Nghiên cứu thu nhận enzyme protease từ nội tạng cá chẽm (lates calcarifer) và thử nghiệm ứng dụng để sản xuất bột cá thực phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG









LÂM TUYẾT HẬN






NGHIÊN CỨU THU CHẾ PHẨM ENZYME PROTEASE TỪ NỘI
TẠNG CÁ CHẼM (Lates calcarifer) VÀ ỨNG DỤNG SẢN XUẤT
BỘT CÁ THỰC PHẨM







LUẬN VĂN THẠC SỸ KĨ THUẬT

Nha Trang - 2009
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG









LÂM TUYẾT HẬN






NGHIÊN CỨU THU CHẾ PHẨM ENZYME PROTEASE TỪ NỘI
TẠNG CÁ CHẼM (Lates calcarifer) VÀ ỨNG DỤNG SẢN XUẤT

BỘT CÁ THỰC PHẨM


Chuyên ngành: Công nghệ sau thu hoạch
Mã số: 60.54.10



LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT




NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. ĐỖ VĂN NINH:



Nha Trang - 2009

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và
kết quả nêu trong luận văn là trung thực, chưa được ai công bố trong bất kỳ công
trình nào.

Tác giả luận văn



Lâm Tuyết Hận

ii

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành Luận văn, trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám Hiệu Trường
Đại học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm Khoa Chế biến sự kính trọng, niềm tự hào
được học tập và nghiên cứu tại trường trong những năm qua.
Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho thầy: TS. Đỗ Văn Ninh - Phó
Hiệu trưởng - Trường Đại học Nha Trang đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi
trong suốt quá trình thực hiện luận văn.
Xin cám ơn: TS. Nguyễn Anh Tuấn - Trưởng khoa Chế biến, GS. TS. Trần
Thị Luyến, TS. Nguyễn Thị Nga, PGS.TS. Ngô Đăng Nghĩa – Giám đốc Viện
Công nghệ Sinh học, TS. Vũ Ngọc Bội - Phó Giám đốc - Viện Nghiên cứu Công
nghệ Sinh học và Môi trường -Trường Đại học Nha Trang cùng các thầy cô phản
biện đã cho tôi những lời khuyên quí báu để công trình nghiên cứu được hoàn thành
có chất lượng.
Đặc biệt xin được ghi nhận tình cảm, sự giúp đỡ của: các cán bộ thuộc Viện
Công nghệ Sinh học và Môi trường, quý thầy cô giáo Khoa Chế biến và bạn bè đã
chia sẻ cùng tôi trong quá trình nghiên cứu.

iii

MỤC LỤC
Trang
LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN vi
DANH MỤC CÁC BẢNG vii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ viii
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. TỔNG QUAN VỀ ENZYME PROTEASE 4
1.1.1. Phân loại enzyme protease:[03], [06], [45], [48]. 4
1.1.2. Protease trong cá và động vật thuỷ sản [04], [34] 8
1.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng lên hoạt tính enzyme [06], [34], [44], [45] 9
1.2. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG PROTEASE NỘI TẠNG
CỦA ĐỘNG VẬT THỦY SẢN [06], [11], [12], [34], [39], [42], [43] 12
1.2.1. Một số nghiên cứu về protease nội tạng của động vật thủy sản 12
1.2.2. Ứng dụng protease trong chế biến thủy sản 14
1.3. NHỮNG VẤN ĐỀ TỒN TẠI CẦN GIẢI QUYẾT VÀ HƯỚNG PHÁT
TRIỂN NGHIÊN CỨU, ỨNG DỤNG ENZYME PROTEASE TRONG CHẾ
BIẾN THỦY SẢN Ở NƯỚC TA [34] 16
1.3.1. Những vấn đề tồn tại trong nghiên cứu và ứng dụng protease trong chế biến 16
1.3.2. Hướng phát triển nghiên cứu và ứng dụng protease, CPE nội tạng cá

trong chế biến thủy sản ở nước ta.[34] 17
1.4. GIỚI THIỆU VỀ CÁ CHẼM VÀ PHẾ LIỆU CÁ CHẼM TRONG QUÁ
TRÌNH CHẾ BIẾN[04], [16] 20
1.4.1. Giới thiệu về cá Chẽm 20
1.4.2. Giới thiệu về phế liệu của ngành chế biến thuỷ sản Việt Nam [57] 23
1.5. GIỚI THIỆU VỀ BỘT CÁ VÀ PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG PROTEASE
ĐỂ SẢN XUẤT BỘT CÁ THỦY PHÂN TỪ CÁ NỤC [06], [29], [33] 24

iv

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 26
2.1.1. Nguồn thu nhận enzyme protease 26
2.1.2. Nguyên liệu cá sử dụng để thủy phân thu bột đạm 26
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27
2.2.1. Sơ bố trí thí nghiệm tổng quát 27
2.2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu về enzyme nội tạng cá Chẽm 28
2.2.3. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính protease của DC và CPE 32
2.2.4. Nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân thịt cá Nục
bằng chế phẩm protease nội tạng cá Chẽm 34
2.3. Các phương pháp nghiên cứu: 37
2.3.1. Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson [06] 37
2.3.2. Phương pháp phân tích. 37
2.3.3. Các thiết bị thí nghiệm chủ yếu đã sử dụng 38
2.3.4. Pháp xử lý số liệu 38
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 39
3.1. THÀNH PHẦN KHỐI LƯỢNG CỦA CÁ CHẼM. 39
3.2. NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA
PROTEASE NỘI TẠNG CÁ CHẼM. 39
3.2.1. Xác định điều kiện ủ thích hợp 39

3.2.2. Xác định dung môi chiết rút enzyme từ nội tạng cá Chẽm 42
3.2.3. Xác định tỷ lệ nước cất và nội tạng cá 43
3.2.4. Xác định quá trình kết tủa enzyme 44
3.2.5. Xác định một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính protease của DC và CPE 47
3.2.6. Đề xuất quy trình thu nhận CPE nội tạng cá Chẽm 51
3.3 NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN THỊT CÁ NỤC BẰNG CPE
NỘI TẠNG CÁ CHẼM 54
3.3.1 Thành phần hoá học của cá Nục 54
3.3.2 Nghiên cứu chế độ thủy phân thịt cá Nục bằng CPE nội tạng cá Chẽm 55
3.4. QUI TRÌNH ĐỀ XUẤT BỘT ĐẠM THỦY PHÂN TỪ THỊT CÁ NỤC 77

v

3.4.1. Đề xuất qui trình 77
3.4.2.Thuyết minh qui trình 78
3.4.3. Sơ bộ tính toán chi phí nguyên liệu sản xuất bột đạm thủy phân từ cá Nục 78
3.4.4. Sản xuất thử bột cá Nục theo quy trình đề xuất 79
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 82
TÀI LIỆU THAM KHẢO 83
PHẦN PHỤ LỤC

vi


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

CPE: chế phẩm enzyme là chế phẩm thu được từ quá trình kết tủa protease

nội tạng cá Chẽm.
DC: dịch chiết
ĐC: đối chứng
NC: nghiên cứu
N
aa
: hàm lượng nitơ axit amin định lương theo phương pháp Sorensen
(phương pháp formol)
N
NH3
: nitơ NH
3
N
TS
: nitơ tổng số
pH
opt
: pH thích hợp
t
opt
: nhiệt độ thích hợp
T: thời gian
V: thể tích
TN: tự nhiên

vii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1. Thành phần khối lượng của cá Chẽm (% so với toàn bộ cơ thể) 39
Bảng 3.2. Kết quả thu nhận protease từ nội tạng cá Chẽm 53
Bảng 3.3. Sơ bộ tính toán giá thành cho 100g protease CPE (1,24 UI/g) 53
Bảng 3.4. Thành phần khối lượng của thịt cá Nục (%) 54
Bảng 3.5. Thành phần hoá học chủ yếu của cá Nục 54
Bảng 3.6. Thành phần amino acid tự do của thịt cá Nục tươi 55
Bảng 3.7. Trạng thái cảm quan của các mẫu thủy phân thịt cá Nục bằng CPE
nội tạng cá Chẽm 56
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của tỷ lệ muối bổ sung tới sự thay đổi trạng thái cảm
quan của các mẫu thủy phân thịt cá Nục bằng CPE 60
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước bổ sung tới sự thay đổi trạng thái cảm

quan của các mẫu thủy phân thịt cá Nục bằng CPE 64
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của pH tới sự thay đổi trạng thái cảm quan của các mẫu
thủy phân thịt cá Nục bằng CPE. 67
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự thay đổi trạng thái cảm quan của các
mẫu thủy phân thịt cá Nục bằng CPE 70
Bảng 3.12. Sự biến đổi trạng thái cảm quan của hỗn hợp theo thời gian
thủy phân 75
Bảng 3.13. Sơ bộ tính toán giá thành cho bột đạm thủy phân từ thịt cá Nục
(trong 100kg thịt cá) 79
Bảng 3.14. Trạng thái cảm quan của bột đạm thủy phân từ thịt cá Nục 79
Bảng 3.15. Thành phần hóa học của bột đạm 80
Bảng 3.16. kết quả kiểm nghiệm vi sinh trong bột đạm thủy phân cá Nục 80
Bảng 3.17. Thành phần axit amin trong bột đạm thủy phân từ cá Nục 81



viii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 2.1.Cá Chẽm (Lates calcarifer) 26
Hình 2.2. Cá Nục thuôn (Decapterus macrosoma) 26
Hình 2.3. Sơ đồ tách chiết protease từ nội tạng cá Chẽm 27
Hình 3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ tới hoạt tính protease nội tạng cá Chẽm 40
Hình 3.2. Ảnh hưởng của thời gian ủ tới hoạt tính protease của nội tạng cá
Chẽm 41
Hình 3.3. Ảnh hưởng của dung môi chiết đến hoạt tính protease nội tạng cá 42
Hình 3.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch chiết đến hoạt tính protease nội tạng cá 43
Hình 3.5. Ảnh hưởng của tác nhân kết tủa tới hoạt tính protease CPE 44
Hình 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ aceton (%) đến hoạt tính enzyme 45

Hình 3.7. Ảnh hưởng của thời gian tủa đến hoạt tính protease của CPE 46
Hình 3.8. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme trong DC và CPE 47
Hình 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme 49
Hình 3.10. Độ bền nhiệt của enzyme nội tạng cá Chẽm. 50
Hình 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ muối ăn tới hoạt tính enzyme protease nội
tạng cá Chẽm 48
Hình 3.12. Quy trình thu nhận CPE nội tạng cá Chẽm 52
Hình 3.13. Ảnh hưởng của tỷ lệ CPE tới hàm lượng protein của các mẫu thủy
phân. 58
Hình 3.14. Ảnh hưởng của tỷ lệ CPE tới hàm lượng NH
3
của các mẫu thủy
phân. 58
Hình 3.15. Ảnh hưởng của tỷ lệ CPE tới hàm lượng Naa của các mẫu thủy
phân. 59
Hình 3.16. Ảnh hưởng của tỷ lệ muối ăn tới hàm lượng protein của các mẫu
thủy phân 61
Hình 3.17. Ảnh hưởng của tỷ lệ muối ăn tới hàm lượng Naa của các mẫu thủy
phân. 62

ix

Hình 3.18. Ảnh hưởng của tỷ lệ muối ăn tới hàm lượng NH
3
của các mẫu thủy
phân 62
Hình 3.19. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước tới hàm lượng protein của các mẫu thủy
phân 65
Hình 3.20. Ảnh hưởng tỷ lệ nước đến hàm lượng NH
3

của các mẫu thủy phân 65
Hình 3.21. Ảnh hưởng tỷ lệ nước đến hàm lượng Naa của các mẫu thủy phân 66
Hình 3.22. Ảnh hưởng pH đến hàm lượng protein của các mẫu thủy phân 68
Hình 3.23. Ảnh hưởng pH đến hàm lượng NH
3
của các mẫu thủy phân 67
Hình 3.24. Ảnh hưởng pH đến hàm lượng Naa của các mẫu thủy phân 69
Hình 3.25. Ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng protein của các mẫu thủy phân 72
Hình 3.26. Ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng Naa của các mẫu thủy phân 73
Hình 3.27. Ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng NH
3
của các mẫu thủy phân 73
Hình 3.28. Ảnh hưởng hàm lượng protein, NH
3
, Naa của các mẫu thủy phân
thịt cá Nục bằng CPE. 76
Hình 3.29. Qui trình sản xuất bột đạm từ thịt cá Nục 77

1

MỞ ĐẦU

Protease là một nhóm enzyme có thể thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như
từ thực vật, từ nội tạng động vật hay từ vi sinh vật, là một nhóm enzyme được ứng
dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực sản xuất và đời sống như: công nghiệp, nông
nghiệp, công nghiệp thực phẩm…Trong thời gian gần đây, một số nhà khoa học ở
nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới đã tiến hành nghiên cứu thu nhận protease từ
nội tạng cá và động vật thuỷ sản khác để sử dụng trong chế biến thủy sản. Tuy nhiên,
ở nước ta, các công trình nghiên cứu về protease nội tạng cá cũng như sử enzyme này
còn rất hạn chế và vì vậy, đây là lĩnh vực mới thuộc Công nghệ sinh học đang trên đà

phát triển, rất cần được quan tâm nghiên cứu.
Hiện nay cá cũng một trong những mặt hàng xuất khẩu chủ lực của ngành
Thủy sản tỉnh Cà Mau, Theo thống kê của Sở Nông Nghiệp Cà Mau. Tổng các sản
phẩm thủy sản xuất khẩu năm 2008 là 76.772 tấn. Trong đó, cá chiếm khoảng 20%
đến 30% với các loại sản phẩm fillet, cắt khúc, nguyên con bỏ nội tạng,
surimi…Theo số liệu thống kê từ các nhà sản xuất thì phế liệu của sản phẩm cá
fillet khoảng 48-50% tuỳ thuộc vào giống loài và mùa vụ. Nhưng riêng đối với
loài cá Chẽm fillet, phế liệu chiếm khoảng 50 ÷ 55%. Theo báo cáo năm 2008
của Sở Nông Nghiệp Cà Mau từ năm 2008 đến năm 2010 sản lượng cá Chẽm
khai thác tự nhiên và nuôi trồng tăng rất lớn, vì hiện nay có rất nhiều đơn đặt
hàng tại các nhà máy chế biến thủy sản tại Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc trăng, Cần
Thơ. Từ thực tế trên UBND Cà Mau đã có kế hoạch mở rộng, đầu tư nuôi cá
Chẽm cho những vùng nuôi tôm không hiệu quả nhằm khai thác một cách hiệu
quả diện tích ao nuôi và cung cấp nguyên liệu cho các nhà máy trong và ngoài
tỉnh. Như vậy, trong thời gian tới nguyên liệu cá Chẽm tại Cà Mau sẽ có sản
lượng lớn được chế biến thành mặt hàng fillet đông lạnh và các sản phẩm khác
và do đó, lượng phế liệu từ cá Chẽm thải ra hàng ngày tại các nhà máy chế biến
rất nhiều. Hiện tại, riêng xí nghiệp Chế Biến Xuất Nhập Khẩu & Dịch vụ thủy
Cà Mau hàng ngày trung bình thải ra từ 1,3 tấn đến 2,0 tấn phế liệu chưa xử lý
hoăc chỉ xử lý sơ bộ rồi thải ra ngoài làm ảnh hưởng đến môi trường và đời sống
người dân nơi đây. Phế liệu cá Chẽm gồm nội tạng, da, đầu, xương, vây

2

vẩy Không có giá trị kinh tế cao nhưng lại nhanh ươn thối, gây ô nhiễm môi
trường, khó khăn cho các nhà quản lý cũng như các nhà sản xuất, ảnh hưởng xấu
đến chất lượng sản phẩm và môi trường của các nhà máy chế biến thủy sản. Để giải
quyết khó khăn trên hiện nay,Việt Nam và trên thế giới đang có xu hướng tận dụng
phụ phẩm để chế biến thành các sản phẩm giá trị gia tăng [25], [27], [34] như chế
biến nội tạng thành chế phẩm enzyme, peptit có hoạt tính sinh học, sản phẩm y học,

bột cá …Việc chế biến phế liệu cá có thể mang lại những hiệu quả kinh tế cao cho
địa phương cũng như cả nước.
Mặt khác, lượng cá tạp, cá nhỏ chiếm tỷ lệ rất đáng kể, trên 30% tổng sản
lượng của cá. Theo truyền thống, cá tạp chỉ sử dụng chế biến nước mắm, thức ăn
chăn nuôi, ướp muối…Hiệu quả kinh tế thấp.
Từ thực tế trên, yêu cầu cấp bách đặt ra cho các nhà khoa học, công nghệ
ngành thủy sản sử dụng hợp lý, hiệu quả lượng phế liệu cá cũng như lượng cá nhỏ,
cá tạp do các nhà máy chế biến thủy thải ra hàng ngày. Một trong những hướng giải
quyết vấn đề trên là thu nhận chế phẩm protease từ nội tạng cá và sử dụng chế phẩm
này để chế biến cá tạp thành phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, vừa giảm thiểu chất
thải, vừa nâng cao hiệu quả kinh tế của ngành thủy sản.
Với mong muốn góp phần giải quyết vấn đề trên của tỉnh Cà Mau, tôi thực
hiện đề tài: “Nghiên cứu thu nhận enzyme protease từ nội tạng cá Chẽm (Lates
calcarifer) và thử nghiệm ứng dụng để sản xuất bột cá thực phẩm” nhằm tăng giá trị
sử dụng và sử dụng triệt để hơn nguồn phế liệu cá Chẽm và nguyên liệu cá tạp,
giảm ô nhiễm môi trường tạo điều kiện thuận lợi cho ngành kinh tế thủy sản địa
phương phát triển.
Mục đích của đề tài.
Xác định các điều kiện thích hợp để tách chiết, thu nhận chế phẩm protease
từ nội tạng cá Chẽm (Lates calcarifer) ở vùng Cà Mau, xác định hoạt tính và các
yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính protease của chế phẩm thu được. Sau đó thử nghiệm
ứng dụng chế phẩm protease thu được vào trong sản xuất bột cá thủy phân từ thịt cá
Nục (Decapterus macrosoma).



3

Nội dung nghiên cứu của đề tài
1. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình xử lý nội tạng cá Chẽm để

chiết rút, thu nhận dịch chiết nội tạng và xử lý dịch chiết thu chế phẩm enzyme nội
tạng cá Chẽm, từ đó xây dựng qui trình thu nhận chế phẩm protease nội tạng cá
Chẽm.
2. Nghiên cứu một số tính chất của chế phẩm protease nội tạng cá Chẽm: Độ
bền nhiệt, khả năng chịu muối, nhiệt độ thích hợp, pH thích hợp.
3. Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm enzyme protease từ nội tạng cá Chẽm để
thủy phẩm thịt cá Nục, bột đạm thủy phẩm từ thịt cá Nục.
Ý nghĩa thực tiễn và khoa học.
Thành công của đề tài luận văn sẽ được áp dụng để sản xuất bột cá, bột dinh
dưỡng.
Nâng cao được giá trị sử dụng và giá trị kinh tế của phế liệu cá cũng như
nguồn nguyên liệu cá tạp, cá Chẽm và giảm ô nhiễm môi trường và tăng thu nhập,
giải quyết được đời sống khó khăn cho người dân tỉnh Cà Mau.
Tăng giá trị của nguyên liệu cá Chẽm, từ đó khuyến khích được người nuôi.
Lần đầu tiên nghiên cứu về các đặc tính của protease từ nội tạng cá Chẽm và
nghiên cứu ứng dụng enzyme này trong chế biến thủy sản, kết quả của luận văn góp
phần làm phong phú thêm những hiểu biết về protease từ nội tạng cá Chẽm nói
riêng và protease từ động vật thủy sản nói chung.
Kết quả của luận văn sẽ góp phần vào chương trình “Chế biến các sản phẩm
có giá trị gia tăng” của nước ta cũng như ngành thực phẩm.








4

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. TỔNG QUAN VỀ ENZYME PROTEASE
1.1.1. Một số khái niệm cơ bản về enzyme
Hầu hết các phản ứng hóa sinh học xảy ra trong hệ thống sống đều do enzyme
xúc tác. Enzyme là những protein có khả năng xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng
hóa học xảy ra trong tế bào sống cũng như xảy ra ở ngoài tế bào. Mặt khác enzyme
còn có hoạt lực xúc tác cao gấp hàng trăm, hàng nghìn lần so với các chất vô cơ
thông thường. Chẳng hạn trong phản ứng thủy phân saccharose nếu dùng enzyme
saccharase làm chất xúc tác thì tốc độ phản ứng nhanh gấp 2.10
12
lần so với khi
dùng axit làm chất xúc tác. Quan trọng hơn nữa là enzyme có khả năng xúc tác cho
những phản ứng hóa học xảy ra trong những điều kiện nhiệt độ bình thường của cơ
thể, ở pH môi trường gần pH sinh lý. Trong khi các chất vô cơ không có khả năng
xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng hóa học thì enzyme có khả năng xúc tác đặc hiệu
cao đối với kiểu phản ứng cũng như đối với cơ chất mà nó tác dụng [6].
Ví dụ: axit clohydric có khả năng xúc tác thủy phân liên kết peptit có trong
protein cũng như liên kết glycosit trong tinh bột. Còn protease là enzyme chỉ thủy
phân liên kết peptit trong protein mà không thủy phân liên kết glycosit trong tinh
bột, còn amylase lại chỉ có khả năng thủy phân liên kết glycosit của tinh bột mà
không thuỷ phân được liên kết peptit của protein.
Do những ưu điểm trên mà ngày nay việc nghiên cứu và ứng dụng enzyme
càng có ý nghĩa về mặt lý thuyết cũng như thực tiễn.
Bản chất cấu trúc của enzyme
Enzyme là các protein có hoạt tính sinh học, do vậy chúng có đầy đủ tính chất
của một protein.
Về khối lượng phân tử: enzyme là những protein có khối lượng phân tử lớn, đa
số enzyme có khối lượng phân tử từ 6.000 ÷1.000.000 Dalton do vậy enzyme
không thể đi qua được màng bán thấm.

5

Giống như các protein khác, enzyme có thể hòa tan trong nước, trong dung
dịch muối loãng và khi tan trong nước thì tạo thành dung dịch keo giống như dung
dịch của protein, enzyme không tan trong dung môi phân cực.
Enzyme bị kết tủa bởi các yếu tố gây kết tủa protein. Các yếu tố vật lý và hóa
học làm kết tủa protein thì cũng làm kết tủa enzyme. Enzyme cũng bị mất hoạt tính
khi bị tác động bởi các yếu tố gây biến tính protein như nhiệt độ cao, axit hoặc kiềm
đặc, muối kim loại nặng…
Enzyme được cấu tạo bởi các L- axit amin kết hợp với nhau qua liên kết
peptit. Các kết quả nghiên cứu cho thấy enzyme cũng bị thủy phân dưới tác dụng
của các peptit-hydrolase, axit hoặc kiềm. Khi enzyme bị thủy phân hoàn toàn tạo
thành các L- axit amin, trong một số trường hợp ngoại lệ ngoài axit amin còn nhận
được các chất khác.
Enzyme có hai loại: enzyme một thành phần và enzyme hai thành phần.
Enzyme một thành phần thì trong thành phần của nó chỉ có protein, những enzyme
này thường xúc tác cho các phản ứng thủy phân. Enzyme hai thành phần gồm có:
phần protein và phần phi protein. Phần protein gọi là apoenzyme, phần phi protein
gọi là coenzyme. Phân tử enzyme một thành phần cũng như hai thành phần đều
chứa protein nhưng chuỗi polypeptit trong phân tử enzyme có thể thay đổi tùy từng
enzyme [13].
Đến nay người ta đã xác định được rằng phần lớn enzyme trong tế bào đều có
cấu trúc bậc bốn bao gồm nhiều tiểu đơn vị, các tiểu đơn vị này có thể liên kết với
nhau bằng liên kết hydro, liên kết cộng hóa trị hoặc một số liên kết khác, tùy mức
độ liên kết mà hình thành nên các đồng phân của enzyme gọi là isoenzyme.
Trung tâm hoạt động của enzyme là một phần nhỏ trong cấu trúc của enzyme
có nhiệm vụ liên kết với cơ chất và chuyển hóa cơ chất.
Có những enzyme có một trung tâm hoạt động nhưng cũng có enzyme có hai
hay nhiều trung tâm hoạt động.

Ví dụ: alcol-dehydrogenase của gan động vật có hai trung hoạt động, còn
alcol-dehyrogenase của nấm men có tới bốn trung tâm hoạt động. Các trung tâm
hoạt động có thể giống nhau, nhưng cũng có thể khác nhau về cấu tạo và chức năng.

6

Đối với enzyme một thành phần trung tâm hoạt động của nó là sự phối hợp
giữa các nhóm chức nằm ở mạch bên của axit amin có trong thành phần của nó.
Các nhóm chức thường gặp là: nhóm sulfihydryl (-SH-) của Cys; nhóm hydroxyl
(-OH-) của Ser, Thr, Tyr; nhóm cacboxyl (-COOH) của Asp, Glu; nhóm amin
(-NH
2
-) của Lys; vòng imidazol của His; nhóm guanilic của Arg. Đối với
enzyme hai thành phần trung tâm hoạt động của nó ngoài các nhóm chức của
axit amin người ta còn gặp các nhóm chức của các thành phần phi protein
chẳng hạn như các nhóm chức của phần coenzyme ( thường chứa các vitamin
hoặc các ion kim loại) [13].
Cơ chế tác động của enzyme
Enzyme thường tác động vào cơ chất theo phương trình phản ứng sau:
E + S ES P +E
Trong đó E: là enzyme; S: là cơ chất; ES: là phức hợp enzyme-cơ chất; P: là
sản phẩm.
Enzyme tác dụng và chuyển hóa cơ chất trải qua ba giai đoạn:
+ Giai đoạn 1: enzyme tác dụng với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức
hợp enzyme-cơ chất (ES) không bền, phản ứng xảy ra nhanh và đòi hỏi năng lượng
thấp, các liên kết yếu tạo thành giữa enzyme và cơ chất trong phức hợp ES là: tương
tác tĩnh điện, liên kết hydrogen, liên kết Vandecvan. Mỗi liên kết đòi hỏi những điều
kiện khác nhau và chịu ảnh hưởng khác nhau khi có nước.
+ Giai đoạn 2: là giai đoạn tạo phức chất hoạt hóa xảy ra biến đổi cơ chất
dưới tác dụng của một số nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme làm

cho cơ chất từ chỗ không hoạt động trở thành hoạt động, một số liên kết trong cơ
chất bị kéo căng ra và mật độ electron trong cơ chất bị thay đổi.
+ Giai đoạn 3: là giai đoạn tạo ra sản phẩm của phản ứng và giải phóng
enzyme. Đây là giai đoạn cuối của quá trình phản ứng từ cơ chất sẽ hình thành sản
phẩm và enzyme được giải phóng dưới dạng tự do như ban đầu.
1.1.2. Cách gọi tên và phân loại enzyme protease: [03, 06, 45, 53].
Cách gọi tên và phân loại nhóm enzyme thủy phân protein – protease cũng
thay đổi qua các thời kỳ [48]. Theo Grassmann và Dyckerhoff (1928) thì protease

7

được phân chia thành proteinase và peptidase. Theo Bergmann và Ross (1936) thì
peptidase lại được chia thành 2 nhóm là endopeptidase và exopeptidase.
Năm 1960, Hartley [48] phân chia proteinase thành 4 nhóm theo cơ chế xúc
tác. Nhưng do các hiểu biết mới về mặt hóa học trong trung tâm hoạt động của
enzyme nên Barrett đã phân chia lại và được ủy ban danh pháp hóa sinh quốc tế
công nhận (1984). Theo Barrett proteinase được chia làm 4 nhóm nhỏ, tên các nhóm
này gồm tên của các axit amin quan trọng nhất có vai trò xúc tác trong trung tâm
hoạt động của enzyme.
+ Proteinase serine (EC.3.4.21.): là những proteinase có nhóm (-OH) của serine
trong trung tâm hoạt động. Các proteinase serine này thường hoạt động ở vùng pH kiềm
và có tính đặc hiệu tương đối rộng. Tính đặc hiệu của chúng thể hiện về phía gốc axit
amin chứa nhóm (-CO - ) của liên kết peptit bị thủy phân. Nhóm (-OH) này có vai trò
đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Các enzyme thuộc nhóm này
như: trypsin có thể thủy phân liên kết peptit chứa nhóm (-CO-) của axit amin kiềm (Lys,
Arg), chymotrypsin xúc tác thủy phân liên kết peptit chứa nhóm (-CO-) của axit amin có
vòng thơm, … Chúng bị ức chế mạnh dưới tác dụng của DFP và một số protein đặc hiệu
khác như các antitrypsin có ở hạt đậu tương.
+ Proteinase cystein (EC.3.4.22.): là các proteinase có nhóm thiol (-SH) của
axit amin cystein trong trung tâm hoạt động. Nhóm (-SH) này có vị trí đặc biệt

trong trung tâm hoạt động xúc tác của enzyme, vì nó có khả năng phản ứng cao,
tham gia nhiều biến đổi hóa học như axit hóa, phosphoryl hóa, oxy hóa,… Vai trò
của nhóm thiol trong phân tử enzyme thể hiện ở nhiều mặt khác nhau như tạo thành
phức trung gian enzyme – cơ chất, kết hợp giữa cơ chất và cofactor… Các
proteinase cystein thường hoạt động mạnh ở vùng pH trung tính và có tính đặc hiệu
rộng, chúng chỉ hoạt động khi nhóm thiol trong trung tâm hoạt động không bị bao
vây. Do đó các chất như cystein, axit ascorbic ở nồng độ xác định thường có tác
dụng làm bền và hoạt hóa enzyme này. Một số ion kim loại nặng, đặc biệt là các
muối thủy ngân và các chất khác như iodoacetamid có tác dụng ức chế proteinase
cystein, còn các chất oxy hóa như: iôt, H
2
O
2
, EDTA,… có khả năng gắn với ion kim
loại nên thường làm tăng độ bền của nhóm enzyme này.

8

+ Proteinase aspartic (EC.3.4.23.): là những proteinase chứa nhóm (-COOH)
trong trung tâm hoạt động. Các nhóm (-COOH) này thuộc mạch bên của Asp hoặc
Glu hay cũng có thể là nhóm (-COOH) đầu C của chuỗi polypeptit. Các proteinase
aspartic thường hoạt động mạnh ở vùng pH axit, bị ức chế bởi diazoacetyl
norleucine methyl ester (DNME) và có tính đặc hiệu đối với các axit amin có vòng
thơm hoặc axit amin kỵ nước ở cả hai phía của liên kết peptit bị thủy phân.
+ Proteinase kim loại (EC.3.4.24): là những proteinase trong trung tâm hoạt động
chúng có các ion kim loại. Các proteinase kim loại thường hoạt động mạnh nhất ở vùng pH
trung tính và có tính đặc hiệu về phía gốc axit amin chứa nhóm (-NH -) của liên kết peptit,
chúng có thể tác dụng lên liên kết peptit chứa nhóm (- NH -) của các axit amin kỵ nước có
kích thước lớn hoặc liên kết peptit được tạo thành từ các axit amin có phân tử lượng thấp.
Các proteinase kim loại thường giảm hoạt động mạnh dưới tác động của EDTA.

1.1.3. Protease trong cá và động vật thuỷ sản [04, 34]
Protease của cá là protease nội bào, có ở mọi nơi tế bào nhưng tập trung
nhiều nhất ở cơ quan tiêu hóa, kế đó là cơ quan nội tạng khác và cơ thịt.
1.1.3.1. Protease của cơ quan tiêu hóa
Hệ enzyme tiêu hóa có nhiều bộ phận khác nhau, mỗi bộ phận có chức năng
và đặc điểm riêng trong qúa trình chuyển hóa và hấp thụ.
Theo như các nhà sinh hóa động vật, trong hệ enzyme tiêu hóa của cá sự
phân bố và vai trò protease có thể như :
- Khoang miệng: Enzyme không có vai trò gì ở đây.
- Họng (hầu): Chưa có enzyme tham, vì ở cá không có tuyến nước bọt.
- Thực quản cá: Theo như tài liệu tham khảo thì các nhà nghiên cứu cho
rằng, thấy enzyme gần giống tripsin và một số enzyme khác nhưng hoạt tính yếu.
- Dạ dày: Là cơ quan dự trữ thức ăn, theo nhà nghiên cứu ở dạ dầy có
enzyme pepsin A, B, C, D.
- Đường ruột: Có enzyme tripsin, chymotripsin, cacbonxylpeptidase A, B.
Enzyme này tiết ra ngoài tế bào cùng dịch vị, có chức năng tiết dịch ruột, trong đó
có hệ enzyme thủy phân, hấp thụ, nội tiết, miễn dịch, bài tiết.

9

- Tuyến tụy có thể sản xuất ra dịch tiêu hóa có thành phần phức tạp, trong đó
enzyme thủy phân protein và enzyme thủy phân các thành phần khác trong thức ăn.
Đặc biệt của tuyến tụy là tổng hợp được các enzyme thủy phân protein.
Như vậy, các cơ quan của hệ tiêu hóa từ dạ dày, ruột, tuyến tụy là cơ quan
chủ yếu chứa hệ enzyme protease, tuy nhiên từng cơ quan có chức năng riêng.
- Enzyme dạ dày: Dạ dày của cá là cơ quan duy nhất có chưa enzyme pepsin
xúc tác cho phản ứng thủy phân protein trong môi trường axit mạnh. Theo như tài
liệu của các nhà nghiên cứu đã xác định, trong dạ dày của cá chứa 2 loại enzyme là
pepsin và parapepsin.
1.1.3.2. Protease của cơ thịt cá

Ở cơ thịt cá tồn tại enzyme protease thuộc loại cathepsin, giống cathepsin
của động vật máu nóng nhưng không đồng nhất. Theo các nhà nghiên cứu cho biết
có hai ý kiến về enzyme cathepsin trong cơ thịt cá như sau:
-Trong cơ thịt cá chỉ có enzyme cathepsin D thuộc nhóm endopeptidase, pH
thích hợp là 3,5 – 4.0, thủy phân hemolobin ở pH thích hợp 4,0. enzyne này ngừng
hoạt động ở nhiệt 5
0
C nhưng khi nung nóng 68
0
C trong 15 phút vẫn còn 85% hoạt
độ, enzyme này bị ức chế bởi xistein và khả năng chịu muối kém, muối 5% hoạt độ
còn rất kém.
-Trong cơ thịt, ngoài cathepsin D ra còn có các cathepsin khác như E, A, B,
C và các exopeptidase.
1.1. 4. Phương pháp tách chiết thu nhận CPE [06]
Để tách chiết protease từ nội bào, cần phá vở cấu ỷtúc tế bào bằng phương
pháp cơ học (nghiền với thuỷ tinh hoặc xay, nghiền, đồng hoá bằng sóng siêu
âm…) sau đó dùng các dung môi thích hợp như nước, dung dịch muối trung tính,
các dung dịch đệm để chiết rút enzyme. Dịch chiết thu được, ngoài enzyme còn có
các protein tạp, các chất tan hữu cơ và vô cơ nên phải xử lý, tinh sạch enzyme.
Phương pháp xử lý và tinh sạch enzyme rất đa dạng, phức tạp, tuỳ mức độ,
yêu cầu tinh sạch. Các biện pháp thường áp dụng là: thẩm tích, lọc gel Sephadphex,
CM-xenluloza, siêu lọc, kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc muối hữu cơ,
phương pháp sắc ký, điện di, hấp phụ chọn lọc…và thường áp dụng kết hợp nhiều
phương pháp mới có thể thu CPE có độ tinh sạch cao.

10

1.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng lên hoạt tính enzyme [06, 13, 17, 21]
Trong quá trình thủy phân thịt cá bằng protease có nhiều yếu tố ảnh

hưởng đến tốc độ thủy phân như:
Ảnh hưởng của nhiệt độ: Khi tăng hay giảm nhiệt độ thường ảnh
hưởng đến hoạt tính của enzyme và enzyme chỉ thể hiện hoạt tính cao nhất ở
một giới hạn nhiệt độ nhất định. Thông thường đối với đa số enzyme thì nhiệt
độ thích hợp nằm trong khoảng 40 ÷50
o
C và ở nhiệt độ lớn hơn 70
0
C đa số
enzyme bị mất hoạt tính. Như vậy nhiệt độ 70
0
C gọi là nhiệt độ tới hạn của
enzyme. Trong khoảng nhiệt độ thích hợp cho hoạt độ của enzyme nếu nhiệt
độ tăng 10
0
C thì tốc độ thủy phân của enzyme tăng 1,5 ÷2 lần. Nhiệt độ thích
hợp đối với một enzyme có thể thay đổi khi có sự thay đổi về pH cơ chất.
Ảnh hưởng của pH: Enzyme rất nhạy cảm đối với sự thay đổi của pH.
Mỗi enzyme chỉ hoạt động trong một vùng pH nhất định gọi là pH tối thích.
pH tối thích của đa số enzyme nằm trong vùng trung tính, axit yếu hoặc kiềm
yếu, chỉ rất ít enzyme hoạt động trong vùng axit hay kiềm. Thịt cá thường có
thể bị thủy phân bởi enzyme protease có sẵn trong cơ thịt như cathepsin và
các protease bổ sung thêm từ bên ngoài vào. Vì thế chúng ta phải chọn
enzyme nào đóng vai trò xúc tác chính cho quá trình thủy phân để tạo pH
thích hợp cho nó và hạn chế ảnh hưởng đến các enzyme khác.
Ảnh hưởng của nồng độ enzyme: Trong điều kiện thừa cơ chất, nếu càng
tăng nồng độ enzyme protease thì quá trình thủy phân xảy ra càng mãnh liệt. Khi
nồng độ enzyme càng bão hòa với nồng độ cơ chất, dù tăng nồng độ enzyme bao
nhiêu đi nữa thì vận tốc của quá trình thủy phân rất ít thay đổi.
Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất: Khi enzyme protease kết hợp với cơ

chất là thịt cá, sẽ tạo thành phức trung gian enzyme và cơ chất, phức này sẽ
kéo căng liên kết peptit, chuyển hóa thành sản phẩm dịch đạm và giải phóng
enzyme. Quá trình này cứ tiếp tục xảy ra đến khi cơ chất hết, nếu nồng độ cơ
chất thích hợp với lượng enzyme sẽ làm cho quá trình thủy phân diễn ra đều
đặn, nhanh chóng.

11

Ảnh hưởng của nồng độ muối: Trong quá trình thủy phân chúng ta
thường bổ sung muối ăn bởi vì muối ăn có tác dụng ức chế hoạt động của vi
sinh vật gây thối rữa và các loại vi sinh vật không chịu muối nhưng nếu bổ
sung muối ăn với tỷ lệ cao vào hỗn hợp thủy phân sẽ làm giảm hoạt tính của
enzyme protease vì bản chất hóa học của enzyme là protein nên cũng bị kết
tủa bởi muối trung tính. Mặt khác khi nồng độ muối quá cao làm sản phẩm
bột đạm có vị mặn. Để chọn được nồng độ muối thích hợp bổ sung vào quá
trình thủy phân cần phải tiến hành trên các mẫu bổ sung muối ăn với các tỷ lệ
khác nhau để từ đó chọn được tỷ lệ muối ăn bổ sung cho phù hợp.
Ảnh hưởng của diện tích tiếp xúc: Khi thủy phân diện tích tiếp xúc
giữa enzyme protease và thịt cá cũng ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ thủy phân.
Để tạo điều kiện cho enzyme protease hoạt động tốt ngưới ta thường xay nhỏ,
đập dập, cắt khúc cá. Khi diện tích tiếp xúc giữa enzyme protease với protein
càng lớn thì quá trình thủy phân càng dễ dàng và ngược lại.
Ảnh hưởng của thời gian: Thời gian thủy phân kéo dài hoặc rút ngắn đều ảnh
hưởng đến hiệu quả của quá trình thủy phân do enzyme tác động và chất lượng của sản
phẩm. Thời gian tác dụng kéo dài thì enzyme có điều kiện để cắt mạch triệt để, dẫn đến sự
biến đổi sâu sắc của cơ chất, nhưng nếu kéo dài thời gian thủy phân quá mức sẽ tạo điều
kiện cho vi sinh vật hoạt động làm sản sinh ra nhiều sản phẩm thứ cấp như: NH
3
, H
2

S,
indol, … đồng thời khi thời gian kéo dài hiệu quả kinh tế kém. Khi rút ngắn thời gian thủy
phân, sự thủy phân protein chưa triệt để dẫn tới hiệu suất thủy phân kém, gây loãng phí
nguyên liệu và gây khó khăn ở công đoạn lọc, tách xương để thu dịch thủy phân.
Ảnh hưởng của tỷ lệ nước bổ sung vào hỗn hợp thủy phân: Nước là môi
trường thuận lợi cho hoạt động enzyme và vi sinh vật. Các kết quả nghiên cứu cho
thấy, điều kiện để các loại enzyme và vi sinh vật hoạt động được là môi trường phải
có nước và lượng nước ở trạng thái tự do tối thiểu phải là 15%. Do vậy trong quá
trình thủy phân thịt cá nếu ta bổ sung nước với tỷ lệ thấp thì hạn chế hoạt động của
vi sinh vật nhưng đồng thời cũng ức chế hoạt động của enzyme làm giảm hiệu suất
thủy phân. Nhưng nếu bổ sung nước với tỷ lệ quá cao thì chính nước là môi trường
thuận lợi để cho vi sinh vật hoạt động và phát triển phân hủy sản phẩm thành các

12

sản phẩm thứ cấp như: indol, NH
3
, H
2
S… làm ảnh hưởng đến chất lượng bột đạm.
Vì vậy để xác định tỷ lệ nước bổ sung thích hợp cho quá trình thủy phân ta tiến
hành thí nghiệm trên nhiều mẫu bổ sung nước với tỷ lệ khác nhau và từ đó chọn tỷ
lệ nước bổ sung thích hợp cho quá trình thủy phân.
Chất lượng bột cá thành phẩm còn bị ảnh hưởng bởi chất lượng nguyên
liệu cá dùng cho quá trình thủy phân như: loài cá, độ tươi của cá…
Ảnh hưởng của bản thân nguyên liệu: Mỗi loài cá khác nhau sẽ có hàm
lượng protein khác nhaụ, cá có giá trị dinh dưỡng cao sẽ có đầy đủ các axit amin
không thay thế với tỷ lệ cân đối.
Nguyên liệu cũng ảnh hưởng đến chất lượng bột cá thành phẩm, cá ươn thì
sự phân hủy protein thịt cá thành sản phẩm cấp thấp như: indol, scaptol, H

2
S,
NH
3
,…các chất này dễ gây ngộ độc cho người sử dụng.
1.2. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG PROTEASE NỘI TẠNG CỦA
ĐỘNG VẬT THỦY SẢN [06, 11, 12, 34, 39, 42, 43].
1.2.1. Một số nghiên cứu về protease nội tạng của động vật thủy sản
Ở Việt Nam có nhiều công trình công bố về nghiên cứu sử dụng protease,
các công trình công bố tập trung trong các lĩnh vực tách chiết, tinh chế, nghiên cứu
một một số đặc tính của enzyme… một số công trình nghiên cứu về protease nội
tạng tại Việt Nam như:
Nguyễn Văn Lệ (1996) nghiên cứu về protease đầu tôm bộp cho thấy khi
tách protease đầu tôm qua cột lọc gel sephadex G -75 thu được hai protease có nhiệt
độ thích hợp ở 60
0
C, 50
0
C và pH tương ứng là 7,5; 8,5. Tác giả còn cho thấy có thể
sử dụng protease đầu tôm bộp trong thủy phân thu bột đạm từ phế liệu đầu tôm và
ứng dụng trong thủy phân cá.
Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Văn Ngoạn, Phạm Thị Hà, Vũ Thanh Hoa và
Nguyễn Văn Lệ (1993) công bố nghiên cứu về protease đầu tôm biển cho thấy hoạt
độ proteolitic của DC cực đại ở pH 7,5 nhiệt độ 65
0
C; đối với CPE, pH
0pt
là 8,5 và
t
0pt

= 55
0
C. Cystein, iôt và các ion kim loại hoá trị 2 (Ba, Cu, Pb, Ca, Fe, Mg, Cd,
Zn, Mn, Hg) ở nồng độ 10
-3
M làm giảm hoạt độ proteolitic của DC và CPE, tách

13

CPE qua cột sắc kí lọc gel sephadex G-75 thu được hai loại protease có hoạt lực chủ
yếu là protease P-I và protease P-II.
Nguyễn Thị Mỹ Trang (2004), công bố công trình nghiên cứu protease của
đầu tôm bạc nghệ (Metapenaeus brevicornis). Kết quả cho thấy có thể dùng đệm
Britton để chiết enzyme protease có hoạt tính cao và thu nhận chế phẩm protease kỹ
thuật bằng cách dùng aceton để gây kết tủa protease thu được có nhiệt độ thích hợp
là 50
0
C, pH thích hợp từ 8,5÷9,5. khi tách protease này bằng sắc kí lọc gel sephadex
G-75 cho thấy P-II là một protease serine Dùng chế phẩm enzyme kỹ thuật của đầu
tôm này để thủy phân cá mối cho bột đạm chất lượng cao [45].
Nguyễn Văn Truyền (2006), nghiên cứu chiết enzyme protease từ đầu tôm
càng xanh, tác giả nghiên cứu xây dựng quy trình chiết enzyme, thử các yếu tố ảnh
hưởng như: Dùng đệm briton để chiết, kết tủa enzyme protease bằng aceton 70%,
nhiệt độ tối thích 55
o
C, pH tối thích 8, nhiệt độ 60
0
C bị phá hủy, NaCl 1 làm tăng
hoạt tính, Các chất làm giảm hoạt độ protease DC và CPE là: DFP, Cd
2+

, Cu
2+
, Hg
2+,
Pb
2+,
, Mg
2+
, Zn
2+
, Fe
2+
, CN
-
, H
2
O
2
, L- cystein, EDTA trong đó DEP làm giảm gần
như hoàn toàn hoạt tính của proteaes DC và làm mất hoàn toàn hoạt tính của protease
CPE còn Ca
2+
, Ba
2+
, As thì làm tăng nhẹ hoạt độ protease DC và CPE [44].
Các nghiên cứu về protease cá không nhiều, chủ yếu có một số công trình sau:
Đỗ Văn Ninh (2004) công bố các nghiên cứu về protease thu nhận từ nội tạng
cá và gan mực cho thấy chế phẩm protease thu được từ nội tạng cá và gan mực là một
hỗn hợp gồm nhiều protease có nhiệt độ thích hợp từ 50


55
0
C và hoàn toàn có thể
sử dụng protease này trong thủy phân cơ thịt cá để sản xuất dịch đạm thủy phân ứng
dụng trong sản xuất pasta cá cũng như bột dinh dưỡng [34].
Trần Quốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn (2006), nghiên cứu thu nhận chế phẩm
enzyme protease từ ruột cá basa (Pangasius bocourti). Nhóm nghiên cứu cho biết,
dịch chiết protease kiềm thu được có tổng hoạt tính 15,79UI/gCKNT (chất khô nội
tạng) trong điều kiện chiết: tỷ lệ mẫu/dung môi 1/1(w/w); pH 9,5; nhiệt độ 35
o
C;
thời gian chiết 10 phút. Dung môi isopropanol là tác nhân thích hợp nhất để kết tủa
proteasẹ Tỷ lệ thể tích dịch chiết enzyme và thể tích isopropanol là 15/85, mức tinh
sạch chế phẩm protease kiềm là 1,65 lần và hiệu suất thu hồi enzym đạt được là
90,42%.[18].

14

Một số công trình nghiên cứu về protease nội tạng thủy sản nước ngoài như:
Năm 1987 Doke S.N và cộng sự cho biết protease của thịt tôm he Ấn Độ
(P.inducus) là một protease kiềm, hoạt động cực đại ở pH 8,0, bền với nhiệt, hoạt
động phụ thuộc vào ion kim loại, có khối lượng phân tử 25kDa và được xem như
một protease serine Theo các tác giả này, trong thịt tôm còn tìm thấy hoạt động của
exopeptidase mang tính chất của một aminopeptidase, hoạt động cực đại ở pH trung
tính (pH 6,8) [49].
Năm 1996, các tác giả H.R. Kim, H.H. Baek, S.P. Meyes, K.R. Cadwallader
và J.S. Godber thuộc trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp Louisiana đã nghiên cứu
sử dụng “chất chiết từ gan – tụy” của tôm nước ngọt và nhận thấy khi sử dụng
“chất chiết từ gan – tụy” tôm để xử lý phế liệu cua có thể làm tăng khả năng chiết
tách các chất tạo mùi từ phế liệu cua.

Các công trình nghiên cứu trên đã góp phần thúc đẩy lĩnh vực nghiên cứu
về protease nội tạng cá ở nước ta phát triển. Các nghiên cứu ứng dụng protease ở
nước ta vẫn còn một số hạn chế như các chế phẩm enzyme được sản xuất với giá
thành còn cao … Vì vậy cần nghiên cứu làm hạ giá thành chế phẩm enzyme và
đưa ra một phương pháp ứng dụng phù hợp với điều kiện sản xuất thực tế tại
Việt Nam, đặc biệt là cần nghiên cứu về protease từ động vật thủy sản là một
lĩnh vực còn ít các công trình nghiên cứu nhưng có nhiều triển vọng ở nước ta.
1.2.2. Ứng dụng protease trong chế biến thủy sản.
Từ lâu các nhà khoa học đã nghiên cứu và cho biết enzyme protease trong hệ
tiêu hóa ứng dụng trong sản xuất nước mắm rất phổ biến. Nhiều nhà khoa học đã ứng
dụng protease để sản xuất nước mắm ngắn ngày bằng cách bổ sung thêm enzyme
protease từ tụy tạng, ruột non. Thời gian gần đây, nhờ CPE thương mại có tác dụng
thủy phân thịt cá mạnh, rút ngắn thời gian thủy phân thịt cá chỉ còn 10-30 ngày.
Ngoài ra protease còn ứng dụng trong lột da, mang bao rất hiệu quả. Để lột
da một số loài thủy sản vốn rất khó bóc vỏ, tách da ở Iceland đã thực hiện việc
ngâm cá ngừ, cá đuối trong dung dịch hỗn hợp proteaza và cacbohydrase ở 60
0
C,
sau đó phun nước có áp lực trên bền mặt cá, da sẽ được tách ra một cách nhẹ nhàng