Nghiên cứu đánh giá khả năng phân hủy Polylactic Axit (PLA) của một số chủng vi sinh vật phân lập ở Việt Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



NGUYỄN THỊ THANH LỊCH


NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY
POLY LACTIC AXIT (PLA) CỦA MỘT SỐ CHỦNG
VI SINH VẬT PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM




LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC






HÀ NỘI - 2011

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



NGUYỄN THỊ THANH LỊCH

NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY
POLY LACTIC AXIT (PLA) CỦA MỘT SỐ CHỦNG
VI SINH VẬT PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm
Mã số: 60 42 30


LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN QUANG HUY


HÀ NỘI - 2011
Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Nguyễn Thị Thanh Lịch Khoá 2009-2011

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Tình hình ô nhiễm môi trƣờng trên thế giới và Việt Nam 3
1.1.1. Tình hình ô nhiễm môi trƣờng trên thế giới 3
1.1.2. Tình trạng ô nhiễm môi trƣờng ở Việt Nam 4
1.2. Tình trạng ô nhiễm rác thải nilon 5
1.3. Một số phƣơng pháp xử lý rác thải 8
1.3.1. Phƣơng pháp chôn lấp 8

1.3.2. Phƣơng pháp đốt 9
1.3.3. Phƣơng pháp xử lý rác bằng con đƣờng sinh học 10
1.4. Polymer sinh học 11
1.4.1. Khái niệm 12
1.4.2. Nhựa sinh học – Khả năng ứng dụng và nhu cầu thị trƣờng 12
1.4.3. Một số loại polymer sinh học phổ biến hiện nay 13
1.4.3.1. Polylactic acid (PLA) 13
1.4.3.2. Polyhydroxyalkanoate(PHA) và Poly–3–hydroxybutyrate (PHB 14
1.4.3.3. Poly – ε – caprolactone (PCL) 15
1.4.3.4. Polyamide (PA) 16
1.4.3.5. Polybutylene succinate (PBS) và polyethylene succinate (PES) 17
1.4.3.6. Polyethylene (PE) 17
Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Nguyễn Thị Thanh Lịch Khoá 2009-2011

1.4.4. Ƣu, nhƣợc điểm và hƣớng phát triển của polymer sinh học 18
1.4.4.1. Ƣu điểm 18
1.4.4.2. Nhƣợc điểm 19
1.5. Các vi sinh vật có khả năng phân hủy polymer sinh học 20
1.5.1. Vi khuẩn 21
1.5.2. Xạ khuẩn 22
1.5.3. Nấm 23
1.6. Cơ chế phân hủy polymer sinh học theo con đƣờng sinh học 23
CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26
2.1. Nguyên liệu 26
2.2. Hóa chất và thiết bị 26
2.2.1. Hóa chất 26
2.2.2. Thiết bị 26
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 27

2.3.1. Phƣơng pháp thu thập mẫu 27
2.3.2. Môi trƣờng phân lập nuôi cấy 27
2.3.2.1. Môi trƣờng khoáng cơ bản 27
2.3.2.2. Môi trƣờng LB 27
2.3.3. Phân lâ
̣
p trên môi trƣơ
̀
ng khoa
́
ng có bổ sung 0,2% PLA 28
2.3.3.1. Phƣơng pha
́
p cấy trải 28
2.3.3.2. Phƣơng pha
́
p nuôi cấy lắc 28
2.3.3.3. Phƣơng pháp cấy điểm 28
Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Nguyễn Thị Thanh Lịch Khoá 2009-2011

2.3.4. Phƣơng pha
́
p xa
́
c đi
̣
nh, nhâ
̣

n da
̣
ng chu
̉
ng nghiên cƣ
́
u 28
2.3.4.1. Phƣơng pha
́
p nhuô
̣
m Gram 28
2.3.4.2. Chụp ảnh trên knh hiển vi điện tử qut 29
2.3.4.3. Phƣơng pháp giải trình tự gen mã hóa 16S rARN 30
2.3.5. Phƣơng pha
́
p xa
́
c đi
̣
nh hoa
̣
t đô
̣
một số enzyme ngoại bào 30
2.3.5.1. Xác đi
̣
nh khả năng sinh amylase 30
2.3.5.2. Xác đi
̣

nh khả năng sinh cellulase 31
2.3.5.3. Xác định hoạt độ catalase 31
2.3.5.4. Xác định hoạt độ protease 32
2.3.6. Phƣơng pháp đánh giá khả năng phân hủy PLA 34
2.3.6.1. Phƣơng pháp đo vòng phân hủy PLA 34
2.3.6.2. Phƣơng pháp thu hồi PLA 35
2.3.6.3. Phƣơng pháp tăng khả năng phân hủy PLA 35
2.3.7. Phƣơng pháp tối ƣu hóa các điều kiê
̣
n nhiê
̣
t đô
̣
, pH, nồng đô
̣
muối NaCl 36
2.3.8. Phƣơng pháp thống kê sinh học 36
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37
3.1. Phân lập tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy PLA 37
3.2. Đặc điểm hình thái của chủng T2 41
3.3. Phân loại chủng T2 dựa trên trình tự 16S rARN 43
3.4. Hoạt độ một số enzym ngoại bào của chủng T2 44
3.4.1. Khả năng sinh amylase. 44
3.4.2. Khả năng sinh cellulase 45
Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Nguyễn Thị Thanh Lịch Khoá 2009-2011

3.4.3. Hoạt độ catalase và protease 46
3.5. Khả năng phân hủy polymer sinh học 47

3.5.1. Khả năng phân hủy PLA của chủng Klebsiella variicola T2 47
3.5.2. Khả năng phân hủy một số polymer sinh học khác của chủng Klebsiella
variicola T2 49
3.6. Tối ƣu hóa các điều kiện phân hủy PLA 51
3.6.1. Tối ƣu khả năng phân hủy PLA từ chủng Klebsiella variicola T2 51
3.6.2. Tối ƣu điều kiện nhiệt độ 52
3.6.3. Tối ƣu điều kiện pH 54
3.6.4. Ảnh hƣởng của NaCl 55
KÊ
́
T LUÂ
̣
N 56
KIÊ
́
N NGHI
̣
56
TÀI LIỆU THAM KHẢO 57
PHỤ LỤC 65








Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Nguyễn Thị Thanh Lịch K18 - Sinh học Thực nghiệm

BNG MT S U VIT TT
CMC Cacboxymetyl cellulase
CHCl
3
Chlorofom
INT Iodonitrotetrazolium chloride
PA Polyamide
PBS Polybutylene succinate
PBSA Polybutylene succinate - co-butylene adipate
PCL Poly   caprolactone
PE Polyetylene
PEC Polyester cacbonate
PES Polyetylene succinate
PHA Polyhyroxyalkanoate
PHB Poly3hydroxybutyrate
PHBV Poly3hydroxybutyrate - co -3-hydroxy valerate
PLA Poly lactide acid
PP Polypropylene
PS Polystyrene
PVC Polyvinylchlorua
w/v 

(g)/



(ml)

 

Nguyn Th Thanh Lch 1 -2011
MỞ ĐẦU

      
    





    
       
       

 v ng hii b
u ci. Vic s dn phm t nhn gc sinh hc
 thay th di nha polymer tng hng rt trin v
sn phm t polymer sinh h  nh
ph             y ca
t din ra chi mt nhiu th y bu
xy ra.
Vi sinh v y polymer sinh h n t
ng t  ng, chng lo
kh y polymer sinh hc ph thuu kin t ].
Kt qu u cng s cho tht cha t 1,610
4
n

8,710
5
t 10
5
t c bi 10
2
n 10
3

 

Nguyn Th Thanh Lch 2 -2011
t   di polymer sinh h
nhau [44 gi v ng vi sinh v 
hy polymer sinh hn, nm s khun.
ng  Vit trong nhng v c nhi
vi,  i t n phm nha. 






 








 





Vi  p, tuyn ch     ng vi sinh v  
y polymer sinh hc rn x 
ng.  Vit Nam s  u v vi sinh vt
  u.
T nhc hi “Nghiên cứu đánh
giá khả năng phân hủy poly lactic axit (PLA) của một số chủng vi sinh vật phân
lập ở Việt Nam”  cho vic ng dng trong vic t phm ch ng
trong vi t m thing.









 

Nguyn Th Thanh Lch 3 -2011
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình ô nhiễm môi trƣờng trên thế giới và Việt Nam
1.1.1. Tình hình ô nhiễm môi trƣờng trên thế giới

Trong nhu vi nhng him ha
 a bt
 qu  gii.
Cng ti x s  ca
 Hin ti, s ng i ti Anh mng 3%.
Nu ng biu hi  hii Anh s ht ch cha
a, dn tt cuc khng ho  Napoli va qua.
i ca   ca 
ca nhiu qu c phi ra mnh,
bt bui gim bng in
ch  vic s dng l Theo Quynh s -4-
i gic 25% ng cht thi ch n
o vi mc th 69].
c nhng chic x c,
c bit coi trng v i Thy
n hit ph bin sn xu i sinh hot bin
 y  l i  ng thi gim s
ng ng ti 19% [69].
Theo s liu co v ng M ch 55% tng s ti M
c ch t. Theo mu ca T ch
Xanhkhp th gii  t khng l chng gn
6,5 triu tn i  [69].


 

Nguyn Th Thanh Lch 4 -2011

l
1.1.2. Tình trạng ô nhiễm môi trƣờng ở Việt Nam


 

       


   [5].
     

 [5].
 

Nguyn Th Thanh Lch 5 -2011

  [5]
 
 


 
   
-76].
1.2. Tình trạng ô nhiễm rác thải nilon
c s dng rn c.
nh nhng lnhng ng c n
ng vc kh.  k



 

2
c 
].
 

Nguyn Th Thanh Lch 6 -2011
Th hai: vic s d i xu ti sc kho ci.
T nha PVC (pt ph gia
 m, do, dai lc ht ph gia ch
yc s do, kim loi nng, ph ng cht cc k
nguy him. Cht ph o TOCP  
n kinh ngo sng; cht BBP (butyl benzyl phthalate)
 th t s d tt bm sinh np
].
Nhng lo   hoc hp nh  cha
DOP (dioctin phatalat) cc, c nam. Tr em b nhim
ch i gi b n 
 sm [4].
u s d ng thc ph 
khin thc phm nhi             
i,  
Th  yc s dng mt ln ri b thng.
 i thi ra trong m ph  mt tm
nilon khng l i 0,8 mm. Ch c ta, vi con s 
  mt c c/1m
2
. Theo kho
 2010 t Nam x khong 2.500 ta ra
 mt phn nh trong s n
ln b vt b kh  kinh t m ho

ng cho con i [4]:
              

t



 

Nguyn Th Thanh Lch 7 -2011
 

[4].
i vi th gi t vn nng
c hn ch s dc thay th
bng sn ph p thi
Ti  lon b cm  mt s . Ti Hoa K, 
 Long Beach, San ti Israel u c
bin [72]. M gic s dng. M
th gii s d   i s d 
trong m n mi Ireland s d
  74, 75].
S      n xu c chim 67% trong tng s  i ra,
h c 72% s c
 gi tc thu gom phi t 
trong t [2].

 nh mt  M [72]
 

Nguyn Th Thanh Lch 8 -2011
 Vit Nam c s d trong hong sinh hot
i. Hi liu thc v s c s dng 
Vit Nam.
Theo mt kha p (CIE)
mi Vi dn phn gc t
nha. T n nay, con s t
t Nam x khong 800 tn 2010, con s 
2.500 t  [7].
 

 [71].
1.3. Một số phƣơng pháp xử lý rác thải
Vhin nn
     m gim thi  
t s c s dng.
1.3.1. Phƣơng pháp chôn lấp
 


2
S, NH
3
, CH
4
, CO
2
, NO
X
, SO

X




   

 




 




 

Nguyn Th Thanh Lch 9 -2011




 , 15,5% 
 , 85%  .  , 90%















 [14].


 [14].


 
  

 [70].
1.3.2. Phƣơng pháp đốt

1000
o
C). 


,  . 













 75%  u




50% [15].






].


 


 ].
Ti Vic s d yu khin

 p nhn.
 

Nguyn Th Thanh Lch 10 -2011
Nu s d  H   phi t
12 tri







[14].























 . 
 , 



 . 



























 . 

 , 
,  , 
ng thi, vi





 n
sinh ra rt nhi [14].


m bo vic x i


. 

 









s 















. Vi t 
 

   . 
 



















.
1.3.3. Phƣơng pháp xử lý rác bằng con đƣờng sinh học
 i bng sinh hc s du t, sinh
vt nhm bi thng chc hi
vng, to, lau, sy  x t b m
kim loi n ci t ng x
t li v
c bia vi sinh v
x i d  dn cacbon ct.
Tt c  t bao gm vi khun, nm mc, x khu ng
chh  
i v ng sinh hu
cao, mt nhin di
t tri so vn n
ng 20% so vp), x  p ti

m thim nguc
 

Nguyn Th Thanh Lch 11 -2011
ngm, gim thic mm bnh, s d  to 
sn phng trt [10].
ng d sinh hc x t thi rn  Vit Nam ch yu tp trung
     th  p, cht thi c    p ch bin
c phi sinh hong s d hiu
 k m vi sinh vt.  hic ng d x t
th k p cho x i sinh ho
thp thc phm. Thc t cho thy hiu qu  dng cht
thi  Viu loi ch phm vi sinh vu sn
xung d u su i hiu qu kinh t cao.
Hin nhing dng ngh   x i
sinh ho c, ) [6].
1.4. Polymer sinh học
Viy m  
v t thi sinh hot, tt th 
nilon hi dng   gii thuc lo
y. Nht trong sn xu
i vng khi thi b. u gii sao
t ph bin  nhiu qu gii bt chp nhng cnh
 i to lu mt tng, sc kh n nn trong
qung  hu ht Nam.
Trong nh gii quy
thn phm nh
tring dng n phm polymer sinh hkh  y trong t
 n phm nhn gu. Mt s 
ng di sn gim thim

ng [32].
 

Nguyn Th Thanh Lch 12 -2011
1.4.1. Khái niệm
Polymer sinh hng polymer tng hp t lactic axit
(PLA), poly (-hydroxybulyrate) (PHB), poly (-caprolactone) (PCL) PLA hic
sn xut nhiu nhiu trong nhc s dng trong
  sn xu  sn ph
c phm, y t i ch t liu thay th].
1.4.2. Nhựa sinh học – Khả năng ứng dụng và nhu cầu thị trƣờng
 
  
     


n [76].

               
   
             
 
  [76].


 


         -Committee of


     -General Committee for the Agricultural
h
 73].
 

Nguyn Th Thanh Lch 13 -2011


 
 [73].


Nam [68].
1.4.3. Một số loại polymer sinh học phổ biến hiện nay
1.4.3.1. Poly lactic acid (PLA)
PLA 
g
kh CO
2

2
O
 

 


 

-    

 
 [73].
Nhi nha trong sut ca nh 
a truyn th du ho  
t b chun hi n phm nha truyn thng theo phn
p m  lactic :
 

Nguyn Th Thanh Lch 14 -2011





 [26].
u ln nht trong s tt c c. Nh
u  i dng ht vi nhic s d
nghi sn xut sn phm dng cu
lo [27].
1.4.3.2. Polyhydroxyalkanoate(PHA) và Poly–3–hydroxybutyrate (PHB)


























 , phospho, . 


























 3 : 
35: poly3hydrobutyrate (PHB), 






 614: poly3hydroxyoctanoate (PHO),  3 
 :
poly3hydroxybutyrateco3hydroxyvalerate (PHBV).
2000, 










 1,42 

. 




 , 



,  , ,
[53]. 
 

Nguyn Th Thanh Lch 15 -2011






 , 












 
















 [32].

















. PHB (poly 3-





0
C
CO
2

2
O 

(Imperial Chemical Industries) 
Rastonia eutropha [73].













 , 



























 .


, 






 [34].
1.4.3.3. Poly – ε – caprolactone (PCL)















 , 
60
o
C, 

 60
o
C. 















 







: Pennicillium sp, Aspergillus sp, Clostridium [62].
 

Nguyn Th Thanh Lch 16 -2011

-c






















 . 







  .



,  t tinh

[49].
ng s d i nh 
n p. Khi trn vi tinh bt, PCL 
kh y sinh hc ca vt li dt
cho cho PVC [66].
i kh ng dng cvt liu sinh hc 
  y bth 
kt este. So vi PLAy ch  phn/thit b 
 sng. Cc Quc phc phm Hoa K (FDA) chng
nh t liu dn thuc hay ch  i [66].
1.4.3.4. Polyamide (PA)

















 , 
 












. 



















 .
Nht loi polyme sinh hn gc t du thc vt. PA 11
thuc v i polyme k thu sinh ht ca PA
 n xuu 
 

Nguyn Th Thanh Lch 17 -2011
 ci khi sn xut PA 12.
Kh u nhin so vc ng d thut
ng dn chng m 
n, ng mm dn du ho thao, b phn tit liu [77].
1.4.3.5. Polybutylene succinate (PBS) và polyethylene succinate (PES)
























 112114
o


 103106
o
C. 
























.
























 e glycol . 

, 





















 [47, 49]. 
















.
1.4.3.6. Polyethylene (PE)
Polyethylene (PE) 





















 . 









 











 . , 
















 (MW= 600800) 
Acinetobacter 





.







 , 


















.  , 
 




. 















,  , 






, 



[49].
Nhng mn ca PE  c
nh   c sn xut t s n ph

ng hay bp. PE n gc sinh ht v m-i
PE truyn th sinh h - c
 

Nguyn Th Thanh Lch 18 -2011
ca sn ph hai nguu ki tp ch
 to. h ngun sinh h
th giu  [77].
1.4.4. Ƣu, nhƣợc điểm và hƣớng phát triển của polymer sinh học
1.4.4.1. Ƣu điểm


 nh C, CO
2
,
H
2








 [73].



PLA 

   
 [73].

. N



