƣợng nhỏ sẽ đƣợc hòa tan và
khuếch tán vào dung môi trƣớc, sau đó mới đến các chất có phân tử lƣợng lớn
(thƣờng là tạp chất nhƣ nhựa, keo…). Do đó, nếu thời gian trích ly ngắn thì
không chiết đƣợc hết các chất trong nguyên liệu, nhƣng nếu thời gian trích ly
quá dài, dịch chiết sẽ bị lẫn nhiều tạp, gây bất lợi cho các công đoạn sau.
, cần phải lựa chọn thời gian trích ly sao cho phù hợp với các
thành phần nguyên liệu, dung môi, phƣơng pháp trích ly và đảm bảo hiệu quả
kinh tế cho quá trình trích ly.

15


 Hình thái, tính cht và cu to ca t c nguyên li
u
:

Mức độ phá vỡ cấu trúc tế bào càng nhiều thì sự tiếp xúc giữa chất cần
chiết và dung môi càng tăng nên rút ngắn thời gian chiết và chiết triệt để hơn.
Kích thƣớc càng nhỏ thì diện tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi
càng tăng, hiệu suất chiết tăng, tuy nhiên cũng không nên nhỏ quá vì sẽ gây
khó khăn cho quá trình phân ly tiếp theo.
1.1.3.3 
Có nhiều cách phân loại, dựa vào nhừng yếu tố khác nhau:
 Dựa vào nhiệt độ, có các phƣơng pháp chiết sau: chiết nóng, chiết nguội
(ở nhiệt độ thƣờng).
 Dựa vào chế độ làm việc, có phƣơng pháp chiết sau: gián đoạn, bán liên

tục, liên tục.
 Dựa vào chuyển động tƣơng hỗ giữa hai pha, có phƣơng pháp: ngƣợc
dòng, xuôi dòng, chéo dòng.
 Dựa vào áp suất làm việc, có phƣơng pháp chiết sau: áp suất thƣờng (áp
suất khí quyển), áp suất thấp (áp suất chân không), áp suất cao.
1.1.3.4 
 
 Dung môi hòa tan các chất cần chiết mà không hòa tan các chất khác.
 Dung môi phải có thành phần hóa học ổn định không gây ra phản
ứng phụ với nguyên liệu.
 Dung môi không biến đổi thành phần của sản phẩm khi bảo quản.
 Dung môi có nhiệt độ sôi thấp để dễ dàng tách dung môi ra khỏi chất
cần chiết sau khi chiết. Sau khi tách chiết không để lại mùi vị lạ.
 Dung môi không ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời, chất lƣợng sản phẩm.
 Dung môi khó cháy nổ, an toàn trong sản xuất.
 Dung môi không ăn mòn thiết bị chiết.
 Dung môi rẻ tiền, dễ kiếm, có khả năng sử dụng trong sản xuất.

16
  [5], [6], [10], [24], [25], [29], [39]
Dựa vào tính chất của Theobromine mà ta lựa chọn dung môi phù hợp
nhất để nâng cao hiệu quả trích ly.
Theobromine thuộc nhóm alkaloit, là nhóm hợp chất hữu cơ, phân tử
có nhân dị vòng và có tính kiềm hoặc lƣỡng tính, nitơ trong phân tử alkaloid
tạo nên đặc tính cơ bản của loại hợp chất này
[5]
. Cụ thể: trong phân tử
Theobromin chứa cả hai nhóm chức không phân cực là –CH
3
và nhóm chức

phân cực :-NH-, -N=, -CO, dó đó Theobromine có thể tan trong cả hai dung
môi phân cực và không phân cực.
Dựa vào các đặc tính ta tiến hành lựa chọn các dung môi có tính phân
cực yếu nhƣ cloroform, etylaxetat và dung môi phân cực nhƣ etanol, nƣớc.
Ngoài các dung môi sử dụng trong quá trình trích ly kể trên còn có dung
môi CO
2
siêu tới hạn
.
Đây là dung môi rất thích hợp để tách chiết Theobromin.
Tách chiết bằng dioxide carbon siêu tới hạn đòi hỏi chi phí đầu tƣ cao hơn
nhƣng nhờ tính chọn lọc cao. Do đó, nó đƣợc khuyến khích cho việc tách chiết
và tinh chế các sản phẩm có giá trị nhƣ alkaloid. Với công nghệ này, tách chiết
và tinh chế đƣợc tiến hành đồng thời, dung môi của các chất lỏng siêu tới hạn
có thể dễ dàng thay đổi trong các biến đổi của nhiệt độ và áp suất nhiệt động
lực học. Trong tách chiết bằng carbon dioxide siêu tới hạn, có thể làm giảm
nhiệt nhƣ quá trình tách chiết thông thƣờng. Tuy nhiên, dung môi này đòi hỏi
sử dụng thiết bị phân tích hiện đại, chí phí gửi mẫu phân tích rất cao.
Do đó cần tiến hành bố trí thí nghiệm để lựa chon dung môi phù hợp nhất,
đạt hiệu quả trích ly tốt nhất.
1.2 
1.2.1 [12], [26], [29], [33], [34], [35], [36],[37]
 Một bài báo khoa học mang tên “Tìm hiểu về lợi ích sức khỏe từ chocolate
mang lại” của tác giả TS. David Jockers (2003) trình bày về Theobromin và các
công trình nghiên cứu liên quan nhƣ sau:
17


Ca cao chứa hợp chất Theobromin, nó là một alkaloid có tính đắng tƣơng tự nhƣ
Cafein. Theobromin đƣợc sử dụng trong điều trị sƣng và phù nề.

Theobromin cũng đƣợc sử dụng nhƣ một thuốc lợi tiểu và một chất kích thích tự
nhiên tim mạch, tăng lƣu lƣợng oxy đến các vùng khác nhau trong cơ thể. Cải
thiện lƣu lƣợng máu, kích thích chức năng nhận thức và cải thiện trí nhớ.
 Một nghiên cứu đƣợc công bố trong tháng 4 năm 2007 bởi Cơ quan lƣu trữ nội
khoa cho thấy, ca cao có hiệu quả giảm huyết áp hơn so với trà xanh và đen. Mặc
dù Theobromin và Cafein là các alkaloid rất giống nhau nhƣng Theobromin không
gây nghiện nhƣ Cafein. Nó có tác động ít hơn đối với hệ thống thần kinh trung
ƣơng hơn so với Cafein. Theobromin không kích thích chức năng tim mạch ở mức
độ lớn hơn so với Cafein. Mặc dù nó không đƣợc coi là có tác dụng sinh lý gây
nghiện nhƣ Cafein nhƣng nó lại có vai trò quan trọng trong việc gây nghiện sôcôla .
 Các nhà nghiên cứu thuộc Trƣờng Y Harvard đã nghiên cứu tác động tiêu thụ ca
cao đến tỉ lệ bệnh tật của ngƣời dân Ấn Độ sống trên các hòn đảo ngoài khơi bờ
biển Panama. Họ đã tìm thấy sự giảm đáng kể tỷ lệ bệnh tim và ung thƣ của những
ngƣời sông trên đảo so với nhóm ngƣời sống trên đất liền tiêu thụ ít ca cao hơn.
 Trong một công trình nghiên cứu của tác giả R. Bhattacharjee
[12]
và P. Lava
Kumar năm 2007 có bài viết nhƣ sau:
 Khoảng 3,5% Theobromin xuất hiện trong hạt ca cao khô, nó là một chất kích
thích cơ bắp. Tuy nhiên, hàm lƣợng Theobromin cao gây ra những tác hại nhƣ suy
thận, suy tim, và yếu cơ. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng, ca cao và sôcôla giàu
flavonoid có tác dụng chống ôxi hóa, tốt cho hệ tim mạch và giảm huyết áp.
Qua công trình nguyên cứu trên ta thấy đƣợc lợi ích mà Theobromin mang lại,
tuy nhiên hàm lƣợng Theobromin chỉ đƣợc sử dụng trong giới hạn cho phép. Nếu
dùng quá lƣợng thì gây tổn thƣơng cơ thể.
 Một bài viết của tác giả Marleny D. A. Saldana (2003)
[29]
đã chỉ ra rằng: “Tách
chiết alkaloid bằng CO
2

siêu tới hạn”. Đây là bài viết rất hay viết về các phƣơng
pháp tách chiết alkaloids nhƣ sau: