Nghiên cứu nấm linh chi đa niên, nấm đa niên, các chất có hoạt tính sinh học chính của chúng nhằm góp phần bảo vệ sức khoẻ cộng đồng và tinh sạch chế phẩm TAQ P150254

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỂ TÀI NGHIÊN cứu KHOA HỌC
TRONG ĐIỂM ĐẠI HOC QUỐC GIA HÀ NỘI
“NGHIÊN CỨU NẤM LINH CHI ĐA NIÊN, NẤM ĐA NIÊN,
CÁC CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC CHÍNH CỦA CHÚNG NHẰM
GÓP PHẨN BẢO VỆ SỨC KHOẺ CỘNG ĐỔNG
VÀ TINH SẠCH CHẾ PHẨM TAQ POLYMERAZA TÁI TÓ HỢP s ử
DUNG TRONG CÔNG NGHỆ SINH HỌC ”
Mã số: QGTĐ.03.08
Chủ trì: GS. TSKH. Trịnh Tam Kiệt
ĐAI HOC QUỐC <
TRUNG TẤM : HÒNG
SIA HÀ NỒI
riN ĨHƯVIẾN
ỈNT" / r - ~
7 ) / n ^ /
Ịy 1 / Ly ^
ĩ
Hà Nôi, 2005
Đ
ại hục Qưoc gia ha NỌI
TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SINH HỌC
* * *
_________________
NGHIÊN CỨU NẤM LINH CHI ĐA NIÊN, NẤM ĐA NIÊN,
CÁC CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC CHÍNH CỦA CHÚNG
NHẰM GÓP PHẨN BẢO VỆ sức KHOẺ CỘNG ĐổNG VÀ TINH
SẠCH CHẾ PHẨM TAQ POLYMERAZA TÁI Tổ HỢP s ử DỤNG
TRONG CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Mả số: QGTĐ.03.08
Chủ trì để tài: GS. TSKH. Trịnh Tam Kiệt
Danh sách những người thực hiện chính

STT
Ho và tên
•
Chức vu
•
Cơ quan
1
GS. TSKH. Trinh Tam Kiêt
• •
Chủ trì đề tài
TTCNSH-
ĐHQGHN
2
TS. Dương Văn Hợp
Chủ trì đề tài nhánh
nt
3
GS. TS. Lê Đình Lương
Chủ trì đề tài nhánh
nt
4
TS. Đàm Bạch Dương
Cán bô NC
•
nt
5
CN. Hoàng Văn Vinh Cán bô NC
•
nt
6 CN. Vũ Thị Kim Ngân

Cán bô NC
•
nt
7 Ths. Trần Thi Lan
•
Cán bô NC
•
nt
8 CN. Nguyễn Xuân Hùng
Cán bô NC
•
nt
9
TS. Ngô Anh
Cán bô NC
•
ĐH. Huế
10
PGS. TS. Lê Xuân Thám Cán bô NC
•
TT Sinh hoc
•
phóns xạ
11
Ths. Ta Bích Thuân
• •
Cán bo NC
•
ĐH KHTN
12

Ths. Đoàn Văn Vê
•
Cán bố NC
•
nt
13
CN. Trinh Tam Bảo
•
Cán bô NC
•
nt
HÀ NỘI - 2005
BÁO CÁO TÓM TẮT
1. Tên đề tài: " Nghiên cứu nấm Linh chi đa niên Ị nấm đa niên, các
chất có hoạt tính sinh học chính của chủng nhằm góp phần bảo vệ
sức khoẻ cộng đồng và tình sạch ché phẩm Taq polymeraza tái tổ
hợp sử dụng trong công nghệ sinh học"
Mả số: QGTĐ.03.08
2. Chủ trì đề tài: GS. TSKH. Trịnh Tam Kiệt.
3. Danh sách những người thực hiện chính
STT
Ho và tên
•
Chức vu
•
Co quan
1 GS. TSKH. Trinh Tam Kiêt
• •
Chủ trì đề tài
TĨCNSH -

ĐHQGHN
2
TS. Dương Văn Hợp
Chủ trì đề tài nhánh
nt
3
GS. TS. Lê Đình Lươn2
Chủ trì đề tài nhánh
nt
4
TS. Đàm Bạch Dương
Cán bô NC
•
nt
5
CN. Hoàng Văn Vinh
Cán bô NC
•
nt
6
CN. Vũ Thị Kim Ngân
Cán bô NC
•
nt
7
Ths. Trần Thi Lan
•
Cán bô NC
•
nt

8 CN. Nguyễn Xuân Hùng
Cán bô NC
•
nt
9
TS. Ngô Anh
Cán bồ NC
•
ĐH. Huế
10
PGS. TS. Lê Xuân Thám
Cán bô NC
•
TI' Sinh hoc
•
phón^ xạ
11
Ths. Ta Bích Thuân
• •
Cán bo NC
•
ĐH KHTN
12
Ths. Đoàn Văn Vê
•
Cán bô NC
•
nt
13
CN. Trinh Tam Bảo

Cán bô NC
nt
4. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
4.1. Mục tiêu
- Nghiên cứu định loại một số loài nấm Linh chi đa niên, nấm đa niên quí
dựa trên các đặc điểm hình thái và sinh học phân tử.
. c
• s_/
- Nghiên cứu một số nhóm chất có hoạt tính sinh học chính dược sử dụng
trong việc góp phần tăng cường khả năng miễn dịch và phòns chốnc uns thư.
- Nghiên cứu tinh sạch enzim đặc hiệu Taq polymeraza dùns trong sinh
học phân tử.
4.2. Nội dung
- Nghiên cứu đặc điểm hình thái và sinh học phân tử của một số loài nấm
Linh chi đa niên, nấm đa niên quí và bảo tồn nsuồn sen của chúng trong nuôi
cấy thuần khiết.
- Nghiên cứu một số nhóm chất có hoạt tính sinh học chính và phương
thức chiết xuất hoạt chất quí từ một số loài quan trọng.
- Nghiên cứu khảo nghiệm tác dụng của chế phẩm “nấm đa niên” trong
việc tãng cường khả năng miễn dịch và phòng chống ung thư.
- Nghiên cứu tinh sạch Taq polymeraza tái tổ hợp từ vi khuẩn E. coli dùng
cho phản ứng PCR.
5. Các kết quả đạt được
- Nghiên cứu xác định loài nấm đa niên của Việt Nam thuộc các họ
Ganodermataceae (2 chi, 13 loài); Hymenochaetaceae (2 chi, 23 loài):
Coriolaceae ( 7 chi, 15 loài). Các đặc điểm hình thái và hiển vi của một số loài
quan trọng đã được mô tả.
- Xác định được quy trình tách chiết ADN từ nấm Linh chi đơn niên. Đã
nghiên cứu sử dụng enzyme giới hạn cắt gen Mn SOD để phân loại và nhận dạng
nấm linh chi đơn niên và nấm linh chi đa niên Gau.

- Đã nghiên cứu sự mọc và sự hình thành quả thê của 5 chủng nấm đa
niên Toh, El, Hl, Gs và Cl. Sự hình thành bảo tử vô tính cũng như quả thê của
các chủng trên đã được mô tả.
- Các nhóm chất có hoạt tính sinh học chính của các chủng El. Toh. Hl,
• • 7
Cl, NI đã được nghiên cứu bằns các phương pháp sắc kí cho thấy chúna rất giàu
các chất có hoạt tính sinh học.
- Tất các các dịch chiết của 5 chủng nấm đa niên cũng như hỗn họp của
chúng không gây độc đối với các dòng tế bào đẫ thử nghiệm. Sau khi được xử lí
với dịch chiết nước và cồn đã quan sát thấy sự ức chế quá trình tăn 2 sinh của tế
2
bào ung thư phụ thuộc vào nồng độ. Việc ứng dụng dịch chiết nấm cho các bệnh
nhân tự nguyện bước đầu đã cho kết quả khả quan.
- Đã xây dựng được quy trình lách và tinh sạch Protein tái tổ hợp Taq
polymeraza. Chế phẩm thu được đạt hoạt tính 1.5 - 2\xỊ ịil. Chế phẩm trên đã
cung cấp cho một số phòng thí nghiệm sinh học phán tử để thay thế chế phẩm
nhập ngoại.
- Góp phần đào tạo 1 nghiên cứu sinh và 1 cử nhân khoa học tài năn2 theo
hướng nghiên cứu của đề tài.
- Đã có 01 báo cáo tại hội nghị quốc tế, 03 báo cáo tại hội nghị quốc 2Ĩa
và 06 bài báo đăng trên các tạp chí chuyên ngành.
6. Tình hình kinh phí
- Kinh phí được cấp: 300 triệu đổng.
- Kinh phí đã sử dụng: 300 triệu đồng.
TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SINH HỌC
ăn Hợp
GS. TSKH. Trịnh Tam Kiệt
cơ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI
Đại học Quốc gia Hà Nội
SUMMARY

1. The title project:
Study of perennial Ganoderma, polypores mushroom, their main
bioactive compounds for health protection and pufification recombinant Taq
polymerase for biotechnological research.
Code number: QGTĐ.03.08
2. Prject Coordinator: Prof. Dr. Sc. Trinh tarn kiet
3. Project members:
- Prof. Dr. Sc. Trinh Tam Kiet - Center of Biotechnology. VNU
- Dr. Duong Van Hop - Center of Biotechnology, VNU
- Prof. Dr. Le Dinh Luong - Center of Biotechnology. VNU
- Dr. Dam Bach Duong - Center of Biotechnology, VNƯ
- BA. Hoang Van Vinh - Center of Biotechnology, VNU
- BA. Nguyen Thi Kim Ngan - Center of Biotechnology, VNƯ
- BA. Trinh Thi Tam Bao - Center of Biotechnology, VNƯ
- BA. Nguyen Xuan Hung - Center of Biotechnology, VNU
- MSC. Tran Thi Lan - Center of Biotechnology, VNU
- MSC. Doan Van Ve - College of Science, VNU
- MSC. Ta Bich Thuan - College of Science, VNU
- Dr. Le Xuan Tham - Center of Radio biotechnology.
4. The objectives and research contents
4.1. The objectives
- Research and identifycation the perennial Ganoderma, polypores
mushroom base on morphological and molecular characteristica.
- Research on main bioactive compounds for health protection
(stimulation immune system and antitumor).
- Pufification recombinant Taq polymerase for biotechnological research.
4.2. The research contents
- Research and identifycation the perennial Ganoderma, polypores
mushroom base on morphological and molecular characteristica and maintaining
the strains on culture collection.

- Research on main bioactive compounds and method to exstract the main
bioactive compounds from some important specices.
- Study using the abouv exstractions to stimulation immune system and
antitumor traitement.
- Pufification recombinant Taq polymerase for PRC reaction.
5. Main results
- There are about 51 specices of the perennial Ganoderma. polypores
mushroom had been found (Ganodermataceae - 2 genus. 13 species
Hymenochaetaceae - 2 genus, 23 species, Coriolaceae - 7 eenus. 15 species).
- The morphological and micropic characteristica of some importan
species are discribed and maintaining the strains on culture collection.
- Finding the method to extraction DNA of anual Linzi and identification
Ganoderma using PCR - RFLP analysis of Mn SOD gene.
- The growing and fruiting of the perenial linzhi and polypores strains
Toh, El, HI, Gs and c were studied on Agar medium and Substrat.
- The main bioaactive compounds of the strains El,Toh, HI, N1. Cl were
identificative by chromatography methods: MS, HPLC, TLC.
- All extracts and their mixtures do not exhibit cytotoxic effect against the
tested cell lines. Upon treatement with ethanolic and aqueous extracts, a
concentration-dependent inhibition of cell proliferation was abserved. The
exstractions were using to treatement of the free willing patients and give the
good results.
- The Taq polymerase for PRC was on pufificated exstract and have
activity about 1.5 - 2ji/ |il. This product was using in some molecular
laboratorium in Vietnam.
- Six papers have been published and two presentations on National
congress and one in Japan.
- Two graduate students is being under the research direction of the
project.
Cei^ter'ofiBiot^chnologv, VNU

/ T Director
IKl.Jh’C : i/f, \
CON
5 IN
long Van Hop
Project implementing organization
Vietnam National University, Hanoi
Prof. Dr. Sc. Trinh Tam Kiet
5
Số lượng các loài nấm đã được định danh là 80060 loài (Từ điển nám.
Kirk et al, 2001). Trong đó , sô lượng loài nấm lớn (Marcro fun21) có quả thê
nhìn thấy bằng mắt thường khoảng 14 nghìn loài và có thể lên tới 22 nshìn loài
(Hawkworth, 2001) trong đó, khoảng 50% các loài có thể ãn được bỏ'i các mức
độ khác nhau, hơn 2000 loài an toàn (cả các hợp chất tron2 tế bào và các hợp
chất trao đổi thứ cấp đều có tính sinh kháng nguyên yếu và khôn2 gây phản ứng
phụ ) và khoảng 700 loài được cho rằng có các đặc tính dược liệu. Các số liệu
hiện có cho thấy nấm lớn là nguồn tài nguyên vô tận ẩn chứa các hợp chất có
trọng lượng phân tử lớn như: Polysaccharide, Polaccharide- Protein và đặc biệt
giàu các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp có trọng lượng phân tử nhỏ hơn.ít nhất
có 651 loài và 7 dưới loài thuộc 182 chi của các Nấm có đảm đa bào
(Heterobasidiomycetes) và Nấm có đảm đơn bào (Holobasidiomycetes) chứa các
Polysaccharide có tác dụng dược liệu (Reshetnikov et al., 2001). Chú ne hầu hết
là các Glucan với nhiều loài liên kết Glycoside khác nhau như p-1 ->3, p -l->6 và
p - l->3) nhưng một số thực sự là Hecteroglucan. Một số polysaccharide liên kết
với các gốc protein như phức hợp PSP (Krestin) chiết suất từ nấm Vân chi
(Ttrametes versicolor). Các chất này có tác dụng chủ yếu chống ung thư, nhưng
nằm trong vách tế bào nấm, thường che lấp bởi thành phần chính của nấm là
kitin. Bên cạnh đó, từ nấm lớn hàng trăm các chất có hoạt tính sinh học có trọn 2
lượng phân tử nhỏ hơn cũng đa được tách chiết, sàng lọc, nshiên cứu cấu trúc
cũng như hoạt tính sinh học của chúng. Trước hết phải kể đến các Terpenoit như

ganoderic axit, lucideric axit, ganoderiol, ganodermodiol từ các loài Ganoderma
cũng như các lanostal, sterol, phenol từ hàng loạt các loài nấm lớn khác.
Hoạt tính chống ung thư, điều hòa hệ miễn dịch, antioxydan, chống viêm
nhiễm, chống virus, vi khuẩn, nấm; làm giảm lượng choresterol. mỡ. đường
trong máu cũng được nghiên cứu tích cực tại nhiều nước có nền công nshiệp
phát triển [8, 10, 14, 15, 16, 17].
Những nghiên cún về thành phần loài nấm lớn của Việt Nam đã được
Trịnh Tam Kiệt và các tác giả khác tiến hành [1, 2, 4, 11, 18, 19] và thống kê
toàn bộ vao năm 2001 [3], bao gồm khoảng 1200 loài trong tổng số 2250 loài
nấm được định tên khoa học . Trong đó có một số loài được ghi nhận là có tác
I. Mơ ĐẢƯ
dụng dược liệu nhưng chưa chỉ ra các đặc điểm sinh học cũne như tác dụnơ dược
học của chúng. Một số chủng nấm dược liệu khác như Linh chi, Vân chi. Nấm
đầu khỉ, Nấm lỗ cũng được nhập nội và nuôi trồng thử nghiệm ở một số cơ sở
nghiên cứu và nuôi trồng nấm của Việt Nam. Một số sản phẩm nấm như linh chi
khô nguyên cái hoặc cắt lát, bột nấm, chè linh chi cũng được sản xuất thử
nghiệm và cung ứng cho người tiêu dùng. Tuy nhiên, những nghiên cứu kỹ lưỡng
hơn về thành phần loài, sự phân bố, trữ lượng, khả năng đưa vào nuôi trồng các
loài nấm dược liệu mọc tự nhiên của Việt Nam cũn° như xác định chất lươn.2 và
• • • • • c • • c
tác dụng dược lí còn chưa được làm sáng tỏ.
Trong khuôn khổ dự án hợp tác với CHLB Đức: Nghiên cứa các chơi có
ỉìoat tính sinh học ở Việt Nam. Các chất có hoạt tính sinh học chính của £ần 100
• • • • •
loài nấm lớn đã được nghiên cứu, hơn 50 chất đã được xác định tới cấu trúc phân
tử, trong đó có khoảng 30 chất có cấu trúc mới cho khoa học đã được mò tả [14]
. Một số chất có hoạt tính cao, kìm hãm sự hoạt động của tế bào ung thư, tăn2,
khả nãng miễn dịch của cơ thể, kháng các vi sinh vật gây bệnh, chống viêm có
khả năng ứng dụns lớn trong dược phẩm, mỹ phẩm [12]. Đặc biệt gần đây “Cổ
linh chi” (thưc ra chính xác hơn lànấm linh chi đa niên và nấm đa niên) đã được

đặc biệt lưu ý.
ADN polymeraza là enzim xúc tác cho phản ứng nhân sen PCR
(Polymerase Chain Reaction) hay là phản ứng trùng hợp chuỗi nucleotit (chiều
5’-3’) theo nguyên tắc bổ sung so với sợi ADN khuôn (template) khi có mặt các
cặp mồi. Kỹ thuật PCR là kỹ thuật rất quan trọng cho sinh học phân tử. Phản ứns
PCR không chỉ đơn giản là nhân dòng gen nghiên cứu mà còn được phát triển ra
nhiều kỹ thuật khác nhau trong nghiên cứu cơ bản và ứng dụng trong mọi lĩnh
vực Nông Sinh Y như RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA), AFLP
(Amplified Fragment Length Polymorphism) RT-PCR (Reverse Transcription -
Polymerase Chain Reaction) AP-PCR (Arbitrarily primed - Polymerase Chain
Reaction), PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment
Length Polymorphism) và các kỹ thuật finger printing khác như: SSR (Single
Sequence Repeat), minisatelite. Trong kỹ thuật di truyền kỹ thuật PCR được
dùng trong cải biến een như tạo các đột biến điểm, tạo các đầu nối (adaptor) để
gắn các đoạn gen với nhau. Tronơ lĩnh vực nchiên cứu ứng dụng phải kể đến
hàng loạt các loại kit PCR và RT-PCR nhằm chẩn đoán nhanh các bệnh vi
khuẩn, vi rút, bệnh di truyền cho người, động vật, tôm cá và thực vật vv
Rõ ràng phản ứng PCR có ứng dụng rộng lớn nhưna yêu cầu tiên quyết của
phản ứng là tính đặc hiệu (hay độ chính xác) cao. Đây là yêu cầu bắt buộc cho
mọi enzim ADN polymeraza dùng cho phản ứng PCR ở nhiệt độ cao, tại đó đoạn
mồi (primer) bám đặc hiệu vào đúng sợi khuôn. Đến nay đã có rất nhiều các
nghiên cứu đề cập đến đặc tính này của các loại ADN polymeraza có nguồn gốc
từ vi sinh vật ưa nhiệt như Sulfolohiis.soifuiaricns. Bacillus slcì ioỉỉtcrphilus.
Thenmis aquaticus, Thermits íhcrììĩoplìilus hav Pyrococus fumaricus. Tuy nhiên,
cho đến nay trên thực tế. enzim phổ hiến và chủ yếu nhất là ADN polymeraza
được tinh sạch trực tiếp (native) hoặc sản xuất theo con đường tái tổ hợp
(recombinant) từ gen ADN polymeraza của vi khuẩn Thenmis aquaticus. Một
enzim khác ít được dùng tại một số phòng thí nghiệm trên thế giới cũng đang
được lưu hành trên thị trường là ADN polymeraza sản xuất từ vi khuẩn
Pyrococcus furiosus có tên thương mại là pfu. Tính phổ biến của enzim ADN

polymeraza của Thermits aquaticus tronơ mọi nghiên cứu sinh học phân tử có
thể được giải thích bởi các đặc tính ưu việt như: enzim có hoạt tính cao và bền
nhiệt hơn các enzim ADN polymeraza khác, enzim ADN polymeraza này có khả
năng nhân gen với cả các cặp mồi đặc hiệu (specific primers) và mồi vạn nâng
(degenerate primers). Điều này có ý nshĩa rất quan trọng cho việc tách dòng gen
bằng kỹ thuật PCR dựa vào chuỗi axit amin đã biết của protein nshiên cứu.
Ngoài ra, nhiều nghiên cứu đã chứng minh được vai trò của enzim nói trên xúc
tác cho phản ứng giải trình tự ADN (sequencing) và sao chép ngược ADN từ sợi
khuôn ARN mà không một enzim ADN polymeraza nào có được.
Vì vậy việc nghiên cứu tích cực thành phần loài , định loại và mô tả các
đặc điểm sinh học của chúng trong thiên nhiên cũng như phân lập thuân khiết dể
bảo tồn nguồn gen, bước đầu định loại chúng bằng sinh học phân tử, nshiên cứu
trong môi trường nuôi cấy, xác định các nhóm chất chất có hoạt tính sinh học
chính của một số loài nấm quan trọng, khảo nghiệm việc sử dụng quả thể của
các loài này trong “liệu pháp nấm đa niên” và nghiên cứu sản xuất chế phẩm Taq
ADN polymeraza thay thế sản phẩm nhập ngoại có nghĩa khoa học va thực tiễn
8
II. KẾT QUẢ NGHIÊN cứu
Lào Cai Sapa, Lai Châu, Sơn La, Yên Bái, Tam Đảo, Ba Vì. Cúc Phươne.
Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình. Thừa Thiên Huế, Đà Nẵng,
KonTum, Đắc Lắc, Đắc Nông. Tổng số mẫu thu được khoảng 500 mẫu.
+ Các mẫu vật trên đã được xử lý, sấy khô và bảo quản tại Bảo tàng Nấm
Trung tâm Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội.
2.2. Nghiên cứu thành phần loài, định loại và mô tả các loài quan trọng của
Việt Nam
+ Nghiên cứu đặc điểm hình thái quả thể, sợi, bào tử dưới kính hiển vi
quang học và kính hiển vi điện tử quét của khoảng 15 chủng.
+ Bước đầu định loại và mô tả các loài thường gặp. Các số liệu nghiên cứu
cho thấy tập đoàn nấm cổ linh chi và nấm Đa niên chủ yếu của Việt Nam khá
phong phú:

* Thànlì phần loài nấm đa niên đã ghi nhận được tại Việt Nam
(Theo Ainsworth & Bisby’: “Dictionary of the Funsi” 1995 va Trinh Tam
Kiet va cac tac gia khac: “Checklist of plant species of Vietnam”. Fungi p.51 -
393,2001).
Ngành Basidiomycota
Lóp Basidiomycetes
Dưới lóp Holobasidiomycetidae
Bộ Ganodermatales
Họ Ganodermataceae ( Donk) Donk, 1948
Chi Ganodenna Karst., 1881
Dưới chi Elfvingia (12 species)
1. Gatwderma annulare (Fr.) Gilbn.
2. G. appỉanơtum (Pers.) Pat
9
3. G. austraỉe (Fr.) Pat.
4. G. cf. brow nil (Murr.) Gilbn.
5. G. gibbosum (Blume & Nees, Fr.) Pat.
6. G. lobatlim (Schw.) Atk.
7. G. oroflavum (Lloyd) Humph.
8. G. philippii (Bres & Henn.) Bres.
9. G. tornatum (Pers.) Bres.
10.Ơ. cf. Triangulum Zhao & Xu
11. G. cf. ungulatum Zhao & Zhang
12. Ganoderma sp. 1
13.Ganoderma sp.2
Chi Tomophagus Murr 1905
1. Tomophagus collossus Murr.
BỘ Hymenochaetales
Họ Hymenochaetaceae Imazeki & Toki, 1954
Chi Phellinus Quell., 1886 (22 species)

1. Phellinus adamantiiuis (Berk.) Ryv.
2. Ph. bambusinus (Pat.) Pat.
3. Pil. cf. conchatus (Pers.: Fr.) Pat.
4. Ph. contignus (Pers.: Fr) Pat.
5. Ph. extensus (Lev.) Pat.
6. Ph. fastuosus (Lev.) Ryv.
7. Ph. gilvus (Schw.: Fr.) Pat.
8. Ph. hartigii (Allesch. et Schnabl.) Pat.
9. Ph. igniarius (L.: Fr.) Quel.
10. Ph. lamaensis (Murr.) Pat.
11. Ph. linteus (Berk, et Curt.) Teng
12. Ph. niighenensis (Mont.) Cunn.
13. Ph. noxinus (Corner) Cunn.
14. Ph. pachvphloeus (Pat.) Pat.
15. Ph. pectinatus (Klotzsch) Quel.
16. Ph. pini (Brot.: Fr.) Ames
17. Ph. puỉìns (Berl. et Mont.) Ryv.
18. Ph. rimosus (Berk.) Pilat
19. Ph. robustus (Karst.) Bourd. et Galz.
20. Ph. senex (Nees et Mont.) Imaz.
21. Ph. setulosus (Lloyd) Imaz.
22. Ph. tonilosus (Pers.) Bourd. et Galz.
Chi Phylloporia Murrill, 1904
1 .Phylloporia ribis ( Schumach.:Fr.) Ryvarden
BỘ Poriales
Họ Coriolaceae (Imazeki) Singer, 1961
Chi Nigrofomes Murrill, 1904 (1 species)
1. Nigrofomes melanoporus (Mont.)Murrr.
Chi Lariciofomes Kotl. & Pouzar, 1957 (1 species)
1. Lariciofomes officinalis (Vill.: Fr.) Kotl. & Pouz.

Chi Fomitopsis p.Karst., 1881(4 species)
1. Fomitopsispinicola (Svv.:Fr.)P.Karst.
-Ungulina marginata(Pers.:Fr.)Pat.
2. Fomitopsis rhodophaeus (Lev.)Imaz.
3. Fomitopsis dochimus (Berk.& Br.) Ryv.
4. Fomitopsis carneus Blume &Nees)Imaz.
Chi Pereniporia Murrill. 1942 (4 species)
1. Perenipoha meduỉỉa-panis (Jacq.:Fr.)Donk
11
2. p.martius (Berk.)Ryv.
3. P. cf. Latisima (Berk.)Ryv.
4. Pereniporia sp.
Chi Pyrofomes Kotl. & Pouzar, 1964 (1 species)
1. Pyrofomes aỉbomarginatus (Lev.) Rvv.
Chi Rigidoporus Murrill, 1905 (3 species)
1. Rigidoporus lineatus (Pers.) Ryv.
2. R. microporus{Yĩ.) Overeem.
3. R. v//7c/ws(Berk.) Ryv.
Chi Wolfiporia Ryvarden &Gilb., 1984(1 species)
1. Wolfiporia cocos (Schw.)Ryv.&Gilb
Qua bản danh lục các loài nấm đa niên đã 2ặp ỏ' trên, chúng ta thấy các loài
nấm thuộc chi Pheỉlinus chiếm ưu hế rõ rệt, khoảng, 50% số loài đã đưoc chi
• • » *,
__
,
nhận, sau đó đến các đại diện của họ Ganodermataceae và Poriaceae với số
lượng loài gần tương đương như nhau, khoảng trên dưới 10 loài.
Cũng tương tự như vậy, khi xem xét về đa dạne bộ ta thấy ưu thể rõ rệt
thuộc về Hymenochaetales, sau đó mới tới Ganodermatales và Poriales.
về đa dạng chi, ta thấy nổi bật ưu thế ưu thể tuyệt đối trons các nấm đa

niên của Việt Nam thuộc về Pheìỉinus, sau đó tới Ganoderma thuộc dưó'i chi
• • S •
Elfvingia đóne vai trò quan trọng. Các chi Fomitopsis và Pereniporia đóns vai
trò trung bình. Một số chi chỉ có mọt loài được ahi nhận như Nigrofomes,
Laricifomes, Tomophagus, Wolfiporia,
Nhằm bảo tồn nguồn gen nấm, các quả thể tươi đã được phân lập sơ bộ tại
hiện trường và phân lập thuần khiết tại phòng thí nghiệm. Các chủns giống gốc
Nấm được lưu trữ tại Bảo tàng Giống Gốc Nấm, Trung tâm CNSH, Đại học Quốc
gia Hà Nội (30 chủng).
2.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử
Bên cạnh việc sử dụng các phương pháp nghiên cứu hình thái giải phẫu,
nghiên cứu các đặc điểm hiển vi quane học cũns như điện tử. việc thăm dò định
12
loại linh chi đa niên cũng bước đầu được tiến hành tại phòng di truyền và sinh
học phân tử do GS. Lê Đình Lương chủ trì. Các kết quả ban đầu thu nhận được
cho thấy :
+ ơ các loài Linh chi đơn niên : Xác lập được quv trình tách chiết ADN
từ nấm Linh chi đơn niên. Có thể tóm tắt như sau: ủ 0.1 2 mẫu nấm với 1 ml
dịch chiêt (Tris 100 mM pH 8, EDTA 50 mM, SDS 1%) ở 65°c trong 30 phút;
thêm 200 |Lil kali axetat 5M, ủ đá 20 phút; ly tâm thu dịch nổi; kết tủa ADN bằns
một thể tích isopropanol; rửa kết tủa hai lần bằng etanol 70%; làm khô và hòa
tan ADN trong 30|J.1 nước MiliQ.
+ Ở các loài Linh chi đa niên : phươne pháp tách chiết ADN áp dụns
cho nấm Linh chi đơn niên không phù hợp với nấm Linh chi đa niên: sản phẩm
tách chiết chỉ có ARN, không thu được ADN.
Để khắc phục khó khăn trên, nhằm phân loại và nhận dạng 2 loài trong chi
Ganodenna bằng kỹ thuật PCR- RFLP đối với đoạn gen Mn SOD đã được nhán
bản dựa trên những n°hiên cứu trước đây của chúng tôi:
* Phương pháp nghiên cứu:
- ADN được tách chiết từ các mẫu theo Nguyễn Thị Kim Duns và Lê Đình

Lương, có cải tiến [IX].
- PCR với mồi đặc hiệu cho gen Mn SOD của G.lucidum và G.australe là
FGaul và RGau2. Trình tự của cặp mồi này do Nguyễn Hoài Giang, Nguyễn
Xuân Hùng, Lê Đình Lương thiết kế [XI] có trình tự như sau:
FGaul: 5’- GA A GCA CCA CCA GAC CTA CGT C- 3’
RGau2: 5’- AGA CGT CGA CGC CGA TGA TGG- 3’
- Cắt sản phẩm PCR bằng 11 enzym giới hạn với đệm phù hợp, ở 37°c trong 5
giờ [XII].
- Điện di kiểm tra sản phẩm PCR và cắt enzym giới hạn trên gel polyacrylamid
6% và nhuộm bạc[XII].
* Kết quả nghiên cứu:
a. Nhân dang G.australe:
13
Với tất cả các enzym sử dụng, Gau luôn tạo ra số lượng và kích thước các
đoạn cắt giới hạn khác so với 3 mẫu thuộc G.ìucidum do đó G.ausĩraỉe có thế
được phân biệt rất rõ bởi tất cả các ezyme sử dụng(Bảnơ 1). Trong đó. có hiệu
quả nhất là enzym Seal, Fspl, Pstl vì 3 enzym này chỉ cắt đặc hiệu đối với nó.
Seal chỉ cắt Gau , tạo ra 2 băng đều có kích thước khoảng 375bp; Fsp\ tạo ra 2
băng có kích thước 600 và 150 bp; còn Pstl tạo ra 2 băng có kích thước 650 và
lOObp. Tiếp theo có thể dùng Aval, Avail và Prill và chúng đều tao ra. các đoan
ADN ở Gau khác xa so với Gll, G12 và HQ.
b.Nhân dang G.lucidum và các dưói loài của nổ:
G.ỉucidum có thể được nhận dạng dựa trên kiểu cắt đặc trưng bởi các
enzym Pvul, Aval, Avail, Mnỉ I, Hha I, Alul, Sa ch EcoRl như thể hiện trong
Bảng. 1.
G12 có thể được phân biệt với Gll và HQ bởi sự khác biệt trong kích
thước các đoạn cắt được tạo ra, đặc biệt sự khác biệt này khá rõ ở Hìial, Mnll,
Pvul và Aval. G12 rất có thể là dị hợp tử đối với locus Mn SOD nên cho hai băn2
sản phẩm PCR có kích thước khoảng 700 và 720 bp, do đó khi cắt bởi các ezyme
giới hạn tạo ra nhiều băng có tổng kích thước khoảng 1200bp.

HQ có quan hệ gẫn gũi nhất với Gll do số lượng và kích thước các đoạn
cắt giới hạn của chúng rất giống nhau đối với đa số enzym. Như vậy có thể xếp
HQ vào một dưới loài của G.lucidum rất gần với Gll. Tuy nhiên, HQ cũng có thể
được phân biệt với Gll bởi kiểu cắt của enzym Avail. Gll chỉ cho 2 bang : 440
và 220 bp, còn HQ cho 4 băng: 440, 320, 220 và 115 bp. Điều này có thê được
giải thích do HQ cũng là dị hợp tử đối với locus này, trong đó 1 alen có 1 điểm
cắt (tạo 2 băng 440 và 220 bp giống với Gll) còn 1 alen có 2 điểm cắt cho Avail
(tạo 3 băng 320, 220 và 115 bp). Ava\\ cắt đoạn ADN của G12 cũng tương tự như
của HQ.
14
Fsp\ Sea I
Pst I
PCR
Gau HQ GI1 GI2 Gau HQ GI1 GI2 Gau HQ GỈ1 GI2 Mr Gau HQ GI1 GỈ2
700
600
500
400
300
Aval A v a \ \ \
M n l \
P v u \
Gau HQ GI1 GI2 Gau HQ GI1 GI2 Gau HQ GI1 GI2 Gau HQ GI1 GI2 Mr
•>»
m i.
£ h r "M S * *- ĩ ể k é :
Mi ss
500
400
300

j52|,
«g» -:r r ^ <m + jMto .
~ w 3 *
« a * V S + m 4 1 » £ g j | 4 * « »
. V «*v'
H i l l
iH
,v * ♦♦
9& Iter
■ *v S t-
20 0
175
150
125
100
75
y*/ơl
Sacl
EcoRI Hhal
Gau HQ G11 GI2 Gau HQ GI1 GI2 Gau HQ Gil GI2 Gau HQ GI1 GỈ2 Mr
m* . “ SB .5
V * A f Z
m
V* . ^ * I f ’g J
• liu I
" *-'■ 'f Ess - ỵ y t
imm ỂỒ •*» *w* irife M Ip
• • • V * V
M rt» - i^ L ' •"
,5^ ■«*?»>■ '<w«

v l£* ; - < - ■'•
.> '.At**
. ' i ; i ' " . * w »
-i* V *
22» #•# ^v: -
SSP &*r\
***}«# .v-**
'im r* '
*& ỊH* ■*** «*t»
'■■•■• • » ' '"'.
^ tiniil »rt»"
500
400
300
«** «4»-
***■*-
Sản phẩin PCR (PCR) với cặp mồi FGaul và RGau2 và cắt enzym giói hạn
Chú thích: Mr: Thang ADN chuẩn (25/100 ladder - Bioneer)
15
Bảng 1. Các đoạn giới hạn (bp) dược tạo ra khi cát đoạn gen Mn SOD cùa các mảu
Ganoderma bởi các enzvm giói hạn
TT
Tên
Enzym
Gau HQ
GI1 ! GI2
Số
Băng
Kích thước
băng(bp)

Số
băng
Kích thưóc
băng (bp)
sỏ'
băng
Kích thước
băng (bp)
Số
băng
Kích thước
băng (bp)
0
PCR*
1
750 1
690 1 690
2<2>
720+700
1
Pst\
2
650+100 1
690
(không cát)
1
690
(khòng cắt)
2(2)
720+700

(không cắt)
2
Seal
-Ị(1)
375 1
690
(không cát)
1
690
(không cắt)
2^2)
720+700
(không cắt)
3
Fsp\
2
600+150 1
690
(không cắt)
1
690
(không cắt)
2(2)
720+700
(không cắt)
4.
AvaU
2
710+630
4(2)

450+320+
220+120
2 450+220
4<2)
470+320+
240+120(2) -
_______________________________________________]
5.
Ava\[3)
2
570+130 1
630 1 630
2<2)
680+660
6.
Pvu l(3)
o
400+390+300 3
310+290+
110
3(4)
310+290
110
3(2:
310+300+
110
7
Mn/I(3)
5
250+175+

130+105+
100
2
250+120+
90+70
2
250+120+
90+70
0(2)
260+140+
132+127+
120+115+
90+85

—

-
8
Hha l<3>
6
250+160+
115+110+
90+80
4
200+150+
110+70
4
200-1-150+
110+70
8<2)

200+175+
150+130+
120+115+
50+70

1
9 Alu\
2
560+190
2
500+165
2
500+165
4(2)
520+510+
180+170
10
Sac I
2
560+190
2
500+165 2
500+165
4(2)
520+510+ Ị
180+170
- 1
11
EcoR\
2

620+130
2
560+130
2
560+130
3(2)
590+570+
130
Chú thích: *: Sản phẩm PCR với cặp mồi FGaul và RGau2
(1): tạo thành 2 băng cùng kích thước 375 bp
(2): có thể giải thích sự tạo nhiều băng do các mẫu là dị hợp tử đối với locus Mn
SOD.
(3):bảng chỉ liệt kê các đoạn ADN nhìn thấy trên bản gel. Những đoạn còn lại
quá nhỏ ( dươi 70bp) không thể thấy được trên bản gel do nồng độ gel 6% khống phù hợp.
(4)'do nồng độ ADN cao nên enzym chưa cắt hoàn toàn đã bị mất hoạt tính
16
- ơ chủng Toh (Tomophagus), phát triển sợi dạng bône mau xám và rất
mềm. Khi hầu hết hệ sợi đã chuyền sang giai đoạn trưởns thành, chime ta cỏ thê
quan sát thấy sự tào thành bào tử vách dày, hay còn gọi la hâu bào tư
1 - - • •
(chlamydospore) với những kiêu hoa văn điên hình. Đặc biệt, trons điều kiện tối
ưu, chủng này có thê hình thành qua thê chín với nhiều lồ tươna đôi lớn. Trên
bào tầng, ta có thể tìm thấy nhiều bào tứ đảm điên hình cua loài với kích thước
trong khoang 15-18 jam. Dưới kính hiển vi điên tử quét (SEM), ta quan sát
được nhừng bào tử đã nảy mầm và cấu trúc hoa văn dạng mạng.
ổ£.
■i'
í
Bào tử của Tomophagus và Pereniporìa trong nuôi cấv thuán khiết.
- ơ chủng E1 (Ganoderma sp.), hệ sợi đôi màu từ trăne sane \ ànLL sau

một thời sian. Các sợi eắn với nhau rất chặt. Trên bề mặt cấu trúc soi quan sát
• ^ ✓ • • • I
thấy nhiều eiọt nước. Trên bề mặt có nhiều nếp nhăn và vết nứt.
- ơ chủng P1 (Pereniporia sp.), hệ sợi ban đầu màu trăna. sau đó chuyên
thành màu X m đen. Khi quan sát dưới kính hiển vi ta thấy sợi nám \ ói bào tư
vách dày điển hình khôns có hoa văn. Trons điều kiện tối ưu, chung, này có thẻ
hình thành mầm môn2 quá thể (primordium).
- Ò chủng HI (.Pheỉỉỉnus), hệ sợi ban đằu cũn2, có màu trăna dạnii bôna.
sau đó chuyến sang vàng. Đặc biệt, sợi nấm có thê leo men theo thành bình tam
giác (Erlenmeyer flask), đạt tới độ cao 3-5(-7) cm và đôi khi còn chạm nút hỏng.
Khi quan sát dưới kính hiển vi, hầu hết cấu trúc sợi là sợi nấm dạng lông cứng.
Dưới nhùng điều kiện tối ưu, chủng nàv có thẻ hình thành qua thê bât thụ dạng
^ Đạc biẹt ơ chung P1 có hình thành hậu bào tử, đầu tiên màu xám sau
chuyen sang mau đen, gây ân tượng như nuôi cấy bị nhiễm. Bào tử hữu tính
hình trái xoan điển hình, đạt kích thước
Trong cac chung nuôi cây, chỉ có P1 hình thành quả thể dạng 2Ờ nổi. dạng
ban cau co chia thuy ít nhiêu, đâu tiên màu trăng sau chuyển sans màu vàng,
kích thươc5 -12 cm. Trên quả thê hình thành ông rộng, kích thước 2-3 èns tronơ
1 mm . Khi quan sát dưới kính hiên vi, các đảm bào tử điển hình được hình
thành, kích thước dạt 15-18 |am. Dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM), thấy rõ
lỗ nảy mầm và trang trí dạng mạng lưới rộne.
m * * *
* t ; ■
* , e ỵ • ị
i f * " 1 » *
Sự hình thành quả thể của Phelìinus
* Sự mọc và sự hình thành của các chủng nấm khi nuôi cấy trên giá
thể mùn cưa
Mùn cưa gỗ bồ đề đã có bổ sung dinh dưỡng được sử dụng để nghiên cứu
sự mọc và sự hình thành quả thể của các chủng nấm nói trên.

Trons tối, cả bốn chủng đều mọc tốt trên giá thể, hình thành sợi nấm màu
trắng, đạt tốc độ từ 200 I^m - 300 Ịim.
Khi hệ sợi đã lan kín eiá thể, được chuyển ra sána để Iì2hiên cứu sự mọc
trong điều kiện nhiệt độ phòng.
Qua đó ta thấy :
Chủne HI chỉ hình thành mô sẹo mà chưa hình thành quả thể thành
thục.
19
Chủng P1 hình thành quả thê phối thai màu trắng xám. sau đó hình
thành lỗ màu hồng thịt nhưng chưa hình thành quả thể thành thục.
Chủng Toh hình thành quả thể màu vàng và nếu chăm súc tốt sẽ cho
quả thể thành thục với mặt mũ đầu tiên màu vàng sáng sau chuyên thành vàns
đạm, nhẵn bóng tương tự màu sắc quả thể ngoài tư nhiên. Phía dưới hình thành
ống nấm điển hình 2-3 ông trong 1 mm.Trên lớp bào tầng hình thàn bào tử nấm
thành thục. Thời gian hình thành quả thể thành thục tron2 điều kiên thuân lợi
40 ;60 ngày.
Chủng E1 phát triển tạo thành quả thể thành thục, hình thành ốna
nấm điển hình màu trắng và bào tử giá điển hình.Thời gian hình thành quả thể
thành thục dài tới 120-140 ngày.
V — ./ •
* -yv -'*' **
fclWWl1* *» -N, *■
*
m B z w - *•> '
>V':^ v ;1- '
Sự hình thành quả thể của Ganodenna
Sự hình thành quả thể của Tonnorphagus
20
Cũng như trên môi trường thạch khoai tây, sự mọc và hình thành quà thể
của các chủng nấm lồ nhiều năm trên giá thể mùn cưa cũng bị ảnh hườne bởi

nhiều nhân tố môi trường, lấy ví dụ như ánh sáne. chế độ khí, nhiệt độ. đô ẩm và
' • • •
điều kiện dinh dưỡng. Trong số đỏ, ánh sáng và nhiệt độ là hai nhân tố tối quan
trọng đối với sự phân hoá vùng sinh dưỡng và sinh sản. Quá trình tạo bào từ
non, quá trình phân hoá mù chịu ảnh hường tích cực của ánh sáng và nhiệt độ
trong khi sự mọc của sợi trong điều kiện có ánh sáno và nhiệt độ tươne đối cao
thì lại bị ức chế một cách rõ rệt.
• • • •
2.5. Nghiên cứu một số nhóm chất có hoạt tính sinh học chính của một số
loài quan trọng
Quả thể của 5 chủng nấm cổ linh chi và nấm Đa niên đã được tách chiết
trong các dung môi hữu cơ. Tỷ lệ các nhóm hoạt chất tách chiết được khoản2 từ
2.5 - 4.5% trọng lượng khố của quả thể nấm. Các nhóm chất tự nhiên chủ yếu đã
được chỉ ra bằng những nghiên cứu trên sắc ký cột, sắc ký bản mỏns, sắc ký
khí và nghiên cứu khối phổ cho thấy các chất chiết của nấm cổ linh chi và nấm
Đa niên rất giàu các hoạt chất. Ngoài các chất có trọng lượng phân tử lớn như:
Polysaccharide, Polysaccharide-peptide, Peptaibol thì các chủng nghiên cứu
còn chứa nhiều Steroid (esgosterin), Tepenoid. Đáng kể nhất là 7 colossolacton
mới (được gọi chung là colossin), từGanoderma coỉossimr, lanostanoic, poricoic,
tumuloic axit từ Wolfiporia r<9Cới’ Ganoderic acid, aplanic acid từ Ganoclermơ
sp
Từ trước tới nay, khi đề cập tới nấm lồ đa niên, người ta chú ý nhiều đến
tác hại của chúng, gây mục gỗ, làm thiệt hại nhiều cho lâm nghiệp. Nhằm tìm
hiểu giá trị dược lý của các loài nấm lồ đa niên trên, việc nghiên cứu một số
nhóm chất có hoạt tính sinh học chính cũng được tiến hành bước đầu.
Các chủns nshiên cứu nấm sử dụns trong nghiên cứu bao gồm :
Nấm đươc chiết đưọc chiết suất trons nước đun sôi 3 lần. mồi lần 2 tiếng
và hàm lượng sinh khối thu được như sau :
21
Quả thể khô của một vài loài nấm đa niên quan trọns được chiết suất

nhằm mục đích nghiên cứu về những nhóm họp chất có hoạt tính sinh học chính.
Hàm lượng có trong dịch chiết nước và cồn vào khoảna từ 2,5 tới 4% trọnơ
lượng quả thể khô và rất giàu các họp chất có hoạt tính sinh học.
Chúng tôi chọn các phương pháp sắc kí để nghiên cứu về các hợp chất
chứa trong những dịch chiết này. Các phương pháp sắc kí lớp mỏng (TLC) và
(EMS) được sử dụng. Một điều không có gì đáng neạc nhiên là các dịch chiết
chứa vô cùng nhiều các hợp chất có hoạt tính và chúng tôi phải tách chiết, sàng
lọc rất kỹ mới có thể đi sâu nghiên cứu được.
. *
■ - - i - •
; - h
. ị, t, ;>
r1
< :»
í .J* <
■a !
Khối phổ của dịch chiết cồn của El.
Khối phổ của dịch chiết nước của El.
22
>1''. ■
->f '*-! ' f-~' '•
rue
:
^'r*-rV
ri-M< i*c I 2 0 <
*!/'>! 1 . * 2 ^» -• . W its I'-il*
/ u V •: ? !, 1 1 -n
f "• r > *
f ,\ r á
r -

■* t
í- Q F 1 0 F 1 1
r * " r ' ‘
r . D He
Sắc kí lớp mỏng của dịch chiết cồn El
23
o " o
( V
cK 'X't
* 0^0
X
o
D
~ " /
l:V
i .
c "O
O' ■'cr'Y
E
Cl
o ' c
c
CứÍY trúc phân tử cùa Coìossoỉactoiis (Tonnorphagus)
MOOC
Mt
X
Ml-
hC
/ ,
f v lrr M e

riOOC
Me \
- i
h O O C
í / . e Ị Ị
Me.
H
Me
Q» 1
ts/e
0
1
HOOC
r/ *-
■OI
M
Fig. 3
Cấu trúc phân tử của Terpenoid (Wolipona)