Nghiên cứu một số tính chất có lợi của hệ vi sinh vật trong ruột cá cơm trắng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN THỊ DIỄM HƯƠNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÍNH CHẤT CÓ LỢI
CỦA HỆ VI SINH VẬT TRONG RUỘT CÁ CƠM TRẮNG

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS.TS. ĐỖ THỊ BÍCH THỦY

Huế, 2014


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
STT

Chữ viết tắt

Tên đầy đủ

1

A.

Aeromonas

2

B.

Bacillus

3

Cs

Cộng sự

4

C.

Carnobacterium

5

DNA

Axit Deoxyribonucleic

6

DNS

Dinitrosalisilic

7

ĐC

Đối chứng

8

E.

Enterococcus

9

E. coli

Escherichia coli

10

FAO

Food and Agriculture Organization

11

LAB

Lactic acid bacteria

12

L.b

Lactobacillus

13

Lc.

Lactococcus

14

Ln.

Leuconostoc

15

H.

Helicobacter

16

HP

Đơn vị hoạt độ protease

17

MRS

The Man, Rogosa and Sharpes

18

MTCB

Môi trường cơ bản

19

P.

Pediococcus

20

PCR

Polymerase Chain Reaction-phản ứng khuếch đại gen

21

OD

Mật độ quang

22

S.

Streptococcus

23

TCA

Tricloacetic

24

V.

Vibro

25

WHO

The healthy World Organization (tổ chức y tế thế giới)


MỤC LỤC
Trang

PHẦN MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1
1. Tính cấp thiết của đề tài.......................................................................................1
2. Mục đích của đề tài..............................................................................................2
3. Nội dung nghiên cứu ...........................................................................................2
PHẦN 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 4
1.1. Tổng quan về cá cơm .......................................................................................4
1.2. Tình hình nghiên cứu hệ vi sinh vật trong ruột cá ở trong nước và trên thế giới ....5
1.2.1. Hệ vi sinh vật trong ruột cá........................................................................5
1.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ..............................................................6
1.2.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ............................................................6
1.3. Protease...........................................................................................................10
1.3.1. Giới thiệu chung về protease ...................................................................10
1.3.2. Phân loại protease ....................................................................................10
1.3.3. Protease từ vi khuẩn và tình hình nghiên cứu protease trong nước, trên thế giới ..12
1.3.4. Ứng dụng của protease ............................................................................14
1.4. Hệ vi khuẩn lactic ...........................................................................................16
1.4.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn lactic .........................................................16
1.4.2. Phân loại các chủng vi khuẩn lactic .........................................................17
1.4.3. Hệ vi khuẩn lactic trong ruột cá ...............................................................20
1.4.4. Một sớ tính chất có lợi của vi khuẩn lactic ..............................................21
1.4.5. Một sớ ứng dụng của vi khuẩn lactic .......................................................26
PHẦN 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 29
2.1. Đối tượng nghiên cứu .....................................................................................29
2.2. Thiết bị, hóa chất sử dụng ..............................................................................29
2.2.1. Thiết bị .....................................................................................................29
2.2.2. Hóa chất ...................................................................................................30
2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................30
2.3.1. Phương pháp vi sinh vật ..........................................................................30

2.3.2. Phương pháp khảo sát khả năng sinh protease ........................................35
2.3.3. Khảo sát khả năng chịu muối NaCl .........................................................37
2.3.4. Khảo sát khả năng chịu axit ....................................................................38
2.3.5. Khảo sát khả năng tự kết dính .................................................................39
2.3.6. Khảo sát khả năng sinh bacteriocin .........................................................40
2.3.7. Phương pháp xử lý số liệu .......................................................................40
PHẦN 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 41
3.1. Kết quả phân lập hệ vi sinh vật từ ruột cá cơm ..............................................41
3.2. Kết quả định danh các chủng vi sinh vật phân lập được ................................49
3.3. Khảo sát một sớ tính chất của hệ vi sinh vật hiếu khí ....................................65
3.3.1. Kết quả định tính hoạt độ protease của vi sinh vật trong ruột cá cơm ....65
3.3.2. Kết quả định lượng hoạt độ protease của vi sinh vật trong ruột cá cơm .....68
3.3.3. Kết quả khả năng chịu muối của các chủng vi sinh vật hiếu khí .............68
3.4. Khảo sát một sớ tính chất của hệ vi sinh vật yếm khí ....................................72
3.4.1. Khảo sát khả năng chịu ḿi...................................................................72
3.4.2. Khảo sát khả năng tự kết dính của các chủng vi sinh vật yếm khí ..........77
3.4.3. Khảo sát khả năng chịu axit của các chủng vi sinh vật yếm khí .............79
3.4.4. Khảo sát khả năng sinh bacteriocin của các chủng vi sinh vật yếm khí ..81
PHẦN 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................ 86
4.1. Kết luận ..........................................................................................................86
4.2. Kiến nghị ........................................................................................................86
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 87
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1. Các chủng vi sinh vật phân lập được từ ruột cá cơm .............................41
Bảng 3.2. Phân nhóm các chủng vi sinh vật có khới phổ Maldi-Tof tương đồng ..49
Bảng 3.3. Kết quả trình tự gen 16S rDNA của các chủng vi sinh vật hiếu khí ......55

Bảng 4.2. Kết quả trình tự gen pheS của các chủng vi sinh vật yếm khí ...............61
Bảng 3.4. Kết quả định danh của các chủng vi sinh vật phân lập từ ruột cá cơm ..63
Bảng 3.5. Khả năng sinh protease ngoại bào của các chủng phân lập được từ ruột
cá cơm.....................................................................................................65
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến khả năng phát triển của các chủng vi
sinh vật hiếu khí qua các mốc giờ ở nồng độ 5% ...................................69
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến khả năng phát triển của các chủng vi
sinh vật hiếu khí qua các mớc giờ ở nồng độ 10% .................................70
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến khả năng phát triển của các chủng vi
sinh vật hiếu khí qua các mớc giờ ở nồng độ 15% .................................71
Bảng 3.9. Kết quả khả năng chịu ḿi của các chủng vi sinh vật yếm khí ở nồng
độ muối 15% (OD đo ở 600nm) .............................................................73
Bảng 3.10. Kết quả khả năng chịu muối của các chủng ở nồng độ muối 20%
(OD đo ở 600nm) ...................................................................................74
Bảng 3.11. Kết quả khả năng chịu muối của các chủng ở nồng độ muối 25%
(OD đo ở 600nm) ...................................................................................76
Bảng 3.12. Kết quả khảo sát khả năng chịu pH thấp (số lượng tế bào log CFU/ml) ..79
Bảng 3.13. Khả năng kháng E. coli và Samonella của các chủng vi khuẩn lactic ...82


DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Hình ảnh cá cơm .......................................................................................4
Hình 1.2. Sơ đồ phân loại protease .........................................................................12
Hình 2.1. Cá cơm trắng (Stolephorus tri) ...............................................................29
Hình 2.2. Sơ đồ thể hiện nguyên tắc hoạt động của hệ thớng MALDI-TOF MS ....33
Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc (trái) và tế bào (phải) của các chủng vi sinh vật
phân lập được từ ruột cá cơm .................................................................48
Hình 3.2. Kết quả phổ MALTDI-TOF MS của các chủng thuộc nhóm 1 ..............50
Hình 3.3. Kết quả phổ MALTDI-TOF MS của các chủng thuộc nhóm 3 ..............50

Hình 3.3. Kết quả phổ MALTDI-TOF MS của các chủng thuộc nhóm 2 ..............51
Hình 3.4. Kết quả phổ MALTDI-TOF MS của các chủng thuộc nhóm 4 ..............52
Hình 3.5. Kết quả phổ MALTDI-TOF MS của các chủng thuộc nhóm 5 ..............52
Hình 3.6. Kết quả phổ MALTDI-TOF MS của các chủng thuộc nhóm 7 ..............52
Hình 3.7. Kết quả phổ MALTDI-TOF MS của các chủng thuộc nhóm 6 ..............53
Hình 3.8. Kết quả điện di ........................................................................................54
Hình 3.9. Hình ảnh thể hiện mức độ sinh tổng hợp protease của các chủng vi sinh
vật hiếu khí..............................................................................................67
Hình 3.10. Hoạt độ protease của các chủng vi khuẩn hiếu khí .................................68
Hình 3.11. Khả năng tự kết dính của các chủng vi sinh vật yếm khí .......................78
Hình 3.12. Tế bào khuẩn lạc sau 1 giờ (độ pha loãng 10-9) và 3 giờ
(độ pha lỗng 10-5) ni cấy của chủng Enterococcus hirae C25 ..........81
Hình 3.13. Vòng kháng khuẩn từ bacteriocin của các chủng vi sinh vật yếm khí ....85


PHẦN MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Cá cơm (Stolephorus) thuộc họ cá Trổng (Engraulidae) thường sống từng
đàn chủ yếu tập trung ở các vùng ven biển (độ sâu dưới 100m) của biển nhiệt đới
và cận nhiệt đới, có một sớ lồi phân bớ rộng vào các cửa sơng. Ở Việt Nam, cá
cơm thường phân bố chủ yếu ở các vùng biển như: Quảng Ninh, Hải Phịng,
Thanh Hóa, Thái Bình, Nam Định, Nghệ An, Hà Tĩnh, Thừa Thiên Huế, Quảng
Nam, Quảng Ngãi, Bình Định, Phú n, Khánh Hịa, Ninh Thuận, Bình Thuận,
Vũng Tàu, Tiền Giang, Bến Tre, Trà Vinh, Sóc Trăng, Bạc Liêu, Kiên Giang, Cà
Mau và vịnh Thái Lan…
Hiện nay, cá cơm là họ đứng đầu về sản lượng trong ngành khai thác thủy sản
trên thế giới và là đối tượng đánh bắt quan trọng trong nghề cá nổi ven biển ở nước
ta. Đây là một nguồn lợi thủy sản có giá trị kinh tế tương đới lớn. Sản lượng khai
thác hàng năm có thể lên đến hàng ngàn tấn (theo ước tính của Viện nghiên cứu
biển Nha Trang trữ lượng cá Cơm của nước ta vào khoảng 50-60 vạn tấn).

Cá cơm là một loại cá rất được ưa chuộng vì hương vị cũng như giá trị dinh
dưỡng mà chúng đem lại. Cá cơm có thể được sử dụng như là nguyên liệu để
làm nước sốt cá lên men gọi là garum, ngoài ra cũng được chế biến thành nhiều
món ăn khác như cá cơm kho tiêu, cá cơm khô… nhưng nổi tiếng nhất vẫn là
nước mắm cá cơm.
Nước mắm là một loại nước chấm quen thuộc được ưa chuộng nhất ở nước ta
và không thể thiếu trong mỗi bữa ăn hằng ngày. Nước mắm có giá trị dinh dưỡng
cao (trong nước mắm có chứa 13 loại acid amin và một sớ loại vitamin đặc biệt là
vitamin nhóm B. Nguyên lý của quá trình sản xuất nước mắm là sự phân giải
protein của cá thành các amino acid nhờ vào hệ enzyme protease ngoại bào của hệ
vi sinh vật trong ruột cá. Bên cạnh đó, hệ vi khuẩn lactic trong ruột cá cũng đóng
vai trị là nhân tớ tạo hương cho sản phẩm nước mắm.
Sản xuất nước mắm hiện nay đang là một thế mạnh của ngành thủy sản, hàng
năm giúp tiêu thụ khoảng 40-60% tổng số cá đánh bắt được và được chế biến khắp
1


nơi trên tồn q́c. Tuy nhiên, một thực trạng cho thấy, nghề làm nước mắm nước
ta hiện nay vẫn còn theo phương pháp cổ truyền, chưa có điều kiện áp dụng cơng
nghệ mới. Hầu hết q trình chế biến nước mắm phụ thuộc rất lớn vào sự tồn tại
của hệ enzyme ngoại bào có trong hệ vi sinh vật ở ruột cá. Do vậy thời gian sản
xuất tương đối dài (6-12 tháng), đồng thời chất lượng nước mắm không ổn định về
màu sắc và mùi vị… Chính vì vậy, q trình sản xuất nước mắm cổ truyền hiện nay
cần được cải tiến bằng cách sử dụng các chế phẩm sinh học giúp tăng cường quá
trình thủy phân và quá trình lên men của cá nhằm rút ngắn thời gian sản xuất và
chất lượng sản phẩm ổn định, đem lại hiệu quả kinh tế cao.
Xuất phát từ những vấn đề thực tiễn nêu trên tôi quyết định chọn đề tài
“Nghiên cứu một số tính chất có lợi của hệ vi sinh vật trong ruột cá cơm
trắng” với mục đích cung cấp một phần thông tin về hệ vi sinh vật trong ruột cá
và khai thác một sớ tinh chất có lợi của chúng làm tiền đề cho những nghiên cứu

ứng dụng vào thực tiễn.
2. Mục đích của đề tài
Tìm hiểu rõ hơn về hệ vi sinh vật ở trong ruột cá cơm nhằm cung cấp một số
thông tin về hệ vi sinh vật trong ruột cá.
Khai thác nguồn gen của hệ vi sinh vật hiếu khí sinh protease ngoại bào phân
lập từ ruột cá cơm.
Khai thác nguồn gen của hệ vi sinh vật yếm khí và một sớ tính chất có lợi
của chúng (khả năng chịu acid, khả năng tự kết dính và khả năng ức chế vi
khuẩn gây bệnh).
3. Nợi dung nghiên cứu
1. Phân lập hệ vi sinh vật từ ruột cá cơm và xác định một số đặc điểm hình
thái của các chủng phân lập được.
2. Định danh các chủng vi sinh vật phân lập được ở cấp độ lồi.
3. Khảo sát một sớ tính chất của các chủng vi sinh vật phân lập được
 Đối với hệ vi sinh vật hiếu khí
- Khảo sát khả năng sinh enzyme protease ngoại bào
- Khảo sát khả năng chịu muối

2


 Đới với hệ vi sinh vật yếm khí
- Khảo sát khả năng chịu muối
- Khảo sát khả năng chịu acid
- Khảo sát khả năng tự kết dính
- Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh (bacteriocin)

3

PHẦN 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về cá cơm
Cá cơm (Stolephorus) thuộc họ cá trổng (Engraulidae) là loài cá sớng chủ yếu
ở nước mặn (một sớ lồi thuộc họ của chúng sống trong nước ngọt hay nước lợ). Cá
cơm có kích thước nhỏ, chiều dài tới đa 50cm (thường dưới 15cm), trên thân có một
sọc dọc màu bạc chạy từ đuôi đến vây bụng, chúng thường bơi thành đàn và ăn các
loại sinh vật phù du, chủ yếu là thực vật phù du. Chúng có mặt ở rất nhiều vùng
biển trên thế giới nhưng tập trung chủ yếu ở các vùng biển nhiệt đới và cận nhiệt
đới. Chúng đẻ trứng giữa tháng 10 và tháng 3 [55].

Hình 1.1. Hình ảnh cá cơm
Cá cơm là một loại thực phẩm có hương vị đặc trưng và giá trị dinh dưỡng
cao. Cá cơm chứa nhiều thành phần dinh dưỡng rất tốt cho sức khỏe con người đặc
biệt là hàm lượng protein cao và một sớ vitamin nhóm B. Chính vì vậy, cá cơm
được dùng làm thực phẩm trong các bữa ăn hàng ngày của người dân. Vào thời La
Mã nó đã được dùng để chế biến làm nước sốt lên men cá cơm gọi là Garum. Hiện
nay rất nhiều dạng sản phẩm cá cơm xuất hiện như trên thị trường như mắm chua cá
cơm, cá cơm khô, cá cơm tẩm gia vị... nhưng nổi tiếng nhất vẫn là nước mắm cá
cơm. Nước mắm cá cơm có màu sắc vàng đẹp có mùi vị thơm ngon hơn so với
nước mắm lên men từ các loại khác như cá nục, cá linh, cá trích…[79].
Hiện nay, cá cơm là họ cá đứng đầu về sản lượng trong ngành khai thác thủy
sản trên thế giới và đối tượng đánh bắt quan trọng trong nghề cá ở nước ta. Ở Việt

4


Nam, một số vùng biển đánh bắt cá cơm với lượng lớn như Nha Trang, Quảng
Ngãi, Phan Thiết, Phú Quốc,... Sản lượng đánh bắt lên đến cả ngàn tấn (theo ước
tính của Viện nghiên cứu biển Nha Trang trữ lượng cá cơm ở nước ta vào khoảng

50-60 vạn tấn). Một sớ loại cá cơm có nhiều ở vùng biển Việt Nam như: cá cơm
thường gọi là cá cơm ruồi (Stolephorus commersonii), cá cơm Ấn Độ (Stolephorus
indicus), cá cơm Trung Hoa hay còn gọi là cá cơm than (Stolephorus chinensi ), cá
cơm trắng (Stolephorus Tri).
Trong nội dung nghiên cứu này chúng tôi sử dụng cá cơm trắng (Stolephorus
Tri) làm đối tượng nghiên cứu.
1.2. Tình hình nghiên cứu hệ vi sinh vật trong ruột cá ở trong nước và trên thế giới
1.2.1. Hệ vi sinh vật trong ruột cá
Hệ vi sinh vật trong ruột cá, bao gồm cá nước ngọt và cá biển đã thu hút sự
quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới và được nghiên cứu rộng rãi bằng
cách sử dụng các kỹ thuật khác nhau.
Số lượng và thành phần vi sinh vật cá, phụ thuộc số lượng, thành phần hệ
vi sinh vật nước. Hệ vi sinh vật phân lập từ trứng, da, mang, ruột cá đã được
mô tả trong một sớ lượng hạn chế các lồi cá. Nói chung, phạm vi nghiên cứu
của hệ vi sinh vật được phân lập chỉ liên quan đến môi trường sống của cá và
thay đổi theo các yếu tố độ mặn của môi trường sống và lượng vi sinh vật trong
môi trường nước [50].
Trong nhiều nghiên cứu chỉ phân lập với cấp độ chi nên khó khăn trong việc
xác định mới quan hệ chính xác giữa hệ vi sinh vật đặc trưng với cá. Vi sinh vật từ
da và mang cá chỉ là thống qua chứ khơng phải cư ngụ cớ định. Ngồi các bộ phận
của cá như da, mang thì ruột cá cũng là nơi chứa nhiều vi sinh vật. Các vi sinh vật
thường thấy trong ruột cá như Clostridium sporogenes, Clostridium putrificus,
Escherichia coli. Ngồi ra cịn có các vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm như
Samonella và Clostridium (đặc biệt là trong ruột cá tầm) [6].
Người ta cho rằng hệ vi sinh vật đường ruột cá có ảnh hưởng đến q trình
tiêu hóa của cá. Các chi hiện diện trong ruột nói chung dường như từ mơi trường
hoặc chế độ ăn ́ng mà có thể tồn tại và nhân lên trong đường ruột, mặc dù có

5

bằng chứng cho rằng sự tồn tại một sớ lồi vi khuẩn đường ruột khác biệt trong một
sớ lồi cá. Do đó rất khó để xác định chính xác sự đóng góp của hệ vi sinh vật
đường ruột do sự phức tạp trong đường ruột của các loài cá khác nhau [50], [72].
1.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Các cơng trình trong nước nghiên cứu về hệ vi sinh vật ruột cá cịn rất hạn
hẹp. Các cơng trình đã được nghiên cứu cũng chỉ tập trung vào một loại vi sinh vật
có lợi nào đó trong ruột của một sớ loại cá.
Nhóm nghiên cứu Phan Duệ Thanh và Nguyễn Thị Lợi, Bộ môn CNSH - Vi
sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội tiến hành phân lập và
tuyển chọn các chủng vi khuẩn sinh lactic có đặc tính probiotic từ ruột cá chép
(Cyprinus carpio).
Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của các vi khuẩn phân lập từ
ruột cá chim vây vàng và ruột cá giò nhằm định hướng trong nuôi trồng thủy hải sản
bền vững của nhóm tác giả Bùi Vĩnh Đại, Nguyễn Thị Ngọc Thanh, Nguyễn Văn
Duy, Đại học Nha Trang.
Nghiên cứu thu nhận chế phẩm protease từ ruột cá Basa (Pangasius
bocourti) Trần Quốc Hiền-Trung tâm Công nghệ Sau thu hoạch, Viện Nghiên
cứu nuôi trồng thủy sản II và Lê Văn Việt Mẫn-Trường Đại học Bách khoa,
ĐHQG-HCM.
Nghiên cứu của Trần Thị Kiều Tiên Bộ môn CNSH, Khoa Sinh học, Trường
Đại học Khoa học Huế về phân lập tuyển chọn các chủng vi khuẩn sinh amylase và
protease ngoại bào cao có trong ruột cá nục (Decapterus).
1.2.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Các cơng trình nghiên cứu cho thấy, hệ vi sinh vật trong ruột cá rất đa dạng
về chủng loại nó phụ thuộc vào mơi trường sớng và thói quen sớng của chúng.
Việc khám phá hệ vi sinh vật đường ruột đang được các nhà khoa học trên thế
giới quan tâm.
Trust và Sparrow (1974) đã nghiên cứu hệ vi sinh vật trong đường tiêu hóa
của cá hồi nước ngọt, nhận thấy rằng số lượng vi khuẩn trong các họ cá hồi nước

ngọt tăng giữa dạ dày và phần sau của ruột. Các lồi, sớ lượng vi khuẩn có trong

6


đường tiêu hóa biến động theo loại thức ăn mà cá ăn vào, bao gồm các vi khuẩn
kỵ khí bắt buộc, nhiệt độ thích hợp cho sự tăng trưởng là ở nhiệt độ thấp (dưới
20oC). Các vi khuẩn chủ yếu tập trung ở bề mặt biểu mô của đường ruột. Nghiên
cứu này cho thấy khơng có sự khác biệt đáng kể trong hệ vi khuẩn của cá ở các
loài khác nhau (giới tính, trạng thái sinh sản, trọng lượng, hoặc nguồn địa lý) [74].
Nghiên cứu về hệ vi sinh vật trong ruột của cá hồi, Yoshimizu và Kimura
(1976) phát hiện rằng hệ vi sinh đường ruột của những cá hồi khỏe mạnh khi sống
ở biển chủ yếu bao gồm chi Vibrio. Ngoài ra, khi so sánh với các loài cá biển khác
nhau, số lượng các vi sinh vật đường ruột khơng khác nhau nhiều giữa các lồi và
thay đổi từ 102-107/g, và không phụ thuộc vào trọng lượng hay giới tính của cá.
Trong đó, Vibrio chiếm ưu thế (61%), trong khi chi Aeromonas phát quang chỉ
chiếm 21%. Nghiên cứu này cũng cho thấy rằng, trong 14 cá thể của 6 lồi được
đánh bắt ở vùng biển phía đơng Bering, sớ lượng vi sinh vật hiện diện trong đường
ruột là 102-107/g, chủ yếu cũng là chi Vibrio (61%) và còn lại 40%các chủng vi
sinh vật là phát quang [76].
Sugita và cs (1982) khảo sát hệ vi khuẩn phân lập từ ruột của Tilapia
nilotica. Nhóm tác giả đã chia cá thành các nhóm và ni trong mơi trường nước
ngọt, bổ sung 25, 50, 75, hoặc 100% nước biển. Kết quả nhóm tác giả này đã
phân lập được các loại Bacteroides, vi khuẩn hiếu khí gram âm, Coryneforms và
Streptococci, cầu khuẩn, trực khuẩn hiếu khí gram dương và nấm men. Trường
hợp cá được nuôi trong 75 và 100% nước biển, số lượng các vi khuẩn kỵ khí bắt
buộc giảm hoặc biến mất, vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí tùy nghi, hình que, gram
âm chiếm ưu thế. Nghiên cứu về hệ vi khuẩn từ đường tiêu hóa của các lồi cá
nước ngọt ở sông, Sugita và cs (1983) đã phân lập được các vi khuẩn hiếu khí và
kỵ khí từ bảy loại cá được đánh bắt ở các vị trí khác nhau dọc theo một con sông

ở Nhật Bản và đã so sánh chúng với hệ vi khuẩn của nước, bùn cát, và côn trùng
thủy sinh. Tổng số vi khuẩn trong ruột là 105-108 CFU/g, trong đó
Enterobacteriaceae và nhóm Vibrio Aeromonas chiếm ưu thế. So sánh các vi
sinh vật phân lập từ ruột, nước, bùn lắng, thực vật thủy sinh và các loài cơn
trùng, với vị trí lấy mẫu và thời gian lấy mẫu khác nhau, cho thấy có sự tương

7


đồng về chi. Từ đó, tác giả đã kết luận rằng hệ vi sinh vật đường tiêu hóa của cá
có nguồn gốc từ môi trường sống của chúng.
Nghiên cứu của Frerichs, Hendrie (1985) về vi khuẩn liên quan đến bệnh của cá
và nghiên cứu của Newman và cs (1972) về hệ vi sinh vật hiếu khí ở ruột của cá
bluefish (Pomatomus saltatrix) nhận thấy rằng các loài Enterobacter, Aeromonas, và
Acinetobacter là chiếm ưu thế trong những loài cá nước ngọt, khác hẳn với những lồi
ở đường tiêu hóa của các loài cá biển, Vibrio, Pseudomonas, Achromobacter,
Corynebacterium, Flavobacterium, và Micrococcus chiếm ưu thế [30].
MacFarlane và cs (1986) nghiên cứu định tính và định lượng của hệ vi sinh
đường ruột trong cá vược vằn đánh bắt ở cửa sông và ven biển, nhận thấy sự khác
biệt trong thành phần của hệ đường ruột cá vược vằn (Morone saxatilis) ở biển và
cửa sông và cũng kết luận rằng vi sinh vật đường ruột cá có mới quan hệ với mơi
trường sớng.
Austin và A1-Zahrani (1988) nghiên cứu về các ảnh hưởng của các chất kháng
khuẩn lên hệ vi sinh vật trong đường tiêu hóa của cá hồi vân, thấy rằng số lượng các
vi khuẩn dị dưỡng hiếu khí dọc theo đường tiêu hóa giảm dần. Vi khuẩn kỵ khí đã
được phát hiện trên ruột và trong ruột [17].
Sugita và cs (1991) nghiên cứu về khả năng sinh vitamin B12 của hệ vi sinh vật
trong ruột cá hồi vân (Oncorhynchus mykiss) đã kết luận rằng tổng sớ vitamin B12
được tạo thành bởi sự có mặt của các vi khuẩn Aeromonas(A. Hydrophila),
Enterobacteriaceae, Moraxell, và Acinetobacter cùng với Bacteroides loại A,

Bacteroidaceae, và Clostridium [72].
Grisez và cs (1997) đã quan sát hệ vi sinh vật trong đường ruột của ấu trùng cá
vền biển (Dicentrarchus labrax) và cá vược biển (Sparus aurata), thấy rằng ở giai đoạn
ấu trùng có một tỷ lệ cao của nhóm V. anguillarum, V. tubiashii, và Vibrio.
Joborn, và cs (1999) tiến hành phân lập hệ vi sinh vật của cá hồi Atlantic
(Salmo salar) và đã phát hiện một loài mới là C. Inhibens. Ngoài ra, hoạt tính kháng
khuẩn chớng lại mầm bệnh cá cũng đã được chứng minh, đặc biệt là ở hai loài
Aeromonas salmonicida và Vibrio anguillarum [35].

8


Rudresh và cộng sự (2010) đã phân lập và khảo sát một sớ tính chất của hệ
vi sinh vật trong ruột của Garra mullya đánh bắt ở cửa sông, thu được 19 chủng
vi khuẩn, các chủng này rất sự đa dạng về đặc điểm hình thái, trong đó 2 chủng
là có khả năng di động, 5 chủng gram (+) gồm 3 cocci và 2 bacillococci, còn lại
14 chủng Gram (-) gồm 2 khuẩn tròn, 9 là Bacillococci và 3 trực khuẩn [65].
Enzyme tiêu hóa nội sinh trong cá đã được nghiên cứu bởi một số nhà nghiên
cứu (Dhage, 1968; Kawai và Ikeda, 1972; Das và Tripathi, 1991). Tuy nhiên, thông
tin liên quan đến vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme trong đường ruột, nguồn gốc và ý
nghĩa của chúng trong cá vẫn cịn rất khiêm tớn [24], [25], [39].
Trong nghiên cứu của Kar và Ghosh (2008) hệ vi khuẩn sinh tổng hợp
enzyme ngoại bào trong đường tiêu hóa của Labeo rohita (Hamilton) và Channa
punctatus (Bloch) đã được phân lập,và khảo sát khả năng sinh tổng hợp amylase,
protease và cellulase của chúng. Kết quả cho thấy rằng thành phần của enzyme
được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn trong đường tiêu hóa cá thể có liên quan tới
thức ăn của chúng [37].
Allameh và cs (2012) đã tiến hành phân lập, định danh và mơ tả các đặc
tính của Leuconostoc mesenteroides như là một probiotic mới từ ruột cá lóc
(Channa striatus) [14].

Kim và cộng sự (2013) đã kiểm tra sự đa dạng và phong phú của quần thể vi
sinh vật trong ruột cá bơn ô liu. Tất cả các chủng vi khuẩn phân lập được chia thành
thành bốn ngành là Proteobacteria, Fimicutes, Actinobacteria và Bacteroidetes.
Trong đó, có 13 lồi vi khuẩn lactic được phân lập từ ruột cá. Nhìn chung, có sự
khác biệt đáng kể về sự phong phú của vi sinh vật giữa cá tự nhiên và cá nuôi. Sự đa
dạng và phong phú của các loài vi khuẩn lactic trong ruột của cá tự nhiên là lớn hơn
so với cá nuôi cho ăn bằng thức ăn cơng nghiệp [41].
Từ các cơng trình nghiên cứu trên cho thấy, hệ vi sinh vật trong ruột các lồi cá
khác nhau, sớng trên các mơi trường khác nhau đã thu hút được sự quan tâm của các
nhà khoa học trên khắp thế giới qua sự đa dạng của các cơng trình nghiên cứu. Chúng
rất đa dạng và phong phú, tùy theo lồi, thói quen sớng và môi trường sống của cá.
Trong môi trường nước ngọt, các chi Enterobacter, Aeromonas, và Acinetobacter

9


chiếm ưu thế. Trong khi đó trong mơi trường biển các chi Vibrio, Pseudomonas,
Achromobacter, Corynebacterium, Flavobacterium và Micrococcus lại chiếm ưu thế.
Hơn nữa, khả năng sinh enzyme ngoại bào cũng như một sớ tính chất có lợi của hệ vi
sinh vật phân lập được từ ruột cá cũng đã được chứng minh.
Vì vậy, việc nghiên cứu ''Nghiên cứu một số tính chất có lợi của hệ vi sinh vật
trong ruột cá cơm trắng'' sẽ góp thêm phần thơng tin về hệ vi sinh vật trong ruột cá
và khả năng sinh tổng hợp enzyme protease ngoại bào cũng như khai thác một sớ
tính chất có lợi của chúng để làm tiền đề cho những nghiên cứu ứng dụng chế phẩm
sinh học nhằm cải tiến quy trình cơng nghệ sản xuất nước mắm cổ truyền hiện nay.
1.3. Protease
1.3.1. Giới thiệu chung về protease
Protease là nhóm enzyme xúc tác thủy phân mới liên kết peptide của
proteintheo phản ứng:

Ngồi ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận
chuyển acid amin.
1.3.2. Phân loại protease
Hiệp hội Hóa sinh và Sinh học phân tử quốc tế (1984) đã đề nghị sử dụng
thuật ngữ peptidase (protease) để chỉ các enzyme thủy phân mối liên kết peptide
(thuộc phân nhóm E.C.3.4) [8].
Thuật ngữ protease được sử dụng một cách rộng rãi hơn đồng nghĩa với
peptidase. Các peptidase được chia thành hai nhóm enzyme phụ thuộc vào vị trí
phân cắt của các liên kết peptide:exopeptidase và endopeptidase.
* Exopeptidase: làm nhiệm vụ xúc tác phân giải các liên kết peptide ở 2 đầu
chuỗi polypeptide của protein. Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide,
exopeptidase được chia thành 2 phân nhóm.
- Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi
polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide.
Ngồi ra, trong nhóm này cịn chứa các enzyme: dipeptidase và tripeptidase.

10


- Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi
polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.
* Endopeptidase (proteinnase): nhóm enzyme xúc tác thủy phân liên kết
peptide trong cấu trúc phân tử protein tạo thành polypeptide, peptone. Thuộc nhóm
này có các enzyme sau: pepsin, rennin, trypsin, chymotripsin, renin, papain, subtilisin,
ficin, bromelain.
Dựa vào sự có mặt của các nhóm chức năng trong trung tâm hoạt động, các
proteinase cịn được chia làm 4 nhóm gồm serine proteinase, cysteine proteinase,
aspartic proteinase và metallo proteinase.
- Serine proteinase: là những protease có nhóm -OH của gớc serine trong
trung tâm hoạt động, có vai trị đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của

enzyme. Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện
tính đặc hiệu cơ chất tương đới rộng. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ phân biệt là
chymotrypsin và subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như
chymotrypsin, trypsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm các enzyme vi khuẩn.
- Cysteine proteinase: các protease thuộc nhóm này có nhóm -SH trong trung
tâm hoạt động. Cysteine proteinase bao gồm các protease thực vật như papain,
actinidin, bromelin, một vài protease động vật và protease ký sinh trùng. Các
cysteine proteinase thường hoạt động mạnh ở pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ
chất rộng và chỉ hoạt động được khi nhóm -SH trong trung tâm hoạt động của nó
khơng bị bao vây.
- Aspartic proteinase: hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin. Nhóm
pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như pepsin, chymosin, cathepsin, renin, các
protease của nấm mớc. Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung
tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.
- Metallo proteinase: là nhóm protease có chứa kim loại trong cấu trúc được
tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các sinh vật bậc cao. Các metallo
proteinase thường hoạt động mạnh nhất ở vùng pH trung tính.

11


Phân loại protease được tóm tắt trên hình 1.1.
Peptidase (Protease)
(E.C.3.4)

Exopeptidase
(E.C. 3.4.11-17)

Endopeptidae
(E.C. 3.4.21-99)

Serine protease

Aminopeptidase
Cystein protease
Aspartic protease

Carboxypeptidase

Metallo protease

Hình 1.2. Sơ đồ phân loại protease
Người ta cũng có thể dựa vào vùng pH hoạt động tới thích để phân thành
ba nhóm: protease acid tính (pH < 6), kiềm tính (pH 8-11) và trung tính (pH 67,5). Tuy nhiên, cách phân loại này chỉ có ý nghĩa thực dụng, khơng thật sự
chính xác vì pH tới thích của mỗi enzyme cịn phụ thuộc vào bản chất cơ chất và
nhiều yếu tố khác nữa [8].
1.3.3. Protease từ vi khuẩn và tình hình nghiên cứu protease trong nước, trên thế giới
 Protease vi khuẩn
Protease thu nhận từ vi khuẩn được quan tâm nhiều nhất so với protease thu
nhận từ các đối tượng khác như động vật, thực vật, nấm…. Vi khuẩn có chu kỳ phát
triển ngắn, khả năng sinh enzyme mạnh, thao tác đơn giản, tiết kiệm diện tích ni
cấy. Do đó, protease từ vi khuẩn có tính chất hóa sinh đa dạng, hoạt tính mạnh, tớc
độ phản ứng nhanh, độ bền nhiệt lớn, có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ
phân triệt để, cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất, dễ ứng dụng với các mục đích
khác nhau, giá trị kinh tế lớn.

12


* Protease từ vi khuẩn ruột cá [62]
Vi khuẩn thuộc Bacillus sp. đến nay là nguồn quan trọng nhất của một số men

vi khuẩn thương mại (Ferrero và cs năm 1996;. Kumar và cs 1999;. Sookkheo và cs,
2000;. Singh và cs, 2001; Gupta và cs, 2002;. Beg & Gupta, 2003; Shafee và cs,
2005; Chu, 2007; Silva và cs, 2007). Những nghiên cứu đầu tiên trên protease sản
xuất vi khuẩn phân lập từ đường tiêu hóa của cá, cá đới màu xám bởi Hamid và cs
(1979) và cá trắm cỏ bởi Trust và cs (1979).
Trong một nghiên cứu phân lập vi khuẩn từ ruột của Arabesque
(Pleurogrammus azonus) bởi Hoshino và cs 1997, một trong các chủng cho thấy hoạt
tính phân giải protein mạnh. Dòng phân lập được xác định thuộc chi Pseudomonas và
biểu hiện sản xuất protease cao nhất ở 10oC, và hoạt độ giảm khi tăng nhiệt độ nuôi
cấy. Morita và cs (1998) phát hiện hoạt tính protease trong mơi trường nuôi cấy của
Flavobacterium balustinum phân lập từ ruột cá hồi (Oncorhynchus keta). Khối lượng
phân tử của các protease là 70 kDa và điểm đẳng điện của nó là gần 3,5, và hoạt độ
tối ưu đối với cơ chất azocasein là ở 40°C và pH từ 7-9.
Ghosh và cs (2002) nghiên cứu in vitro khả năng sinh enzyme các chủng vi
sinh vậtB. circulans Lr 1.1, B. pumilus Lr 1.2 và B. cereus Lr 2.2, phân lập từ
đường tiêu hóa của cá chép. Nhóm tác giả cơng bớ rằng các chủng vi khuẩn này là
nguồn thu nhận các enzyme phân giải protein tớt. Bairagi và cs (2002) định lượng
hoạt tínhphân giải protein trong các chủng vi khuẩn phân lập từ chín loài cá nước
ngọt và xác định được hoạt độ cao nhất biểu hiện trong dòng vi khuẩn TP3A phân
lập từ ruột của cá rô phi ăn tạp. Belchior và Vacca (2006) phân lập một loại vi
khuẩn psychrotrophic, Pseudoalteromona sp. từ đường ruột của cá tuyết (Meluccius
hubbsi) và xác định rằng hoạt độ protease ở 7°C thấp hơn so với ở 22°C. Kar &
Ghosh (2008) phân lập và liệt kê vi khuẩn dị dưỡng trong ruột của cá chép và cá lóc
để đánh giá tầm quan trọng của hệ vi sinh vật đường tiêu hóadinh dưỡng cá. Nghiên
cứu này cho thấy một mối tương quan rõ rệt giữa vi khuẩn sinh enzyme và thức ăn
của chúng. Mật độ tối đa của vi khuẩn phân giải protein đã được phát hiện trong C.
punctatus (cá ăn thịt) so với L. rohita (cá ăn cỏ).

13

Esakkiraj và cs (2009) công bố khả năng protease ngoại bào bởi B. Cereus
phân lập từ ruột của cá nước lợ (Mugil cephalus) trong thí nghiệm ni cấy lắc các
chế phẩm khác nhau của chất thải cá ngừ chế biến như thịt cá, thịt cá đã khử mỡ,
thủy phân kiềm và acid thủy phân (nguồn nitơ). Nhóm tác giả đã khảo sát tác động
của nhiệt độ, pH, nguồn carbon đến khả năng sinh protease ngoại bào của các chủng
vi khuẩn. Kết quả cho thấy mơi trường thích hợp nhất để chủng này sinh tổng hợp
protease ngoại bào cao là: thịt cá khử mỡ (3%), glactose (1,5%) và NaCl (3%).
Sự sản xuất protease ngoại bào cao nhất khi Triton X100 đã được thêm vào
môi trường so với các chất bề mặt khác, và sản xuất protease tối ưu được ghi nhận
khi 0,8% Triton X100 được thêm vào. Sau đó, Mondal và cs (2010) đã tiến hành
một thí nghiệm để xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu cho sản xuất protease ngoại
bào của hai chủng vi khuẩn B. licheniformis BF2 và B. subtilis BH4. Kết quả thí
nghiệm của nhóm tác giả cho thấy rằng pH, nhiệt độ và nitơ đóng vai trò quan trọng
nhất trong sản xuất protease bởi B. licheniformis BF2 và B. subtilis BH4. Protease
ngoại bào của cả hai chủng có khả năng chịu nhiệt và khả năng tổng hợp protease
ngoại bào của các chủng này tăng trong điều kiện lên men bán rắn. Cao thịt bị được
cơng bớ là nguồn nitơ kích thích khả năng sinh tổng hợp protein tốt nhất.
Qua các nghiên cứu cho thấy các vi khuẩn trong ruột cá có khả năng sinh
ptotease ngoại bào. Điều này có đóng góp quan trọng trong giai đoạn phân giải
protein của cá trong sản xuất nước mắm.
1.3.4. Ứng dụng của protease
Công nghệ enzyme là một trong bốn bộ phận cơ sở của cơng nghệ sinh học.
Sự hình thành và phát triển công nghệ enzyme ở nhiều nước thường bắt đầu từ các
enzyme thủy phân, đặc biệt là các enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân protein
(protease) và các enzyme phân giải polysaccharide kiểu tinh bột (amylase). Trong
đó, sản lượng protease được sử dụng trong thực tế chiếm tỷ lệ khá lớn, khoảng 50%
toàn bộ chế phẩm enzyme [1].
Protease được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như:
+ Chất tẩy rửa: Protease là một trong những thành phần không thể thiếu trong

tất cả các loại chất tẩy rửa, từ chất tẩy rửa dùng trong gia đình đến những chất làm

14


sạch kính hoặc răng giả và kem đánh răng. Việc ứng dụng enzyme vào các chất tẩy
rửa nhiều nhất là trong bột giặt. Các protease thích hợp để bổ sung vào chất tẩy rửa
thường có tính đặc hiệu cơ chất rộng để dễ dàng loại bỏ các vết bẩn do thức ăn, máu
và các chất do cơ thể con người tiết ra.
+ Cơng nghiệp thuộc da: Q trình chế biến da bao gồm một số công đoạn như
ngâm ướt, tẩy lông, làm mềm da và thuộc da. Thông thường các phương pháp thuộc da
thường dùng các hóa chất độc hại như natri sulfide, làm ảnh hưởng rất nghiêm trọng
đến môi trường khi nước thải của nhà máy này thải ra sơng. Việc sử dụng enzyme để
thay thế các hóa chất đã rất thành công trong việc nâng cao chất lượng da và làm giảm
ô nhiễm môi trường. Protein là một thành phần cơ bản của da và lông nên protease đã
được sử dụng để thủy phân một số thành phần phi collagen của da và loại bỏ các
protein phi fibrin như albumin, globulin trong q trình thuộc da rất có hiệu quả.
+ Do protease kiềm từ Bacillus được tạo thành với lượng lớn, có đặc tính bền
vững, hoạt động tớt với nhiệt độ và pH cao nên chúng được ứng dụng ở nhiều
ngành công nghiệp khác nhau như: xử lý phim X-quang đã qua sử dụng để nhằm
thu hồi bạc, làm nước mắm cá (Rebeca et al., 1991), làm thức ăn gia súc (Cheng và
cs, 1995), xử lý chất thải từ động vật giáp xác (Yang và cs, 2000), xử lý rác thải
trong các lò mổ gia cầm trên cơ sở dùng Bacillussubtilis (Dalev, 1994), v.v….
Ngồi ra, protease cịn được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành khác như:
- Trong công nghiệp thực phẩm protease được sử dụng để chế biến thịt, sữa
hay công nghiệp sản xuất bia…
- Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong
thực phẩm và sản xuất một số thức ăn kiêng.
- Protease của nấm mốc và vi khuẩn phối hợp với amylase tạo thành hỗn hợp
enzyme dùng làm thức ăn gia súc có độ tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn trong chăn nuôi

gia súc và gia cầm.
- Điều chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật để sản xuất vaccine,
kháng sinh,…
- Sản xuất keo động vật, chất giặt tổng hợp để giặt tẩy các chất bẩn protein,
sản xuất mỹ phẩm,…

15


1.4. Hệ vi khuẩn lactic
1.4.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic được xác định là vi khuẩn Gram dương, có hình thái là hình
cầu hoặc hình que, catalase và oxydase âm tính, khơng có khả năng sinh bào tử,
khơng di động, nhiều lồi trong chúng là vi sinh vật kỵ khí tùy nghi, vi hiếu khí, có
khả năng tồn tại cả hiếu khí và kỵ khí (Batt C.A., 2000) [19].
Vi khuẩn lactic hiện diện nhiều trong các sản phẩm lên men như sữa chua, kim
chi, rau quả muối chua, tôm chua, và trong nước mắm. Đối với sản phẩm lên men
thì vi khuẩn lactic đóng vai trị lên men nhằm tạo cấu trúc, hương vị cho sản phẩm
như sữa chua, tôm chua, nước mắm. Đối với các sản phẩm thủy phân như nước
mắm, vi khuẩn lactic không những đóng vai trị sinh hương mà cịn đóng vai trò
thủy phân protein .Theo nghiên cứu của Nattewan Udomsil (2010) cho biết
Tetragenococcus halophilus có khả năng thủy phân protein. Bảy chủng đã được
chọn vào ứng dụng trong hoạt động thủy phân protein và sinh các hợp chất gây
hương trong 64 chủng Tetragenococcus halophilus đã được phân lập [75].
Vi khuẩn lactic có rất nhiều ứng dụng trong các sản phẩm nhưng khơng phải
lồi nào cũng có ứng dụng trong tất cả các sản phẩm và mang lại các đặc tính có lợi
cho sản phẩm. Mỗi loại sản phẩm là có một hay nhiều lồi vi khuẩn tham gia hoạt
động, ví dụ: Trong sản xuất các sản phẩm về sữa, vi khuẩn lactic đóng vai trị quyết
định chất lượng sản phẩm chỉ có Lactococcus hay trong các sản phẩm lên men rau
quả thì q trình lên men được quyết định bởi nhóm Lactobacillus, Leuconotoc,

Pediococcus. Như vậy qua đây, nhận thấy chủng loại của vi khuẩn lactic rất đa dạng
và phong phú.
Theo Axelsson (2004), vi khuẩn lactic gồm các chi chính sau: Aerococcus,
Carnobacterium,

Enterococcus,

Lactobacillus,

Lactococcus,

Leu-conotoc,

Oenococcus, Pediococcus, Tetragenococcus, Vagococcus và Weissella. Các chi này
có nhiều đặc điểm giớng nhau như về hình thái, ví dụ: Pediococcus, Enterococcus,
Lactococcus đều là hình cầu hay Lactobacillus, Carnobacterium là hình que. Do đó,
trong q trình nghiên cứu dễ bị nhầm lẫn giữa các chi nếu chúng ta không tiến
hành khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của mỗi chi để phân biệt sự khác nhau

16


giữa các chi này. Việc khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa có ý nghĩa rất lớn
trong nghiên cứu vi khuẩn lactic bởi việc này giúp công nghệ vi sinh xác định đến
cấp độ chi của loài vi khuẩn lactic thơng qua đặc điểm sinh lý, sinh hóa. Từ đó tạo
điều kiện thuận lợi cho q trình nghiên cứu. Những đặc điểm sinh lý, sinh hóa sử
dụng trong việc phân biệt giữa các chi là: Khảo sát khả năng phát triển ở 10˚C,
45˚C, khả năng chịu hai nồng độ muối 6%, 18%, khả năng chịu pH tại hai giá trị là
4,4; 9,6. Khả năng sinh CO2 từ glucose và khả năng sinh axit lactic [18].
1.4.2. Phân loại các chủng vi khuẩn lactic

Phần sau đây chỉ là một bản tóm tắt phân loại, tập trung vào một sớ lồi
thường gặp trong công nghệ thực phẩm.
1.4.2.1. Enterococcus, Lactococcus, Streptococcus, và Vagococcus
Mặc dù có sự phân tách và hình thành các chi mới nhưng chi Streptococcus
vẫn là một chi lớn và khó phân loại một cách hồn hảo. Chi này được phân thành ba
nhóm: sinh mủ, miệng và liên cầu khuẩn streptococci “khác”. Nhóm sinh mủ có
chứa một sớ tác nhân gây bênh nổi bật như S. pyogenes và S. agalactiae. Một tác
nhân khác là S. pneumonia trước đây thuộc nhóm này nhưng đã được chuyển qua
nhóm miệng. Lồi được ứng dụng trong công nghệ thực phẩm là S. thermophilus,
được sử dụng trong sản xuất sữa chua và một số loại phơ mai. Lồi này được xếp
vào nhóm Streptococcus ở miệng. Khả năng chịu nhiệt cao là đặc điểm nổi bật của
chúng, chúng có thể phát triển ở cả nhiệt độ 52oC [18].
Lactococcus có liên hệ chặt chẽ với cơng nghệ chế biến sữa, đặc biệt là Lc.
lactis. Ba loài của Lc. Lactis có thể được phân biệt: Lc. lactis subsp. lactis, Lc. lactis
subsp. cremoris, và Lc. lactis subsp. hordniae. Chỉ có hai lồi đầu tiên có vai trị
quan trọng trong chế biến sữa. Đặc điểm phân biệt giữa Lactococcus, Enterococcus
và Streptococcus chủ yếu dựa vào khả năng phát triển ở các nhiệt độ khác nhau và
nồng độ NaCl khác nhau. Trong khi các chủng Lactococcus không thể phát triển ở
45oC, NaCl 6,5% và pH 9,6 thì các chủng Enterococcus lại phát triển được trong cả
ba điều kiện trên, khơng có quy luật chung cho nhóm Streptococcus.
Các lồi thuộc chi Vagococcus mới được mô tả dễ bị nhầm lẫn với
Lactococcus, nhưng các chi được phân biệt rõ ràng bởi thành phần axit béo.

17


Enterococcus khơng có vai trị quan trọng trong cơng nghệ thực phẩm. Một sớ
lồi, đặc biệt là E. faecalis là những tác nhân gây bệnh cơ hội, vì thế chúng là những
tác nhân không mong muốn trong thực phẩm. Tuy nhiên hiện nay, các chế phẩm của E.
faecium và E. faecalis được sử dụng như là probiotic. Enterococcus cũng đã được

chứng minh là có mặt trong một sớ loại phơ mai địa phương ở phía nam châu Âu [31].
1.4.2.2. Aerococcus, Pediococcus, và Tetragenococcus
Aerococcus, Pediococcus và Tetragenococcus tạo nên các vi khuẩn lactic dạng
tetrad. Chi Aerococcus hiện nay có năm lồi. Chi này ít được ứng dụng trong cơng
nghệ thực phẩm.
Pediococcus là dạng vi khuẩn lactic lên men đồng hình, chịu axit. Pedicoccus
đóng vai trị rất quan trọng trong cơng nghệ thức phẩm theo cả nghĩa tích cực lẫn
tiêu cực. P.damnosus là một tác nhân chính làm hỏng bia, vì sự phát triển của chúng
có thể dẫn đến sự tạo thành diacetyl và acetone, làm cho bia có vị giớng bơ. P.
acidilactici và P.pentosaceus được sử dụng làm giống nuôi cấy khởi đầu trong sản
xuất xúc xích và ủ thức ăn gia súc [18]. Chúng cịn có vai trị quan trọng trong sự
chín của phơ mai. Các đặc tính chính để phân biệt giữa các loài là các loại đường
lên men, thủy phân arginine,tăng trưởng ở mức pH khác nhau (7,0 và 4,5).
Chi Tetragenococcus trước đây được coi là Pediococcus halophilus. Chúng có
khả năng chịu được nồng độ ḿi cao (18%) và cần nồng độ muối 5% để phát triển.
Đây là đặc điểm để phân loại với các vi khuẩn lactic khác. Chi này có vai trị quan
trọng trong các thực phẩm có hàm lượng ḿi cao như nước tương.
1.4.2.3. Leuconostoc, Oenococcus, và Weissella
Chi Leuconostoc được xem như là vi khuẩn lactic dạng hình cầu, lên men dị
hình, chỉ sản xuất D-lactic từ glucose, không sản xuất ammonia từ arginine. Tuy
nhiên rất dễ nhầm lẫn giữa Leuconostoc với một số vi khuẩn lên men dị hình dạng
cầu – trực. Từ đó có thể dự đốn rằng Ln. paramesenteroides cùng vớimột sớ vi
khuẩn lên men dị hình (ví dụ Lb. confuses và Lb. viridescens.) có thể đại diện cho
một chi mới, kể từ khi nhóm này được tách ra từ cả hai chi leuconostocs và
lactobacilli. Chi này được gọi là Weissella.

18


Weissella gồm các vi khuẩn “giớng như Leuconostoc”, đó chính là các loài

trước đây được xem như Ln. paramesenteroides; Ln. confusus; Ln. viridesens [18].
Chi này vì thế có cả dạng hình cầu và que.
Các nghiên cứu phát sinh lồi cũng tiết lộ rằng Leuconostocs rượu vang còn
được gọi là Ln. oenos, chỉ có họ hàng xa với Leuconostocs khác và rằng lồi này vì
vậy đã được tách ra và tạo thành một chi mới. Chi này được gọi là Oenococcus. Có
thể phân biệt giữa Oenococcus và Leuconostoc khá đơn giản, dựa vào axit cuối
cùng và khả năng chịu cồn, trong khi đó thì việc phân biệt giữa Weissella và
Leuconostoc vẫn là một vấn đề nan giải.
1.4.2.4. Lactobacillus và Carnobacterium
Chi Lactobacillus là chi lớn nhất trong nhóm vi khuẩn lactic. Nó khơng đồng
nhất, các lồi chứa đựng một sớ lượng lớn các đặc tính kiểu hình, tính chất sinh lý,
sinh hóa. Chúng là những vi khuẩn gram dương, catalase âm tính, sinh trưởng trong
điều kiện kỵ khí khơng bắt buộc hoặc vi hiếu khí. Các lồi trong chi Lactobacillus
có thể tiến hành cả lên men lactic đồng hình thơng qua con đường EmbdenMeyerhof hoặc dị hình thơng qua con đường pentose-phosphate. Chúng phát triển
mạnh trong mơi trường có tính axit, tùy loài mà pH dao động từ 4,5 đến 6,4.
Chúng là vi khuẩn rất phổ biến trong tự nhiên, một số lồi được ứng dụng
trong cơng nghệ thực phẩm. Lactobacillus có thể sớng sót trong mơi trường axit
nên thường được dùng trong ủ chua thức ăn và lên men rau quả. Ngồi ra, chúng
cịn được tìm thấy trong khoang miệng, đường tiêu hóa và âm đạo của người và
động vật. Chúng có vai trị quan trọng trong việc duy trì sự ổn định của hệ vi sinh
trong cơ thể, tạo ra những lợi ích sức khỏe cho vật chủ và ức chế một sớ vi sinh
vật gây bệnh khác.
Các lồi thuộc chi Carnobacterium ban đầu được phân loại là nhóm III của chi
Lactobacillus, bao gồm: Lb. divergens, Lb. carnis, và Lb. piscicola. Tuy nhiên các
nghiên cứu sau này đã chỉ ra một sớ tính chất khác biêt so với Lactobacillus là có
khả năng sớng sót ở pH 9,6, thành phần axit béo. Do đó chúng được tách ra và tạo
thành một chi riêng biệt.

19