tóm tắt luận án nghiên cứu đặc điểm một số gen điều hoà sinh tổng hợp anthocyanin liên quan đến tính chịu hạn của cây ngô nếp địa phương

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN


PHẠM THỊ THANH NHÀN



NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM MỘT SỐ GEN ĐIỀU
HOÀ SINH TỔNG HỢP ANTHOCYANIN LIÊN
QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY NGÔ
NẾP ĐỊA PHƢƠNG

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 62 42 01 21


TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC



THÁI NGUYÊN, NĂM 2014


2

Công trình đƣợc hoàn thành tại Trƣờng Đại học Sƣ phạm – Đại học
Thái Nguyên


Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: GS. TS. Lê Trần Bình


Phản biện 1:

Phản biện 2:

Phản biện 3:

Luận án sẽ đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng chấm luận án cấp Đại học
họp tại Trƣờng Đại học Sƣ phạm- Đại học Thái Nguyên
Vào hồi giờ ngày tháng năm 2014

Có thể tìm luận án tại:
Thƣ viện Quốc gia
Trung tâm Học liệu- Đại học Thái Nguyên
Thƣ viện trƣờng ĐH Sƣ phạm- ĐH Thái Nguyên


1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Ngô (Zea mays L.) là một trong ba cây ngũ cốc quan trọng nhất
cung cấp lƣơng thực cho loài ngƣời và là cây thức ăn cho gia súc (với
70% chất tinh trong khẩu phần ăn), là nguyên liệu cho các nhà máy sản
xuất và chế biến lƣơng thực- thực phẩm- dƣợc phẩm, là mặt hàng nông
sản xuất khẩu có giá trị. Giá trị sử dụng rộng rãi của ngô đƣợc chứng
minh bằng 670 mặt hàng khác nhau. Ở Việt Nam, ngô là cây lƣơng thực
quan trọng thứ hai sau lúa của nông dân vùng trung du và miền núi phía
Bắc, và là cây lƣơng thực chính của đồng bào các dân tộc thiểu số ở các
vùng núi cao. Năm 2012, tỉnh Sơn La có diện tích trồng lúa là 48200 ha,
ngô là 133700 ha; tỉnh Hà Giang có diện diện tích trồng lúa là 37400
ha, ngô là 52500 ha; tỉnh Cao Bằng có diện tích trồng lúa là 30700 ha,
ngô là 39300 ha; tỉnh Lào Cai có diện tích trồng lúa là 30600 ha, ngô là
33700 ha (theo Tổng cục thống kê, 8/2013).
Nƣớc ta có 75% diện tích là đồi núi, lƣợng mƣa hàng năm không

đồng đều giữa các vùng, tình trạng hạn hán thƣờng xuyên xảy ra dẫn
đến năng suất của các giống cây trồng nói chung, cây ngô nếp địa
phƣơng nói riêng bị giảm. Trong những năm gần đây, hƣớng sản xuất
ngô ở nƣớc ta là tăng cƣờng diện tích ngô lai có năng suất cao trên cơ
sở ứng dụng các thành tựu khoa học kỹ thuật tiên tiến. Các giống ngô
nếp địa phƣơng có chất lƣợng hạt cao, khả năng chịu hạn tốt và phù hợp
với điều kiện canh tác đất dốc của từng vùng ở miền núi, nhƣng do năng
suất thấp nên nhiều giống quý bị mất dần. Vì vậy, việc nghiên cứu và
chọn tạo các giống ngô có khả năng chịu hạn là rất cần thiết, góp phần
bảo tồn nguồn gen và tạo vật liệu cho lai giống.
Trƣớc đây, công tác chọn giống truyền thống thƣờng tốn rất
nhiều thời gian và công sức, nhất là đối với những tính trạng đa gen
chịu nhiều ảnh hƣởng của điều kiện môi trƣờng. Hiện nay, công nghệ
sinh học đƣợc coi là phƣơng tiện hữu hiệu để khắc phục những vấn đề

2
khó khăn đó. Sự hiểu biết về phân tử DNA, RNA, protein, hay các hợp
chất thứ cấp có liên quan đến các đặc tính, tính trạng giúp cho ngƣời
nghiên cứu chủ động lựa chọn kỹ thuật sinh học tác động vào chúng
nhằm nhận dạng giống cây trồng theo mong muốn. Chọn giống nhờ sự
trợ giúp của chỉ thị phân tử liên kết với các tính trạng (Molecular
Assisted Selection- MAS) đang ngày càng đƣợc quan tâm vì phƣơng
pháp này có thể rút ngắn đƣợc thời gian chọn lọc, thậm chí có thể chọn
lọc sớm ở giai đoạn cây non.
Anthocyanin là một loại sắc tố dịch bào, là sản phẩm thứ cấp của
quá trình trao đổi chất. Anthocyanin thuộc nhóm flavonoid, xuất hiện
trong các bộ phận của thực vật với màu đỏ, đỏ tía, tím và xanh đậm.
Ngoài việc tạo màu sắc đẹp để bảo vệ và thụ phấn, anthocyanin còn có
hoạt tính sinh học rất quý là khả năng chống oxy hóa mạnh, giúp tế bào
giữ nƣớc khi mất cân bằng áp suất thẩm thấu. Anthocyanin đƣợc coi là

một dấu hiệu của điều kiện cực đoan và là một phần trong cơ chế hạn
chế tác động tiêu cực đó. Hiện nay, định hƣớng nghiên cứu xác định chỉ
thị cho đặc tính chịu hạn của cây trồng đang đƣợc quan tâm, trong đó có
chỉ thị sắc tố anthocyanin.
Xuất phát từ các lý do trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài “Nghiên
cứu đặc điểm một số gen điều hoà sinh tổng hợp anthocyanin liên
quan đến tính chịu hạn của cây ngô nếp địa phƣơng”.
2. Mục tiêu của đề tài
Xác định đƣợc mối tƣơng quan giữa anthocyanin và khả năng
chịu hạn của cây ngô nếp địa phƣơng.
Xác định và phân lập đƣợc một số gen điều hòa quan trọng liên
quan đến sinh tổng hợp anthocyanin ở cây ngô nếp địa phƣơng.
Đánh giá đƣợc mức độ phiên mã của gen điều hòa sinh tổng hợp
anthocyanin của ngô nếp địa phƣơng trong điều kiện hạn.
Những mục tiêu trên nhằm định hƣớng ứng dụng trong tuyển chọn
và bảo tồn giống ngô nếp có chất lƣợng và khả năng chịu hạn cao.

3
3. Nội dung nghiên cứu
- Đánh giá khả năng chịu hạn thông qua một số chỉ tiêu sinh lý, hoá
sinh (hàm lƣợng đƣờng, hoạt độ amylase, chỉ số chịu hạn tƣơng
đối ). Phân nhóm các giống ngô theo mức độ chịu hạn.
- Xác định mối tƣơng quan giữa sự biến đổi hàm lƣợng anthocyanin
và khả năng chịu hạn của ngô nếp địa phƣơng.
- Phân lập 02 đoạn gen B và Lc điều hòa hoạt động của nhóm gen cấu
trúc mã hoá enzyme chuyển hóa tổng hợp sắc tố anthocyanin ở đại
diện của nhóm giống ngô chịu hạn tốt và kém trong điều kiện hạn.
- Sử dụng kỹ thuật real- time RT- PCR để phân tích, so sánh mức độ
biểu hiện của gen B và Lc giai đoạn phiên mã ở đại diện của nhóm
giống ngô chịu hạn tốt và kém trong điều kiện hạn.

4. Những đóng góp mới của luận án
- Xác định đƣợc mức độ tƣơng quan giữa hàm lƣợng anthocyanin với
khả năng chịu hạn của cây ngô nếp địa phƣơng, và anthocyanin
đƣợc coi là một trong các chỉ thị chọn lọc giống ngô chịu hạn.
- Phân lập đƣợc 02 đoạn gen B và Lc mã hóa cho protein là nhân tố
phiên mã điều hòa quá trình sinh tổng hợp anthocyanin
- Bƣớc đầu xác định đƣợc mức độ phiên mã của 02 gen B và Lc là
một trong các chỉ thị cho khả năng chịu hạn giai đoạn cây ngô non.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Ý nghĩa khoa học
- Kết quả nghiên cứu của luận án cung cấp những dẫn liệu khoa học
về vai trò của anthocyanin khi cây ngô nếp địa phƣơng bị hạn
- Cung cấp thông tin về hai gen điều hòa (nhân tố phiên mã) B và Lc
thuộc họ bHLH tham gia sinh tổng hợp anthocyanin ở cây ngô nếp
địa phƣơng bị hạn.
- Tìm hiểu đƣợc cơ sở sinh học phân tử của khả năng chịu hạn ở cây
ngô nếp địa phƣơng thông qua so sánh mức độ biểu hiện của gen
điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin.
Ý nghĩa thực tiễn

4
- Kết đánh giá khả năng chịu hạn của cây ngô nếp địa phƣơng giai
đoạn hạt nảy mầm và cây non đƣợc sử dụng làm cơ sở để đánh giá
khả năng chịu hạn ở cây trồng. Trong đó, anthocyanin đƣợc xem là
chất chỉ thị chọn lọc và chất chống oxy hóa cao.
- Sử dụng gen Lc của ngô nhƣ một gen chỉ thị mạnh mẽ để tăng tổng
hợp anthocyanin nhằm tạo ra các loại thực phẩm vừa có lợi cho sức
khỏe ngƣời tiêu dùng, vừa có tiềm năng kinh tế cho ngƣời sản xuất
và vừa có lợi cho sự chống chịu hạn cho bản thân cây trồng.
6. Cấu trúc của luận án

Luận án dài 132 trang gồm các phần: Mở đầu (4 trang); Chƣơng
1. Tổng quan tài liệu (35 trang); Chƣơng 2. Vật liệu và phƣơng pháp
nghiên cứu (14 trang); Chƣơng 3. Kết quả và thảo luận (50 trang); Kết
luận và đề nghị (1 trang); Các công trình đã công bố liên quan đến luận
án (1 trang); Tài liệu tham khảo (20 trang) với 24 tài liệu Tiếng Việt và
167 tài liệu tiếng Anh; 24 bảng số liệu; 28 hình; Phụ lục 06 trang.

Chƣơng 1.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Luận án đã tham khảo và tổng kết 191 tài liệu với các nội dung bao
gồm: (1) Cây ngô; (2) Phản ứng của cây ngô trƣớc hạn (Mối liên quan giữa
hạn và tính chống chịu stress oxy hóa; Các dạng oxy hoạt hóa; Hệ thống bảo
vệ cây trồng khỏi tác động của oxy hóa; Cơ sở sinh lý, sinh hóa và sinh học
phân tử của tính chịu hạn ở cây ngô); (3) Anthocyanin và vai trò chuyển hóa
các dạng oxy hoạt hóa (Vai trò của anthocyanin khi thực vật bị hạn; Gen
điều hòa tổng hợp anthocyanin ở cây ngô); (4) Ứng dụng real- time PCR
nghiên cứu mức độ biểu hiện gen tham gia sinh tổng hợp anthocyanin.
Kết quả phân tích và tổng hợp khẳng định cây ngô là một loài
ngũ cốc có giá trị hết sức quan trọng đứng cạnh lúa mì và lúa nƣớc. Ở
các vùng núi cao và vùng sâu của Việt Nam, ngô nếp đƣợc ngƣời dân sử
dụng làm lƣơng thực chính. Cũng nhƣ tình trạng chung trên thế giới, các
nghiên cứu về giống ngô nếp địa phƣơng ở Việt Nam đƣợc công bố ít và

5
đang đứng trƣớc nguy cơ bị xói mòn quỹ gen. Vì vậy, việc sƣu tập, nghiên
cứu và đánh giá một cách toàn diện nguồn gen các giống ngô nếp địa
phƣơng là hết sức cần thiết cho công tác giống, và bảo tồn.
Hiện tƣợng nóng hạn thƣờng xuyên xảy ra làm sản sinh các gốc
tự do (hay các dạng oxy hoạt hóa, Reactive Oxygen Species- ROS) oxy
hoá các đại phân tử, làm mất hoạt tính của chúng và gây độc cho tế bào.

Có nhiều giả thuyết giải thích về cơ chế này ở cây ngô. Các cơ chế tập
trung theo hai hƣớng: chống hạn và chịu hạn. Theo hƣớng thứ nhất, cây
biến đổi hình thái để hạn chế sự mất nƣớc. Hƣớng thứ hai diễn ra nhiều
cơ chế: sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu, sự đóng bớt khí khổng, tăng
hàm lƣợng các chất hoà tan, tăng kích thƣớc bộ rễ, tăng tổng hợp các
chất chỉ thị
Anthocyanin là những glucozit, thuộc họ flavonoid, do gốc đƣờng
glucose, glactose kết hợp với gốc aglucon có màu. Ngoài tác dụng là
chất màu thiên nhiên đƣợc sử dụng rất an toàn trong thực phẩm,
anthocyanin là hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học quí nhƣ khả năng
chống oxy hóa mạnh, tăng khả năng giữ nƣớc của tế bào. Anthocyanin
hạn chế tác động của hạn bằng các cách nhƣ: (i) lọc ánh sáng để làm
giảm mức độ nghiêm trọng của sự ức chế quang hoá và phục hồi quang
tổng hợp ở lá; (ii) làm giảm một lƣợng lớn các lƣợng tử cao năng là
nguyên nhân tạo ra các ROS hoặc có thể loại ROS trực tiếp (khả năng
chuyển hóa ROS gấp 4 lần so với vitamin E, C).
Sinh tổng hợp anthocyanin đƣợc nghiên cứu đầu tiên trên đối
tƣợng Zea mays. Sự có mặt của anthocyanin là kết quả của một chuỗi
phản ứng hoá sinh có sự xúc tác của các enzyme đƣợc mã hoá bởi các
gen CHS (hay gen C2), DFR (hay gen A1), CHI, F3’H, F3’5’H, ANS,
3GT (hay gen bronze1- Bz1). Đó là các gen cấu trúc. Sự biểu hiện của
các gen này rất cần sự có mặt các TFs thuộc họ MYB, MYC (hay
bHLH) và WD40. Ở thực vật, các protein MYB và MYC tham gia vào
quá trình chống chịu hạn của tế bào. Các gen thuộc họ MYB điều hòa
sinh tổng hợp anthocyanin ở ngô đã đƣợc nghiên cứu gồm C1

6
(colorless1), P1 (Pericarp color1), và Pl (purple leaf). Trong khi các
gen thuộc họ MYC đƣợc nghiên cứu gồm B (booster), R (red), Sn và Lc
(Leaf color).

Anthocyanin có mặt ở hầu hết các bộ phận của nhiều loài thực vật,
đặc biệt trong rau, củ và quả. Do vậy, anthocyanin là một phần không
thể thiếu trong chế độ ăn uống của con ngƣời và mang lại nhiều lợi ích
sức khỏe. Nghiên cứu về chất chỉ thị anthocyanin, ngƣời ta thấy rằng
khi thực vật bị hạn, hàm lƣợng chất này đƣợc tăng cƣờng, làm thay đổi
màu sắc của thân và lá, làm tăng tính chống chịu hạn của cây. Đây là
kết quả tác động của các protein và enzyme do các gen mã hóa liên
quan. Việc nghiên cứu cơ chế điều hòa và điều khiển quá trình này
nhằm tạo ra nguồn lƣơng thực, thực phẩm giàu anthocyanin hay chọn
tạo những giống cây có khả năng chống chịu hạn mang lại giá trị thực
tiễn rất cao. Hƣớng nghiên cứu này còn mới mẻ, đặc biệt đối với các
giống ngô nếp địa phƣơng ở Việt Nam.

Chƣơng 2.
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU
- Đề tài luận án sử dụng 10 giống ngô nếp địa phƣơng do Viện nghiên
cứu ngô Đan Phƣợng- Hà Nội cung cấp: BN (Bản Nƣa), BS1 (Bản Son
1), DG2 (Dẻ Gà 2), ĐX2 (Đông Xuân 2), KL (Khuổi Liềng), Mo (Mo),
NH (Nà Hạo), PT (Pác Tàn), TB (Thôn Búa), VK2 (Vân Kiều 2).
- Đề tài sử dụng vector pBT và chủng vi khuẩn E.coli DH5α do Phòng
Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ cung cấp.
2.2. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU, HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ
2.2.1. Địa điểm nghiên cứu
- Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, Phòng Công nghệ ADN
ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam, Hà Nội.

7

- Phòng thí nghiệm Di truyền và Công nghệ gen, Khoa Sinh- KTNN,
Trƣờng Đại học Sƣ phạm Thái Nguyên.
2.2.2. Hóa chất
Sử dụng các loại hóa chất tinh khiết có nguồn gốc từ Anh, Đức,
Mỹ, Thụy Điển của hãng Invitrogen, Fermatas, Roche, Merck
2.2.3. Thiết bị
Các thiết bị đƣợc sử dụng đƣợc sản xuất bởi các hãng có uy tín cao
Roche, AB applied Biosystem, Biorad, Eppendorf
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Nhóm phƣơng pháp hoá sinh
- Định lƣợng lipit tổng số; Xác định hàm lƣợng đƣờng (Nguyễn Văn
Mùi, 2001);
- Xác định hoạt độ - amylase theo phƣơng pháp của Heikel đƣợc mô
tả trong tài liệu của Phạm Thị Trân Châu và Trần Thị Áng (1997);
- Xác định hoạt độ protease theo phƣơng pháp Ason cải tiến (Nguyễn
Văn Mùi, 2001);
- Phƣơng pháp chiết tách anthocyanin cải tiến theo quy trình của Luis
(2001) và Huỳnh Thị Kim Cúc (2007);
- Định lƣợng anthocyanin (Luis, 2001).
2.3.2. Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn của một số giống ngô nếp
địa phƣơng (Lê Trần Bình và Lê Thị Muội, 1998)
2.3.2. Nhóm phƣơng pháp sinh học phân tử
- Phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số theo kit Trizol (Invitrogen);
- Phƣơng pháp RT- PCR;
- Tạo vector tái tổ hợp;
- Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến chủng E.coli DH5;
- Kiểm tra sản phẩm chọn dòng;
- Tách plasmid;
- Xác định trình tự gen;
- Phƣơng pháp real- time PCR.

2.3.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu

8
- Các số liệu thống kê đƣợc xử lý trên máy vi tính bằng chƣơng trình
Excel theo Chu Hoàng Mậu (2008).
- Sử dụng phần mềm NTSYS version 2.02i để phân tích sự đa dạng và
mối quan hệ giữa các giống ngô.
- Sử dụng phần mềm BioEdit, DNAstar, ClustalW phân tích trình tự gen.

Chƣơng 3.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA 10 GIỐNG NGÔ NẾP
ĐỊA PHƢƠNG
3.1.1. Khả năng chịu hạn của 10 giống ngô nếp địa phƣơng giai
đoạn hạt nảy mầm
3.1.1.1. Ảnh hưởng của hạn đến hàm lượng đường và hoạt độ

-amylase
Khi hạt nảy mầm, - amylase đƣợc tổng hợp và hoạt động mạnh
làm cho hàm lƣợng đƣờng tăng, kéo theo sự gia tăng áp suất thẩm thấu
và khả năng chống chịu mất nƣớc của tế bào. Việc khảo sát đặc điểm
phản ứng kiểu gen ở giai đoạn hạt nảy mầm là một trong những cơ sở
đánh giá tính chịu hạn của cây ngô. Hoạt độ - amylase tăng từ giai
đoạn 1 ngày tuổi đến 7 ngày tuổi và giảm sau 9 ngày tuổi ở cả lô đối
chứng và lô gây hạn. Ở 7 ngày tuổi, giống NH và Mo có hoạt độ
amylase cao nhất, thấp nhất là giống VK2.
Hàm lƣợng đƣờng tan đều tăng từ giai đoạn mầm 1 ngày tuổi đến
7 ngày tuổi, và giảm ở 9 ngày tuổi. Hàm lƣợng đƣờng cao nhất ở giống
Mo và NH, thấp nhất ở giống BS1 và VK2. Khi xử lý hạn sinh lý, hàm
lƣợng đƣờng và hoạt độ amylase đều tăng lên so với đối chứng và có

mối tƣơng quan thuận, hệ số tƣơng quan cao từ 0,72 đến 0,91. Kết quả
này chứng tỏ sorbitol đã ảnh hƣởng đến hàm lƣợng đƣờng và hoạt độ
của - amylase.
3.1.1.2. Ảnh hưởng của hạn đến hoạt độ protease
Hoạt độ của protease của các giống ngô đều tăng dần đến ngày
mầm thứ 7, giảm vào ngày thứ 9, kết quả này phù hợp với một số công

9
trình đã công bố. Giống NH và Mo có hoạt độ protease là 2,14
ĐVHĐ/mg và 2,12 ĐVHĐ/mg, cao hơn so với các giống khác cùng
giai đoạn mầm 7 ngày tuổi, thấp nhất là giống KL, VK2. Sau 9 ngày
hạn sinh lý, hoạt độ enzyme thấp nhất ở giống BS1. Theo Vanacker và
cộng sự (2006), quá trình oxy hóa và sự suy thoái protein sẽ tăng theo
mức độ hạn. Các protein bị oxy hóa này nhanh chóng bị phân hủy bởi
protease.
3.1.2. Đánh giá khả năng chịu hạn của 10 giống ngô giai đoạn cây non
3.1.2.1. Tỷ lệ thiệt hại của 10 giống ngô khi bị hạn
Khi bị hạn, sự thoát hơi nƣớc vƣợt quá sự hấp thu nƣớc làm
lƣợng nƣớc trong tế bào giảm, lúc này sự mất sức trƣơng thƣờng gây
nên sự đóng lỗ khí khổng và giảm hoạt động quang hợp, gây tổn thƣơng
cho cây. Các giống khác nhau sẽ có những đáp ứng khác nhau để làm
giảm hoặc tránh bị tổn thƣơng. Kết quả cho thấy: cả 10 giống nghiên
cứu đều chịu ảnh hƣởng của hạn và tỷ lệ thiệt hại tăng theo thời gian.
Sau 3 ngày gây hạn, các giống ngô bắt đầu bị ảnh hƣởng, lá non quăn
lại. Sau 5 ngày hạn, mức độ ảnh hƣởng tăng lên rõ rệt. Đặc biệt sau 9
ngày, tất cả các giống ngô đều bị héo lá và số lƣợng cây bị chết cũng
tăng lên cao. Giống có tỷ lệ thiệt hại cao nhất là BS1 và KL (sau 3
ngày: 11,11% và 16,67%; sau 5 ngày: 30,56% và 31,67%; sau 7 ngày:
44,44% và 44,44%; sau 9 ngày: 68,06% và 67,47%; sau 11 ngày:
95,65% và 93,94%). Giống có tỷ lệ thiệt hại thấp nhất là Mo và NH, từ

ngày hạn thứ 7 trở đi giống NH có tỷ lệ thiệt hại thấp hơn (sau 3 ngày:
5,56% và 11,11%; sau 5 ngày: 11,11% và 16,67%; sau 7 ngày: 33,33%
và 33,33%; sau 9 ngày: 44,44% và 43,45%; sau 11 ngày: 85,33% và
85,19%). Kết quả phân tích khả năng chịu hạn giai đoạn cây con 3 lá
của cây ngô có sự tƣơng đồng với các kết quả trên các đối tƣợng thực
vật khác nhƣ lạc, lúa, đỗ xanh, đỗ tƣơng
3.1.2.2. Chỉ số chịu hạn tương của 10 giống ngô trong điều kiện hạn
nhân tạo
Kết quả thu đƣợc sau khi xử lý hạn nhân tạo cho thấy, tỷ lệ cây

10
không héo và cây hồi phục giảm dần theo các ngày hạn. Sau hạn 7
ngày, tất cả các giống đều có 100% cây héo, các giống có khả năng hồi
phục cao nhất là Mo, NH và TB (tƣơng ứng là 76,67%, 72,33% và
71,33%), kém nhất là giống BS1, KL và VK2 (43,33%, 45% và 45%).
Sau 9 ngày hạn, các giống có khả năng hồi phục cao nhất là NH, Mo và
TB (tƣơng ứng là 37,33%, 36,67% và 36,67%), kém nhất là giống BS1
và VK2 (23,33%). Sau 11 ngày hạn, các giống có khả năng hồi phục
cao nhất là NH và Mo (tƣơng ứng là 24,33% và 23,33%), kém nhất là
BS1 và VK2 (10,67% và 11,33%). Giống có chỉ số chịu hạn tƣơng đối
cao nhất là Mo và NH (16276,03; 18365,61), giống BS1, KL, VK2 có
chỉ số chịu hạn tƣơng đối thấp nhất (9789,72; 10449,01 và 10045,04).
Chỉ số chịu hạn của 10 giống ngô đƣợc sắp xếp theo thứ tự giảm dần
nhƣ sau: NH> Mo> TB> PT> BN> DG2> KL> ĐX2> VK2> BS1.
3.1.3. Phân nhóm 10 giống ngô nghiên cứu theo mức độ chịu hạn
Hệ số giống nhau về mức phản ứng của kiểu gen trƣớc hạn phản
ánh mối quan hệ di truyền của các giống ngô. Kết quả phân tích bằng
chƣơng trình NTSYS version 2.02i cho thấy hệ số giống nhau giữa các
đối tƣợng là rất thấp (từ 0,08 đến 0,19). Các cặp: BN- DG2, BS1- VK2,
PT- DG2, Mo- TB có hệ số giống nhau cao nhất. Các giống ngô nếp

nghiên cứu đƣợc chia thành ba nhóm: Nhóm có khả năng chịu hạn kém
nhất gồm các giống BS1, VK2, ĐX2, và KL; Nhóm có khả năng chịu
hạn trung bình gồm BN, DG2 và PT; Nhóm có khả năng chịu hạn tốt
nhất gồm Mo, TB và NH.
3.2. ẢNH HƢỞNG CỦA HẠN NHÂN TẠO ĐẾN HÀM LƢỢNG
ANTHOCYANIN Ở CÂY NGÔ NẾP ĐỊA PHƢƠNG
Trong các dung môi đã sử dụng để định lƣợng anthocyanin, dung
môi acetone có HCl 0,01% tỏ ra hiệu quả cao nhất, hàm lƣợng
anthocyanin cao và phổ hấp thụ giống với phổ chuẩn đã nghiên cứu
trƣớc đó. Đối với dung môi acetone, hàm lƣợng anthocyanin tách chiết
đƣợc trong dung môi acetone tuyệt đối có HCl 0,01% cao hơn trong
dung môi acetone 70% có HCl 0,01%.

11
3.2.1. Sự biến động hàm lượng anthocyanin trong rễ của 10 giống ngô
Hàm lƣợng anthocyanin trong rễ tăng từ giai đoạn sau hạn 1
ngày đến sau 7 ngày, giảm sau 9 ngày. Sự chênh lệch hàm lƣợng giữa
hai ngƣỡng kế tiếp không lớn, các giá trị thấp hơn trong thân mầm và
lá. Sau 9 ngày hạn, hàm lƣợng ở BS1, KL và VK2 giảm hơn các giống
khác, và đây là ba giống có khả năng chịu hạn kém nhất (Bảng 3.4).
Bảng 3.4. Sự biến động hàm lƣợng anthocyanin trong rễ của 10 giống ngô (%)
Giống
Các ngƣỡng gây hạn nhân tạo
TH
Hạn 1 ngày
Hạn 3 ngày
Hạn 5 ngày
Hạn 7 ngày
Hạn 9 ngày
HL

HL
%TH
HL
%TH
HL
%TH
HL
%TH
HL
%TH
BN
0,076
0,082
107,89
0,084
110,53
0,086
113,16
0,095
125,00
0,089
117,11
BS1
0,068
0,070
102,94
0,071
104,41
0,075
110,29

0,075
110,29
0,067
98,53
DG2
0,071
0,078
109,86
0,081
114,08
0,082
115,49
0,090
126,76
0,083
116,90
ĐX2
0,086
0,094
109,30
0,098
113,95
0,101
117,44
0,108
125,58
0,098
113,95
KL
0,070

0,073
104,29
0,074
105,71
0,078
111,43
0,078
111,43
0,069
98,57
Mo
0,091
0,102
112,09
0,110
120,88
0,115
126,37
0,118
129,67
0,115
126,37
NH
0,098
0,110
112,24
0,119
121,43
0,124
126,53

0,129
131,63
0,128
130,10
PT
0,092
0,101
109,78
0,108
117,39
0,111
120,65
0,112
121,74
0,111
120,65
TB
0,092
0,101
109,78
0,107
116,30
0,110
119,57
0,112
121,74
0,110
119,57
VK2
0,075

0,079
105,33
0,082
109,33
0,083
110,67
0,086
114,67
0,075
100,00
(TH: Trước hạn; HL: hàm lượng; %TH: % tăng so với trước hạn; các
giá trị có sai số từ ±0,001 đến ±0,006; n=3; mức độ tin cậy 95%)
3.2.2. Sự biến động hàm lượng anthocyanin trong lá của 10 giống ngô
Hàm lƣợng anthocyanin trong lá tăng từ giai đoạn sau 1 ngày hạn
đến sau 7 ngày, và giảm sau 9 ngày. Sự chênh lệch hàm lƣợng giữa hai
ngƣỡng kế tiếp rõ và thấp hơn so với trong thân mầm (Bảng 3.5). Hàm
lƣợng ở giống BS1, KL và VK2 giảm mạnh mẽ nhất sau 9 ngày hạn, và
đây cũng là ba giống có khả năng chịu hạn kém nhất. Trong khi đó, các

12
giống có chỉ số chịu hạn cao luôn có hàm lƣợng anthocyanin cao hơn
nhƣ các giống NH, Mo, PT, TB.
Bảng 3.5. Sự biến động hàm lƣợng anthocyanin trong lá của 10 giống ngô (%)
Giống
Các ngƣỡng gây hạn nhân tạo
TH
Hạn 1 ngày
Hạn 3 ngày
Hạn 5 ngày
Hạn 7 ngày

Hạn 9 ngày
HL
HL
%TH
HL
%TH
HL
%TH
HL
%TH
HL
%TH
BN
0,122
0,130
106,56
0,139
113,93
0,152
124,59
0,160
131,15
0,131
107,38
BS1
0,080
0,082
102,50
0,085
106,38

0,088
110,00
0,090
112,50
0,070
87,50
DG2
0,113
0,125
110,62
0,129
114,16
0,130
115,04
0,145
128,32
0,123
108,85
ĐX2
0,110
0,120
109,09
0,125
113,64
0,130
118,18
0,143
130,00
0,116
105,45

KL
0,086
0,092
106,98
0,092
106,98
0,095
110,47
0,100
116,28
0,080
93,02
Mo
0,161
0,191
118,63
0,205
127,33
0,210
130,43
0,230
142,86
0,201
124,84
NH
0,170
0,210
123,53
0,230
135,29

0,250
147,06
0,290
170,59
0,220
129,41
PT
0,128
0,144
112,50
0,155
121,09
0,159
124,22
0,172
134,38
0,150
117,19
TB
0,130
0,145
111,54
0,157
120,77
0,160
123,08
0,175
134,62
0,152
116,92

VK2
0,082
0,084
102,44
0,089
108,54
0,092
112,20
0,095
115,85
0,080
97,56
(TH: Trước hạn; HL: hàm lượng; %TH: % tăng so với trước hạn; các
giá trị có sai số từ ±0,001 đến ±0,006; n=3; mức độ tin cậy 95%)
3.2.3. Sự biến động hàm lượng anthocyanin trong thân mầm và bẹ lá
của 10 giống ngô nếp
Hàm lƣợng anthocyanin trong thân mầm và bẹ lá tăng từ giai
đoạn sau 1 ngày hạn đến sau 5 ngày, giảm sau 7 ngày và tăng trở lại sau
9 ngày. Sự chênh lệch hàm lƣợng giữa hai ngƣỡng kế tiếp lớn. Sau 7
ngày hạn, ba giống có chỉ số chịu hạn thấp BS1, KL và VK2 giảm mạnh
mẽ hàm lƣợng anthocyanin so với các giống khác. Trong khi đó các
giống có chỉ số chịu hạn cao luôn có hàm lƣợng anthocyanin cao hơn
nhƣ các giống NH, Mo, PT, TB.
Hàm lƣợng anthocyanin tăng mạnh mẽ nhất trong thân mầm và bẹ

13
lá (đạt giá trị cực đại sau 5 ngày bị hạn), sau đó đến lá và rễ (tăng cao
nhất sau 7 ngày bị hạn). Khi đo giá trị hấp thụ của các dịch chiết trên
máy quang phổ đều thu đƣợc đƣờng biểu diễn hàm lƣợng anthocyanin
trong thân mầm rõ nét nhất. Do vậy, các phân tích về gen đƣợc thực

hiện với mẫu phần thân mầm và bẹ lá.
3.2.4. Sự biến động hàm lượng anthocyanin trong thân mầm và bẹ lá
cây ngô qua các ngưỡng xử lý bởi hạn nhân tạo so với đối chứng
Sau 1 ngày hạn, hàm lƣợng anthocyanin ở các giống tăng từ
107% đến 140% và tiếp tục tăng sau 3 ngày gây hạn so với đối chứng
(từ 115% đến 148%). Sau hạn 5 ngày, hàm lƣợng anthocyanin của các
giống BS1, ĐX2, KL giảm, song vẫn cao hơn so với đối chứng, các
giống còn lại tiếp tục tăng, riêng hai giống Mo và NH chịu hạn tốt tăng
vƣợt trội (154% và 181%). Sau ngày hạn thứ 7, giá trị này giảm mạnh ở
cả 10 giống, giống NH vẫn duy trì lƣợng anthocyanin cao nhất. Sau 9
ngày hạn, lƣợng anthocyanin trong tất cả các mẫu tăng trở lại (cao nhất
ở các giống NH, Mo, PT, TB). Sau 11 ngày bị hạn, lá và phần lớn thân
khô héo. Kết quả này tƣơng đồng với kết quả nghiên cứu ở ngô của
Efeoğlu và cộng sự (2009).
Sinh tổng hợp anthocyanin thƣờng xảy ra khi tế bào mất cân bằng
thẩm thấu, vì các glycoside của anthocyanin có thể điều chỉnh khả năng
thẩm thấu của tế bào, giảm thiểu sự mất nƣớc qua bốc hơi. Điều này có
thể đƣợc giải thích rằng: khi cây ngô gặp hạn, lƣợng ROS đƣợc sản sinh
ra nhiều gây căng thẳng cho tế bào. Anthocyanin đƣợc sử dụng để khử
các gốc oxi hóa. Chúng hoạt động nhƣ những chất có hoạt tính
peroxidase trong tế bào chất, ức chế sự hình thành gốc OH* để bảo vệ
DNA. Khi hạn kéo dài, hàm lƣợng anthocyanin cạn dần, các yếu tố
tham gia chống chịu đƣợc tăng cƣờng, trong đó axit absisic cũng đƣợc
tổng hợp nhiều hơn và tạo hiệu ứng tăng cƣờng tổng hợp các nhân tố
phiên mã điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin. Anthocyanin cũng đƣợc
tăng cƣờng để bảo vệ diệp lục khi cây tiếp tục bị hạn vì chúng định vị

14
nhiều trong các tế bào mô giậu và mô xốp, trong lớp biểu bì vào thời
điểm hạn và già hóa. Do đó, anthocyanin tích lũy trong cây có thể tham

gia vào quá trình chống chịu hạn thay cho proline hay các cơ chế khác.
Sau khi lƣợng anthocyanin đạt giá trị cao nhất có thể, quá trình đồng
hóa chúng dừng lại mặc dù hạn kéo dài, vì chất diệp lục giảm do quá
trình lão hóa của lá, và nhu cầu lƣợng anthocyanin ít.














Hình 3.7. Màu sắc thân mầm và lá của cây ngô sau 7 ngày hạn. (A):
Giống NH đối chứng (ĐC) và hạn nhân tạo (H); (B): Giống NH trong
môi trường MS có sorbitol (H) và đối chứng (ĐC) giai đoạn hạt nảy
mầm; (C): Giống BS1 đối chứng (ĐC) và hạn nhân tạo (H); (D): Giống
BS1 và NH ở giai đoạn hạt nảy mầm sau 3 ngày bị hạn bởi sorbitol
Mối tƣơng quan chặt chẽ giữa sự biến đổi hàm lƣợng anthocyanin
và khả năng chịu hạn (thông qua tỉ lệ thiệt hại ở mỗi ngƣỡng xử lý bởi
hạn) của từng giống đƣợc thể hiện bằng hệ số tƣơng quan tuyến tính
(Bảng 3.8). Nhƣ vậy, khi tỉ lệ thiệt hại tăng theo thời gian xử lý hạn
nhân tạo thì cây ngô cũng đòi hỏi sự tích lũy hàm lƣợng anthocyanin

(c)


(C)
(D)
(A)
(B)

ĐC
ĐC
H
H
H
ĐC
BS1
NH

15
trong tế bào ngày một tăng để giúp tế bào chống chịu lại điều kiện cực
đoan do môi trƣờng thiếu nƣớc gây ra. Điều kiện khô hạn có lợi cho sự
hình thành sắc tố anthocyanin màu đỏ do giảm sự hấp thụ nitrat. Các
sắc tố anthocyanin đƣợc sử dụng nhƣ những marker kiểu hình, và là
công cụ tuyệt vời để nghiên cứu các quá trình di truyền phân tử và sinh
hóa ở từng mô biểu hiện đặc hiệu.
Bảng 3.8. Mối tƣơng quan giữa sự biến động hàm lƣợng anthocyanin
và tỷ lệ thiệt hại
TT
Giống
Hệ số tƣơng quan tuyến tính R
Rễ
Lá
Thân và bẹ lá
1
BN
0,81
0,97
0,65
2
BS1
0,94
0,99
0,80
3
DG2
0,75
0,95
0,78

4
ĐX2
0,74
0,96
0,78
5
KL
0,94
0,97
0,91
6
Mo
0,73
0,88
0,71
7
NH
0,82
0,98
0,72
8
PT
0,77
0,97
0,73
9
TB
0,76
0,97
0,83

10
VK2
0,78
0,94
0,68
3.3. PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN B, LC Ở GIỐNG NH VÀ BS1
3.3.1. Đặc điểm trình tự đoạn gen B của giống NH và BS1
Kết quả chọn dòng phân tử mang đoạn gen B
Trong ngô, họ bHLH tham gia con đƣờng anthocyanin là một họ
nhỏ, gồm bốn gen B, R, Lc, và Sn. Locus B (hay b1) gồm các alen B- I,
B- Peru, B-Bolivia. Tùy thuộc vào từng giống ngô mà có thể có một
hoặc cả bốn gen này. Để nghiên cứu sâu hơn về cơ sở phân tử của sinh
tổng hợp anthocyanin liên quan đến hạn, mRNA của giống chịu hạn tốt

16
(NH) và chịu hạn kém (BS1) đƣợc sử dụng để phân lập đoạn gen B. Sản
phẩm PCR thu đƣợc rất đặc hiệu, kích thƣớc khoảng 0,8 kb (Hình 3.8A)
và dòng plasmid tái tổ hợp của mẫu NH và BS1 có mang sản phẩm
PCR đã đƣợc chọn lọc (Hình 3.8B).
Kết quả xác định trình tự nucleotit của đoạn gen B
Trình tự đoạn gen B đọc đƣợc dài 801 bp, là một phần của gen B,
mã hóa cho 267 axit amin. Đoạn peptit suy diễn của trình tự đọc đƣợc
thuộc vị trí từ 27- 267 của phân tử protein B hoàn chỉnh. Đoạn này
thuộc một phần vùng MIR và vùng có tính axit của họ bHLH.

So sánh trình tự của đoạn gen B của hai giống ngô nếp NH và BS1
Trình tự nucleotit của đoạn gen B ở hai giống BS1 và NH tƣơng
đồng 98% với trình tự cDNA (mã số NM_001112236 và KC_771884).
Trình tự đoạn gen B ở hai giống NH và BS1 khác nhau ở 1 vị trí
nucleotit thứ 678. Trình tự của giống BS1 có 12 vị trí sai khác so với
trình tự cDNA của gen b1 (mã số NM_001112236). Trình tự của giống
NH có 13 vị trí sai khác so với b1.
Phân tích trình tự tương đồng của đoạn gen B
Dựa vào các trình tự nucleotit của gen B và gen trong họ bHLH
trong con đƣờng anthocyanin ở ngô và các đối tƣợng khác đã công bố
trên ngân hàng gen quốc tế (NCBI), kết quả phân tích trình tự tƣơng


1kb
750bp
M NH BS1
(A)

1kb
750bp

M BS1 NH
(B)
Hình 3.8. Hình ảnh điện di
sản phẩm RT- PCR của
đoạn gen B (A) và kiểm tra
plasmid tái tổ hợp bằng

BamHI (B) của giống BS1
và NH. M: marker 1kb


17
đồng cho thấy, trình tự nucleotit của đoạn gen B ở hai giống thu đƣợc
có sự tƣơng đồng cao với trình tự gen b1, B1 và B- Peru đã công bố trên
GenBank (98,8%, 99,1% và 98,8%).
So sánh cấu trúc của các vùng chức năng của protein B
Kết quả cho thấy, vùng MIR của protein B (thuộc vị trí từ 1 đến
252) là nơi tƣơng tác với protein MYB để tăng tốc độ phiên mã của các
gen cấu trúc. Vùng này có 9 vị trí axit amin khác nhau giữa NH và BS1
so với trình tự b1 trên GenBank (vị trí 36, 93, 101, 171, 202, 223, 230,
234 và 281). Trong đó, cDNA của hai giống khác nhau ở một vị trí
nhƣng hoàn toàn giống nhau về axit amin.
Vùng có tính axit (thuộc vị trí từ 253- 410) là nơi tƣơng tác với
protein WD40 và PAC1. Vùng này có một vị trí axit amin khác nhau
(V281 của b1, A281 của giống NH và BS1).
3.3.2. Đặc điểm trình tự đoạn gen Lc của giống NH và BS1
Kết quả chọn dòng phân tử mang đoạn gen Lc
RNA tổng số của 2 giống ngô đƣợc sử dụng làm khuôn cho
phản ứng PCR với cặp mồi Oligo(dT)
18
, LcF1 và LcR1 để phát hiện
gen Lc. Sản phẩm PCR thu đƣợc rất đặc hiệu, có kích thƣớc khoảng
0,8kb (Hình 3.12A) và dòng plasmid tái tổ hợp của mẫu NH và BS1 có
mang sản phẩm PCR đã đƣợc chọn lọc (Hình 3.12 B).

Kết quả xác định trình tự nucleotit của đoạn gen Lc

Hình 3.12. Hình ảnh điện
di sản phẩm RT- PCR của
đoạn gen Lc (A) và kiểm
tra plasmid tái tổ hợp bằng
BamHI (B) của giống BS1
và NH. M: marker 1kb

1kb
750bp
500bp
250bp
P
NH
P
BS1
M NH BS1
NH BS1 M
0,8kb►

0,8kb
(A)
(B)

18
Trình tự đọc đƣợc dài 822 bp là một phần của gen Lc mã hóa cho 273
axit amin. Đoạn peptit suy diễn của trình tự đọc đƣợc thuộc vị trí từ
337- 610 của phân tử protein Lc hoàn chỉnh.
So sánh trình tự của đoạn gen Lc của hai giống ngô nếp NH và BS1
Đoạn gen Lc đƣợc xác định tƣơng đồng với trình tự nucleotit
phía cuối của gen Lc hoàn chỉnh (98% với trình tự mã số DQ414252,
99% với trình tự mã số NM001111869). Trình tự đoạn gen Lc ở hai
giống NH và BS1 khác nhau ở 12 vị trí, thuộc các nucleotit thứ 1092,
1127, 1330, 1336, 1546, 1554, 1571, 1687, 1762, 1804, 1815 và 1821.
Phân tích trình tự tương đồng của đoạn gen Lc
Trình tự nucleotit của gen Lc ở hai giống thu đƣợc có sự tƣơng
đồng rất cao với trình tự gen Lc và SN đã công bố trên GenBank (từ
98,9% đến 99,3%). Hai trình tự này cũng có tƣơng đồng cao với các
trình tự trong họ bHLH ở cây ngô.
So sánh cấu trúc của các vùng chức năng của protein Lc
Trình tự axit amin suy diễn của hai giống NH và BS1 khác nhau
ở 9 vị trí. Các axit amin giống nhau của NH và BS1 chủ yếu thuộc vùng
acidic và bHLH của nhân tố phiên mã Lc. Vùng bHLH là đặc trƣng của
nhóm protein MYC (bHLH). Đây chính là vị trí tƣơng tác của protein
Lc với DNA để tăng tốc độ phiên mã của các gen cấu trúc. Vùng này có
hai vị trí axit amin khác nhau (444 và 446).
3.3.3. Đặc điểm về cấu trúc protein thuộc họ bHLH ở cây ngô
Đối với phân tử protein R và Lc hoàn chỉnh ở ngô có 610 axit
amin đƣợc bắt đầu bởi vùng MIR ở đầu N và kết thúc bởi vùng dimer
hóa đầu C (Hình 3.16). Đối với phân tử protein B hoàn chỉnh có 562
axit amin, vị trí vùng vùng dimer hóa đầu C từ axit amin 462-562.
Trƣớc đây, ngƣời ta cho rằng, các tín hiệu định vị nhân này không cần

19

thiết. Song kết quả thực nghiệm cho thấy việc loại bỏ tín hiệu thứ hai
hay thứ ba dẫn đến kết quả định vị nhân kém hiệu quả.
Vùng MIR là nơi tƣơng tác với protein MYB. Những biến đổi ở
vị trí 19 trong vùng này luôn đi kèm với sự thay đổi ở vị trí 16 lizin.
Trong nghiên cứu của Pattanaik và cộng sự (2008) trên đối tƣợng cây
tía tô (Perilla frutescens), sự thay thế lyzin thành methionin ở vị trí axit
amin thứ 157 (K157M) đã dẫn đến hoạt động trans của protein họ
bHLH tăng lên gấp 50 lần so với đối chứng. Một gen mã hóa cho
protein MYC- RP đƣợc gây đột biến điểm K157M chuyển vào cây
thuốc lá, kết quả cho thấy hàm lƣợng anthocyanin tách chiết đƣợc từ
cây chuyển gen cao hơn so với cây wild- type. Khi axit amin alanin
(A159 của MYC- RP trong cây tía tô, A161 của Delila trong cây mõm
chó và A172 trong protein Lc của ngô) bị thay thế bởi axit aspartic sẽ
làm mất hoạt động trans đối với protein MYC- RP và Delila, làm suy
giảm nghiêm trọng hoạt động trans đối với protein Lc. Nếu xảy ra đột
biến đồng thời K157M/N354D của Delila dẫn đến gia tăng hoạt động
promoter của gen CHS trong cây Arabidopsis.

Hình 3.16. Các vùng chức năng của nhân tố bHLH. NLS- tín hiệu định
vị nhân (nuclear localization signals); MIR- vùng tương tác với protein
MYB (MYB-interacting region); ACT- Vùng giả định (aspartokinase,
chorismate mutase, and TyrA domain).
Vùng còn lại có 85 axit amin cuối là vùng giả định ACT có vai
trò tạo sự tƣơng thích với DNA, nhƣng không làm ảnh hƣởng đến hoạt
động độc lập của ARE (trình tự điều hòa cis bảo thủ trên promoter của
một số gen cấu trúc). Sự dimer hóa rất cần thiết cho hoạt động điều hòa
của các TFs thuộc họ bHLH. Sự dimer hóa hoàn toàn bị loại bỏ nếu

20
thiếu vùng 532-560, làm giảm kích hoạt của promoter A1, dẫn đến hình

thành rất ít tế bào màu đỏ. Khi Ser 560, GLN 562, và Ser 564 đồng thời
đƣợc thay thế bằng Ala, khả năng dimer hóa của protein R bị giảm đáng
kể. Khi tạo đột biến thêm ba axit amin vào cấu trúc xoắn thứ hai trong
vùng bHLH của protein Lc ở ngô (từ 458- 464), sự tƣơng tác của
protein bị cản trở, có tác động tiêu cực đến sự tích lũy anthocyanin
trong tế bào.
3.4. ĐỊNH LƢỢNG MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GEN B VÀ Lc
BẰNG PHẢN ỨNG REAL- TIME PCR
Để định lƣợng mức độ phiên mã của hai gen B và Lc ở hai giống
ngô chịu hạn tốt có hàm lƣợng anthocyanin cao nhất (NH) và chịu hạn
kém có hàm lƣợng anthocyanin thấp nhất (BS1) qua các ngƣỡng xử lý
hạn nhân tạo, RNA tổng số của các mẫu đƣợc tách chiết đảm bảo độ
tinh sạch và hàm lƣợng để thực hiện phản ứng phiên mã ngƣợc với mồi
Oligo(dT)
18
. Phản ứng real- time RT- PCR sẽ xác định mức độ phiên
mã của hai gen thông qua số lƣợng sản phẩm cDNA tổng hợp đƣợc.
3.4.1. Định lƣợng mức độ biểu hiện của gen B giai đoạn cây con
Với hai cặp mồi của gen tham chiếu Actin và gen B đã phân lập
đƣợc ở hai giống NH và BS1, kết quả của phản ứng real- time RT- PCR
đƣợc trình bày ở Hình 3.17 và Hình 3.18. Từ kết quả thu đƣợc, lƣợng
mRNA của gen B tăng hay giảm đƣợc tính theo phƣơng pháp của Livak
(Hình 3.17).
Đối với giống BS1, mức độ phiên mã của gen B thấp (Ct= 40),
tăng ở ngƣỡng sau hạn 3 ngày và 5 ngày (gấp 1,19 và 1,21 lần), giảm ở
ngƣỡng sau hạn 9 ngày (chỉ bằng 0,76 lần) so với trƣớc hạn; tăng ở
ngƣỡng sau hạn 3 ngày và 5 ngày (gấp 1,19 và 1,28 lần), giảm ở
ngƣỡng sau hạn 9 ngày (chỉ bằng 0,72 lần) so với đối chứng. Đối với
giống NH, mức độ phiên mã của gen B cao hơn ở giống BS1 (giá trị Ct

21
từ 36,75 đến 40,04), tăng ở ngƣỡng sau hạn 3 ngày và 5 ngày (gấp 2,28
và 8,51 lần), giảm ở ngƣỡng sau hạn 9 ngày (gấp 1,54 lần) so với trƣớc
hạn; tăng ở ngƣỡng sau hạn 3 ngày và 5 ngày (gấp 2,71 và 4,32 lần),
giảm ở ngƣỡng sau hạn 9 ngày (gấp 2,50 lần) so với đối chứng. Trong
nghiên cứu này, mức độ phiên mã của gen B trong thân cây ngô non bị
hạn ở mức thấp có lẽ có sự tƣơng đồng với gen B- Peru đã công bố. Kết
quả đƣợc thể hiện ở Hình 3.15 chứng tỏ đƣờng biểu diễn nhiệt độ nóng
chảy, đỉnh chảy của cặp mồi gen Actin (ActF, ActR) và gen B (BF2,
BR2) sử dụng trong phản ứng real- time RT- PCR rất đặc hiệu.


















Hình 3.18. Biểu đồ chảy (A) và biểu đồ đỉnh chảy (B) của gen B và Act
ở hai giống ngô NH và BS1 qua các ngƣỡng xử lý bởi hạn.

(B)

Hình 3.17. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi mức độ phiên mã của gen B ở
giống ngô NH và BS1. TH: Trước hạn; ĐC: Đối chứng


(A)
(B)

22
3.4.2. Định lƣợng mức độ biểu hiện của gen Lc giai đoạn cây con
Với hai cặp mồi của gen tham chiếu Actin và gen Lc đã phân lập
đƣợc ở hai giống NH và BS1, kết quả của phản ứng real- time RT- PCR
đƣợc trình bày ở Hình 3.19 và Hình 3.20.

Hình 3.20. Biểu đồ chảy (A) và biểu đồ đỉnh chảy (B) của gen
Act và Lc ở hai giống ngô NH và BS1 qua các ngƣỡng xử lý bởi hạn
Đối với giống BS1, mức độ phiên mã của gen Lc có giá trị Ct từ
31,69 đến 32,61, tăng ở ngƣỡng sau hạn 3 ngày và 5 ngày (gấp 1,68 và
2,08 lần), giảm ở ngƣỡng sau hạn 9 ngày (gấp 1,26 lần) so với trƣớc

(A)

(B)

Hình 3.19. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi mức độ phiên mã của gen Lc ở
giống ngô NH và BS1. TH: Trƣớc hạn; ĐC: Đối chứng


23
hạn; tăng ở ngƣỡng sau hạn 3 ngày và 5 ngày (gấp 1,77 và 2,10 lần),
giảm ở ngƣỡng sau hạn 9 ngày (gấp 1,40 lần) so với đối chứng. Đối với
giống NH, mức độ phiên mã của gen Lc cao hơn ở giống BS1 (giá trị Ct
từ 29,65 đến 30,26), tăng ở ngƣỡng sau hạn 3 ngày và 5 ngày (gấp 2,99
và 3,63 lần), sau hạn 9 ngày gấp 4,66 lần so với trƣớc hạn; tăng ở
ngƣỡng sau hạn 3 ngày và 5 ngày (gấp 2,28 và 18,90 lần), giảm ở
ngƣỡng sau hạn 9 ngày (gấp 3,36 lần) so với đối chứng. Nhƣ vậy, có sự
chênh lệch về mức độ phiên mã của gen B và Lc ở mẫu chịu hạn tốt so
với ở mẫu chịu hạn kém. Tuy nhiên, giá trị chu kỳ ngƣỡng (Ct) của
phản ứng real- time RT- PCR gen B lại cao hơn so với gen Lc, chứng tỏ
lƣợng sản phẩm mRNA của gen Lc nhiều hơn, và gen này hoạt động
mạnh hơn. Kết quả Hình 3.20 chứng tỏ đƣờng biểu diễn nhiệt độ nóng

chảy, đỉnh chảy của cặp mồi gen Actin (ActF, ActR) và gen Lc (LcF2,
LcR2) sử dụng trong phản ứng real- time RT- PCR rất đặc hiệu.
Gen Lc của ngô có thể đƣợc sử dụng nhƣ một gen đánh dấu mạnh
mẽ để tăng tổng hợp anthocyanin và tiến hành trên một số đối tƣợng cây
trồng nhằm tạo ra các loại thực phẩm vừa có lợi cho sức khỏe ngƣời
tiêu dùng, vừa có tiềm năng kinh tế cho ngƣời sản xuất, và vừa có lợi
cho sự chống chịu hạn cho bản thân cây trồng.