Nghiên cứu biểu hiện gen GerF trong nhóm gen sinh tổng hợp gốc đường khử dTDP-6deoxy-D-Allose của cấu trúc kháng sinh Dihydrochalcomycin.

bộ giáo dục và đào tạo
Viện đại học mở hà nội
khoa công nghệ sinh học

khóa luận tốt nghiệp
Đề tài:
NGHIấN CU BIU HIN GEN GERF TRONG NHểM GEN SINH
TNG HP GC NG KH DTDP-6DEOXY-D-ALLOSE CA
CU TRC KHNG SINH DIHYDROCHALCOMYCIN
Giáo viên hớng dẫn : TS. Tạ THị THU THủY
Sinh viên thực hiện : lê đỗ huyền trang
Lớp : cnsh-0802
Hà Nội 2012
Khóa luận tốt nghiệp Lê Đỗ Huyền Trang-CNSH 0802
LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy giáo cô giáo, các cán bộ
khoa Công Nghệ Sinh Học Viện Đại Học Mở Hà Nội đã trang bị kiến thức,
tạo điều kiện về máy móc, trang thiết bị và giúp đỡ em trong quá trình hoàn
thành khóa luận.
Em xin được bày tỏ lòng biết sâu sắc tới TS.Tạ Thị Thu Thủy người đã
giao đề tài và trực tiếp hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ em trong
quá trình thực nghiệm
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới kỹ sư Phạm Thị Thúy Vân và kỹ
sư Nguyễn Thị Huế đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt cho em những kiến
thức cơ bản nhất từ những ngày đầu trong quá trình hoàn thành khóa luận
Xin gửi lời cảm tới gia đình, bạn bè đã luôn quan tâm, động viên em
trong suốt thời gian qua
Do thời gian và khả năng bản thân còn nhiều hạn chế nên trong bài
khóa luận còn có nhiều điển thiếu sót. Rất mong được sự chỉ bảo của các thầy
giáo, cô giáo, sự góp ý của các bạn để bài khóa luận được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 25 tháng 05 năm 2012
Sinh viên
Lê Đỗ Huyền Trang
1
Khóa luận tốt nghiệp Lê Đỗ Huyền Trang-CNSH 0802
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU ĐẶC BIỆT
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ KHÁNG SINH 3
1.1. Lịch sử phát triển của kháng sinh 3
1.2. Giới thiệu chung về kháng sinh 4
1.2.1. Định nghĩa về kháng sinh 4
1.2.2. Đơn vị kháng sinh 5
1.2.3. Phân loại kháng sinh 5
1.2.4. Cơ chế tác động của kháng sinh 7
1.2.4.1. Ức chế quá trình tổng hợp vách tế bào vi khuẩn 8
1.2.4.2. Ức chế chức năng của màng nguyên sinh chất 8
1.2.4.3. Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein 8
1.2.4.4. Ức chế quá trình tổng hợp axit nucleic 9
1.3. Ứng dụng của kháng sinh 9
1.3.1. Ứng dụng kháng sinh trong y học 9
1.3.2. Ứng dụng kháng sinh trong chăn nuôi 10
1.3.3. Ứng dụng kháng sinh trong trồng trọt 10
1.3.4. Ứng dụng kháng sinh trong công nghệ thực phẩm 10
1.4.Tính kháng thuốc 11
1.5.Giới thiệu về kháng sinh dihydrochalcomycin 11
1.6.Giới thiệu về đường dTDP-6deoxy-D-Allose 13
1.6.1. Gốc đường khử trong cấu trúc kháng sinh 13
1.6.2. Đường dTDP-6deoxy-D-Allose 14

1.6.3. Giới thiệu về gen gerF 14
1.7. Enzyme giới hạn 15
1.8.Giới thiệu về vector biểu hiện pET-32a(+) 16
1.8.1. Vector 16
1.8.2. Vector biểu hiện pET-32a(+) 16
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
2.1. Hóa chất và thiết bị 18
2.1.1. Hóa chất 18
2.1.2. Thiết bị, máy móc sử dụng trong nghiên cứu 20
2.2. Chủng vi sinh vật và điều kiện nuôi cấy 20
2.2.1.Vi sinh vật 20
2.2.2. Điều kiện nuôi cấy 20
2.3. Môi trường nuôi cấy 20
2
Khóa luận tốt nghiệp Lê Đỗ Huyền Trang-CNSH 0802
2.4. Các phương pháp nghiên cứu `21
2.4.1. Phương pháp đo giá trị OD 21
2.4.2. Phương pháp chuyển gen vào vi khuẩn E.coli BL21 DE3 21
2.4.2.1. Chuẩn bị tế bào khả biến 22
2.4.2.2. Chuyển gen vào vi khuẩn E.coli BL21DE3 23
2.4.3. Tách chiết DNA plasmid 23
2.4.4. Điện di DNA agarose gel 24
2.4.5. Phương pháp biểu hiện protein trong E.coli BL21-DE3 25
2.4.5.1. Biểu hiện protein ở các nồng độ IPTG khác nhau 26
2.4.5.2. Biểu hiện protein ở các nhiệt độ khác nhau 26
2.4.5.3. Biểu hiện protein ở các điều kiện thời gian khác nhau 27
2.4.6.Phương pháp tách protein thô 27
2.5. Điện di protein 28
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31
3.1. Phân tích trình tự axit amin của gen gerF 31

3.2. Kết quả kiểm tra plasmid có trong tế bào vật chủ E.coli BL21 DE3 35
3.3. Kết quả biểu hiện enzyme GerF 37
3.3.1. Nồng độ IPTG để biểu hiện protein 37
3.3.2. Ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ đến biểu hiện protein 38
3.3.3. Ảnh hưởng của điều kiện thời gian đến biểu hiện protein 40
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN 42
4.1. Kết luận 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO 43
3
Khóa luận tốt nghiệp Lê Đỗ Huyền Trang-CNSH 0802
CÁC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU ĐẶC BIỆT
DNA
RNA
aa
Amp
dNTP
LB
OD
SDS
EDTA
TAE
TBE
IPTG
TE
Sol
Acid deoxyribonucleic
Acid ribonucleic
Amino axit
Ampicillin
Deoxyribonucleotide 5’- triphosphates

Luria-Bertani
Optical Density
Sodium dodecyl sulphate
Ethylen diamin tetra-acid acetic
Tris- acetate –EDTA
Tris- base- EDTA
Isopropyl-β-D-thiogalacto-pyranoside
Trophectoderm
Sollution
4
Khóa luận tốt nghiệp Lê Đỗ Huyền Trang-CNSH 0802
bp
ORF
Base pare
Open reading frame
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình 1 : Cơ chế tác dụng của kháng sinh
Hình 2: Cấu trúc kháng sinh dihydrochalcomycin
Hình 3: Nhóm gen deoxysugar tham gia sinh tổng hợp dihydrochalcomycin
5
Khóa luận tốt nghiệp Lê Đỗ Huyền Trang-CNSH 0802
Hình 4: Dự đoán chức năng của gen gerF trong sinh tổng hợp gốc đường khử
dTDP- mycinose thành phần quan trọng trong cấu trúc kháng sinh
dihydrochalcomycin
Hình 5: Vector biểu hiện pET-32a(+)
Hình 6: Sơ đồ điện di protein trên gel acrylamide
Hình 7: So sánh trình tự nucleotide gen gerF với trình tự của một số gen có
chức năng dTDP-4-keto-6-deoxyglucose 3-epimerase trong ngân hàng gen thế
giới NCBI
Hình 8: So sánh trình tự axit amin gerF với gen có cùng chức năng của chủng

Streptomyces, KCTC 0041BP đăng ký trên ngân hàng gen
Hình 9: So sánh trình tự axit amin gerF với gen có cùng chức năng của chủng
streptomyces sp. Mg1 đăng ký trên ngân hàng gen
Hình 10: So sánh trình tự axit amin gerF với gen có cùng chức năng của
chủng streptomyces bikiniensis đăng ký trên ngân hàng gen
Hình 11: Trình tự axit amin của gerF với các enzyme có cùng chức năng của
xạ khuẩn khác đăng ký trên ngân hàng gen
Hình 12: Sơ đồ biểu hiện gen gerF vào vật chủ E.coli BL 21 DE3
Hình 13: Kết quả điện di sản phẩm chuyển gen gerF vào vector biểu hiện pET-
32a(+)
Hình 14 : Điện di enzyme gerF ở các nồng độ IPTG khác nhau
Hình 15: Điện di enzyme gerF ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau
Hình 16: Điện di enzyme gerF ở các điều kiện thời gian khác nhau
6
Khóa luận tốt nghiệp Lê Đỗ Huyền Trang-CNSH 0802
Mở đầu
Ngày nay công nghệ sinh học được coi là một trong năm nghành công
nghệ tiên phong của nhân loại tiến vào thế kỷ 21. Trong đó công nghệ sinh
học vi sinh vật sản xuất kháng sinh ngày càng có nhiều ứng dụng trong Y học
và các lĩnh vực khác bảo vệ sức khỏe và phục vụ cho đời sống của con người
và đang có những bước phát triển vượt bậc.
Việc ứng dụng các tiến bộ di truyền học trong phân lập sàng lọc, cải tạo
giống cho phép tạo ra những chủng giống vi sinh vật có khả năng tổng hợp
các hoạt chất mới có hiệu suất cao.
Trước tình trạng các loại vi sinh vật gây bệnh biến đổi gây hại cho đời
sống con người ngày càng nhiều vì vậy thách thức đối với công nghệ sản xuất
kháng sinh không phải ít.
Dihydrochalcomycin là kháng sinh thuộc nhóm Macrolide (PKS –
Polyketide synthase) có 16 cacbon, nhóm kháng sinh này có khả năng ức chế
hoạt động của vi khuẩn rất mạnh. Quá trình sinh tổng hợp kháng sinh này có

sự tham gia của nhiều loại gen trong đó gerF thuộc nhóm gen tham gia sinh
tổng hợp gốc đường khử dTDP-6deoxy-D-Allose của cấu trúc kháng sinh
dihydrochalcomycin, tuy đóng vai trò quan trọng nhưng vẫn chưa có nghiên
cứu chính thức về gen này. Vì vậy nhóm nghiên cứu đã nghiên cứu về việc
biểu hiện gen GerF trong nhóm gen sinh tổng hợp gốc đường khử dTDP-
6deoxy-D-Allose của cấu trúc kháng sinh Dihydrochalcomycin
Đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu biểu hiện gen GerF trong nhóm gen
sinh tổng hợp gốc đường khử dTDP-6deoxy-D-Allose của cấu trúc kháng
sinh Dihydrochalcomycin.
Mục tiêu đề tài: Biểu hiện được gen gerF trong tế bào E.coli BL21 DE3
và tìm điều kiện thích hợp để biểu hiện protein nội bào (Enzyme nội bào)
7
Khóa luận tốt nghiệp Lê Đỗ Huyền Trang-CNSH 0802
Nội dung nghiên cứu:
- Kiểm tra vector chứa gen gerF (pGerF)
- Sử dụng phần mềm phân tích chức năng của gen gerF
- Nghiên cứu biểu hiện gen gerF trong vật chủ E.Coli BL21 DE3
8
Khóa luận tốt nghiệp Lê Đỗ Huyền Trang-CNSH 0802
CHƯƠNG I
TỔNG QUAN VỀ KHÁNG SINH
1.1. Lịch sử phát triển của kháng sinh
Từ thời xa xưa, trong dân gian đã biết dùng nấm mốc trên đậu phụ để
đắp chữa mụn nhọt. Từ mấy thế kỷ trước tại Châu Âu, Châu Mỹ người ta đã
biết dùng bánh mỳ, ngô hay giầy da cũ đã mốc để điều trị vết lở loét, sưng mủ
trên da. Theo quan điểm của khoa học hiện nay thì mốc trên đậu phụ, trên
bánh mỳ, thực tế có chứa chất kháng sinh, chỉ có điều người xưa chưa biết
đến vi khuẩn, hay lại càng không biết khái niệm chất kháng sinh là gì
Cho đến năm 1928, một nhà khoa học scotland là Alexander Flemming,
lần đầu tiên thấy trong môi trường nuôi cấy tụ cầu vàng nếu lẫn nấm thì

khuẩn lạc gần nấm sẽ không phát triển được. Nấm này được đặt tên là
penicilium notatum, hoạt chất tiết ra gọi là penicilin.
Năm 1929, ông công bố penicilin trước dư luận công chúng. Ông
khẳng định rằng chất này có thể trở thành một thứ thuốc quan trọng nhưng
ông không có khả năng và kỹ thuật để tách chiết.
Năm 1938, Flemming nhận được thư của hai nhà khoa học từ trường
đại học Oxford là Ernst Boris Chain và Howard Walter Florey, đề nghị hợp
tác với ông tiếp tục thực hiện công trình nghiên cứu về penicilin. Ngày
25/5/1940, họ đã tách chiết và thử nghiệm thành công penicilin trên chuột.
Năm 1941, nhóm đã chọn được loại nấm penicilium ưu việt nhất là
chủng penicilium chrysogenium, tạo ra loại penicilin có hoạt tính cao hơn cả
triệu lần penicilin do Flemming tìm thấy năm 1928. Năm 1945, Flemming
được giải Nobel về y học cùng với Ernst Boris Chain và Howard Walter
Florey
9
Khóa luận tốt nghiệp Lê Đỗ Huyền Trang-CNSH 0802
Năm 1942 bắt đầu điều trị có hiệu quả bệnh nhiễm trùng . Năm 1943
dự án sản xuất penicilin được chính phủ Mỹ đặc biệt chú ý, cho đến năm
1944, penicilin đã được sản xuất ở quy mô lởn Mỹ để phục vụ chữa trị cho
thương bệnh binh trong chiến tranh thế giới thứ II. Sau đó Nga và một số
nước khác cũng sản xuất được penicilin G và penicilin V. Việc phát hiện ra
penicilin tạo ra một bước ngoặt lớn trong lịch sử y học thế giới
Cũng trong năm 1944, waksman tìm ra streptomycin bởi nuôi cấy nấm
streptomycin griseus và ông gọi đó là kháng sinh
Đến nay các nhà khoa học thông báo đã phát minh được hơn 10000
chất kháng sinh tự nhiên trong số đó hơn 2000 chất do thực vật tạo ra, khoảng
7000 chất do vi sinh vật tổng hợp trong số này có khoảng 100 chất được ứng
dụng trong y học và một số lĩnh vực khác
Từ những kháng sinh đã biết các nhà nghiên cứu đã điều chế được hàng
ngàn dẫn chất mới là các kháng sinh bán tổng hợp và trong số này có khoảng

50 chất cũng đã được đưa vào sử dụng
Đồng thời có 2 kháng sinh được sản xuất hoàn toàn bằng tổng hợp hóa
học đó là cloramphenicol và pyrrolnitrin
1.2. Giới thiệu chung về kháng sinh
1.2.1. Định nghĩa về kháng sinh
Có rất nhiều định nghĩa về kháng sinh và theo sự phát triển của khoa
học thì các định nghĩa dần dần được thay đổi và hoàn thiện hơn, cụ thể:
Năm 1941, bắt đầu sản suất kháng sinh penicilin để dùng trong lâm
sàng. Khi đó kháng sinh được coi là “những chất do vi sinh vật tiết ra ( vi
khuẩn, vi nấm) có khả năng kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật khác”[1]
Tuy nhiên định nghĩa này khá hạn chế vì như vậy nhóm các kháng sinh
thực vật, cũng như các kháng sinh tổng hợp, bán tổng hợp và các hợp chất hóa
học có khả năng tiêu diệt chọn lọc các vi sinh vật khác đều không được đề cập
đến.[1]
10
Khóa luận tốt nghiệp Lê Đỗ Huyền Trang-CNSH 0802
Với sự phát triển của khoa học, ngày nay kháng sinh được định nghĩa “
là tất cả các hợp chất có nguồn tự nhiên ( từ thực vật hay do vi sinh vật tiết ra)
hoặc tổng hợp, bán tổng hợp với đặc tính là ngay ở nồng độ rất thấp có khả
năng đặc hiệu ức chế hoặc tiêu diệt chọn lọc các vi sinh vật gây bệnh, đồng
thời không có tác dụng hoặc tác dụng yếu lên người, động vật hoặc thực vật
được điều trị”[17]
1.2.2. Đơn vị kháng sinh
Đơn vị kháng sinh là lượng kháng sinh tối thiểu hòa tan trong một thể
tích môi trường xác định có tác dụng ức chế hay tiêu vi sinh vật kiểm định.[2]
VD
1
: Đơn vị hoạt lực của penicilin là lượng penicilin ít nhất hòa tan
vào 50ml canh thang có tác dụng ức chế sự phát triển của staphylococcus
aureus 209P

VD
2
: Đơn vị hoạt lực của streptomycin là lượng streptomycin ít nhất
hòa tan trong 1ml canh thang có tác dụng ức chế sự phát triển của E.coli
Năng lực tích tụ kháng sinh của chủng hay nồng độ chất kháng sinh
thường được biểu thị bằng các đơn vị là: mg/ml, µg/ml, hay đơn vị kháng sinh
UI/ml (hay UI/g)
1.2.3. Phân loại kháng sinh
Phân loại kháng sinh nhằm khái quát một cách hệ thống danh mục các
kháng sinh ngày càng nhiều thêm. Có thể phân loại dựa vào phổ tác dụng, cơ
chế tác dụng, phân loại theo nguồn gốc, con đường sinh tổng hợp hay cấu trúc
hóa học. Tuy nhiên phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học là khoa học
nhất.[1]Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học gồm có 9 nhóm kháng
sinh chính:
Nhóm 1: Các kháng sinh cacbonhydrat
Các saccarid thuần nhất: Njirimycin
Các aminoglycosid, Các N-glycosid : Streptomycin
Các ortozomycin: Verninomycin
Các glycopeptid: Vancomycin
11
Khóa luận tốt nghiệp Lê Đỗ Huyền Trang-CNSH 0802
Nhóm 2: Các lacton macrocyclic
Các kháng sinh macrolid : Erythromycin
Các kháng sinh polyen: Nystatin
Các kháng sinh anzamycin : Rifamycin
Các kháng sinh macrotetrolid : Tetranactin
Nhóm 3: Các kháng sinh quinon và dẫn xuất
Các kháng sinh tetracyclin: Tetracyclin
Các kháng sinh antracyclin: Adriamycin
Các kháng sinh naftoquinon: Actinorodin

Các kháng sinh benzoquinon: Mitomycin
Nhóm 4: Các kháng sinh peptid và axit amin
Các dẫn chất axit amin: Cycloserin
Các kháng sinh β-lactam: Penicilin
Các kháng sinh peptid: Bacitracin
Các kháng sinh cromopeptid: Actinomycin
Các kháng sinh depcipeptid: Valinomycin
Các peptid tạo kelat: Bleomycin
Nhóm 5: Các kháng sinh dị vòng chứa Nitơ
Các kháng sinh nucleozid: Polioxin
Nhóm 6: Các kháng sinh dị vòng chứa oxy
Kháng sinh polyete: Monenzin
Nhóm 7: Các kháng sinh mạch vòng no
Các dẫn chất alkan: Cycloheximid
Kháng sinh steroid: Axit fuzidic
Nhóm 8: Các kháng sinh chứa nhân thơm
Dẫn chất benzen: Chloramphenicol
Các chất nhân thơm ngưng tụ:griseofulvin
Các ete thơm: Novobiocin
Nhóm 9: Các kháng sinh mạch thẳng
12
Khóa luận tốt nghiệp Lê Đỗ Huyền Trang-CNSH 0802
Các chất chứa phospho: Phosphomycin
1.2.4. Cơ chế tác động của kháng sinh
Các kháng sinh tác dụng cơ bản qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp
rất khác nhau của tế bào vi sinh vật gây bệnh. Chúng liên kết vào các vị trí
chính xác hay các phân tử đích của tế bào vi sinh vật mà tạo ra các phản ứng
trao đổi chất. Các đích tác dụng đặc trưng cho từng nhóm kháng sinh, tuy
nhiên trong nhiều trường hợp vẫn chưa biết được chính xác hết các cơ chế tác
động của kháng sinh.[2] Các mức tác dụng kháng sinh đối với vi khuẩn được

thể hiện như sau: (hình 1)
Hình 1 : Cơ chế tác dụng của kháng sinh
1.2.4.1. Ức chế quá trình tổng hợp hình thành vách tế bào vi khuẩn
13
Khóa luận tốt nghiệp Lê Đỗ Huyền Trang-CNSH 0802
Chức năng của màng tế bào là: Giữ hình dạng đặc trưng của vi khuẩn,
che đỡ cho màng tế bào không bị phá vỡ dưới áp lực thẩm thấu cao ở bên
trong tế bào, làm khuôn mẫu để tổng hợp vách tế bào mới
Kháng sinh tác động lên quá trình hình thành vách tế bào làm cho vi
khuẩn dễ bị các đại thực bào phá vỡ màng tế bào do thay đổi áp suất thẩm
thấu với cơ chế:
Giai đoạn 1: Kháng sinh gắn vào thụ thể PBP
s
ức chế tranpeptidase
ngăn tổng hợp peptidoglycan. Những thụ thể khác nhau có ái lực khác nhau
đối với một loại thuốc
Giai đoạn 2: Hoạt hóa các enzyme tự tiêu ly giải tế bào trong môi
trường đẳng trương làm vi khuẩn Gram(-) có vách tế bào không hoàn chỉnh,
các vi khuẩn Gram(+) biến thành dạng hình cầu không có vách tế bào
1.2.4.2. Ức chế hình thành màng nguyên sinh chất
Chức năng của màng nguyên sinh chất: Thẩm thấu chọn lọc, vận
chuyển chủ động và kiểm soát các thành phần bên trong màng tế bào với cơ
chế làm mất đi sự toàn vẹn của tế bào vì vậy các phân tử có khối lượng lớn và
các ion bị thoát ra ngoài từ đó tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh, màng tế bào vi
khuẩn và vi nấm dễ bị phá vỡ bởi một số tác nhân như: Imidazole tác động
lên vi nấm, polymycin tác động lên vi khuẩn Gram(-) làm mất đi sự toàn vẹn
của màng của tế bào
1.2.4.3. Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein
Cơ chế: Kháng sinh gắn vào thụ thể trên tiểu phân 30S, làm mất hoạt
tính của phức hợp đầu tiên trong quá trình hình thành chuỗi peptide, thông tin

mRNA bị đọc sai làm một axit amin không phù hợp và cuối cùng làm vỡ các
polisomes thành monosomes dẫn đến vi khuẩn mất chức nằng tổng hợp
protein
Nhóm aminoglycosid gắn với receptor trên tiểu phân 30S của
ribosome làm cho quá trình dịch mã không chính xác.
14
Khóa luận tốt nghiệp Lê Đỗ Huyền Trang-CNSH 0802
Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phân 50S của ribosome ức chế
enzyme peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các axit amin với các chuỗi
polypeptide.
Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phân 50S của ribosome
làm ngăn cản quá trình dịch mã các axit amin mới vào chuỗi polypeptide.
1.2.4.4. Ức chế quá trình tổng hợp axit nucleic
Nhóm refampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quá trình
sao mã tạo thành mRNA (RNA thông tin).
Nhóm quinon ức chế tác dụng của enzyme DNA gyrase làm cho hai
mạch đơn của DNA không thể duỗi xoắn làm ngăn cản quá trình nhân đôi của
DNA.
Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA( axit paminobenzonic) có tác
dụng cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp axit nucleotid.
Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác có quá trình tạo nhân
purin làm ức chế quá trình tạo axit nucleic
1.3. Ứng dụng của kháng sinh
1.3.1. Ứng dụng kháng sinh trong y học
Penicillin là kháng sinh đầu tiên được sử dụng trong y học từ năm
1940, sau đó một loạt các chất kháng sinh khác từ xạ khuẩn được phát minh
ra và nhanh chóng được ứng dụng để điều trị các bệnh nhiễm trùng hiểm
nghèo
Một số kháng sinh quan trọng ứng dụng trong y học có giá tri kinh tế
cao là: Penicillin G, Tetracyclin, Oxitetracyclin, Chloramphenicol,

Cephalosporin C, Kanamycin, polymycin B, Gentamycin có tác dụng kháng
khuẩn. Streptomycin, Rifamycin tác dụng kháng lao. Actimomycin D,
Bleomycin, Daunorubicin và Mitomycin C kháng ung thư. Nistattin và
Griseofulvin kháng nấm,
1.3.2. Ứng dụng kháng sinh trong chăn nuôi
15
Khóa luận tốt nghiệp Lê Đỗ Huyền Trang-CNSH 0802
Kháng sinh được sử dụng như chất kích thích tăng trọng gia súc gia
cầm, giảm chi phí thức ăn như: Enduracidin, mikamicin, siomicin, thiopeptin,
thiotrepton,
- Tác dụng lên hệ vi sinh vật đường ruột làm tăng số lượng vi sinh vật có ích
trong ruột, tăng cường tổng hợp vitamin, tăng cường tái hấp thụ thức ăn,
làm giảm các vi sinh vật có hại tiết ra chất độc, giúp động vật tăng cường
trao đổi chất nhanh
- Một cách gián tiếp tăng cường điều tiết hoocmon đặc biệt là hoocmon sinh
trưởng giúp cơ thể lớn nhanh
1.3.3. Ứng dụng kháng sinh trong trồng trọt
Sử dụng thuốc hóa học trong bảo vệ thực vật đưa lại hiệu quả kinh tế rõ
rệt nhưng có nhiều nhược điểm như: Khó phân hủy trong đất dẫn đến tích lũy
các chất độc, thay đổi hệ sinh thái, ảnh hưởng đến đời sống con người còn sử
dụng kháng sinh trong trồng trọt có nhiều ưu điểm: Hoạt tính kháng sịnh
mạnh đối với mầm bệnh, dễ thấm vào các tế bào cây, liều điều trị không hại
đến cây, không gây ảnh hưởng hoặc gây ảnh hưởng thấp đến môi trường sống
của các sinh vật khác và môi trường sống của con người, một số kháng sinh
được sử dụng như:
- Trichotexin: Chống nhiều loại nấm gây bệnh như Botrytis cenerea,
helmintosporium gây bệnh cho bông
- Kasugamycin: Có thể thay cho blasticidin chữa bệnh vàng lụi và độc tính
với người loại thấp
- Herbicidin A và B là kháng sinh diệt cỏ kìm hãm sự phát triển của

xanthamonas oryzae gây bệnh cho lúa,
1.3.4. Ứng dụng kháng sinh trong công nghiệp thực phẩm
Bảo quản thực phẩm tươi và thực phẩm đóng hộp là vấn đề rất quan
trọng. Nguyên nhân làm hỏng thực phẩm là do vi khuẩn gây ra, sau khi phân
hủy thực phẩm nó còn tiết ra chất độc. Một số kháng sinh được sử dụng trong
bảo quản như: Pimaricin là chất diệt nấm bảo vệ bề mặt thực phẩm, tilozin tác
dụng chống lại các bào tử vi khuẩn, nizin có tác dụng chống lại clostridium,
1.4. Tính kháng thuốc
16
Khóa luận tốt nghiệp Lê Đỗ Huyền Trang-CNSH 0802
Khi tìm ra penicilin nhân loại có trong tay một vũ khí thần kỳ chống lại
các bệnh nhiễm trùng do các vi khuẩn Gram(+) gây ra: Staphylococcus,
streptococcus, Sau đó streptomycin được phát minh(1944) có tác dụng lên vi
khuẩn Gram(-) và trực khuẩn lao. Loài người tưởng như bình an vì có trong
tay những “thần dược” để chống lại các bệnh nhiễm trùng tuy nhiên việc sử
dụng kháng sinh chưa hợp lí hay nói đúng là sử dụng sai kháng sinh trong
điều trị, chăn nuôi làm xuất hiện ngày càng nhiều các vi sinh vật kháng kháng
sinh làm cho kháng sinh không còn là thần dược nữa.[1]
Định nghĩa: Kháng thuốc là hiện tượng vi sinh vật mất đi tính nhạy cảm
ban đầu của nó trong một thời gian hay vĩnh viễn với tác dụng của kháng sinh
hay hóa trị liệu.[1]
Kháng thuốc tự nhiên: Hiện tượng vi sinh vật đã kháng thuốc từ ban
đầu, có sẵn trong gen (proteus kháng các tetracyclin, streptococus nhóm D
kháng lincomycin). Về mặt sinh hóa có 2 cơ chế quan trọng: Đó là tính thấm
của tế bào hay sự thiếu vắng phân tử đích.
Kháng thuốc mới nhận: Khi xử lý vi sinh vật với kháng sinh thì trong
số đó có một số cá thể có khả năng sống sót trong môi trường có hàm lượng
kháng sinh cao đáng kể so với vi sinh vật có cùng nguồn gốc.
Điều đó lý giải mỗi ngày lại có rất nhiều các loại kháng sinh mới được
nghiên cứu bào chế để chống lại các loại vi sinh vật kháng thuốc ngày càng

gia tăng
1.5. Giới thiệu về kháng sinh dihydrochalcomycin.
Dihydrochalcomycin là kháng sinh thuộc nhóm Macrolide (PKS –
Polyketide synthase) có 16 cacbon.[8]. Nhóm kháng sinh này có khả năng ức
chế hoạt động của vi khuẩn rất mạnh bằng cách các kháng sinh liên kết với
tiểu phần lớn 50S ribosome của vi khuẩn từ đó ức chế quá trình sinh tổng hợp
protein của vi khuẩn.[9]
Dihydrochalcomycin được tách chiết từ chủng streptomyces sp,
KCTC0041 Bp. Dihydrochalcomycin có hoạt tính chống lại các vi khuẩn
Gram(+), là kháng sinh nhóm macrolide có vai trò ứng dụng quan trọng và
17
Khóa luận tốt nghiệp Lê Đỗ Huyền Trang-CNSH 0802
vượt trội hơn so với các kháng sinh macrolide 12 hay 14 cacbon bởi kháng
sinh nhóm này chưa có hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn.[9]
Dihydrochalcomycin có thể liên kết trực tiếp với trung tâm hoạt động
peptidyltranferase của vi khuẩn và từ đó bất hoạt quá trình sinh tổng hợp
protein của vi khuẩn mà những kháng sinh thuộc nhóm Macrolide có 12, 14
cacbon không liên kết trực tiếp được.[14](Hình 2)
Hình 2: Cấu trúc kháng sinh dihydrochalcomycin
Cấu trúc kháng sinh dihydrochalcomycin gồm 3 thành phần chính: 2
gốc đường D-chalcose và D-mycinose gắn với lõi macrolacton tại vị trí lần
lượt là C5 và C20 thông qua cầu nối O-glycosydic
Gốc đường khử D-chalcose và D-mycinose có vai trò vô cùng quan
trọng trong việc thể hiện hoạt tính sinh học trong các chất chứa nó và trong
kháng sinh này. Các gen tham gia sinh tổng hợp đường khử D-chalcose và D-
mycinose đã được xác định trong cosmid Geri5 và đã được giải trình tự từ
cosmid.
1.6.Giới thiệu về đường dTDP-6deoxy-D-Allose
1.6.1. Gốc đường khử trong cấu trúc kháng sinh
Đường khử là gốc đường đặc biệt được tìm thấy rất nhiều trong cấu

trúc của tế bào vi khuẩn, trong tế bào nấm, trong cấu trúc của nhiều chất
kháng sinh, chất chống ung thư hay rất nhiều chất có hoạt tính sinh học.[3]
Trong phân tử chúng có nhiều hơn một nhóm hydroxyl(OH) được thay
thế bởi nguyên tử H hay các nhóm chức khác như amino, methyl, alkyl, các
18
Khóa luận tốt nghiệp Lê Đỗ Huyền Trang-CNSH 0802
loại đường này có thể tồn tại ở dạng đường đơn hay đường đa hoặc phân
nhánh là dẫn xuất của các chất trao đổi bậc hai trong các hợp chất tự nhiên.[3]
Trong cấu trúc tế bào đường khử tham gia tạo thành cấu trúc
peptidoglycon là thành phần của lớp thành tế bào của rất nhiều loại vi sinh vật
đặc biệt là một số vi khuẩn Gram(+) hoặc hình thành lớp lypopolysacharide
trong cấu trúc màng tế bào của vi khuẩn Gram(-).
Nếu mất đi gốc đường khử trong cấu trúc tế bào của một số vi sinh vật
sẽ gây ức chế sinh trưởng của tế bào hoặc tiêu diệt vi sinh vật.[11]
Trong các hợp chất có hoạt tính sinh học đường khử đóng vai trò quan
trọng trong việc xác định hoạt tính của chúng, nếu mất gốc đường trong cấu
trúc thì hoạt tính sinh học của hợp chất đó cũng bị mất.[12]
Gốc đường khử trong nhóm kháng sinh enedine có vai trò quyết định
hoạt tính kháng khuẩn của chất kháng sinh, gốc đường rhamnose trong kháng
sinh calichaemicin đóng vai trò làm cầu nối liên kết phần tử kháng sinh với
enzyme tham gia vào quá trình sao mã hay sinh tổng hợp mRNA.[11]
Gốc đường khử trong nhóm kháng sinh macrolide như erythromycin,
tylosin, pikromycin đóng vai trò trong gắn kháng sinh này với các enzyme
tham gia tổng hợp Protein của vi khuẩn.[13]
1.6.2. Đường dTDP-6deoxy-D-Allose
Đường dTDP-6deoxy-D-Allose là đường trung gian trong con đường
sinh tổng hợp gốc đường D-mycinose là gốc đường cấu tạo kháng sinh
dihydrochalcomycin. Gốc đường dTDP-6-glucose-β-D-Allose dưới tác dụng
của các enzyme mã hóa bởi các gen khác nhau được chuyển hóa thành đường
D-mycinose, D-mycinose là thành phần quan trọng của kháng sinh

Dihydochalcomycin. Trong cấu trúc kháng sinh dihydrochalcomycin, gốc
đường mycinose đóng vai trò là nhóm liên kết với miền II tiểu phần 23S
rRNA của vi khuẩn với vòng macrolacton của kháng sinh
dihydrochalcomycin từ đó tăng khả năng chống lại tế bào vi khuẩn.[9]
1.6.3. Giới thiệu về gen gerF
19
Khóa luận tốt nghiệp Lê Đỗ Huyền Trang-CNSH 0802
Nhóm gen được dự đoán là tham gia sinh tổng hợp đường D-mycinose
trong quá trình tổng hợp kháng sinh dihydrochalcomycin gồm 6 gen là: gerD,
gerE, gerF, gerK, gerM2, gerM3 đã (hình 4)[20]
Trong đó gerF là gen mã hóa cho enzyme dTDP-4-keto-6-
deoxyglucose 3-epimerase, tham gia vào sinh tổng hợp đường của kháng sinh
dihydrochalcomycin thuộc nhóm macolide từ streptomycin sp.KCTC0041BP.
GerF có số axit amin là 196, độ dài của gen gerF là 588 bp.[4]
Hình 3: Nhóm gen deoxysugar tham gia sinh tổng hợp dihydrochalcomycin
Cơ chế: Enzyme gerF (dTDP-4-keto-6-deoxyglucose 3-epimerase)
cùng với sự tương tác của enzyme gerK1(dTDP-4-keto-6-deoxyglucose
reductase) tạo đồng phân cấu trúc quang học chuyển vị trí OH ở vị trí cacbon
số 3 của đường dTDP-4-keto-6-deoxygluco sau đó khử cacbon số 4-keto của
đường dTDP-4-keto-6-deoxy-D-Allose, xúc tác chuyển hóa dTDP-4-keto-6-
deoxyglucose thành đường dTDP-4-keto-6-deoxy-β-D-Allose. Nhờ một số
enzyme thì gốc đường dTDP-6-deoxy-β-D-Allose thành gốc đường dTDP-
mycinose và gốc đường mycinose.[16]. Cuối cùng là quá trình tạo kháng sinh
Dihydrochalcomycin (hình 3)
Tuy có vai trò quan trọng nhưng vẫn chưa có nghiên cứu chính thức về
loại gen này
20
Khóa luận tốt nghiệp Lê Đỗ Huyền Trang-CNSH 0802
Hình 4: Dự đoán chức năng của gen gerF trong sinh tổng hợp gốc đường khử
dTDP- mycinose thành phần quan trọng trong cấu trúc kháng sinh

dihydrochalcomycin.
1.7. Enzyme giới hạn
Enzyme giới hạn( Restriction enzyme, RE) là enzyme Endonuclease có
vị trí nhận biết điểm cắt DNA đặc hiệu. Những enzyme này phân hủy liên kết
phosphodieste của bộ khung DNA mạch đôi mà không gây tổn hại đến bases.
Các liên kết hóa học mà bị enzyme này cắt có thể được nối lại bằng các
enzyme ligases, vì thế các phân đoạn giới hạn (sản phẩm của phản ứng cắt
RE) mà bị cắt từ các nhiễm sắc thể hoặc gen khác nhau có thể được nối lại với
nhau. Nhiều kỹ thuật sinh học phân tử và enzyme giới hạn đều dựa vào các
enzyme giới hạn.[19]
1.8. Giới thiệu về vector biểu hiện pET-32a(+)
1.8.1. Vector
Vector là một hay nhiều đoạn DNA có kích thước nhỏ cho phép cài
(gắn) các đoạn DNA cần thiết, có khả năng tái bản không phụ thuộc vào sự
phân chia của tế bào, tồn tại trong tế bào vật chủ qua nhiều thế hệ không gây
biến đổi gen của tế bào vật chủ.[5]
Vector biểu hiện: Là những vector tách dòng mang promoter mạnh, cho
phép biểu hiện đồng thời cả gen chỉ thị và gen tách dòng tạo nên các protein
lai.[5]
21
Khóa luận tốt nghiệp Lê Đỗ Huyền Trang-CNSH 0802
Một vector biểu hiện gen gồm các thành phần chủ yếu: promoter mạnh,
trình tự sao chép(ori), vị trí khởi đầu phiên mã, vị trí bám của riboxom, tín
hiệu kết thúc mã, các trình tự đa cắt nối (MCS) và các gen chỉ thị
Vector biểu hiện mạnh là vector có đặc điểm: Có khả năng tạo số lượng
lớn các bản sao trong tế bào vật chủ(ori mạnh), promoter hoạt động mạnh,
dịch mã tạo nhiều proteinn lai, đoạn trình tự MSC có nhiều vị trí cắt đặc hiệu
của nhiều loại enzyme giới hạn,
1.8.2. Vector biểu hiện pET-32a(+)
pET-32a(+) là một plasmid có 5899bp. Vector pET-32a(+) được thiết

kế trong nhân dòng vô tính và biểu hiện ở cấp độ cao chuỗi trình tự peptide
nối với protein thioredoxin 109aa Trx•Tag
TM
. Vị trí tách dòng được dùng gắn
gen biểu hiện là fusionproteins, bao gồm chuỗi 6xHis•Tag đây là trình tự rất
đáng chú ý, nó có chứa 6 axitamin histidin có ý nghĩa quan trọng trong việc
tinh sạch protein biểu hiện. Chuỗi 6xHis•Tag nằm ở vị trí nu 327-344, gồm
18 nucleotid. Sau khi chuyển gen cần biểu hiện vào vị trí này, trình tự 18 Nu
này sẽ nằm liền kề với phần đầu của gen cần biểu hiện. Sau khi chuyển sẽ
được sản phẩm : 6-aa-histidin+protein mong muốn
Điều đặc biệt là trình tự 6aa histidin tích điện (-) và nó gắn với protein
sản phẩm của gen cần biểu hiện. Vì vậy khi tinh sạch dựa vào đặc tính này
người ta sẽ đưa sản phẩm vào môi trường có điện tích (+) để lọc sản phẩm.
[21][22]. Vị trí duy nhất để chuyển gen được biểu hiện trên vector. Vùng biểu
hiện hay vùng cloning của gen cần biểu hiện được gắn với T7 promotor, đây
là promotor mạnh giúp cho điều tiết tăng cường quá trình tổng hợp protein.
Bố trí thiết kế vector pET-32a(+) gồm có:
- Promotor T7: 764-780 Nu
- T7 transcription start: 763 Nu
- Trình tự coding 6xHis•Tag: 327-344 Nu (6xHis•Tag có chứa 6aa histidin
được sử dụng để tinh sạch protein
22
Khóa luận tốt nghiệp Lê Đỗ Huyền Trang-CNSH 0802
Hình 5: Vector biểu hiện pET-32a(+)
CHƯƠNG II
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Hóa chất và thiết bị
2.1.1. Hóa chất
- Cao nấm men, trypton, NACl, agar dùng trong môi trường nuôi cấy vi sinh
vật.

- Enzyme giới hạn, enzyme RNAase được dùng trong tinh sạch DNA và các
phản ứng cắt loại bỏ RNA lẫn trong dung dịch DNA
23
Khóa luận tốt nghiệp Lê Đỗ Huyền Trang-CNSH 0802
- Kháng sinh Ampicilin, tạo môi trường có kháng sinh trong nuôi cấy vi
sinh vật có khả năng kháng kháng sinh, thử kháng sinh.
- TE buffer, isopropanol, cồn 70
0
, 90
0
, Solusion I, Solution II, Solution III:
sử dụng trong quá trình tách chiết DNA Plasmid.
- Tris.Cl, EDTA, NaOH, SDS, potassium, acetate, nước cất, dùng pha dung
dịch solution I, II, III
- Ethylbromine, agarose, TAE 5X, buffer loading dùng trong chạy điện di
- Đĩa peptri dùng để nuôi cấy vi khuẩn.
- Ống phalcon 15ml, 50ml, bình tam giác 250ml nuôi cấy vi sinh vật.
- Pipet, đầu côn, eppendoft, ống đong, găng tay,
1/ Chuẩn bị dung dịch đệm( buffer)
Được pha chế từ NaH
2
PO
4
có tính axid nhẹ và NaHPO
4
có tính kiềm
nhẹ. Dựa vào máy đo pH để điều chỉnh pH=7-7,2 thì thích hợp cho môi
trường ly tâm.
2/ Dung dịch dùng để tách chiết plasmid
Solution I: Tách, kết tủa môi trường xung quanh tế bào

- 2M Tris.Cl(Ph=7.5): 2.5ml
- 0,5M EDTA 2ml
- Nước: 95.5 ml hấp Solution I rồi bảo quản ở nhiệt độ 4
0
C
Solution II: Phá vỡ màng tế bào
- 5M NaOH: 4ml
- 10% SDS: 10ml
- Nước: 86ml, bảo quản Solution II ở nhiệt độ 4
0
C
Solution III: Kết tủa protein và các chất
- Potassiumacetate( CH
3
COOK): 12.96g
- 100ml nước
- Điều chỉnh pH=4.8 bằng axit acetic bảo quản Solution III ở 4
0
C
3/ Dung dịch chạy điện di DNA(TAEX1)
TAE x50: Sử dụng để pha TAE x1
- Tris base: 242g
- Axit acetic (CH
3
COOH): 57.1ml
- 0.5M EDTA (pH=8): 100ml
TAE x1:
Lấy 20ml TAE x50 bổ xung thêm 980ml nước cất ta thu được 1000ml TAE
x1 dùng trong chạy điện di DNA.
24