Phân lập, nhân nuôi in vitro và bảo quản lạnh tế bào biểu mô ống dẫn trứng bò

i

B GIÁO D C VÀ ðÀO T O
TRƯ NG ð I H C NÔNG NGHI P HÀ N I
-------

ð

-------

TRUNG KIÊN

PHÂN L P, NHÂN NUÔI IN VITRO VÀ B O QU N L NH
T BÀO BI U MÔ

NG D N TR NG BỊ

LU N VĂN TH C SĨ NƠNG NGHI P

Hà N i, năm 2013
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………

i


ii

B GIÁO D C VÀ ðÀO T O
TRƯ NG ð I H C NÔNG NGHI P HÀ N I
-------

ð

-------

TRUNG KIÊN

PHÂN L P, NHÂN NUÔI IN VITRO VÀ B O QU N L NH
T BÀO BI U MÔ

NG D N TR NG BỊ

LU N VĂN TH C SĨ NƠNG NGHI P

Chun ngành: Công ngh Sinh h c
Mã s : 60420201
NGƯ I HƯ NG D N KHOA H C:
TS. NGUY N H U ð C
B mơn Cơng ngh sinh h c đ ng v t
Khoa Công ngh sinh h c

Hà N i, năm 2013
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………

ii


i

L I CAM ðOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên c u c a tơi. Các s li u và

k t qu nêu trong lu n văn là trung th c và chưa t ng đư c cơng b trong b t
kì cơng trình nghiên c u nào khác.
Tơi xin cam đoan r ng các thơng tin trích d n trong lu n văn ñ u ñã
ñư c ch rõ ngu n g c.
Tác gi lu n văn

ð Trung Kiên

Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………

i


ii

L I C M ƠN
Trong su t quá trình th c hi n lu n văn, tôi xin trân tr ng bày t lịng
bi t ơn sâu s c đ n TS. Nguy n H u ð c – Phó Trư ng Khoa Công ngh
sinh h c, Trư ng B mơn Cơng ngh sinh h c đ ng v t – ð i h c Nông
nghi p Hà N i đã ln t n tình giúp đ , hư ng d n, ñ ng th i b i dư ng cho
tôi nh ng ki n th c chuyên môn và kinh nghi m quý báu.
ð th c hi n ñư c nghiên c u này, tôi xin chân thành c m ơn s tài tr
t ñ tài c p B Giáo d c và ðào t o: “Nâng cao hi u qu t o phơi bị th tinh
ng nghi m b ng k thu t nuôi c y chung v i t bào ng d n tr ng” (mã s
B2011-11-01) và ñ tài c p Nhà nư c “ ng d ng cơng ngh c y chuy n phơi
bị s a cao s n t i Tây Nguyên” (mã s TN3/CO2).
ð th c hi n ñư c nghiên c u này, tơi cũng xin c m ơn s giúp đ c a
các nghiên c u viên, k thu t viên phịng Cơng ngh phơi thu c Vi n Cơng
ngh sinh h c – Vi n Hàn lâm Khoa h c và Công ngh Vi t Nam và các cán
b Vi n Nghiên c u khoa h c Tây Nguyên – Vi n Hàn lâm Khoa h c và

Công ngh Vi t Nam.
V i tình c m sâu s c, tơi xin c m ơn s

ng h và giúp ñ c a các

Th y, Cô giáo thu c B môn Công ngh sinh h c ñ ng v t – Khoa Công ngh
sinh h c – ð i h c Nông nghi p Hà N i trong quá trình th c hi n nghiên c u
t i ñơn v .
ð vi c thu m u ph c v cho nghiên c u thu n l i, tôi xin c m ơn tồn
th anh, ch em cơng nhân lị m gia súc quanh ngo i thành Hà N i và khu
v c lân c n, ñ c bi t là anh Nguy n Xn Chi u – cơng nhân lị m thơn C
ði n – xã H i B i – huy n ðơng Anh đã t n tình giúp đ .
ð hồn thành lu n văn này, tơi cũng xin bày t lịng bi t ơn t i Ban
lãnh đ o; các Th y, Cơ giáo trư ng Cao đ ng Th y s n – T Sơn – B c Ninh,
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………

ii


iii

nơi tôi công tác.
Cu i cùng, tôi xin c m ơn các Th y, Cô giáo; các chuyên viên Ban
qu n lý ñào t o – ð i h c Nơng nghi p Hà N i đã ng h , t o đi u ki n giúp
đ tơi hồn thành các th t c c n thi t ñ b o v thành công lu n văn này.
Hà N i, tháng 6 năm 2013
Tác gi lu n văn

ð Trung Kiên

Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………

iii


iv

M CL C
Trang ph bìa
L I CAM ðOAN ..............................................................................................i
L I C M ƠN...................................................................................................ii
DANH M C CÁC KÝ HI U, CÁC CH

VI T T T.................................vii

DANH M C CÁC B NG.............................................................................viii
DANH M C CÁC HÌNH................................................................................ix
M

ð U ...........................................................................................................1

Chương 1 - T NG QUAN TÀI LI U .............................................................4
1.1. T ng quan cơ quan sinh s n

bò cái, ng d n tr ng và l p bi u mô

t bào ng d n tr ng...................................................................................... 4
1.1.1. Cơ quan sinh s n

bò cái ................................................................. 4

1.1.2. ng d n tr ng bò .............................................................................. 6
1.1.3. L p bi u mô t bào ng d n tr ng..................................................... 8
1.2. K thu t nuôi c y in vitro t bào ñ ng v t có vú................................... 10
1.2.1. ð c ñi m c a t bào ñ ng v t ......................................................... 10
1.2.2. Ni c y t bào đ ng v t................................................................. 11
1.2.3. Mơi trư ng ni c y t bào đ ng v t............................................... 14
1.2.4. Ki m soát nhi m trong nuôi c y t bào ........................................... 16
1.3. K thu t ñông l nh t bào ñ ng v t ...................................................... 19
1.3.1. Khái ni m ....................................................................................... 19
1.3.2. M c đích c a k thu t đơng l nh .................................................... 19
1.3.3. Các bi n ñ i c a t bào trong b o qu n b ng phương pháp đơng
l nh........................................................................................................... 20
1.3.4. Ch t b o qu n đơng l nh................................................................. 22
1.3.5. Quy trình thu nh n t bào đ đơng l nh........................................... 24
1.3.6. Các phương pháp đơng l nh............................................................ 25
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………

iv


v

1.4. K thu t gi i đơng t bào đ ng v t ....................................................... 27
1.5. Phân l p, nhân nuôi in vitro và b o qu n l nh t bào bi u mô ng
d n tr ng ..................................................................................................... 27
1.5.1. Lư c s nghiên c u ....................................................................... 27
1.5.2. Phương pháp phân l p, nuôi c y t bào bi u mô ng d n tr ng...... 28
1.5.3. Các lo i mơi trư ng ni đư c s d ng v i l p đơn t bào bi u mơ
ng d n tr ng............................................................................................ 29

1.5.4. B o qu n l nh t bào bi u mô ng d n tr ng ................................. 30
1.6. nh hư ng c a vi c b sung t bào bi u mô ng d n tr ng vào mơi
trư ng ni phơi bị..................................................................................... 30
1.6.1. Vi mơi trư ng trong ng d n tr ng ................................................. 30
1.6.2. ð ng nuôi c y phôi v i t bào bi u mơ ng d n tr ng bị ............... 32
1.7. Tình hình nghiên c u trong và ngồi nư c ......................................... 36
1.7.1. Tình hình nghiên c u ngồi nư c.................................................... 36
1.7.2. Tình hình nghiên c u trong nư c .................................................... 38
Chương 2 - ð I TƯ NG, N I DUNG, ð A ðI M VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN C U................................................................................................40
2.1. ð i tư ng nghiên c u........................................................................... 40
2.2. N i dung nghiên c u ............................................................................ 40
2.3. ð a ñi m nghiên c u ............................................................................ 40
2.4. Phương pháp nghiên c u..................................................................... 41
2.4.1. Tiêu chí l a ch n phương pháp, trang thi t b và hóa ch t .............. 41
2.4.2. Thu và b o qu n ng d n tr ng bò .................................................. 42
2.4.3. X lý ng d n tr ng bị t i phịng thí nghi m.................................. 42
2.4.4. Phân l p t bào bi u mô ng d n tr ng ........................................... 42
2.4.5. Nuôi c y trong ng nghi m t bào bi u mô ng d n tr ng .............. 43
2.4.6. Phương pháp ñ m t bào................................................................. 44
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………

v


vi

2.4.7. T o l p ñơn t bào bi u mô ng d n tr ng...................................... 45
2.4.8. ðông l nh t bào bi u mô ng d n tr ng......................................... 45
2.4.9. Gi i đơng và ki m tra kh năng phát tri n in vitro c a t bào bi u

mơ ng d n tr ng...................................................................................... 46
2.4.10. Ch n dịng t bào .......................................................................... 47
2.4.11. X lý s li u.................................................................................. 47
Chương 3 - K T QU VÀ TH O LU N.....................................................48
3.1. Phân l p t bào bi u mô ng d n tr ng ............................................... 48
3.2. Kh năng phát tri n in vitro c a t bào bi u mô ng d n tr ng .......... 60
3.3. Kh năng b o qu n l nh t bào bi u mô ng d n tr ng...................... 70
3.4.

nh hư ng c a t bào bi u mơ ng d n tr ng đ n s phát tri n in

vitro c a phơi bị .......................................................................................... 76
K T LU N VÀ KI N NGH ........................................................................83
TÀI LI U THAM KH O..............................................................................84
PH L C: Bài báo ñang in 2013 (T p chí Cơng ngh Sinh h c) ....................95

Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………

vi


vii

DANH M C CÁC KÝ HI U, CÁC CH
BME

VI T T T

Bassal Medium Eagle

BO

Bracket and Oliphant’s medium

BOECs

Bovine Oviduct Epithelial Cells

BSA
cs

Bovine Serum Albumin
c ng s

D’MEM

Dulbecco’s Modified Eagle Medium

DMSO

Dimethyl Sulfoxide

E’MEM

Eagle Medium Essential Medium

FCS

Fetal Calf Serum

IVF

In Vitro Fertilization

IVM

In Vitro Maturation

OCS

Oestrus Cow Serum

LH

Luteinizing Hormone

PBS

Phosphate Buffered Saline

SOF

Synthetic Oviductal Fluid

TCM 199

Tissue Culture Medium 199

Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………

vii


viii

DANH M C CÁC B NG
B ng 1.1. M t s lo i môi trư ng ph bi n trong ni c y t bào đ ng v t .. 15
B ng 3.1. Thành ph n môi trư ng PBS ........................................................ 50
B ng 3.2. Thành ph n môi trư ng D’MEM.................................................. 63
B ng 3.3. Thành ph n môi trư ng BO.......................................................... 77
B ng 3.4. Thành ph n môi trư ng TCM 199 ................................................ 79
B ng 3.5. Kh năng phát tri n c a phơi bị th tinh ng nghi m trong mơi
trư ng TCM 199 có và khơng b sung t bào bi u mô ng d n
tr ng ........................................................................................... 81

Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………

viii


ix

DANH M C CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cơ quan sinh s n c a bị cái ............................................................4
Hình 1.2. T ch c cơ quan sinh d c bị cái .....................................................5
Hình 1.3. C u trúc ng sinh d c

bị cái ........................................................6

Hình 1.4. Bu ng tr ng bị ...............................................................................6

Hình 1.5. V trí ng d n tr ng bị....................................................................7
Hình 1.6. C u t o ng d n tr ng.....................................................................8
Hình 1.7. T bào bi u mơ và các vùng n i liên k t trong t bào bi u mơ ng
d n tr ng.....................................................................................9
Hình 1.8. Ni c y sơ c p ............................................................................ 12
Hình 1.9. Ni c y th c p ........................................................................... 13
Hình 1.10. S bi n ñ i v t lý c a t bào khi đơng l nh................................. 23
Hình 1.11. S phân b nhi t đ trong bình nitơ l ng .................................... 24
Hình 2.1. Phịng thí nghi m Cơng ngh sinh h c ð ng v t – Khoa Công ngh
sinh h c – ð i h c Nông nghi p Hà N i ................................... 40
Hình 3.1. Thi t b Cryologic......................................................................... 48
Hình 3.2. Mơi trư ng PBS............................................................................ 50
Hình 3.3. Tách mơ liên k t, tua vi n c a ng d n tr ng................................ 51
Hình 3.4. B c l lòng ng d n tr ng............................................................. 52
Hình 3.5. Tách nh ng m ng t bào bi u mơ ng d n tr ng........................... 52
Hình 3.6. Cho nh ng m ng t bào bi u mô ng d n tr ng vào ng ly tâm có
ch a 1 ml mơi trư ng D’MEM có b sung 10% FCS................ 52
Hình 3.7. Ly tâm t c đ 1200 vịng/phút trong 5 phút .................................. 53
Hình 3.8. L p t bào l ng ñ ng bên dư i sau khi ly tâm............................... 53
Hình 3.9. Dùng pipet vơ trùng lo i b d ch n i bên trên, tr n l n t bào lên
xu ng v i môi trư ng D’MEM m i có b sung 10% FCS ........ 53
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………

ix


x

Hình 3.10. Bu ng thao tác vơ trùng .............................................................. 54
Hình 3.11. M ng t bào bi u mô ng d n tr ng tách t

ng d n tr ng ngay

sau khi đưa v phịng thí nghi m............................................... 54
Hình 3.12. Kháng sinh Penicillin và Streptomycin ....................................... 56
Hình 3.13. T ni Sanyo ñi u ch nh cân b ng nhi t ñ 37ºC, 5% CO2, đ

m

bão hịa ..................................................................................... 57
Hình 3.14. H th ng cung c p khí cho t

m ................................................ 58

Hình 3.15. H th ng l c nư c c t vô trùng và đ ion hóa ............................. 58
Hình 3.16. ð th th hi n kh năng bám dính và phân chia c a t bào ng
d n tr ng ñư c phân l p

các kho ng th i gian khác nhau ...... 59

Hình 3.17. M ng t bào bi u mơ ng d n tr ng bám xu ng ñáy ñĩa ni và t
bào b t đ u phân chia................................................................ 60
Hình 3.18. T bào bi u mô ng d n tr ng đư c ni trong đĩa nh a NUNC
(lo i 04 gi ng), đã chu n b mơi trư ng ni c y ...................... 61
Hình 3.19. ð th bi u di n kh năng bám dính và ti p t c phát tri n c a các
m ng t bào bi u mơ ng d n tr ng .......................................... 61
Hình 3.20. Mơi trư ng D’MEM ................................................................... 64
Hình 3.21. Huy t thanh bào thai bê .............................................................. 65
Hình 3.22. C u trúc khơng gian c a Trypsin................................................. 66
Hình 3.23. T bào bi u mô ng d n tr ng phát tri n thành l p đơn sau 48 gi

ni in vitro .............................................................................. 67
Hình 3.24. Bu ng đ m Neubauer và bu ng ñ m Thoma.............................. 68
Hình 3.25. C u trúc chung c a bu ng đ m ................................................... 68
Hình 3.26. Kích thư c m i ơ đ m c a bu ng ñ m........................................ 68
Hình 3.27. Phương pháp ch n vùng ñ m v i bu ng đ m Neubauer ............. 69
Hình 3.28. Phương pháp ch n vùng ñ m v i bu ng đ m Thoma.................. 69
Hình 3.29. Phương pháp đ m t bào............................................................. 69
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………

x


xi

Hình 3.30. Thao tác nh trypan blue............................................................. 70
Hình 3.31. Hai m c nhi t ñ ñư c áp d ng ñ h d n nhi t ñ c a t bào b o
qu n l nh trư c khi ñưa vào nitơ l ng (-196ºC) ........................ 71
Hình 3.32. Thi t b tr l nh dùng nitơ l ng s d ng trong nghiên c u.......... 72
Hình 3.33. Ch t b o qu n l nh DMSO ......................................................... 74
Hình 3.34. C ng r dùng trong nghiên c u ................................................... 75
Hình 3.35. T bào bi u mô ng d n tr ng ñư c b o qu n l nh trong nitơ l ng
(-196ºC) .................................................................................... 75
Hình 3.36. T bào bi u mơ ng d n tr ng ti p t c phát tri n sau đơng l nh gi i đơng ................................................................................... 75
Hình 3.37. ðĩa nhi t Tokai-Hit đư c kh ng ch nhi t đ 37ºC..................... 78
Hình 3.38. Ch n dịng t bào trên kính hi n vi ph n pha Nikon Ti-U có g n b
vi thao tác Narishige ................................................................. 78
Hình 3.39. Mơi trư ng TCM 199.................................................................. 81

Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………

xi


1

M

ð U

Tính c p thi t c a đ tài
M t v n ñ hay g p ph i trong vi c t o phơi bị th tinh trong ng
nghi m, đó là hi n tư ng “Block” mà chúng tôi t m d ch là “Ngưng tr ”. Hi n
tư ng này thư ng g p

giai đo n phơi bị đ t 8-16 t bào, nó làm phơi bị th

tinh trong ng nghi m không ti p t c phát tri n thành phôi dâu ho c phôi
nang, khi n t l phơi dâu-phơi nang thu đư c khơng cao. Hi n tư ng “Block”
này xu t phát t s s t gi m ARNm có ngu n g c t t bào tr ng và s kh i
ñ ng c a quá trình phiên mã ARNm c a b gen c a phôi th tinh trong ng
nghi m (Eyestone W.H. và First N.L.,1986) [21].
Trong nuôi phôi in vitro, ñi u này có nguyên nhân tr c ti p t mơi
trư ng ni phơi. Nghĩa là, các đi u ki n c a môi trư ng, trong nh ng trư ng
h p c th , là khơng đáp ng ñ y ñ và k p th i cho t t c các ph n ng sinh
hóa x y ra trong q trình phát tri n c a phơi. ð giúp phơi bị th tinh trong
ng nghi m có th vư t qua ñư c giai ño n “Block” này, ngư i ta s d ng t
bào bi u mô ng d n tr ng (Bovine Oviduct Epithelial Cells = BOECs) như
m t tác nhân b tr quan tr ng trong môi trư ng nuôi phôi (Eyestone W.H. và
First N.L.,1989) [22].
ng d n tr ng bị chính là m t vi mơi trư ng thích h p cho q trình

thành th c cu i cùng c a tr ng, thích h p cho s th tinh, ñ ng th i đó cũng
chính là vi mơi trư ng thu n l i cho s phát tri n c a phôi giai ño n s m.
Theo m t s nghiên c u trên th gi i, phơi bị th tinh ng nghi m đư c ni
chung (co-culture) v i các t bào bi u mơ ng d n tr ng bị s phát tri n đ n
giai đo n phơi dâu-phơi nang v i t l cao hơn (Eyestone W.H. và First N.L.,
1989) [22].
T i Vi t Nam, các nghiên c u t o phơi bị th tinh trong ng nghi m ñã
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………

1


2

đư c ti n hành t i Vi n Cơng ngh sinh h c – Vi n Hàn lâm Khoa h c và
Công ngh Vi t Nam, Vi n Chăn nuôi, Vi n Khoa h c k thu t Nông nghi p
Mi n Nam, Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i (Nguy n Th Ư c và cs,
1999 [4]; Nguy n H u ð c và cs, 2003a [1]; Bùi Xuân Nguyên và cs, 2004
[50]). Bê th tinh trong ng nghi m ñ u tiên c a Vi t Nam cũng ñã ñư c sinh
ra (Nguy n H u ð c và cs, 2003a [1]).
Nh m ti p t c c i thi n hi u qu c a công ngh t o phôi b ng k thu t
th tinh trong ng nghi m c th gi i quy t hi n tư ng “Block” ñã ñ c p
trên, chúng tôi ti n hành th c hi n nghiên c u ñ tài “Phân l p, nhân nuôi in
vitro và b o qu n l nh t bào bi u mô ng d n tr ng bị”.
M c tiêu nghiên c u c a đ tài
Xây d ng thành công phương pháp phân l p, nuôi c y in vitro, b o
qu n l nh t bào bi u mô ng d n tr ng bò.
Ý nghĩa khoa h c và th c ti n c a ñ tài
- Ý nghĩa khoa h c
+ K t qu nghiên c u c a đ tài đóng góp vào vi c xây d ng cơng ngh

nhân ni in vitro và b o qu n l nh t bào bi u mơ ng d n tr ng bị t i Vi t
Nam ñ ng th i thúc ñ y nhanh các nghiên c u cơ b n cũng như ng d ng
trong lĩnh v c công ngh phôi và cơng ngh sinh h c sinh s n đ ng v t t i
Vi t Nam;
+ K t qu nghiên c u c a ñ tài s làm tài li u tham kh o t t cho vi c
nghiên c u và gi ng d y v công ngh phơi đ ng v t trong các trư ng h c,
các cơ s nghiên c u và ng d ng sinh h c

Vi t Nam.

Ý nghĩa th c ti n
+ K t qu c a ñ tài giúp c i thi n hi u qu c a công ngh t o phôi
b ng k thu t th tinh trong ng nghi m, c th nâng cao t l phôi dâu-phôi
nang t o thành thông qua vi c b sung t bào bi u mô ng d n tr ng vào môi
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………

2


3

trư ng nuôi phôi giúp phôi 8-16 t bào vư t qua hi n tư ng “Block” và ti p
t c phát tri n;
+ K t qu c a ñ tài s ph c v

vi c xây d ng ngân hàng l nh

(Cryobank) b o qu n các dòng t bào bi u mơ ng d n tr ng có ch t lư ng t t
nh m ch ñ ng trong các thí nghi m cũng như ph c v m c đích thương m i.

Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………

3


4

Chương 1 - T NG QUAN TÀI LI U
1.1. T ng quan cơ quan sinh s n

bò cái, ng d n tr ng và l p bi u mô

t bào ng d n tr ng
1.1.1. Cơ quan sinh s n

bò cái

Trong các cơ quan n i quan, cơ quan sinh s n c a bò cái n m
ru t th ng và ñư c tách ra b i m t túi sinh d c.

dư i

bị, chính m i liên h phân

b c a t ch c này cho phép ngư i ta có th thao tác ki m tra s n n b ng tay
ho c b ng siêu âm cơ quan sinh s n ví d như ch n ñoán tr ng thái c a bu ng
tr ng c a bị cái (Senger, 2003) [61].

Hình 1.1. Cơ quan sinh s n c a bò cái
“Ngu n: [81]”

Các c u trúc chính c a cơ quan sinh s n

bị cái bao g m: bu ng tr ng,

cơ quan sinh d c ngoài và t ch c cơ quan sinh s n cái. T ch c cơ quan sinh
d c cái g m các h th ng các ñư ng ng sinh d c liên k t v i nhau, m i ng
có m t ch c năng riêng bi t.
ði t ngoài vào, các b ph n ng sinh d c là âm ñ o, c t cung, t
cung và ng d n tr ng. Chúng bao g m 4 l p riêng bi t b t ñ u t l p màng
thanh d ch ngoài, l p cơ, l p dư i niêm m c và cu i cùng là l p niêm m c.
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………

4


5

L p màng thanh d ch ngoài là m t l p ph ngồi bao g m các t bào
hình v y d ng d t bao ph b m t c a t ch c cơ quan sinh d c và nó đư c
n i ti p v i l p màng b ng.
L p cơ là m t l p kép cơ trơn, l p ngoài là l p cơ d c, l p trong là l p
cơ tròn giúp cho vi c co th t c a các ñư ng ng sinh d c. M i cơn co th t là
r t c n thi t ñ v n chuy n giao t , kích thích bài ti t và kích thích trong q
trình sinh đ .
N m bên trong ph n dư i l p cơ là l p dư i niêm m c, ñây là l p có đ
dày khác nhau bao g m m ch máu, dây th n kinh và m ch b ch huy t. L p
dư i niêm m c cũng nuôi dư ng l p niêm m c.
S h p thành c a các bi u mô niêm m c ph thu c khác nhau tùy vào
v trí c a t ch c sinh d c, tr ng thái hormon và tr ng thái c a chu kỳ sinh
s n. Ch ng h n như âm ñ o bao g m các bi u mơ phân t ng hình v y ñ b o

v ch ng l i s tr y xư c trong su t quá trình giao ph i, trong khi

ng d n

tr ng, l p bi u mơ l i nhăn nheo và đư c xáo tr n gi a bi u mơ có nhung
mao và bi u mơ khơng có nhung mao đ thu n ti n cho vi c ti t d ch và s
v n chuy n qua lơng mao (Senger, 2003) [61].

Hình 1.2. T ch c cơ quan sinh d c bò cái
“Ngu n: Bai, 2011 [9]”
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………

5


6

Hình 1.3. C u trúc ng sinh d c

bị cái

“Ngu n: [77]”
Bu ng tr ng bò là cơ quan sinh s n c a gia súc cái, s n sinh ra t bào
tr ng và hormon sinh s n c a gia súc cái (estrogen và progestins). Bu ng
tr ng ñư c treo

c nh trư c dây ch ng r ng, n m trong xoang ch u.

bị

chúng ta có th xác ñ nh ñư c b ng tay khi khám qua tr c tràng. Bu ng tr ng
có hình ovan d t, song hình dáng và kích thư c c a bu ng tr ng s b thay ñ i
và bi n d ng do s phát tri n c a nang tr ng và s t n t i c a th vàng.

Hình 1.4. Bu ng tr ng bò
“Ngu n: [75]”
1.1.2. ng d n tr ng bò
ng d n tr ng bò dài 20-25 cm v i ñư ng kính kho ng 1-2 mm.

ng

d n tr ng ch y dài t ñ u mút c a s ng t cung ñ n ph n hoa kèn (t ch c
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………

6


7

hình ph u) h ng tr ng bao quanh bu ng tr ng. V cơ b n, ng d n tr ng g m
3 ph n: ph n hoa kèn, ph n ph ng ng và ph n eo ng (Ellington, 1991) [19].
Trong in vivo, s th tinh x y ra
trí th tinh này n m

1/3 phía trên c a ng d n tr ng. V

ch n i gi a eo ng-ph ng ng c a ng d n tr ng.

Ngồi các q trình b m sinh, s nhu đ ng c a nhung mao ph ng ng, s
thay ñ i kích thư c c a ng d n tr ng, s mát xoa c a các cơ ng d n tr ng,

và vi c b sung m t l p glycoprotein ñư c ph b ng v t li u ñ c bi t cho ng
d n tr ng t o ñi u ki n cho vi c th tinh đư c thành cơng (Hunter, 2003)
[30].
V m t mơ h c, cũng như t t c các ng khác c a t ch c sinh d c, ng
d n tr ng cũng bao g m màng thanh d ch ngoài, l p cơ, l p dư i niêm m c
và l p niêm m c (Senger, 2003) [61]. L p niêm m c bao g m m t l p đơn
các bi u mơ hình tr g m có c các nhung mao và các t bào kích thích bài
ti t. Các nhung mao hi n di n trong toàn b

ng d n tr ng nhưng s lư ng t

bào có nhung mao tăng m t cách đ t ng t v phía tua bu ng tr ng. Cùng th i
đi m đó, nh ng cơ trơn vịng phía trong c a l p cơ tr nên m ng hơn và h u
h t không xu t hi n

mi ng ph u c a ph n hoa kèn. Nh ng ph n c a ng

d n tr ng dư ng như ñ m nhi m các ch c năng riêng liên quan ñ n s di
chuy n c a tinh trùng, s r ng tr ng, s v n chuy n, s th tinh và v n
chuy n phôi giai ño n s m ñ n t cung (Rodriguez-Martinez, 2007) [56].

Hình 1.5. V trí ng d n tr ng bò
“Ngu n: Avilés và cs, 2010 [8]”

Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………

7


8

Hình 1.6. C u t o ng d n tr ng
“Ngu n: Hunter, 2003 [30]”
1.1.3. L p bi u mô t bào ng d n tr ng
L p bi u mơ c a ng d n tr ng có d ng hình tr đơn gi n và bao g m
2 lo i t bào: t bào có nhung mao và t bào khơng nhung mao. Vi c có m t
c a t bào không nhung mao xen k v i t bào có nhung mao giúp cho s nhu
đ ng d dàng và kích thích bài ti t (Senger, 2003 [61]). Gi ng như t t c các
t bào ñ ng v t, nh ng t bào này ñư c gi i h n v i bên ngoài b i l p màng
huy t tương và có các đ c ñi m như ñ c ñi m chung c a t bào ñ ng v t (Bai,
2011) [9].
Các t bào bi u mô là các t bào phân c c b i vì màng huy t tương đã
đư c cơ c u vào trong 2 vùng riêng bi t: vùng ñ nh và vùng ñáy-bên (Alberts,
2008) [5]. M t c a vùng đ nh

phía trong lịng ng d n tr ng có ch c năng

chuyên d ng như là nhung mao có m t

các t bào có nhung mao. Trong khi

đó, vùng đáy-bên ki m sốt s ngh c a t bào. Nh ng vùng này ñư c phân
tách b i m t ñai n i ch t. Nh ng vùng này có r t nhi u protein khác nhau h p
thành, và ñây là m c tiêu c a các d ng khác nhau c a b máy golgi. L p bi u
mơ đư c đ trên m t l p lư i ngo i bào g i là phi n m ng cơ s (l p màng
n n). Các t bào li n k ñư c liên k t v i nhau và ñư c neo gi trên l p màng
n n b i m t vài d ng t bào n i (Bai, 2011) [9].
ðai n i ch t, ñư c bi t ñ n như m t nút n i, là m t trong b n d ng n i
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………

8


9

có m t

t bào bi u mơ. D ng n i này giúp đóng các vùng đ nh và giúp ngăn

ng a các phân t l t qua bi u mô theo l chân lông gi a các t bào. Chúng
cũng có ch c năng như là m t “hàng rào” phân t , giúp ngăn ng a s khu ch
tán các protein gi a vùng ñ nh và vùng ñáy-bên c a t bào bi u mô, ñ duy trì
s khác nhau m t đ protein gi a các vùng này (Lodish, 2008) [38].
Có s t n t i c a 3 d ng n i neo gi t bào-t bào. Th liên k t n i là v
trí neo gi nh ng s i nh trung gian c a m t t bào v i t bào ti p theo ñư c
phát hi n dư i ñai n i ch t. C 3 d ng n i này, ñư c bi t như vùng n i bám
ch t gi a t bào v i m ng lư i ngo i bào (bán liên k t), neo gi các t bào v i
m ng lư i phía dư i. Chúng th hi n m t quy lu t ch y u ñ gi các t bào
v i nhau và truy n s áp l c d ch chuy n ngang qua tồn b kh i bi u mơ
(Lodish, 2008) [38]. Vùng n i d ng kênh, ñư c bi t ñ n như là vùng n i h ,
cho phép s lan truy n các phân t nư c hòa tan gi a các t bào li n k (Bai,
2011) [9].

A

B

Hình 1.7. T bào bi u mơ (A) và các vùng n i liên k t trong t bào bi u mô
ng d n tr ng (B)
“Ngu n: Alberts, 2008 [5]”

Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………

9


10

1.2. K thu t nuôi c y in vitro t bào đ ng v t có vú
1.2.1. ð c đi m c a t bào ñ ng v t
T t c các t bào đ u có chung c u trúc cơ b n g m màng (membrain),
nguyên sinh ch t (protoplasm), nhân (nucleus) và các bào quan (organelle).
Trong nuôi c y in vitro, t bào ñ ng v t nhìn chung có các đ c đi m sau:
- Tính cơ h c y u: t bào ñ ng v t khơng có vách, nhưng kích thư c
khá l n (kho ng 10 µm) nên tính b n cơ h c y u. Do đó, t bào đ ng v t
trong in vitro r t d v b i các l c tác ñ ng khi khu y tr n ñ tách t bào,
thao tác… Th i gian ti n hành các thao tác v i t bào ñ ng v t nên c g ng
sao cho ng n nh t. Trong b o qu n, di chuy n các m u t bào cũng c n th t
nh nhàng.
- Tăng trư ng và phân chia ch m: th i gian tăng g p đơi s lư ng c a t
bào ñ ng v t trong ñi u ki n sinh lý là 20-40 gi . Hi u su t s n sinh các ch t
có ho t tính sinh h c c a t bào ñ ng v t r t th p và ch m. Do đó c n có th i
gian dài và kh i lư ng t bào l n khi mu n s n xu t các ch t có ho t tính t t
bào ñ ng v t.
- Cơ ch kìm hãm ngư c (negative feed-back): cơ ch

c ch s t ng

h p và ti t ra ngồi mơi trư ng c a m t ch t nào đó, s đư c th c hi n b i
chính s gia tăng n ng đ c a ch t này trong môi trư ng. Do đó, vi c thay
m i mơi trư ng sau m t th i gian ni c y nh t đ nh là r t c n thi t, nh m

tránh s ho t đ ng c a cơ ch kìm hãm ngư c nói trên. Trong phịng thí
nghi m, cơ ch kìm hãm ngư c cịn có th gây t n thương t bào, th m chí
làm ch t hàng lo t.
- Tính ch t c n giá đ : tr t bào máu và m t s giai ño n c a t bào
sinh d c, h u h t các mơ và t bào đ ng v t c n bám vào giá đ đ có th
s ng và phân chia. Thông thư ng t bào tăng trư ng t t khi g n vào b m t
r n. T bào s ng ng phân chia khi ñã hình thành l p đơn liên t c trên b m t
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………

10


11

c a d ng c ni.
- Thay đ i ki u gen và ki u hình: các t bào đ ng v t có th thay đ i
ki u gen và ki u hình, thơng qua q trình dung h p hai t bào có nhân khác
nhau t o thành t bào lai (hybridoma) ho c quá trình bi n n p (ví d : ch ng t
bào bình thư ng có th đư c c m ng thành t bào có các tính ch t c a t bào
ung thư, thơng qua q trình bi n n p đư c th c hi n b i m t virus c m ng
ung thư ho c b ng hóa ch t).
- Có th đư c b o qu n lâu dài b ng phương pháp l nh sâu: các dòng t
bào đ ng v t có th đư c b o qu n l nh sâu trong nitơ l ng (-196ºC) su t
nhi u năm. Khi ñư c gi i đơng và ho t hóa, t bào ph c h i kh năng tăng
trư ng và phân chia như ban ñ u.
- Ngoài các ñ c ñi m trên, t bào đ ng v t cịn có các đ c đi m khác
như kém thích nghi v i mơi trư ng, nh y c m v i ion kim lo i và ña s t bào
ñ ng v t c n huy t thanh, hormon…ñ tăng trư ng và phân chia.
1.2.2. Ni c y t bào đ ng v t
1.2.2.1. Nh ng khác bi t chính c a t bào trong ñi u ki n in vitro so v i invivo

Có nhi u khác bi t v t p tính gi a t bào nuôi c y và t bào cùng lo i
trong cơ th , do chúng chuy n t s k t h p theo d ng không gian ba chi u
sang m t ph ng hai chi u. Khơng cịn đ c tính tương tác t bào chun bi t
c a mơ, vì khi dịng t bào hình thành, nó có th hi n di n ch m t, hay hai
d ng t bào nên nhi u tương tác đa chi u b m t đi.
Mơi trư ng nuôi c y cũng thư ng thi u vài thành ph n liên quan đ n s
đi u hịa in vivo, như các ch t d n truy n th n kinh và h n i ti t. Thi u s
ki m sốt này, chuy n hóa c a t bào trong ñi u ki n in vitro n ñ nh và d
ki m soát hơn trong in vivo, nhưng có th khơng th c s đ i di n cho mơ, nơi
mà các t bào này đư c tách ra. T th c t này, ngư i ta ñã ñưa các hormon
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………

11


12

khác nhau vào môi trư ng nuôi c y và ñây là m t phương hư ng s ñư c ti p
t c nghiên c u.
Có nhi u hình th c ni c y khác nhau tùy đ c tính c a t bào, hay tùy
thu c vào phương pháp: nuôi c y sơ c p (primary culture), nuôi c y th c p
(secondary culture), nuôi c y huy n phù (suspension culture) và ni c y l p
đơn (monolayer culture).
1.2.2.2 Nuôi c y sơ c p
Nuôi c y sơ c p là phương pháp s d ng các t bào sau khi đư c tách
t các m nh mơ và trư c l n c y chuy n ñ u tiên. Quy trình đư c ti n hành
b t ñ u t vi c thu nh n các m nh sinh ph m, các m nh mô s ng. Sau đó, các
m nh mơ đư c x lý sơ b ñ lo i b vi khu n, n m cũng như các thành ph n
không mong mu n khác. Ti p theo, chúng ñư c tách ñ t o huy n phù t bào
đơn trư c khi ni c y.

Nói chung, ni c y sơ c p thư ng ñư c s d ng ñ khai thác các t
bào ban đ u trong nh ng m nh mơ, nh m t o ra các dịng t bào m i.

Hình 1.8. Nuôi c y sơ c p
“Ngu n: [80]”
1.2.2.3 Nuôi c y th c p
Nuôi c y th c p ñư c ti n hành sau khi t bào đư c t o dịng t ni
sơ c p. Nhi u dịng t bào đã đư c thi t l p và thương m i hóa. Ph n l n các
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………

12