nghiên cứu các đặc điểm, cấu trúc của Bacillus cereus

Nhóm:1 GVHD:Cô Trần Thị Mai Anh
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP.HỒ CHÍ MINH
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM
Bộ môn Vệ sinh an toàn thực phẩm
Tiểu luận:
BACILLUS CEREUS
Nhóm thực hiện: 1
Lớp học phần:2105016
GVHD: Cô Trần Thị Mai Anh
 Thành phố Hồ Chí Minh – 10 / 2011 
1
1
Nhóm:1 GVHD:Cô Trần Thị Mai Anh

- Mục lục.
- Nhận xét của giáo viên hướng dẫn và danh sách nhóm.
PHẦN 1: LỜI MỞ ĐẦU
.PHẦN 2: NỘI DUNG
I.Giới thiệu chung về BACILLUS CEREUS.
1.Đặc điểm cấu tạo.
2.Đặc điểm nuôi cấy.
3.Tính chất sinh hóa.
4.Nguồn lây nhiễm.
5.Tính chất gây bệnh.
5.1.Độc tố.
5.2.Triệu chứng ngộ độc.
6.Cách phòng ngừa.
II.Tác hại khi nhiễm BACILLUS CEREUS.
1.Cơ chế sản sinh độc tố và các loại độc tố.
2.Cơ chế gây bệnh.
2.1.Triệu chứng nôn mửa.

2.2.Triệu chứng tiêu chảy.
III.Các phương pháp phát hiện BACILLUS CEREUS trong thực phẩm.
1.Đặc điểm và nguyên tắc.
2.Môi trường và hóa chất.
3.Quy trình phân tích.
2
2
Nhóm:1 GVHD:Cô Trần Thị Mai Anh
Định lượng BACILLUS CEREUS bằng phương pháp đếm lạc khuẩn.
3.1.Phát hiện bằng môi trường chọn lọc.
3.2.Các phản ứng khẳng định.
3.3.Các thử nghiệm phân biệt các loài trong BACILLUS CEREUS nhóm 1.
3.4.Cách tính kết quả.
4.Giới thiệu chung các phương pháp phân tích nhanh.
4.1 .Phương pháp miễn dịch.
4.2. Kĩ thuật latex agglutination (LA) .
4.3. Kĩ thuật lai phân tử( DNA- hybridization).
4.4. Kỹ thuật Microarray, Macroarray.
4.5 .Phương pháp phát hiện vi sinh vật bằng kỹ thuật Real Time PCR.
PHẦN 3:KẾT LUẬN
PHỤ LỤC.
NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN.
…Chân thành nhận lời góp ý của giáo viên hướng dẫn :
………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
………………………………

ĐIỂM CHO TỪNG SINH VIÊN
STT MSSV HỌ TÊN NHIỆM VỤ ĐIỂM GHI CHÚ
1. 10264641 Trần Đông Phương Phần 1
2. 10259831 Đặng Trần Thị Trúc
Tiên
Phần 2/I/1,2,3,4
3. 10067621 Nguyễn Nhân Tín Phần 2/I/5,6
4. 10217411 Nguyễn Thị Kim
Ngân
Phần 2/II
5. 10283711 Phạm Thị Nguyệt Nhi Phần 2/II
3
3
Nhóm:1 GVHD:Cô Trần Thị Mai Anh
6. 10078591 Nguyễn Tuấn Huy Phần 2/III/1,2
7. 10205111 Lê Xuân Thanh Loan Phần 2/III/3+
Powerpoint+presentatio
n
8. 10274011 Trần Minh Thuận Phần 2/III/4
9. 10249121 Trần Thị Ý Yên Phần 3+Phụ lục
10. Powerpoint+presentatio
n
CAC BAN TIM HIEU VE NHUNG VAN DE SAU DE TRA LOI CAU HOI CUA LOP
1.VK KHONG TAO GIAP MO
2.VK DE MOC
3.MOI TRUONG NA, TSA, BA, MYP, MOSSEL, NB, TSB.
4.PHAN UNG VP (+)
5.PHOSPHOLIPID LA GI
6.AP XE
7.TRYPSIN, PEPSIN

8.PHUONG PHAP MIEN DICH,
KI THUAT LATEX AGGLUTINATION
KI THUAT LAI PHAN TU
KI THUAT MICROARRAY
KI THUAT REAL TIME PCR
BCET - RPLA
REAL TIME - PCR
9.PHUONG PHAP DEM KHUAN LAC
PHUONG PHAP MNP
10.PEPTONE DEM
11.KHANG NGUYEN
KHANG THE
CHAY DIEN DI
PHẦN 1:MỞ ĐẦU
Ngay cả khi có Pháp lệnh về Thực phẩm, hàng năm nước ta vẫn ghi nhận được hàng
vạn ca mắc bệnh truyền qua đường thực phẩm. Đó là một vấn đề cấp thiết của xã hội
cần được quan tâm nhiều hơn nữa.Nguyên nhân chính của việc ngộ độc thực phẩm là
do ý thứccủa con người còn quá kém và thực phẩm được sử dụng không an toàn.Vi
khuẩn là nguồn gây bệnh chính qua con đường thực phẩm (các vi sinh vật gây bệnh)
mà cơ quan thuốc và thực phẩm Mỹ khuyến cáo dân chúng về tác hại, cách phát hiện,
cơ chế lây nhiễm và cách đề phòng. Một trong số những loại vi khuẩn gây ngộ độc
thực phẩm đó là Bacillus cereus. Là một vi khuẩn gram dương, hìnhque, kị khí, sinh
bào tử. Bacillus cereus có thể làm người bị ngộ độc ói mửa tiêu chảy và trường hợp
nặng hơn có thể gây tử vong.Bất cứ ai cũng có nguy cơ lây nhiễm Bacillus cereus.
4
4
Nhóm:1 GVHD:Cô Trần Thị Mai Anh
Thực phẩm nhiễm Bacillus cereus là rất phổ biến. Người ăn phải thực phẩm này
thường mắc hai bệnh điển hình là tiêu chảy và nôn mửa.Dạng ngộ độc gây tiêu chảy
bị gây ra bởi loại vi khuẩn Bacillus cereus có cấu trúc phân tử protein lớn. Loại vi

khuẩn này rất dễ dính lên các nhóm thực phẩm như thịt, sữa, rau và cá. Triệu chứng
chính củaloại ngộ độc này là đại tiện ra nước và cơ bụng bị chuột rút khoảng sau 6-
15 tiếng kể từ lúc ăn phải. Triệu chứng này kéo dài khoảng 24tiếng. Nôn mửa cũng có
thể đi kèm nhưng thường hiếm gặp đối với loại ngộ độc gây tiêu chảy bởi Bacillus
cereus trọng lượng phân tử lớn.
Các bác sỹ đã ghi nhận được các biểu hiện lâm sàng đáng chú ý khác với những
người bị ngộ độc bởi loại vi khuẩn Bacillus cereus một khi không được chữa trị kịp
thời và triệt để. Đó là biểu hiện viêm vú, chứng viêm nhiễm nặng, hoại tử, viêm màng
não, nhiễmtrùng, viêm mô tế bào, viêm toàn mắt, áp xe phổi, viêm màng trong tim.
Đối với trẻ sơ sinh, thậm chí có nguy cơ gây tử vong.
Cách phòng cơ bản để khỏi nhiễm loại vi khuẩn Bacillus cereus là cần thận trọng khâu
chế biến thực phẩm và nấu nướng.
Về khả năng kiểm tra vi sinh vật Bacillus cereus ở Việt Nam, theo Cục An toàn thực
phẩm (Bộ Y tế), cả nước chỉ có 38 trung tâm y tế dự phòng tỉnh, chiếm 60% tỉnh
thành, có năng lực kiểm nghiệm. Viện ở 4 vùng miền đều đủ năng lực xét nghiệm loại
vi khuẩn này.
Từ 2001-2006, cả nước ghi nhận được hơn 5.600.000 ca tiêu chảy do nhiễm trùng
qua thực phẩm, trong đó có 84 ca tử vong. Riêng 9 tháng đầu năm ngoái ghi nhận
được hơn 750.000 ca tiêu chảy trong đó có 12 ca tử vong. Thựctế, theo các chuyên
gia, phải gấp ít nhất 10 lần con số được công bố.
Vì vậy, việc nghiên cứu các đặc điểm, cấu trúc của Bacillus cereus mang ý nghĩa đặc
biệt quan trọng trong việc phòng chống và chữa trị những trường hợp bị ngộ độc do
nhiễm Bacillus cereus.
Với phạm vi là một đề tài tiểu luận, nhóm chúng em chỉ đề cập đến Bacillus cereus
trong Bacillus nhóm 1.
PHẦN 2:NỘI DUNG
I .Giới thiệu chung về BACILLUS CEREUS.
5
5
Nhóm:1 GVHD:Cô Trần Thị Mai Anh

Bacillius cereus là vi khuẩn Gram dương khi chưa trưởng thành nhưng có thể thành
Gram âm khi chúng già, hình que, sinh bào tử, kị khí, có khắp nơi trong tự nhiên. Một
số chuẩn vi khuẩn Bacillus cereus gây ngộ độc thực phẩm, trong khi một số chuẩn lại
có lợi cho hệ vi sinh vật đường ruột của động vật, theo phân loại quốc tế thuộc giới
Bacteria, ngành (phylum) firmicutes, lớp (Class) Bacilli, bộ (Order) Bacillales, họ
(Family) Bacillaceaem,chi (Genius) Bacillus, loài (Species) Cereus.
Trong chi Bacillus này ngoài loài Cereus còn có một số loài như:
• Bacillus subtilis • Bacillus coagulans
• • Bacillus thuringiensis
•
• Bacillus natto
•
6
6
•
•
•
• Paenibacillus larvae
•
• Bacillus cereus là loài vi khuẩn hiếu khí, bào tử dạng hình ovan, có khả năng
sinh nha bào, được phát hiện đầu tiên trong một ca nhiễm độc thực phẩm vào
năm 1955. Từ những năm1972 đến 1986 có tới 52 trường hợp trúng độc thực
phẩm do Bacillus cereus được phát hiện và báo cáo chiếm khoảng 2% số ca
bệnh thực phẩm, trên thực tế con số này lớn hơn rất nhiều.
• 1. Đặc điểm cấu tạo BACILLUS CEREUS.
• Trực khuẩn, gram dương, tạo nội bào tử. Kích thước 0,5–1,5 x 2-4 µ. Vi khuẩn
không tạo giáp mô, không có khả năng di động.
• Hình 1: Bacillus cereus trên kính hiển vi
• Hình 2: Khuẩn lạc Bacillus cereus trên môi trường BA
• 2. Đặc điểm nuôi cấy.

• Là loại vi khuẩn dễ mộc
• Hiếu khí và kị khí tùy nghi.
• Nhiệt độ 5-50oC, tối ưu 35-40oC.
• pH 4,5-9,3, thích hợp 7-7,2
• Trên môi trường NA hay TSA sau 24 giờ tạo khóm lớn, nhăn nheo, xù xì.
• Trên môi trường BA tạo dung huyết rộng.
• Trên môi trường MYP (Mannitol Egg Yolk Polymixin): khóm hồng chung
quanh có vòng sáng.
• Trên môi trường Mossel (thạch cereus selective agar): khóm to hồng chung
quanh
• có vòng sáng.
• Trên môi trường canh NB, TSB: đục tạo váng, sau cặn lợn cợn
•
•
• Khuẩn lạc B.cereus trên
Khuẩn lạc B.cereus trên môi trường MYP
• môi trường Mossel
•
• 3. Tính chất sinh hóa.
• Trên môi trường đường: lên men
glucose trong điều kiện hiếu khí và kị
khí, không lên
• men mannitol.
• Khử nitrat thành nitrit.
• Phản ứng VP (+) .
• Phân giải Tyroxin .
• Catalase (+), Citrate (+) .
• Mọc trên NB + 0,001% lyzozym .
•
• 4.Nguồn lây nhiễm.

•
• Bào tử của B. cereus có thể được tìm thấy rộng rãi trong tự nhiên, bao gồm
các mẫu bụi, bẩn, cây ngũ cốc, nước, vv, vì vậy nó là một chất gây ô nhiễm
phổ biến các mặt
• hàng nguyên liệu nông nghiệp.Mức độ ô nhiễm bình thường là <100/g.3
Các loại thực phẩm giàu tinh bột, chẳng hạn như gạo hoặc khoai tây, thường
đi kèm với nôn B. cereus (nôn) bùng phát độc tố. Do quá trình chuẩn bị, một
trong những chiếc xe thực phẩm phổ biến nhất để truyền bệnh nôn B. cereus
là cơm chiên, và đã có nhiều đợt bùng phát báo cáo. Các bào tử của B. cereus
được kích hoạt trong việc chuẩn bị ban đầu của lúa gạo, mà nếu bảo quản ở
nhiệt độ lạm dụng (khoảng 59 đến 104 ° F hoặc 15 đến 40 ° C) cho một thời
gian dài, sẽ phát triển nhanh và sản xuất một
loạiđộc tố là nhiệt ổn định và sẽ không được
bất hoạt trong quá trình nấu ăn tiếp theo.
Các chủng gây tiêu chảy đã được tìm thấy trong
một lựa chọn thực phẩm hơn. Các
• nguồn thông thường bao gồm các mặt hàng
thịt và rau, súp và các sản phẩm sữa. Không
giống như các chất độc nôn, chất độc tiêu chảy
bị phá hủy trong nấu ăn. Nếu các bào tử kinh
nghiệm điều kiện cho phép tăng trưởng, họ có thể phát triển đến mức độ
chất độc được sản xuất.
• 5.Tính chất gây bệnh.
• Vi khuẩn Bacillus cereus phân bố nhiều trong tự nhiên, nhiễm vào các loại thức
ăn qua đêm hay trữ lạnh lâu, thường gây ngộ độc thực phẩm.
• 5.1. Độc tố.
• Độc tố: vi khuẩn sản sinh 2 loại độc tố
• Độc tố gây tiêu chảy (Type 1): Diarrhoed toxin. Vi khuẩn sản sinh độc tố trên
thịt, rau quả, gia vị. Bản chất là một loại protein gây hủy hoại biểu bì và niêm
mạc ruột, gây tiêu chảy có thể nguy hiểm đến tính mạng.

• Độc tố gây nôn mửa (Type 2): Emetic toxin. Vi khuẩn nhiễm trong gạo, cơm
nguội, đậu các loại. Bản chất độc tố là phospholipid có tính ổn định cao không
bị phân hủy ở nhiệt độ cao và dịch dạ dày.
• Ngoài ra vi khuẩn còn có enzyme hemolyzin là một protein gây độc mạnh có
thể gây chết người. Độc tố này có thể trung hòa bởi cholesterol trong huyết
thanh nhưng nó đã góp phần cho sự phát triển của vi khuẩn.
• Bacillus cereus có thể gây ra sự nhiễm trùng và nhiễm độc khác nhau như:
nhiễm trùng máu, viêm màng não và nhiễm trùng mắt.
• 5.2. Triệu chứng trúng độc.
• Thức ăn chứa mật độ vi khuẩn 10
5
vi khuẩn/g thực phẩm đủ gây ngộ độc.
• Biểu hiện: đau bụng, buồn nôn và nôn sau 1-5 giờ ăn phải thực phẩm nhiễm vi
khuẩn. Bệnh có thể kéo dài 24 giờ. Nếu ngộ độc do độc tố vi khuẩn, dấu hiệu
ngộ độc rõ hơn: nôn, mệt mỏi, nhức đầu, mạch nhanh…nếu không điều trị kịp
thời bệnh sẽ tiến triển nặng. Có 2 triệu chứng lâm sàng ngộ độc do Bacillus
cereus gây ra:
• Trường hợp nhiễm type 1 có triệu chứng đau bụng tiêu chảy nhưng
không sốt. Bắt đầu sau 4-16 giờ sau khi ăn thực phẩm nhiễm khuẩn và kéo dài
12-24 giờ. Tiêu chảy có thể là một khối lượng nhỏ hoặc dồi dào và chảy
nước. Loại này được gọi là "ủ bệnh dài" hay hình thức của bệnh tiêu chảy, và
nó tương tự như ngộ độc thực phẩm gây ra bởi Clostridium perfringens
• Trường hợp nhiễm type 2: Loại này được đặc trưng bởi buồn nôn và
nôn mửa và đau bụng và có một khoảng thời gian ủ bệnh là từ 1 đến 6 giờ, thời gian
kéo dài bệnh là 8 đến 10 giờ và trung bình là 9 giờ. Nó giống như Staphylococcus
aureus (tụ cầu khuẩn) gây ngộ độc thực phẩm trong các biểu hiện triệu chứng của nó
và thời gian ủ bệnh. Đây là "hình thức ủ bệnh ngắn" hoặc hình thức nôn của bệnh.
•
•
• Bảng so sánh độc tố type 1 và type 2

• Đặc tính • Type 1 • Type 2
• Bền với nhiệt • 45
0
/30 phút • 120
0
/90 phút
• pH • Ổn định ở pH 4-11 • Ổn định pH 2-11
• Tính nhạy • Nhạy với enzyme • Kháng pepsin và
protease và trypsin trypsin
•
• 6. Cách phòng ngừa.
• Thực phẩm có nguồn gốc gây bệnh là sản phẩm ngũ cốc, nước sôt, hoa quả,
xôi, cơm dĩa. Ở Mỹ cơm chiên được xem là một trong những nguyên nhân
hàng đầu của nhiễm vi khuẩn Bacillus cereus. Chính vì thế mà có người còn
gọi là hội chứng cơm chiên. Những loại thực phẩm dễ nhiễm này bào tử
Bacillus cereus thường có mặt và có thể sống sót nếu đun nấu không kỹ. Trực
khuẩn còn sống sót phát triển sẽ sinh độc tố. Sau khi nấu đối với thực phẩm
ướt, nếu ướp lạnh không đủ độ cũng làm vi khuẩn tăng nhanh. Cần thực hiện
các biện pháp kiểm soát đề phòng bệnh như đảm bảo vệ sinh khi chế biến, nấu
ăn thích hợp và lưu trữ thực phẩm, đặc biệt là gạo đã nấu chín để sử dụng sau
này, bảo quản lạnh ở nhiệt độ thích hợp với thực phẩm chưa ăn ngay và không
nên chế biến thực phẩm quá lâu trước khi ăn.
• II.Tác hại khi nhiễm BACILLUS CEREUS.
• 1.Cơ chế sản sinh độc tố và các loại độc tố.
• Vì ngộ độc thực phẩm do Bacillus cereus không phải là loại bệnh được nói đến
nhiều, sự thật là phạm vi ảnh hưởng của loại bệnh này ít được biết đến, được
báo cáo là nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm và chiếm khoảng 33% trong
tổng số các nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm (đa số các nguyên nhân là do
vi rút) ở Norway (1988-1993), 47% ở Iceland (1985-1992). Tỷ lệ thấp hơn
nhiều được báo cáo ở các quốc gia khác bao gồm U.S (1.3%) và Canada

(2.2%). Ở Anh và xứ Wales, có đến 468 trường hợp từ 1990 đến 1995. Bacillus
cereus là một thực vật hoại sinh trong đất rất phổ biến. Nó được phân lập từ
nhiều nguồn thực phẩm đa dạng, đặc biệt là thực phẩm có nguồn gốc từ thực
vật, từ thịt, các và các sản phẩm từ thịt cá cũng vậy. Phát hiện đầu tiên các về
các mầm bệnh gây ngộ độc thực phẩm là từ năm 1949 khi Hauge đã phân lập
mẫu từ xốt vani sau khi có một ca ngộ độc thực phẩm gây tiêu chảy tại bệnh
viện ở Oslo, Norway. Xốt vani được nấu trước khi tiêu thụ và bảo quản ở nhiệt
độ phòng cho đến khi sử dụng. Để khẳng định Bacillus cerus là nguyên nhân
gây ngộ độc, Hauge đã phát triển mẫu phân lập đến nồng độ khoảng 4x106ml-1
và uống 200ml cocktail. Sau 13h, ông cảm thấy đau bụng và đi tiêu ra nhiều
nước, triệu chứng này dai dẳng khoảng 8h. Hơn 20 năm sau, một triệu chứng
gây ngộ độc thực phẩm khác do chủng Bacillus cereus gây ra lại xuất hiện ở
các công nhân người Anh. Triệu chứng này nặng hơn triệu chứng nôn mửa và
kéo dài một thời gian ngắn (chưa đến 5h), điều này cho thấy rằng đây là một sự
nhiễm độc. Ngày nay, bệnh này liên quan đến triệu chứng gây nôn mửa do
Bacillus cereus.
• Bacillus cereus có thể gây ra sự nhiễm trùng và nhiễm độc khác nhau, thêm
vào đó, những ngộ độc khác do Bacillus cereus gây ra là sự nhiễm trùng máu,
viêm màng não, và nhiễm trùng mắt. Hai loại ngộ độc thực phẩm là nguyên
nhân bởi rất nhiều nhấn tố gây độc hại khác nhau.
• 2. Cơ chế gây bệnh.
• 2.1 Triệu chứng nôn mửa.
• Đặc điểm của bệnh nôn mửa và tính chất của độc tố gây nôn mửa được thể hiện
ở bảng 1-1. Sự giải thích về cấu trúc của độc tố emetic đã đưa đến những hiểu
biết sâu sắc hơn về triệu chứng này. Độc tố emetic có tên là cereulide và là một
chuỗi polypeptide ba lần lặp lại của bốn amino và/hoặc oxy-acid (bảng 1-1)
•
• Cereulide (polypeptide) là tên của một độc tố quan trọng gây ra triệu chứng
nôn mửa do Bacillus cereus sản sinh ra. Bài báo này giải quyết được nghiên
cứu về quá trình sinh tổng hợp độc tố này dựa trên sự bất thường của độc tố

depsipeptide từ Cacbon số 13 (13C) liệt kê ra trên 3 loại tiền L- amino acid
(Valin, Alanin, Leuzin) trên môi trường tổng hợp trung gian. Sự phân tích này
được thực hiện dựa vào mức cấu tạo phân tử của amino hay oxy acid qua NMR
và ESI – MS của phương pháp kính quang phổ trên cereulide và sản phẩm thủy
phân là các dipeptide của nó. Sự hợp nhất của nguyên tử cacbon số 13 (13C) là
chiếm đến 95% trong O-Val, O-Leu và L-Val, trong khi đó chỉ có 40%13C là
kết hợp trong D-Ala của Cereulide.
• Bacillus cereus được biết là nguyên nhân gây ra hai loại ngộ độc thực phẩm, đó
là triệu chứng nôn mửa và triệu chứng tiêu chảy. Phần lớn những ngộ độc do
Bacillus cereus gây ra chỉ mới phát hiện sau này. Cereulide được biết đến với
cấu trúc bậc 1, với 1 dodecadepsipeptide tuần hoàn, với 12 góc lập thể trung
tâm. Hóa học lập thể được chỉ ra từ sản phẩm thủy phân là các dipeptide kiềm
tính, D-O-Leu, D-Ala, L-O-Val và L-Val. Đó là 1 ion Kali mạnh, nó liên kết
yếu với các ion Li+, ion Na+, ion Cs+, nhưng với ion Rb+ nó lại liên kết mạnh
nhất, hơn bất kỳ ion kim loại kiềm nào. Cereulide tạo cấu trúc bậc 2 từ NMR
Emetic Syndrome
Bảng 1-1 Đặc điểm của bệnh nôn mửa và tính chất của triệu chứng gây nôn mửa do B.
Cereus

Tên của độc tố Cereulide

Liều nhiễm độc Số lương B.C 105-108tb/g thực phẩm

Khối lượng độc tố 12-32 μg/kg

Cấu trúc của độ Chuỗi polypeptide [D-O-Leu-D-Ala-L-O-Val-L-Val]

Khối lượng phân tử 1.2 kDa

Thời kỳ ủ bệnh ½ - 5h


Khoảng thời gian mang bệnh 6-24h

Sinh kháng thể Không (none)

Hoạt động sinh học trên người Gây nôn

Cơ quan nhận cảm 5-HT3

Cytotoxic No

Hoạt động trên tế bào HEp-2 Hoạt động không bào

Khả năng chịu nhiệt 90 phút ở 121
0
C

Ảnh hưởng của sự phân giải protein Không

Việc sản sinh ra độc tố như thế nào (not known, but probably enzymatically)
và sự tính toán cơ học các phân tử được biểu thị ở hình 1. Độc tố này là nguyên
nhân dẫn đến sự hình thành các ty lạp thể có chứa ATP và các enzyme lien
quan đến hoạt động chuyển hóa tế bào trong các mô khác nhau. Chúng ta bắt
đầu quan tâm đến con đường sinh tổng hợp của độc tố này cho các chương
trình phòng chống ngộ độc thực phẩm trong tương lai. Nghiên cứu quá trình
sinh tổng hợp tương tự như dodecadepsipeptide, valinomycin. Agata – một
trong nhiều tác giả đã nghiên cứu quá trình phát triển và sinh độc tố của
Bacillus cereus trong quá trình tổng hợp trung gian một cách đầy đủ từ CADM
(hỗn hợp các amino acid) và đường sucrose (đường mía). Người ta nhận thấy
rằng, Bacillus cereus cho phép (chấp nhận) việc sản sinh ra cereulide cấu trúc

bậc 1 và 3 amino acid Val, Leu và Thr là cần thiết. Những nghiên cứu khác về
quá trình sinh tổng hợp cereulide có lẻ là cần thiết để thúc đẩy việc nghiên cứu
tìm ra phương pháp ngăn chặn những ngộ độc từ thực phẩm. Xét đoán từ cấu
trúc của 1, tiền thân của D-Ala, L-O-Val và D-O-Leu sẽ lien quan đến các
amino acid như L-Ala, L-Val, và L-Leu.
•
• Trong thí nghiệm này chú trọng đến sinh tổng hợp trung gian của 3 amino acid
là L-Val, L-Leu, và L-Ala (0.1g/L có đến 99% nguyên tử cacbon ở dạng13C
trong cacboxylic, tất cả 15 amino acid còn lại (0.1g/L), K2HPO4 (5g/L) và
MgSO4.7H2O (0.05g/L), được tiến hành ở nhiệt độ 300C và thời gian là 24h,
giữ ở tốc độ lắc là 200 rpm thu được 2mg cereulide có cùng độc tính ở điều
kiện này đã được đánh dấu để phục vụ cho phân tích các nghiên cứu tiếp
theo.1H NMR của mẫu này là đồng nhất với quang phổ đáng tin cậy ngoại trừ
chất đồng vị của cacbon13C. ESI mass (interpreting Electrospray Mass
Spectra) của nó xuất hiện ở 7 đỉnh trung tâm với m/z là 1201.48 khá hơn mức
bình thường M + K với m/z là 1191.55 (thể hiện ở hình 2), vì vậy cứ trung bình
10 đơn vị mass thì cao hơn bởi vì sự kết hợp cao của13Cs. Chính vì sự liên hợp
cao của13Cs vào phân tử cereulide đã thúc đẩy chúng ta trong việc đo lường
mức quang phổ NMR13C của ion K+ trong phức hợp CDCl3 để đạt được mức
quang phổ như ở hình 3, với số liệu đáng kể 171.4 (L-O-Val), 172.2 (D-O-
Leu), 175.7 (L-Val) và 176.2 (D-Ala) đã được chuyển sang mối tương quan
giữa C-H của nó. Tương ứng với cường độ của 3 cacbon (C6, C9, C12) của L-
O-Val, D-O-Leu và L-Val là nhiều hơn hai lần C6 D-Ala.
•
•
• Tương tự với việc làm riêng các thí nghiệm đã đạt được với bức xạ β proton
của 4 hợp phần amino hay oxy – acid. Loại bỏ các kết quả đạt được với α
proton của O-Val ở 4.61 ppm với bức xạ β-H của nó ở 2.30 ppm để thay đổi từ
bộ ba sang bộ kép (J=3.8 Hz cặp với13C của O- Val). Bức xạ β-H của L-Val ở
2.24 ppm đã làm thay đổi α proton của Val ở 3.82 ppm từ bộ năm thành bộ ba

(J=5 Hz). Cả hai kết quả trên đều chỉ ra được sự kết hợp cao cacbonyl cacbon
của13C tiền thân của các amino acid đối với L-O-Val và cả L-Val. Chưa có kết
quả chính xác nào về sự kết hợp của13C, tuy nhiên trường hợp này lại đúng đối
với Ala và O- Leu. Sự chiếu xạ gốc metyl của Ala ở 1.47 ppm gây ra α-H của
nó (4.27 ppm) giống như sự pha trộn của bộ ba và bộ kép biểu kiến với J=4 và
5 Hz, theo thứ tự định sẵn (tách biệt ra) có nghĩa là tỷ lệ sát nhập lại để tạo
thành cacbonyl cacbon là không quá cao (không đạt đến 100%). Sự chiếu xạ
của β-Hs của O-Leu trong khoảng 1.84 ppm là không đạt kết quả bởi vì dải
sóng tự nhiên của nó quá rộng. Tuy nhiên, quang phổ NMR của13C và những
thí nghiệm riêng lẻ là những minh chứng gần như 100% của sự kết hợp13C tiền
amino acid với 3 hợp phần (O-Leu, Val và O-Val) của cereulide.
•
• Figure 5.Decoupling experiments of a protons of the four components by irradiating b
protons.
• Một phần trăm sự kết hợp của13C là được xác định bởi phép đo phổ từ các sản
phẩm thủy phân cereulide, vì vậy hai dipeptide thu được từ sự thủy phân bằng
kiềm cereulide (1) với 0.1N KOH (hoặc 1N NH4OH) ở rt trong 30 phút. Các
sản phẩm thủy phân dipeptide là D-O-Leu-D- Ala và L-O-Val-L-Val, được
phân tích bằng phương tiện ESI (electrospray ionization)- thước MS/MS ở trên
Q-TOF của phép đo phổ (Mcro Mass Co.,Ltd, Manchester, UK). Để làm được
điều này các chất đồng vị thừa và13C kết hợp lại với nhau thành mẫu, pha
loãng mẫu đó đến độ hòa tan 10-100 pmol/μL trong 99,8% methanol: 0.2%
acid formic trước khi bị electrospray ở 5μL/phút.
• Ngày nay, L-Leu và L-Ala đã được chứng minh để xác định rõ là có được từ
quá trình sinh tổng hợp cereulide, vì hai acid amin này là cần thiêt cho B.
cereus. Một trong những khả năng có thể được nghiên cứu là cả ba L-amino
acid sẽ ít nhất một lần được biến đổi thành các α- keto acid và sau đó biến đổi
thành D-O-Leu và L-O-Val hoặc là sự chuyển hóa amin để tạo thành D-Ala.
Trong trường hợp này chỉ có acid pyruvic sẽ bị pha loãng bởi vì số gốc cao vì
L- Ala là không cần thiết cho B. cereus. Nghiên cứu này có thể giải thích đến

95% sự kết hợp để tạo thành D-O-Leu, L-O-Val, và L-Val khoảng (40%) sự kết
hợp để tạo thành D-Ala.
• 2.1 . Triệu chứng tiêu chảy.
• Triệu chứng tiêu chảy do ít nhất hai loại độc tố đường ruột sản sinh ra trong
suốt quá
• trình sinh trưởng của Bacillus cereus trong ruột non. Sự hình thành độc tố
đường ruột đầy đủ trong thực phẩm để dẫn đến ngộ độc thực phẩm về lý thuyết
mà nói là có thể, nhưng đối với thực phẩm phục vụ cho con người thì đây là
điều không thể chấp nhận. Điều này xảy ra khi, số lượng Bacillus cereus tồn tại
trong thực phẩm thấp nhất là 106/g hoặc /ml và lượng lớn của độc tố đường
ruột phải được hình thành để chống chịu được với pH của dạ dày và enzyme
proteolytic của tá tràng. Những nhân tố này sẽ làm giảm một cách nhanh chóng
hoạt động của độc tố đường ruột thấp ơn 1% sơ với mức độ ban đầu. Thời gian
tương đối dài giữa việc ăn vào những sinh vật này với việc xuất hiện những
triệu chứng của bệnh. Đặc điểm của triệu chứng tiêu chảy được thể hiện trong
bảng 1-2. Mức độ biến đổi của liều lây nhiễm có lẽ do khả năng sản sinh ra các
độc tố đường ruột khác nhau và do tính nhạy cảm của mỗi cá nhân là khác
nhau.
•
• Ở Na-Uy, hai lần bộc phát đã xảy ra với rất nhiều người bị ảnh hưởng
sau khi ăn thịt hầm với khoai tây và rau. Liều lượng gây bệnh xấp xỉ 104 – 105. Lần
đầu tiên bùng phát (1992), 17 – 24 người bị ngộ độc, 3 trong số các bệnh nhân phải
nhập viện từ 1 – 3 tuần, triệu chứng bắt đầu nặng ở 3 bệnh nhân này khá muộn (>24h).
Lần thứ hai, bệnh bùng phát vào tháng 2 năm 1995 khi mà 152 trong số 252 người
Na-uy bị ảnh hưởng trong suốt thời gian tham gia giải vô địch về trượt tuyết. Các đối
thủ trẻ tuổi (16 – 19 tuổi) bị nhiễm triệu chứng này sau hơn 24 giờ ủ bệnh và họ bị đau
từ 1 đến vài ngày.
Diarrheal Syndrome
Bảng 1-2 Đặc điểm bệnh êu chảy gây ra bởi chủng vi khuẩn B. cereus
Đặc 'nh

Liều gây nhiễm 105/g hoặc /ml
Độc tố được sản sinh ra Trong ruột non
Loại độc tố Protein
Thời kỳ ủ bệnh 8 – 16h
Khoảng thời gian mang bệnh 12 – 24h
Triệu chứng Đau bụng dai dẳng, đi êu nhiều nước, thỉnh thoảng
buồn nôn
• Bào tử của Bacillus cereus từ mô tả đầu tiên ở trên (phần giới thiệu chung) là
được phân biệt để cho thấy rằng chúng có khả năng bám vào các tế bào Caco-2
(trên các tế bào biểu mô của người). Sau khi bám vào, các bào tử này nảy mầm
một cách nhanh chóng (trong vòng 1h), hình thành tế bào Bacillus cereus sinh
dưỡng trên đỉnh của các tế bào biểu mô, tiếp đó là sản sinh ra độc tố, nếu độc tố
này xuất hiện trong đường ruột, độc tố đường ruột sẽ tập trung khoanh vùng ở
vùng ngoại biên của ống ruột sẽ tăng cao hơn trong lumen và vì vậy gây nên
mối nguy lớn hơn và gây bệnh một cách trầm trọng. Một điều có thể xảy ra đối
với cơ chế này là thời gian ủ bệnh sẽ lâu hơn như đã quan sát.
• Số lượng và loại độc tố liên quan đến triệu chứng tiêu chảy do ngộ độc thực
phẩm từ Bacillus cereus là đề tài tranh cải từ nhiều năm qua và cho đến nay
vẫn còn đang tranh luận. Cả dạng đơn và dạng phức của độc tố đường ruột
được xác định là nguyê nhân gây ra bệnh tiêu chảy. Có hai sự khác biệt trong
ba hợp phần của độc tố đường ruột được sản sinh bởi các thực phẩm nhiễm
Bacillus cereus, một số nhóm cũng được mô tả độc tố đường ruột một hợp
phần với các phân tử trọng lượng khoảng từ 40 – 100 kDa
• Những nghiên cứu gần đây về độc tố đường ruột đã khẳng định rằng cả độc tố
chỉ có một hợp phần và độc tố nhiều hợp phần đều có liên quan.
• Những nghiên cứu về quá trình sinh tổng hợp giúp thiết lập nên các giải pháp
ngăn ngừa các độc tố sinh ra từ Bacillus cereus trong tương lai gần. Hoặc có
thể đưa ra các phương pháp giúp phát hiện ra độc tố cereulide trong tự nhiên
bất cứ lúc nào.
• III.Các phương pháp phát hiện BACILLUS CEREUS trong thực phẩm.

• 1.Đặc điểm và nguyên tắc.
• Nhóm các phương pháp này dựa trên đặc điểm phát triển của vi sinh vật trên
các môi
• trường đặc trưng và đặc điểm sinh lí, sinh hoá của các chủng, các loài vi sinh
vật khác nhau.
• Ưu điểm của phương pháp này là thao tác đơn giản, dễ làm, không phải đầu tư
dụng cụ, thiết bị đắt tiền. Tuy nhiên với nhóm phương pháp này còn một số hạn
chế như độ nhạy không cao, tốn nhiều nhân công và thời gian phân tích thường
kéo dài do đó hạn chế trong công tác phòng ngừa.
• Bacillus cereus phân biệt với các loài khác trong Bacillus nhóm 1 như
B.anthracis gây bệnh than cho người, B.thuringiensis tạo độc tố kết tinh gây
bệnh cho côn trùng, B.mycoides, B.megaterium dựa vào các đặc tính sinh hóa
Các khuẩn lạc được khẳng định dựa trên các thử nghiệm sinh hóa với các đặc
điểm như lên men glucose, sinh acid trong điều kiện kị khí, khử nitrate thành
nitrite, thử nghiệm VP (+), thủy phân L-tyrosine, tăng trưởng được trong
0.001% lysozyme.
• 3.Qui trình phân tích.
• 25g mẫu + 225ml môi trường pepton đệm (BPW) -> đồng nhất bằng
Stomacher/ 1phút để có độ pha loãng 10.1 -> pha loãng thành dãy thập phân để
có các độ pha loãng thích hợp.
• Định lượng Bacillus Cereus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc.
• 3.1.Phát hiện bằng môi trường chọn lọc:
• Trải 0.1ml mỗi độ pha loãng lên các môi trường thạch rồi ủ 24h ở 30oC.
• MYP: do Bacillus cereus không lên men mannitol, tạo lecithinase và kháng
polymicin nên khuẩn lạc B.cereus có màu hồng eosin, được bao quanh bởi
vùng có tủa, chứng tỏ lecithinase được tạo thành.
• MOSSE: khuẩn lạc to, màu hồng, xung quanh có vòng sáng.
• Chọn từ 5 khuẩn lạc (+) cấy sang thạch nghiên chuẩn bị cho các phản ứng
khẳng định
• Bacillus cereus.

• 3.2.Các phản ứng khẳng định:
• Nhuộm Gram:
• Cấy ria các khuẩn lạc được chọn từ môi trường MYP/MOSSEL sang ống thạch
dinh dưỡng -> ủ ở 30oC/ 24h -> nhuộm Gram -> quan sát dưới kính hiển vi tế
bào nhuộm bằng vật kính 100X nhúng trong dầu.
• Các bước nhuộm Gram:
• Chọn phiến kính sạch -> vẽ lên kính 1 vòng tròn, đường kính 2cm -> ở vị trí
tương ứn với vòng tròn, mặt còn lại nhỏ vài giọt nước cất thành 1 giọt lớn ->
chuyển một ít sinh khối khuẩn lạc vào giọt nước trên kính bằng que cấy vòng
-> khuấy nhẹ bằng đầu que cấy -> dung dịch huyền phù đồng nhất -> bôi đều
trong khu vực của vòng tròn -> để yên cho vệt bôi khô -> đưa phiến kính ở vị
trí cạnh vệt bôi qua lại trên ngọn lửa đèn cồn/đèn Bunsen để cố định vệt bôi
(tránh để vệt bôi tiếp xúc trực tiếp với ngọn lửa)
• Tương tự cho hai chủng VSV đối chứng trong cùng một phiến kính khác:
E.coli làm chủng
• đối chứng cho Gram (-) và Staphylococcus aureus làm chủng đối chứng cho
Gram (+).
• Có hai phương pháp nhuộm Gram:
• Phương pháp Jensen: nhỏ vài giọt dd methy violet lên vệt bôi -> giữ yên
20giây -> dùng bình xịt nước lên vệt bôi -> rửa sạch phẩm nhuộm -> nhỏ vài
giọt KI/I2 lên vệt bôi/ để yên 1phút -> dùng bình xịt cồn 95% lên vệt bôi -> rửa
phẩm nhuộm đến khi mất màu -> để yên vài giây -> rửa bằng nước -> nhuộm
bằng dd safranin/30giây -> rửa sạch bằng nước, thấm nước dư bằng giấy lọc.
• Phương pháp Hucker: tương tự như phương pháp Jensen, nhuộm vệt bôi bằng
dd crystal violet/ 1 phút -> rửa bằng nước -> nhuộm bằng dd KI/I2 / 1 phút ->
khử màu bằng cách xịt cồn 95% -> rửa lại bằng nước -> nhuộm màu bằng dd
safranin/2phút.
• Kết thúc qui trình nhuộm, quan sát dứơi kính hiển vi cho ta thấy tế bào nhuộm
Gram (+) có màu xanh tía (S.aureus), tế bào nhuộm Gram (-) có màu đỏ hồng
(E.Coli). Bacillus cereus là trực khuẩn lớn, Gram (+), thường kết hợp với nhau

thành dạng chuỗi; bào tử hình bầu dục, không có dạng bào tử nang.
• Dùng que cấy vòng chuyển một lượng sinh khối chủng thử nghiệm trong ống
thạch dinh dưỡng vào 0.5ml BPW vô trùng. Tạo huyền phù hóa dịch cho các
phản ứng sinh hóa phía sau.
• Thử nghiệm lên men glucose: Cấy vi khuẩn vào 3ml canh Phenol Red
Glucose Broth -> ủ ở 35oC/ 24h, kị khí -> lắc mạnh ống nghiệm -> quan sát độ
đục ( sự phát triển); sự chuyển màu môi trường từ đỏ sang vàng ( chứng tỏ có
sự sinh acid glucose trong điều kiện kị khí).
•
• Hình 1:Thí nghiệm khả năng khử nitrate.
• Hình 2:Thí nghiệm lên men glucose.
• Thử nghiệm khả năng khử nitrate: cấy vi khuẩn vào 5ml canh trường Nitrate
Broth -> ủ 35oC/24h -> bổ sung vài giọt dd của thuốc thử nitrate -> có màu
cam xuất hiện trong 10phút (chứng tỏ nitrate bị khử thành nitrit)
• Ống A đã cấy vi khuẩn trên canh trường Nitrate Broth chưa bổ sung thuốc thử.
• Ống B và C có bổ sung thuốc thử alpha-naphthylamine và sulfanilic acid. Ống
B cho kết quả dương tính (nitrate bị khử thành nitrite ), Ống C cho kết quả âm
tính với nitrite.
• Thử nghiệm VP: Ở vi sinh vật, biến dưỡng năng lượng bằng phương thức lên
men từ glucose qua con đường đường phân sẽ tạo ra chất trung gian chủ yếu là
pyruvic acid. Để khôi phục dự trữ NAD+ trong tế bào phục vụ cho con đường
đường phân ở các loài vi sinh vật, sau đó pyruvic acid tiếp tục được chuyển hóa
khác nhau tạo ra các sản phẩm lên men cuối cùng khác nhau. Họ
Enterobacteriacceace có đặc tính chung là lên men sinh tổng hợp acid như acid
formic, acid acetic, acid succinic, ethanol, H2 và CO2. Họ này có thể được chia
thành hai nhóm là nhóm không sinh 2,3-butanediol (ví dụ : E.coli) và nhóm
sinh 2,3-butanediol (ví dụ: Enterobacter). Phân tử 2,3-butanediol có thể được
chuyển hóa qua lại thành acetoin: trong điều kiện có oxi và môi trường có tính
kiềm nhờ xúc tác của enzyme 2,3-butanediol dehydrogenase. Ngược lại acetoin
có thể bị khử thành 2,3-butanediol do hoạt tính của enzyme diacetyl reductase;

ngoài ra acetoin còn bị oxi hóa thành diacetyl, chất này tham gia vào phản ứng
tạo màu trong thử nghiệm VP.
• Như vậy, thử nghiệm VP có thể giúp phân biệt các loài trong
Enterobacteriaceace dựa trên sự oxi hóa acetoin (acetylmethylcarbinol, AMC)
từ 2,3-butanediol thành diacetyl. Sự oxi hóa acetoin thành diacetyl được tăng
cường nhờ xúc tác của α-naphthol. Diacetyl kết hợp với nhân guanidine có
trong peptone kết tụ thành phức diacetyl-guanidine có màu đỏ. Trong thuốc thử
Koblentz và O’Meara có chứa creatine có tác dụng bổ sung nguồn nhân
guanidine.
• Các bước tiến hành:
• Môi trường được sử dụng cho thử nghiệm VP là môi trường lỏng Clark-Lubs
(môi trường MR-VP), có pH 6.9. Dùng que cấy vòng cấy vào các ống môi
trường MR-VP một ít sinh khối (trường hợp dùng thuốc thử Koblenntz thì cấy
nhìu sinh khối) từ khuẩn lạc của chủng thuần đã ủ 18-24h trên môi trường KIA
hoặc TSI. Ủ yên các ống môi trường này ở 37oC / 24-48h hoặc đến 10 ngày.
Sau thời gian ủ, bổ sung thuốc thử trực tiếp vào ống môi trường. Có 3 loại
thuốc thử VP là:
• • Thuốc thử Barritt: gồm dung dịch A là 5% α-naphthol trong cồn tuyệt đối,
dung dịch B là 40% KOH hoặc NaOH.
• • Thuốc thử Koblentz: gồm dung dịch A là 5% α-naphthol trong cồn 95%,
dung dịch B là 0.3% creatine, 40% KOH hoặc NaOH.
• • Thuốc thử O’Meara: dung dịch 0.3% creatine, 40% KOH hoặc NaOH
• Khi sử dụng các loại thuốc thử 2 thành phần, trước tiên nhỏ 6 giọt dung dịch A,
sau đó nhỏ 2 giọt dung dịch B, bổ sung 1ml thuốc thử vào ống môi trường. Lắc
nhẹ ống 1 phút để oxi hóa acetoin. Đọc kết quả sau 20 phút hoặc chậm nhất 4h.
• Trước khi sử dụng nên kiểm tra thuốc thử bằng các chủng đối chứng như
E.Coli (VP -) bề mặt môi trường không đổi màu và Enterobacter cloacae (VP
+) có màu đỏ trên bề mặt môi trường.
•
• Thử nghiệm khả năng thủy phân tyrosine: cấy vi khuẩn vào thạch nghiêng

tyrosine -> ủ 35oC/48h -> xuất hiện khuẩn lạc ( chứng tỏ tyrosine bị phân hủy)
• Thử nghiệm với canh Lysozyme Broth: cấy vi khuẩn vào 2.5ml môi trường
Nutrient Broth chứa 0.001% lysozyme, thực hiện tương tự với môi trường
không chứa lysozyme -> ủ ở 35oC/24h -> kiểm tra sự tăng trưởng trong môi
trường chứa và không chứa lysozyme -> những ống có kết quả âm tính ủ thêm
24h -> kết luận vi khuẩn có kháng lysozme hay không. Dựa vào bảng để khẳng
định dòng đã chọn là B.cereus hay không.
• Đ
ặ
c

t
í
n
h

• Loài
• B
.
c
e
r
e
u
s

• B.thu
ringie
nsis
• B.

m
yc
oi
de
s
• B.
an
thr
aci
s
• B.me
gater
ium
• G
r
a
m

• +
(
a
)

• + • + • + • +
• C
a
t
a
l
a

s
e

• +

• + • + • + • +
• D
i

đ
ộ
n
g

• +
/
-
(
b
)

• +/- • -
(c)
• - • +/-
• K
h
ử
• +

• + • + • + • -

(d)


n
i
t
r
a
t
e

• P
h
â
n

h
ủ
y

t
y
r
o
s
i
n
e

• +

• +
• +/
- • -
(d)
• +/-
• K
h
á
n
g

l
y
s
o
z
y
m
e

• +

• + • + • + • -
• P
h
• +

• + • + • + • -
ả

n

ứ
n
g

v
ớ
i

l
ò
n
g

đ
ỏ

t
r
ứ
n
g

• L
ê
n

m
e

n

g
l
u
c
o
s
e

• +

• + • + • + • -
• P
h
ả
n
• +

• + • + • + • -

ứ
n
g

V
P

• S
i

n
h

a
c
i
d

t
ừ

m
a
n
i
t
o
l

• -

• - • - • - • +
• T
a
n

m
á
u

(
c
ừ
u
)

• +

• + • + • -
(d)
• -
•
• 3.3.Các thử nghiệm phân biệt các loài trong Bacillus nhóm I: