Nghiên cứu cấu trúc di truyền một số dòng citrus tristeza virus gây bệnh trên cây ăn quả chi citrus ở việt nam

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lâm Đại Nhân đã tận
tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS.TS. Lê Trần
Bình, PGS.TS. Chu Hoàng Hà đã tạo điều kiện giúp đỡ và đóng góp
những ý kiến quý báu để tồi hoàn thành bản luận văn.
Tồi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy, cồ trong Ban Giám Hiệu
trường ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN trường
ĐHSP Hà Nội 2, Phòng Tổ chúc cán bộ, Phòng
Sau đại học trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện trong thời
gian tôi học tập chương trình thạc sĩ.
Trong thời gian thực tập tôi cũng nhận được sự giúp đỡ tận tình
của Th.s. Đặng Thị Hương, Tập thể cán bộ Phòng Công nghệ tế bào
thực vật, Viện Công nghệ sinh học. Nhân dịp này tồi xin chân thành
cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó.
Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè những người đã
luôn động viên, góp ý cho tôi trong thời gian qua.
MỤC LỤC
2


Hà Nội, tháng 10 năm 2010
La Việt Hồng
LỜT CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
DANH MỤC TÙ VIÉT TẮT
MỞ ĐẦU 1
1. Tính cấp thiết của đề tài 1

2. Mục tiêu nghiên cứu 2
3. Nhiệm vụ nghiên cứu 2
4. Đối tưọng và phạm vinghiên cửu 2
NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀILIỆU 3
1.1. Nguồn gốc, phân bố và giá trị của cây có múi 3
1.2. Những bệnh thường gặp ỏ’ cây có múi 5
1.2.1. Bệnh vàng lá thối rễ 5
1.2.2. Bệnh héo và chết cây do nấm Clitocybe tabessens 5
1.2.3. Bệnh vàng lá Greening 6
MỤC LỤC
3


1.2.4. Bệnh Tristeza 7
1.2.4.1. Triệu chứng và phân bô của bệnh 7
1.2.4.2. Cơ chê lan truyền và trung gian truyềnbệnh 10
1.2.4.3. Virus Citrus Tristeza 11
1.2.4.4. Chuân đoản và phòng chông bệnh 13
1.3. Một số kỹ thuật sinh học phân tử 15
1.3.1. K
ỹ thuật RT-PCR 15
1.3.2. K
ỹ thuật PCR 15
1.3.3. K
ỹ thuật biến nạp plasmide vào E.coỉi 16
1.3.4. K
ỹ thuật tách dòng 17
1.3.5. K
ỷ thuật PCR trực tiếp từ khuẩn lạc 19

1.3.6. K
ỷ thuật xác định trình tự nucleotide 19
1.3.7. X
ử lí số liệu 20
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNGPHÁPNGHIÊN cứu 22
2.1. Vật liệu nghiên cứu 22
2.1.1. V
ật liệu thực vật 22
2.1.2. H
4


óa chất và thiết bị 22
2.2. Phương pháp nghiên cứu 23
2.2.1. S
ơ đồ thí nghiệm 23
2.2.2. P
hương pháp nghiên cứu 23
CHƯƠNG 3. KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31
3.1. Thiết kế mồi 31
3.2. Tách RNA tổng số 32
3.3. Nhân dòng các đoạn gen 33
3.4. Tách dòng gen và xác định trình tự gen 34
3.4.1. Tạo plasmide tái tô hợp 34
3.4.2. Biến nạp vector tái tố hợp vào tế bào khả biến E.colỉ DH5a 35
3.4.3. Chọn lọc plasmide tái tô hợp băng phương pháp colony-PCR 36
3.4.4. Tách plasmide và cắt kiếm tra gen bang enzyme giới hạn 37
3.4.5. Xác định trình tự các đoạn A, F, p của CTV ở các mẫu CT, HG, 38 HN
và VL
KÉT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

1. K
ết luận 45
2. Đ
ề nghị 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO 46
5


PHỤ LỤC 52
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu,
kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố.
Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng của cam, quýt, chanh và bưởi
Bảng 1.2. Hàm lượng vitamin trong quả cam, chanh, quýt, bưởi (mg/100g)
Bảng 2.1. Thành phần môi trường LB đặc, lỏng
Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng tông hợp cDNA
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen
Bảng 2.4. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR khuếch đại gen
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng PCR đọc trình tự nucleotide
Bảng 2.7. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR đọc trình tự nucleotide
Bảng 3.1. Trình tự các cặp mồi đặc hiệu cho CTV
Bảng 3.2. Hệ số tương đồng về trìnhtự nucleotide đoạn Agiữa CT,HG, HN và VL
Bảng 3.3. Hệ số tương đồng về trìnhtự nucleotide đoạn Fgiừa CT, HG, HN và VL
Bảng 3.4. Hệ số tương đồng về trìnhtự nucleotide đoạn pgiữa CT, HG, HN và VL
Hình 1.1. Triệu chứng do virus Citrus Tristeza gây ra Hình 1.2. Rầy mềm, trung
gian truyền bệnh Tristeza
Hình 1.3. (A) Tổ chức genome của CTV kiểu dại (CTV9R), (B) Ảnh hiển vi điện
tử âm bản nucleocapsid
Hình 3.1. Ket quả điện di RNA tách từ 4 mẫu lá trên gel agarose 1%

DANH MỤC HÌNH
6


Hình 3.2. Ket quả điện di sản phấm RT-PCR trên gel agarose 0,8%; M: marker
lkb Hình 3.3. Ket quả điện di kiếm tra sản phẩm tinh sạch PCR; M: Marker 1 kb
Hình 3.4. Sơ đồ cấu tạo vector pBT
Hình 3.5. Khuẩn lạc màu xanh trắng sau khi nuôi qua đêm ở 37°c trên môi trường
LB đặc
Hình 3.6. Ket quả điện di sản phâm colony-PCR với cặp mồi pƯClB trên gel
agarose 1% các mẫu CT, HG, HN và VL, M: Marker 1 kb
Hình 3.7. Ket quả điện di kiếm tra sản phâm cắt plasmide pBT tái tô hợp bằng
enzyme giới hạn đối với mẫu HG, HN, CT và VL; M: Marker 1 kb
Hình 3.8. Ket quả so sánh trình tự nucleotide đoạn A giữa các mẫu CT, HG. HN và
Hình 3.9. Cây phát sinh chủng loại xây dựng trên cơ sở so sánh trình tự đoạn gen
A của CT, HG, HN và VL với các trình tự tương ứng công bố trên GenBank
Hình 3.10. Ket quả so sánh trình tự nucleotide đoạn F giữa các mẫu CT, HG, HN
và VL
Hình 3.11. Cây phát sinh chủng loại xây dựng trên cơ sở so sánh trình tự đoạn
gen F của CT, HG, HN và VL với các trình tự tương ứng công bố trên GenBank


Hình 3.12. Kết quả so sánh trình tự nucleotide đoạn p giữa các mẫu CT, HG, HN
và VL
Hình 3.13. Cây phát sinh chủng loại xây dựng trên cơ sở so sánh trình tự đoạn gen
p của CT, HG, HN và VL với các trình tự tương ứng công bố trên GenBank
|jg microgram
pl microlitre
[Jĩn micrometer
bp base pair

BYV Beet yellows virus
cDNA Complementary DNA
cs
Cộng sự
CP/NCP Protein VO (Coat protein/Nucleocapsid Protein)
CCM Cây có múi
CTV Citrus tristezci virus
CT Cần Thơ (mẫu thu tại tỉnh cần Thơ)
DDBJ Ngân hàng dữ liệugen Nhật Bản thuộc Trung tâm thông tin sinh học
có địa chỉ truy cập: www.ddbi.nig.ac.ip
DEPC Diethyl pyro Carbonate
DNA Deoxyribonucleic acid
EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetic Acid
ELISA Kỹ thuật hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme (Enzyme-linked
immunosorbent assay)
EMBL Phòng Sinh học phân tử Châu Âu thuộc Viện Thông tin Sinh học
Châu Âu có địa chỉ truy cập: www.ebi.ac.uk
HSP70 Heat shock protein 70- protein sốc nhiệt
HG Hà Giang (mẫu thu tại tỉnh Hà Giang)
8


HN Hà Nội (Mầu thu tại Hà Nội)
IPTG Isopropylthio-Ị3-D-galactoside
Kb Kilobase
LB Luria và Bertani
M Marker (thang đo kích thước DNA)
NCBI Trung tâm Thông tin công nghệ sinh học quốc gia của Hoa Kỳ có địa
chỉ truy cập: www.NCBI.nlm.nih.gov
ng Nanogram

nm Nanometer
ORF Open reading frames - khung đọc mở
PNAS Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States
of America (Kỷ yếu Viện Khoa học Quốc gia Hoa Kỳ)
PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuồi polymerase)
PCS Polycloning site - vùng nhân dòng đa điêm cắt
PMF Polymethoxylated flavones
RNA Ribonucleic acid
RNase Ribonuclease
RT- PCR Reverse transcription polymerase chain reaction (phản ứng PCR phiên
mă ngược)
TAE Tris - Acetate - EDTA
Taq Thermus aquatic us
v/p vòng/phút
VL VTnh Long (mẫu thu tại tỉnh VTnh Long)
X-gal 5-brom-4-chloro-3-indolyl-P"D-galactosidase
DANH MỤC TÙ VIÉT TẤT
9


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Cây có múi (CCM) là tên gọi chung của nhóm cây cam, quýt, bưởi, chanh cùng họ
Rutaceae [45]. CCM giữ một vị trí quan trọng trong các loại


cây ăn quả vì đây là loại cây có giá trị dinh dưỡng cao, có hương vị thơm ngon, được
nhiều người ưa dùng. Sản phẩm của CCM được sử dụng với nhiều mục đích khác
nhau như để ăn tươi, vắt lấy nước uống, lấy mùi vị, chế biến thức ăn, làm mứt, chế
biến nước giải khát, làm hương liệu

Trên thế giới, sản xuất CCM là một ngành lớn với diện tích 3,5 triệu ha và sản
lượng 80 triệu tấn/năm, mức tiêu thụ bình quân trên đầu người là 15 kg quả/năm. Ở
Việt Nam, CCM được trồng nhiều ở Đồng bằng sông Cửu Long với diện tích cam
quýt là 94.200 ha, bưởi 45.200 ha, diện tích mỗi năm tăng bình quân gần 7%, CCM
được trồng nhiều ở các tỉnh: cần Thơ, Ben Tre, Đồng Tháp, Vĩnh Long, Tiền Giang
[481.
Tuy nhiên một trong những trở ngại đối với mở rộng diện tích, nâng cao chất
lượng CCM là bệnh vàng lá Greening, bệnh Tristeza làm cho sản lượng cũng như
chất lượng quả giảm, trong đó bệnh Tristeza còn gọi bệnh tàn lụi có tác nhân là virus
Citrus Tristeza gây thiệt hại kinh tế rất lớn trên cây ăn quả có múi [10], [40], [25].
Hiện nay, ở nước ta bệnh Tristeza được coi là một trong hai bệnh gây ảnh
hưởng tới năng suất và phấm chất cây ăn quả có múi cùng với bệnh Greening. Tuy
vậy, vẫn chưa có nhiều nghiên cứu trong việc xác định sự đa dạng về hệ gen của
virus này.
Với những lý do trên chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu cấu trúc di
truyền một số dòng
Citrus tristeza
virus gây bệnh trên cây ăn quả chi
Citrus
ở Việt
Nam”
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Xác định sự đa dạng di truyền của các dòng virus gây bệnh Tristeza ở Việt Nam
trong mối liên hệ với các dòng virus gây bệnh trong khu vực, thế giới đế có biện
pháp quản lý bệnh trên cây ăn quả có múi.
- Góp thêm tư liệu khoa học cho việc xác định trình tự nucleotide toàn bộ hệ genome
11


của virus Citrus Tristeza ở Việt Nam, từ đó đánh giá tính đa dạng di truyền của các

chủng virus được chính xác. Bcn cạnh đó còn có ý nghĩa quan trọng trong việc
nghiên cứu tạo cây chuyển gen kháng virus.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Xác định trình tự 3 đoạn gen của 4 dòng virus gây bệnh trên CCM ở các tỉnh Hà
Giang, Hà Nội, cần Thơ và Vĩnh Long.
- Cây phân loại về sự đa dạng di truyền các đoạn gen của các dòng virus trên.
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng: 4 mẫu lá nhiễm các dòng virus Citrus Tristeza thu tại các tỉnh Hà
Giang, Hà Nội, cần Thơ và Vĩnh Long.
- Phạm vi: xác định trình tự nucleotide 3 đoạn gen của mỗi dòng virus, xây dựng cây
phân loại về sự đa dạng di truyền của 4 dòng virus nghiên cứu.
CHƯƠNG 1. TỎNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Nguồn gốc, phân bố và giá trị của cây có múi
CCM thuộc họ Rutaceae và có khoảng 150 chi và 1500 loài được trồng ở vùng
nhiệt đới và bán nhiệt đới [43], [45]. CCM phát sinh từ vùng Đông Nam Châu Á,
trong đó sự phát triển của một số loài cam quýt được kéo dài từ biên giới Đông Bắc
của Ấn Độ qua Myanma và một số vùng phía nam của Đảo Hải Nam. Những loài này
bao gồm: chanh tây, chanh ta, thanh yên, bưởi, cam ngọt, cam chua [6].
Hiện nay CCM được trồng khắp nơi trên thế giới trong vùng khí hậu nhiệt đới
và Á nhiệt đới. Những vùng trồng phân bố từ vĩ độ 35° Nam đến Bắc, những vùng
thương mại chính là Á nhiệt đới tại vĩ độ cao hơn 20° Nam hay Bắc của xích đạo. Ớ
Việt Nam, CCM được trồng từ Bắc tới Nam. Riêng Đồng bằng sông Cửu Long, CCM
hiện diện tập trung ở các tỉnh Tiền Giang, Vĩnh Long, Đồng Tháp và cần Thơ với các
chủng loại đặc sản như bưởi năm roi, bưởi da xanh, quýt tiều, quýt đường, cam mật,
12


cam dây, cam sành [6].
Cây ăn quả có múi là một loại cây ăn quả lâu năm, nhanh cho thu hoạch, một
số loài có thể cho thu hoạch quả vào năm thứ 2 sau khi trồng. Ở nước ta, 1 ha cam

quýt ở thời kỳ 8 tuối năng suất trung bình có thế đạt 16 tấn. So về giá trị kinh tế 1 ha
trồng cam cho thu nhập gấp 4 - 10 lần 1 ha trồng lúa
Trên thế giới sản xuất CCM là một ngành lớn với diện tích 3,5 triệu ha và sản
lượng 80 triệu tấn/năm, mức tiêu thụ bình quân trên đầu người là 15 kg quả/năm. Ở
Việt Nam, CCM được trồng nhiều ở Đồng bằng sông Cửu Long với diện tích cam
quýt là 94.200 ha, bưởi 45.200 ha, diện tích mỗi năm tăng bình quân gần 7% [48].
Theo tác giả Trần Thượng Tuấn và cộng sự (1994) [6], quả cam quýt được
sử dụng rộng rãi vì chứa nhiều dinh dưỡng cần thiết cho cơ thể, nhất là vitamin
c
(Bảng 1.1; 1.2). Vị chua nhẹ và hơi đắng giúp dễ tiêu hoá, tuần hoàn của máu, vở
giàu pectin được sử dụng làm mứt, kẹo, thuốc nam hay trích lấy tinh dầu, trái được
chế biến thành nhiều sản phấm như: nước giải khát, sirô, rượu bổ

Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng của cam, quýt, chanh và bưởi
Loại
quả
Nước
(%)
Tro
(%)
Protein
(%)
Hydrat
cacbon

(%)
Chất
xơ
(%)
Năng

lượng

(%)
Muối khoáng
(mg/100g)
Ca
p
Fe
Cam
87,5
0,5
0,5
8,4
1,4
43
34
23
0,4
Chan
h
87,5
0,5
0,3
3,6
1,3
18
40
22
0,6
Quýt

88,5
0,6
0,4
8,6
0,8
35
35
17
0,4
Bưởi
83,5
0,4
0,5
15,3
0,7
30
30
19
0,7
13



Tinh dầu được cất từ vở quả, lá và hoa được dùng trong công nghiệp thực
phấm và công nghiệp mỹ phấm. Trên thị trường quốc tế tinh dầu có giá trị rất cao
(1 kg tinh dầu có giá trị trên dưới 300 USD) [1].
Ngoài ra, những loại quả thuộc nhóm Citrus còn được dùng làm thuốc chữa
bệnh. Các thầy thuốc Ấn Độ, Trung Quốc đã dùng vở quả cam để phòng bệnh dịch
hạch, chữa bệnh phối và bệnh chảy máu dưới da. Ớ Mỹ vào những năm 30 của thế kỷ
20 các thầy thuốc đã dùng vỏ cam quýt kết hợp với insulin đế trị bệnh tiểu đường. Ở

Nga bắt đầu thế kỷ 11, các loại quả CCM được sử dụng để phòng ngừa và chữa trị
bệnh y học trong nhân gian, ơ nước ta, nhân dân đã dùng cây lá và hoa quả các loại
cây ăn quả có múi đế phòng và chữa bệnh từ xa xưa, như vỏ quýt có tên dược liệu là
“trần bì”, được sử dụng nhiều trong một số bài thuốc y học cố truyền [1]. Nghiên cứu
mới đây của các nhà khoa học Hoa Kỳ cho thấy hợp chất được chiết xuất từ vỏ cam
quít có tên khoa học là polymethoxylated flavones (PMF) - là những yếu tố chống oxy
hóa tích cực thuộc nhóm flavonoid, có khả năng hạn chế gan xuất tiết loại cholesterol
độc hại LDL - gây ra các bệnh tim mạch [50]. Một thử nghiệm của các nhà khoa học
Israel (Học viện Công nghệ Technion) trên chuột cũng cho thấy tác dụng rất tốt của
dịch chiết từ vở quả cam, chanh, quýt có tác dụng chữa hen suyễn do dịch chiết này
có chứa limonene [50].
Bảng 1.2. Hàm lượng vitamin trong quả cam, chanh, quýt, bưởi (mg/100g)
Loại quả
Vitamin A
Vitamin BI
Vitamin B2
Vitamin pp
Vitamin c
Cam
0,30
0,08
0,03
0,20
48
Chanh
0,30
0,04
0,01
0,01
50

Quýt
0,60
0,08
0,03
0,02
55
Bưỏi
0,02
0,05
0,01
0,10
42
14


1.2. Những bệnh thường gặp ở cây có múi
1.2.1. Bệnh vàng lá thối rễ
Bệnh vàng lá thối rễ là một trong những bệnh quan trọng trên CCM, nhất là
trên cam sành và quýt tiều. Bệnh thường gây hại nặng trong mùa mưa lũ, gân lá có
màu vàng trắng, phiến lá ngả màu vàng xanh và sau đó rụng đi nhất là sau các cơn gió
lớn. Lúc đầu chỉ có một vài cành bị bệnh và biểu hiện sự rụng lá, sau đó toàn lá cây bị
rụng. Khi đào rễ lên ở phía lá vàng và rụng thấy rễ bị thối, vỏ rễ tuột khỏi phần gỗ, gỗ
bị sọc nâu lan dần lên phần rễ chính. Bệnh cũng xuất hiện trên cây bưởi, tuy nhiên
mức độ bệnh ở bưởi ít hơn so với cam sành và quýt tiều. Bệnh chủ yếu do nấm
Fusarium solani tấn công làm hư bộ rễ, tuy nhiên bên cạnh đó còn nhiều tác nhân
khác như Phytophthora, Pythỉum, Slerotỉum, Thỉelavỉopsỉs Trong một số trường hợp
do tuyến trùng gây hại và tạo vết thương cho nấm bệnh tấn công. Các loài tuyến trùng
như: Pratyỉenchus, Radophơlus, Tylenchulus.
1.2.2. Bệnh héo và chết cây do nấm
Clitocybe tabessens

Bệnh héo và chết cây do nấm Clitocybe tabessens thường xảy ra trong
vườn trồng bưởi năm roi và quýt tiều. Triệu chứng biếu hiện qua hiện tượng
lá đọt héo như thiếu nước, khi bệnh nặng thường héo toàn cây, lá khô. Bệnh nặng
trong mùa nắng, bưởi năm roi là bị hại nặng nhất.
1.2.3. Bệnh vàng lá Greening
Là một bệnh gây thiệt hại nặng đến nền sản xuất CCM thế giới nhất là Châu
Phi và Châu Á. Ờ Trung Quốc người ta gọi là “Huanglongbing”, Nam Phi gọi là
Greening. Tuy chưa có một báo cáo chính thức thiệt hại của bệnh, nhưng ở
Philippines người ta đánh giá mức độ nhiễm lên đến 7 triệu CCM [8]. Thái lan có
khoảng 95% cây bị nhiễm bệnh ở các tỉnh phía Bắc và Đông [12], nhiều nước khác
cũng cho thấy thiệt hại của Greening. Ở Việt Nam, bệnh này cũng gây thiệt hại nặng
từ Bắc chí Nam. Có hai dòng chủ yếu gây bệnh này: dòng Châu Phi phát triển mạnh
15


trong điều kiện nhiệt độ 20 - 25°c, dòng Châu Á phát triển cả trong điều kiện lạnh và
nóng (lên đến 35°C) [38]. Vi khuẩn Liberibacters gây bệnh Greening có thế nhiễm
trên tất cả CCM, cam mật, quýt và các dòng lai của quýt là nhiễm nặng nhất. Bưởi
chùm, chanh Rangpus, chanh núm và bưởi nhiễm ít hơn. Chanh giấy, cam ba lá và các
dòng lai có xu hướng chống chịu tốt hơn. Tuy nhiên, không có giống nào kháng lại
bệnh này cả.
Triệu chứng trên lá: sơ khởi với phiến lá biến màu vàng, nhưng kích thước lá
bình thường, đôi khi hình thành những đốm vàng. Những lá mới sau đó nhỏ hơn kích
thước bình thường và mọc thắng đứng, lá bị vàng như triệu chứng thiếu kẽm và sắt.
Ket quả phân tích lá cho thấy hàm lượmg kali cao, nhưng hàm lượng canxi, magie và
kẽm thấp [17], [24].
Triệu chứng trên quả: quả trên cây nhiễm bệnh trở nên nhỏ lại, biến dạng và có
vị đắng hơn, có thế do hàm lượng axit cao và hàm lượng đường giảm thấp. Quả
thường rụng sớm, những quả còn lại thường vẫn giữ được màu xanh [28], có thế vì lý

do này nên người ta gọi theo triệu chứng bệnh là Greening. Quả phát triển lệch tâm,
hạt trên quả bị hỏng và phát triển không bình thường.
Theo báo cáo của Garnier và cộng sự (1984) [18], bệnh Greening do vi khuẩn
Gram âm hiện diện trong mô libe gây ra, vi khuẩn này chưa nuôi cấy được trong
phòng thí nghiệm. Đặc tính của dòng vi khuẩn được xác định thông qua việc định
chuỗi gen 16S ribosome DNA và protein trong ribosome. Ket quả cho thấy vi khuẩn
này thuộc chi Alphaproteobacteria (vi khuẩn Gram âm) và có tên khoa học
“Candidatus Liberibacter”. Loài gây hại ở Châu Phi là Candidatus Liberibacter
africanus. Loài gây hại ở Châu Á (gồm cả Việt Nam) là Candidatus Liberibacter
asiaticus.
Theo các tác giả van Lelyveld LJ và van Vuuren SP (1988) [39], khi cây bị
bệnh greening thì hoạt độ của enzyme peroxidase bị giảm, hoạt động của enzyme này
16


tương quan nghịch với độ nhạy cảm với bệnh greening của loài, do đó có thể sử dụng
chỉ tiêu hoạt độ enzyme peroxidase trong lá như một “chỉ thị” đánh giá khả năng
chống chịu bệnh và độ nhạy cảm với greening.
1.2.4. Bệnh Tristeza
1.2.4.1. Triệu chứng và phân bổ của bệnh
Tristeza là một bệnh nguy hại trên CCM với tác nhân gây bệnh là virus thuộc
họ cỉosterovirus. Triệu chứng bệnh xuất hiện trên CCM tuỳ theo giống, dòng virus
nhiễm (Hình 1.1), được phân loại như sau [44]:
• Mức nhẹ: không gây ảnh hưởng nhiều đến năng suất cây, chỉ gây gân trong
hoặc lõm thân nhẹ trên chanh giấy (Citrus aurantifolia).
• Vàng lùn cây con: gây vàng và lùn trên cây cam chua (sour orange, Citrus
aurantium), chanh giấy (Citrus limon), và bưởi chùm (Citrus paradisỉ).
• Chết nhanh trên cam chua: ghép cam mật (Citrus sinensis) trên gốc ghép cam
chua sẽ cho cây bị lùn, vàng, lõm thân và chết nhanh.
• Lõm thân trên bưởi: cây bị lùn, cả thân và nhánh cây bị lõm nặng khi bóc vỏ

khỏi thân. Giảm năng suất và kích thước quả, cành trở nên giòn và dễ gãy.
• Gây lõm thân trên chanh tàu: cây vẫn sinh trưởng bình thường, thân chính và
cành bị quặc quẹo, khi bóc vỏ thân, phần gỗ bị lõm vào rất nhiều.
• Gây vàng nửa dưới quả gặp ở quýt đường: cây vẫn sinh trưởng và xanh tốt, tuy
nhiên khi quả đạt kích thước bằng quả bóng bàn thì quả bị vàng phần nửa dưới
lên cuống quả, quả rụng hàng loạt, gây thất thoát nặng cho nhà vườn.
Dịch bệnh gây thiệt hại cây với cây cam chua lần đầu tiên được báo cáo ở Nam
Phi trong những năm đầu của thế kỷ 20, và ở Argentina và Brazil trong thập niên 30
thế kỷ trước sau khi các nước này nhập khấu các CCM nhiễm bệnh và rệp truyền bệnh
Toxoptera citricida. Hơn 80 triệu cây ghép trên gốc cam chua (Citrus aurantium) đã
bị chết hoặc không sinh sản được bởi CTV. Các thiệt hại gây ra tại Argentina (hơn 10
17


triệu cây), Brazil (hơn 6 triệu cây) và Hoa Kỳ (hơn 3 triệu cây) [14]. Chỉ riêng ở Tây
Ban Nha có hơn 40 triệu cây, chủ yếu là cam ngọt (Citrus sinensis) và quýt (Citrus
reticulata) được ghép với cam chua cũng giảm khả năng sinh sản [15]. Ngoài ra, CTV
có thể gây ra thân rỗ ở một số giống CCM bất kể gốc ghép được sử dụng, đó là
nguyên nhân quan trọng dẫn đến sự suy giảm của năng suất và chất lượng quả. Đã có
rất nhiều nghiên cứu về bệnh citrus tristeza virus ở vườn cây ăn quả có múi ở Châu
Âu [15], [21], [22]. Khi cây bị bệnh tàn lụi cho ra rất nhiều hoa và quả nhưng chỉ vài
năm cây tàn lụi và chết nhanh chóng [7].
Hiện nay, ở nước ta bệnh Tristeza thấy xuất hiện trên các vườn quýt với triệu
chứng quả bị vàng nửa dưới, còn trên chanh giấy với triệu chứng gân trong và dòng
virus gây lõm thân trên chanh tàu [3], [44].
B
18

(A) Bệnh úa vàng trên cây cam ngọt ghép với gốc cam chua bị nhiễm bệnh do CTV,
so với cây bình thường ở giừa.
(B) Tristeza gây ra sự suy giảm nhanh chóng của cây cam ngọt trên gốc ghép cam

Hình 1.1. Triệu chứng do vừus Citrus Tristeza gây ra
19


chua (cây ở giữa) bao quanh là các cây với các trạng thái bệnh khác nhau suy giảm
chậm.
(C và D) thân của cây cam ngọt nhiễm CTV khi ghép với gốc cam chua, và có dạng
tổ ong ở mặt trong của vỏ cây của các gốc cam chua dưới đoạn chồi của cây bị nhiễm
Tristeza.
(E, F và G) Tristeza là cho quả nhỏ (so với một loại trái cây bình thường trên bàn
tay) các cành và thân của một cây bưởi bị rỗ.
1.2.4.2. Cơ chế lan truyền và trung gian truyền bệnh
Tác nhân truyền bệnh CTV từ cây bị nhiễm bệnh sang cây khoẻ mạnh là rầy
mềm Toxoptera citricida, Aphis gossypii, Aphis spiraecoỉa, Toxơptera aurantii và
Myzus persicae (Hình 1.2) [46]. Nhiều tác giả cho rằng rây mềm Myzus persỉcae chỉ
truyền virus thuộc dòng nhẹ, nên ta có thể dựa vào đó đế lây truyền dòng nhẹ phục
vụ cho phương pháp bảo vệ chéo (Cross- protection). Ngoài ra virus còn được truyền
qua việc chiết ghép.
Sự xâm nhiễm của virus trong thực vật được cho là liên quan đến hai quá
trình: di chuyển từ tế bào này sang tế bào xung quanh (khoảng cách ngắn) và di
chuyến giữa các bộ phận của cây (khoảng cách dài). Svetlana Y. F. và cộng sự
(2008) [35] đã kiếm tra hệ thống xâm nhiễm của CTV ở các loài CCM khác nhau.
Bằng cách sử dụng một dòng CCM “sạch bệnh” CTV và virus gắn protein huỳnh
quang màu xanh (green fluorescent protein-labeled virus), kết quả cho thấy có sự di
chuyển từ tế bào tới tế bào và di chuyển khoảng cách dài, hai con đường này thường
không bị giới hạn, và khả năng di chuyển thay đối tuỳ theo cây chủ. Tập trung phân

tích sự xâm nhiễm ở hai loài cây có múi khác nhau, Citrus macrophylla (loài ít nhạy
cảm với CTV) và cam chua (loài nhạy cảm hơn với CTV), đã cho thấy rằng trong các
cây chủ nhạy cảm hơn có các điếm xâm nhiễm bao gồm một nhóm các tế bào, trong
khi ở những loài CCM ít nhạy cảm với CTV thường là duy nhất một tế bào.
20



1.2.4.3. Virus Citrus Tristeza
Virus Citrus Tristeza (CTV) có nguồn gốc ở Châu Á và đã lan truyền đến tất
cả các nước đang phát triến CCM. CTV thuộc chi Closterovỉrus có kích thước
khoảng 2000
X
12 nm [23], [13], [33] (Hình 1.3 B). Genome là sợi RNA đơn dương,
không phân đoạn. Vo protein bao gồm hai phân tử protein CP và CPm có kích thước
phân tử tương ứng khoảng 25 kDa (chiếm 95%) và 27 kDa (chiếm 5%) [41]. Protein
CP cấu tạo nên phần thân của virus còn protein CPm cấu tạo nên phần đuôi ngắn của
virus. Hình thành hạt virion có cấu trúc “rắn đuôi chuông” ở đầu 5’ của hạt virion,
cấu trúc virion bất thườn này lần đầu tiên được phát hiện ở BVY (Beet yellows virus)
[19]. Những phân tích hoá sinh và di truyền cho thấy hai protein này giữ những chức
năng khác nhau trong hạt virion virus.
Bộ gen của CTV có kích thước khoảng 19,3 kb (Hình 1.3 A) bao gồm 12
khung đọc mở (ORF - open reading frames) và hai vùng không mã hoá (UTR) đầu 5’
và đầu 3’, mã hoá cho ít nhất 19 protein bao gồm 2 enzyme protease tương tự papain,
các protein liên quan tới sự tái bản (RNA polymerase, helicase, methyltransferase),
protein giống với heat shock protein Hsp70 homolog (Hsp70h), 2 protein vỏ CP và
CPm, protein p23 tương tác với RNA, protein p20 được tích luỹ trong thể vùi. Một
so protein chưa rõ chức năng như p61, pl3, p 18 [32], [33], [34], [47]. Hsp70h đóng
vai trò kép liên quan đến việc hình thành đuôi của virion, và sự chuyển động của
virus từ tế bào này sang tế bào khác [10].

Trình tự bộ genome hoàn chỉnh của một vài dòng CTV đã được công bố [23],
Hình 1.2. Rầy mềm, trung gian truyền bệnh Tristeza
21


[35], [30], [27], [40], [8], [42], Các chủng CTV khác nhau trên thế giới có độ
tương đồng gen là không giống nhau, độ bảo thủ CTV giảm dần từ đầu 3’-5’ [10].


(B) Ánh hiến vi điện tử âm bản nucleocapsid rộng và nhỏ của CTV (trái), và
nucleocapsid được xử lí bằng kháng thê đặc hiệu CPm, được gắn vào đó là các hạt
vàng 10 nm (phải).
Đe xác định trình tự genome có vai trò trong việc biếu hiện bệnh, Albiach và
cộng sự (2010) [9] sử dụng phương pháp lai phân tử từ hai chủng T36 gây vàng cây
ghép (seedling yellows syndrome) và T30 không gây triệu chứng này để xác định
trình tự liên quan. Các tổ hợp lai T36/T30 được tạo ra bằng cách thay thế một số
vùng trình tự T30 vào các vùng khác nhau genome đầu 3’ của chủng T36, sau đó tái
bản trong tế bào trần thuốc lá. Các hạt virion được hình thành được nhiễm vào Citrus
macrophylla, làm tương tự với chủng
T36 đế làm đối chứng. Các mẫu này sau đó được ghép lên cam chua. Kết quả cho
thấy, với tố hợp lai T36/T30 được thay thế bởi trình tự T30 ở vùng không được dịch
mã p23-3’ (vị trí nucleotide từ 18.394-19.296) không có triệu chứng vàng cây ghép
hoặc chỉ có rất ít triệu chứng này.
PRO PRO
L I
1 I
MT
J
IhElI

p33
1 1
HSP70h

CPm
n í n


1
RdRp
]

p6


CP

□

p
u


p23

CTV9R (a)
B
Hình 1.3. (A) Tố chức genome c
ủa CTV kiêu dại
(CTV9R): PRO: protein giống papain, MT:

methyl
transferase, HEL: helicase, RdRp: RNA -
dependent
RNA polymerase.
22


Tác giả Ngô Ngọc Lan và cộng sự [3] đã tách dòng và xác định trình tự gen
mã hoá protein vỏ CP và CPm của hai dòng virus gây bệnh ở cây quýt trồng tại cần
Thơ và cây cam sành trồng tại Vĩnh Long, đã thu được gen CP có kích thước 672
nucleotide và gen CPm có kích thước 723 nucleotide. Hai gen này có mức độ tương
đồng cao so với 10 dòng CTV ở các nước khác nhau, hai dòng CTV của Việt Nam
được xếp chung vào một nhóm cùng với dòng NuagA (Nhật Bản), BI65 (Hoa Kỳ), SY
568 (Hoa Kỳ), VT (Israel), T3 1 8A (Tây Ban Nha) trên cây phát sinh chủng loại.
CTV được chia thành 5 chủng chính [46]:
• Virus seedling yellows
• Virus grapefruit pitting
• Virus grapefruit stunt bush
• Virus lime die-back
• Virus Ellendale mandarin decline
1.2.4.4. Chuan đoán và phòng chổng bệnh
Bệnh Tristeza gây ra từ nhiều dòng virus khác nhau, việc hiếu rõ dòng virus
gây hại giúp cho việc quản lý bệnh dễ dàng hơn, các dòng CTV khác nhau thì gây
bệnh khác nhau và chúng có thế chứa các genome “biến thế” tùy thuộc loài rệp
truyền bệnh và loại gốc ghép. Các dòng này có thể được phân biệt bằng các xét
nghiệm các mẫu RNA mạch kép [29] hoặc bằng cách sử dụng kháng thể huyết thanh
đơn dòng đặc hiệu [16] hoặc các kháng thể đơn dòng MCA13 [31]. Có thể sử dụng
một số phương pháp sau đế giám định:
- Phương pháp giám định bệnh đơn giản nhất là ghép mắt bệnh lên cây chanh
giấy, nếu triệu chứng gân trong xuất hiện trên lá non chứng tỏ cây đã nhiễm

bệnh.
- Phương pháp hữu hiệu nhất có thể sử dụng là dùng kháng thể để giám định
23


bệnh thông qua ELISA, Immuno Sorbent Eletron Microcopy (ISEM), Dot
Immuno Blot Assay (DIBA) hoặc que thử nhanh.
- Phương pháp RT-PCR cũng được sử dụng rộng rãi trong việc giám định bệnh.
- Sự phát triển của Tissue print-ELISA [15], [20], để phát hiện CTV trong các
mặt cắt của nguyên liệu thực vật trên màng nitrocellulose, cho phép kiếm tra
với độ nhạy cảm cao của hàng ngàn mẫu một cách đơn giản mà không cần
phải chiết xuất.
Đẻ phòng chống bệnh Tristeza, nhiều phương pháp có thể được áp dụng như
loại trừ cây bệnh, thay đổi phương pháp canh tác như trồng xen canh với ối. Biện
pháp phòng trừ sinh học như sử dụng dòng nhẹ đế bảo vệ chéo, sử dụng gốc ghép
kháng bệnh, sử dụng công nghệ sinh học thông qua chuyển gen, cụ thể như:
- Dùng dòng gây bệnh nhẹ để chủng lên cây và cây sẽ chống chịu tốt khi có
dòng khác độc hơn tấn công (cơ chế bảo vệ chéo - Mild strain crossprotection)
- Sử dụng giống kháng hoặc gốc ghép kháng: nhiều giống CCM tỏ ra chống
chịu bệnh này nghĩa là virus vẫn tồn tại trên cây nhưng không lộ triệu chứng.
Một số giống khác kháng lại bệnh cũng có nghĩa là virus không nhân mật số
trên cây bị nhiễm. Những cây này thuộc nhóm Poncirus trifoliate, Swingled
glutỉnosa và Severinia buxifolia [30].
- Tạo cây chuyến gen kháng đang được ứng dụng ở nhiều nước trên thế giới,
trong đó Hoa Kỳ là nước đi đầu và đã bắt đầu từ 1996. Người ta sử dụng
chính gen từ vỏ protein của virus hay gen cần thiết cho sự sao chép của virus
đế chuyển vào cây với hy vọng đem lại tính khảng cho cây. Tuy nhiên kết quả
mới ở trong phạm vi phòng thí nghiệm và mức độ nhà lưới.
Sử dụng thuốc Coníĩdor cho bệnh vàng lá Greening và rầy chống cánh cũng có
tác dụng tốt đối với rầy mềm, trung gian truyền bệnh Tristeza.

1.3. Một số kỹ thuật sinh học phân tử
24


1.3.1. Kỹ thuật RT-PCR
Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase, Polymerase chain reaction) là sự
kết hợp của hai phản ứng sao mã ngược (reverse transcription) và PCR đế nhân lên
một đoạn gen quan tâm từ RNA. Kỹ thuật này gồm hai giai đoạn:
• Tống họp sọ’i cDNA thứ nhất
Nguyên lí của phương pháp này là sử dụng enzyme sao mã ngược (Reverse
Transcriptase) đế tống hợp nên sợi cDNA thứ nhất từ RNA. Tuỳ theo mục đích của
thí nghiệm mà các loại RNA được sử dụng khác nhau.
Neu muốn nhân một đoạn gen của sinh vật bậc cao mà không có intron thì
người ta thường tống hợp cDNA từ mRNA với mồi oligo(dT)s. Neu là sinh vật bậc
thấp như vi khuẩn, virus Người ta có thể tổng hợp cDNA từ RNA tống số với mồi
ngẫu nhiên hoặc mồi đặc hiệu cho đoạn gen cần nhân lên. Khi mồi gắn bố sung với
sợi RNA khuôn, enzyme sao mã ngược sẽ xúc tác cho quá trình tống hợp cDNA từ
các nucleotide tự do có trong thành phần phản ứng ở một nhiệt độ thích hợp. Phản
ứng tổng hợp cDNA chỉ xảy ra trong một chu kỳ, theo lý thuyết sau khi kết thúc phản
ứng, thu được lượng cDNA tương ứng với lượng RNA khuôn ban đầu. Đe tăng hiệu
quả cho quá trình tống hợp, lượng mồi đưa vào lớn hơn rất nhiều lượng RNA khuôn
và chất kìm hãm (ức chế) enzyme RNAse cũng được đưa vào bảo vệ cho RNA khỏi
bị cắt bởi enzyme RNAse.
• Khuếch đại gen bằng kỹ thuật PCR
Sử dụng cDNA làm khuôn để khuếch đại gen quan tâm bằng phản ứng PCR
với cặp mồi đặc hiệu (Primer-F, Primer-R).
1.3.2. Kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction - chuồi phản ứng trùng hợp) được
Kary Mullis (bằng sáng chế của Hoa Kỳ số 4.683.202) phát minh năm 1985 [4]. Đây
là kỹ thuật tương đối đơn giản cho phép nhân nhanh in vitro một số lượng không hạn

chế nguyên bản một đoạn DNA nhất định trong một khoảng thời gian ngắn, nhờ sự
xúc tác của DNA polymerase. Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp
một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những cặp mồi đặc
25


hiệu. Mồi (primer) là những đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một
đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài đế hình thành mạch mới. Quá
trình này gồm ba bước:
Biến tính DNA từ dạng sợi kép thành dạng sợi đơn bằng cách nâng nhiệt độ
lên 94-95°C trong khoảng thời gian 30 giây đến 1 phút.
Gắn mồi với đoạn DNA cần nhân thông qua hạ nhiệt độ xuống 40- 60°c, trong
khoảng 30 giây đến 1 phút, phụ thuộc vào độ dài và tỉ lệ G+C của đoạn mồi.
Phản ứng polymerase tổng hợp phân tử DNA kéo dài từ đoạn mồi. Hai phân tử
DNA mới được tống hợp theo nguyên tắc bố sung từ hai phân tử khuôn ban đầu. Thời
gian kéo dài từ 1 phút đến vài phút. Đe tránh hiện tượng bắt cặp không đặc hiệu,
phản ứng tống hợp nên được thực hiện ở nhiệt độ
72°c.
Loại polymerase dùng trong
PCR là loại chịu nhiệt (Taq polymerase) được tách chiết từ vi khuấn Thermus
aquaticus, một loại vi khuấn được phân lập từ suối nước nóng. Hiện nay enzyme này
được sản xuất chủ yếu theo con đường tái tổ hợp [5].
Như vậy, sau mỗi chu kỳ phản ứng lượng DNA cần nhân bản sẽ tăng gấp đôi,
với N sợi khuôn ban đầu sau n chu kỳ sẽ có Nx2
n
sợi DNA được nhân lên. Ví dụ, sau
khoảng 20 chu kỳ có tới trên 30 triệu bản được nhân lên từ một sợi khuôn ban đầu.
1.3.3. Kỹ thuật biến nạp plasmid vào
Escherichia colỉ

Biến nạp theo nghĩa rộng là đưa bất kì đoạn DNA vào bất kì tế bào nào. Trong
trường hợp các tế bào E.coli thì có nghĩa là đưa DNA plasmid vào trong tế bào.
Plasmid là những phân tử DNA vòng, sợi kép, tự tái bản, được duy trì trong vi
khuẩn như các thực thể độc lập ngoài nhiễm sắc thể, một so plasmid mang thông tin
về việc di chuyến chính nó từ tế bào này sang tế bào khác (F plasmid), một số khác
mã hoá khả năng kháng lại kháng sinh (R-plasmid) và một số khác mang bộ gen đặc
biệt để sử dụng các chất chuyển hoá bất thường (plasmid phân huỷ). Mỗi plasmid có
một trình tự thực hiện chức năng làm “điểm khởi đầu” sao chép DNA [4].
Lần đầu tiên biến nạp ở vi khuẩn được Frederick Griffith mô tả vào năm 1928