Đặc điểm phân tử của vi rút dại lưu hành ở miền Bắc Việt Nam từ năm 2006 - 2012

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN






Nguyễn Vĩnh Đông




Đặc điểm phân tử của vi rút dại lƣu hành ở miền Bắc
Việt Nam từ năm 2006-2012




LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2012



ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN








Nguyễn Vĩnh Đông





Đặc điểm phân tử của vi rút dại lƣu hành ở miền Bắc
Việt Nam từ năm 2006-2012


Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 604240

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS.BS. Nguyễn Thị Kiều Anh










Hà Nội – Năm 2012


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ
CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN 3
1.1. Sơ lƣợc lịch sử phát hiện vi rút dại 3
1.2. Virut dại 4
1.2.1. Phân loại: 4
1.2.2. Hình thái: 7
1.2.3. Cấu trúc 7
1.2.4. Khả năng và cơ chế gây bệnh 9
1.3. Dịch tễ học bệnh dại 11
1.3.1. Tình hình bệnh dại trên thế giới và Việt Nam 11

1.3.2. Ổ chứa và nguồn truyền bệnh 12
1.3.3. Các biện pháp phòng chống bệnh dại……………………….13
1.3.4. Các loại vắc xin tế bào phòng bệnh dại trên thế giới……….13
1.4. Nghiên cứu trong nƣớc liên quan đến đề tài…………………… 15
1.5. Chẩn đoán phòng thí nghiệm: 15
1.5.1. Chẩn đoán bệnh dại ở người 15
1.5.2. Chẩn đoán trên động vật 17
1.6. Các kỹ thuật sinh học phân tử: 17
1.6.1. Các phương pháp định týp và nghiên cứu sự tiến hóa của vi rút
Dại 17
1.6.2. RT- PCR: 18
1.6.3. RT - Realtime PCR 19
1.6.4. RT - LAMP 20
1.6.5. Kỹ thuật sequencing 20
CHƢƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu: 25
2.2. Vật liệu nghiên cứu: …………………………………………… 25
2.2.1. Chủng vi rút 25


2.2.2. Trình tự gien 26
2.2.3. Sinh phẩm, hóa chất 26
2.2.4. Trang thiết bị, dụng cụ 27
2.2.5. Phần mềm phân tích………………………………………… 28
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu: 28
2.3.1. Xác định và định týp vi rút 30
2.3.2. Phân tích đặc điểm phân tử nucleoprotein. 38
CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 39
3.1. Kết quả về xác định và định týp vi rút: 39
3.1.1. Kết quả xác định vi rút dại lưu hành tại miền Bắc: 39

3.1.2. Kết quả xác định genotype vi rút dại 50
3.2. Kết quả phân tích đặc điểm nucleoprotein vi rút dại. 60
3.2.1. Đặc điểm chung về phân tử nucleoprotein của vi rút dại 60
3.2.2. Mức độ tương đồng ở mức nucleotide và axit amin ………. 63
3.2.3. Kết quả phân tích các SNP xuất hiện ở các chủng vi rút. 67
3.2.4. Trình tự axit amin chủ yếu xuất hiện ở các chủng vi rút. 72
KẾT LUẬN 76
KIẾN NGHỊ 77
TÀI LIỆU THAM KHẢO




Danh mục bảng

Bảng
Tên bảng

Trang
1.1
Phân loại Lyssavirus gây bệnh dại/viêm não tủy
6
3.1
Kết quả chẩn đoán bệnh dại trên người bằng kỹ thuật RT –
PCR
39
3.2
Kết quả chẩn đoán bệnh dại ở động vật
44
3.3

Phân bố bệnh nhân dại được chẩn đoán xác định phòng thí
nghiệm ở một số tỉnh miền Bắc, Việt nam
47
3.4
Sự tương đồng về axit amin và nucleotide của các chủng vi
rút dại phân lập tại Việt Nam so với các chủng vi rút dại ở
các nước Châu Á và các chủng dùng làm vắc xin
65
3.5
Trình tự nucleotide (vị trí 100 – 397) của gen N các chủng
virus dại hoang dại lưu hành ở miền Bắc Việt Nam, 2006 –
2012
69
3.6
Trình tự axit amin (vị trí 1 – 150) của gen N các chủng virus
dại hoang dại lưu hành ở miền Bắc Việt Nam, 2006 – 2012
74




Danh mục hình

Hình
Tên hình
Trang

1.1
Hình ảnh cấu trúc của vi rút dại
8

1.2
Sơ đồ cấu trúc hệ gien của vi rút dại
9
1.3
Ổ chứa vi rút dại ở các loài động vật hoang dại trên Thế giới.
12
2.1
Tiến hành các bước của thử nghiệm
29
3.1
Hình ảnh điện di sản phẩm PCR trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm
lâm sàng
40
3.2
Tiền sử phơi nhiễm của bệnh nhân dại được chẩn đoán xác
định phòng thí nghiệm
42
3.3
Bản đồ lưu hành các chủng vi rút dại ở chó và người thuộc
các tỉnh phía Bắc
49
3.4
Genotype các chủng virus dại phân lập ở Miền Bắc Việt
Nam
52
3.5
Cây phả hệ các chủng virus dại phân lập ở người và động vật
tại Việt Nam (500 nucleotide gen N)
55
3.6

Sự lưu hành các nhóm vi rút dại theo vùng địa dư từ 2006-
2012
58
3.7
Sự lưu hành của các chủng vi rút dại, 2006-2009
59
3.8
Sự lưu hành các chủng vi rút dại xuất hiện các SNP ở vị trí
T124 và C330 tại miền Bắc Việt Nam, 2006 – 2012.
71
3.9
Sự lưu hành của các chủng vi rút dại có sự đột biến axit amin
phân lập tại miền Bắc Việt Nam, 2006 – 2012
75



CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AA
Axit amin
ARN
Axit Ribonucleic
ADN
Axit Deoxy Ribonuleic
Bp
Base pairs
cDNA
Complementary DNA
CVS
Chủng virus thử thách (Challenge Virus Strain)

dNTP
Deoxiribonucleotide 5’-triphosphates
ELISA
Enzyme linked-immusorbent assay (Thử nghiệm hấp phụ
miễn dịch gắn enzyme)
KN
Antigen (Kháng nguyên)
Nu
Nucleotide
PM
Chủng virut Pitman More
PV
Chủng virus Pasteur (Pasteur Virus)
RFFIT
Thử nghiệm ức chế tạo đám huỳnh quang (Rapid
Fluorescent Focus Inhibition Test)
RT-LAMP
Reverse transcriptase-Loop-mediated isothermal
amplification (Phản ứng khuếch đại đẳng nhiệt qua trung
gian vòng phiên mã ngược)
RT-PCR
Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (Phản
ứng sao chép ngược chuỗi di truyền phân tử)
SNP
Single-nucleotide polymorphism (Đa hình di truyền do
một nucleotide đơn)
TAE
Tris Acetate EDTA
TCYTTG
Tổ chức Y tế thế giới

MỞ ĐẦU
Bệnh dại là bệnh viêm não và màng não nguyên phát của động vật có vú,
do vi rút dại thuộc họ Rhabdoviridae gây nên. Đây là một căn bệnh cổ xưa nhất
của động vật và có thể truyền sang người khi tiếp xúc với vi rút dại qua niêm
mạc và da bị tổn thương. Bệnh thường biểu hiện dưới hai thể lâm sàng là thể
hung dữ (chiếm 80%) có các triệu chứng điển hình như tăng kích thích, sợ
nước, sợ gió, sợ ánh sáng, tăng tiết đờm dãi, co thắt các cơ hô hấp và thể liệt
(chiếm 20%). Khi đã lên cơn dại, 100% bệnh nhân tử vong. Ổ chứa vi rút dại
rất đa dạng bao gồm các động vật máu nóng hoang dại và động vật gần người
như chó, mèo, ngựa, trâu, bò, chồn, cáo, chó sói, dơi Cho đến nay, trên thế
giới đã có tới 7 genotype thuộc giống Lyssavirus được ghi nhận là tác nhân gây
bệnh dại và viêm não tủy giống bệnh dại. Vi rút dại cổ điển và các chủng vi rút
sản xuất vắc-xin được xác định thuộc Lysssavirus genotype 1 [2].
Bệnh dại hiện nay được coi là một trong các bệnh bị lãng quên trên thế
giới, nhưng lại tái nổi trội ở một số nước thuộc châu Á, châu Phi [1]. Theo Tổ
chức Y tế Thế giới (TCYTTG), hằng năm có khoảng 55.000 ca tử vong do bệnh
dại và hơn 10 triệu người bị động vật nghi dại cắn hoặc do tiếp xúc với nguồn
truyền bệnh dại phải điều trị dự phòng bằng huyết thanh/vắc xin (VX) dại.
Trong những năm gần đây, Việt Nam và một số nước trong khu vực như
Phillipin, Lào, Cam Pu Chia và Trung Quốc đang phải đối mặt với vấn đề tăng
nhanh các ca bệnh dại. Ở Việt Nam, đã có 560 trường hợp mắc bệnh dại trên
người được báo cáo từ năm 2007-2011 và bệnh dại đã và đang diễn ra ở 25 – 27
tỉnh trên cả nước, nhưng tập trung chủ yếu ở các tỉnh phía Bắc [3]. Nguồn lây
chính của bệnh dại ở Việt Nam là chó và mèo, chưa thấy có ghi nhận các trường
hợp mắc dại do tiếp xúc với các động vật khác. Việc triển khai công tác tiêm
phòng vắc xin dại cho đàn chó mèo chưa được tốt, đặc biệt là ở các vùng nông
thôn, vùng sâu, vùng xa. Hơn nữa việc kiểm soát xuất/nhập động vật giữa các
vùng biên giới, các vùng có dịch bệnh dại ở động vật lưu hành và vùng không

có dịch chưa được chặt chẽ, do vậy ổ chứa bệnh dại vẫn chưa thật sự được kiểm


soát từ đó là nguồn lây bệnh cho người. Đứng trước tình hình bệnh dại gia tăng
và diễn biến phức tạp, ngày 19/1/2009 thủ tướng chính phủ đã chính thức phê
duyệt chương trình phòng chống bệnh dại Quốc Gia CV99/TTG – KTN. Để
đánh giá hiệu quả của chương trình phòng chống bệnh dại, việc giám sát các ca
bệnh dại ở người và động vật là quan trọng cũng như theo dõi đặc điểm phân tử
của các chủng vi rút dại lưu hành giúp cho việc khẳng định hiệu quả của việc
phòng chống bệnh dại trong từng giai đoạn cụ thể, trên cơ sở này có những đề
xuất xác đáng cho việc thực hiện các hoạt động phòng chống bệnh dại hiệu quả
ở các giai đoạn tiếp theo. Chính vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
“Đặc điểm phân tử của vi rút dại lưu hành ở miền Bắc Việt Nam, 2006-2012“
với 2 mục tiêu:
1/ Xác định và định týp các chủng vi rút dại lưu hành ở miền Bắc Việt
Nam, 2006 - 2012.
2/ Phân tích đặc điểm phân tử Nucleoprotein của các chủng vi rút dại lưu
hành ở miền Bắc Việt Nam, 2006 - 2012.







CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. Sơ lƣợc lịch sử phát hiện vi rút dại
Bệnh dại là bệnh viêm não tuỷ cấp và viêm màng não nguyên phát của
động vật có vú. Bệnh có thể truyền sang người qua niêm mạc hoặc da bị tổn

thương.
Từ hàng nghìn năm trước công nguyên, những người thầy thuốc cổ
phương Đông đã viết về căn bệnh tương tự bệnh dại – bệnh sợ nước, sợ gió mà
chó và người mắc phải. Bệnh dại cũng được người da đỏ, người Ả rập và người
Do Thái cổ đề cập trong y văn với 5 dấu hiệu bệnh dại ở chó: mõm há, chảy
nước dãi, tai rủ, đuôi cụp, giọng khàn và khuyến cáo nếu gặp các con vật có
biểu hiện này phải tiêu diệt ngay bằng cung tên. Ở Ai Cập, Hy Lạp, La mã
người ta coi bệnh dại là sự trừng phạt của thượng đế vì sự bí mật của căn
nguyên gây bệnh cũng như sự khủng khiếp của các triệu chứng lâm sàng [10,
16, 47].
Một trăm năm sau công nguyên, Celse đã biết rằng độc tố đã được
truyền từ chó sang người và muốn loại bỏ độc tố này cần phải đốt vết thương
bằng que sắt nung đỏ [46].
Hai trăm năm sau công nguyên, Galien đã đề ra phương pháp phẫu thuật
cắt bỏ phần cơ thể bị vết cắn để ngăn ngừa sự phát bệnh dại [47].
Đầu thế kỷ 19, Zinke đã chứng minh được tính lây nhiễm có trong nước
dãi của chó dại. Tại viện Lion, Galtier đã thành công trong việc gây bệnh thực
nghiệm trên thỏ và thử nghiệm gây miễn dịch cho cừu bằng cách tiêm nước bọt
của con vật bị bệnh dại vào tĩnh mạch con vật lành.
Năm 1884, Louis Pasteur đã thành công trong việc nghiền não tuỷ của
chó mắc bệnh dại sau đó gây nhiễm dưới màng cứng não thỏ. Tiếp tục nghiền
não thỏ đã gây nhiễm truyền cho thỏ tiếp theo và cứ tiếp tục như vậy sau hơn
100 lần tiêm truyền liên tiếp trên não thỏ ông đã thu được chủng vi rút có thời
gian ủ bệnh thu ngắn và cố định 6 - 7 ngày, ông gọi đó là “vi rút dại cố định”


[29, 45, 47]. Pasteur cũng đã phát minh ra phương pháp bất hoạt vi rút dại gây
nhiễm não tuỷ thỏ bằng cách làm khô dưới KOH tinh thể. Ông đã dùng não tuỷ
thỏ bất hoạt này tiêm cho chó, sau đó dùng vi rút dại sống thử thách cho những
con chó này và kết quả thí nghiệm đã giúp Pasteur tìm ra cách sản xuất vắc xin

dại. Ngày 6 tháng 7 năm 1885, lần đầu tiên Pasteur đã dùng vắc xin não thỏ bất
hoạt tiêm cho cậu bé 9 tuổi Joseph Meister, bị một con chó lên cơn dại cắn
nhiều vết. Sau khi được tiêm 13 mũi vắc xin dại của Pasteur, cậu bé đã được
cứu thoát khỏi bệnh dại [24]. Trong vòng một năm sau đó có khoảng 2.500
người bệnh đã được điều trị bằng vắc xin này và chỉ có 12 người bị chết [45].
Năm 1963, dưới kính hiển vi điện tử Atanasiu cùng cộng sự đã nghiên
cứu cấu trúc, hính thái của vi rút dại trên động vật thí nghiệm và trên nuôi cấy
tế bào [6].
Vào những năm 80, ứng dụng tiến bộ của kỹ thuật sinh học phân tử và sự
phát triển của công nghệ sinh học người ta đã sử dụng kỹ thuật kháng thể đơn
dòng để chẩn đoán các chủng vi rút dại gây bệnh ở người và động vật. Bằng kỹ
thuật PCR, sequencing người ta đã có thêm nhiều hiểu biết về trật tự sắp xếp
các gien và trình tự nucleotide của vi rút dại. Nhờ vào sinh học phân tử đã mang
lại nhiều tiến bộ cho việc sản xuất vắc xin dại tái tổ hợp [29].
1.2. Vi rút dại
1.2.1. Phân loại:
Vi rút dại thuộc họ Rhabdoviridae, giống Lyssavirus. Họ Rhabdoviridae
có hơn 100 chủng phân bố trong tự nhiên có thể gây nhiễm cho động vật và
thực vật [16, 30].
Trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về dịch tễ học phân
tử của vi rút dại. Hiện nay, bằng kỹ thuật sinh học phân tử, kỹ thuật kháng thể
đơn dòng, người ta đã nghiên cứu nhận dạng các chủng vi rút phân lập được từ
một số loài động vật hoang dại và hiện tại Lyssavirus gây bệnh dại ở người
được phân chia thành 7 genotype và 4 týp huyết thanh (serotype) [20] trên cơ sở
mối liên quan giữa kháng nguyên và huyết thanh học [16]. Các genotype tập


trung ở các vùng địa lý khác nhau và có ổ chứa ở các động vật hoang dại khác
nhau như dơi, chồn, chó sói, cáo, mèo (Alan C. Jackson và Wiliam H. Wunner,
2002).

Genotype 1 (týp huyết thanh 1): bao gồm các chủng vi rút thử thách chuẩn,
phần lớn các chủng “hoang dại” được phân lập từ loài động vật có vú sống trên
cạn, từ loài dơi ăn côn trùng ở Nam Mỹ và dơi hút máu ở Mỹ La Tinh, kể cả các
chủng vi rút cố định dùng trong phòng thí nghiệm.
Genotype 2 (týp huyết thanh 2): Chủng Lagos, lần đầu tiên được phân lập từ
não dơi ở Nigeria (Lagos-1), sau đó ở Cộng hoà Trung Phi (Lagos-2) và từ dơi
ở Gui-Nê và mèo ở Zim-ba-buê (Lagos-3).
Genotype 3 (týp huyết thanh 3): Chủng Mokola, đầu tiên được phân lập từ
chuột chù ở Nigeria sau đó từ người (Mokola-1), tiếp theo được phân lập từ
chuột chù ở Camơrun (Mokola-2), Cộng hoà Trung phi (Mokola-3) và từ chó ở
Zimbabuê (Mokola-5).
Genotype 4 (týp huyết thanh 4): Chủng Duvenhage, đầu tiên được phân lập từ
người ở Nam Phi (Duvenhage-2) và ở Zimbabuê (Duvenhage-3).
Genotype 5, 6: Lyssavirus phân lập từ người sau khi phơi nhiễm với dơi ở Phần
Lan và Ucraina.
Genotype 7: Lyssavirus phân lập từ loài dơi ở các vùng địa lý thuộc Châu Âu
và Mỹ la tinh.











Bảng 1.1 Phân loại Lyssavirus gây bệnh dại/viêm não tủy
Genotype

Chủng đại diện
Vùng địa lý lƣu hành
Động vật cảm thụ
1
Virus dại và các
chủng virus vaccine
(Serotype 1,
genotype 1)
Trên toàn thế giới trừ Úc,
Vương Quốc Anh,
Ireland, New Zealand,
Nhật Bản, Scandinavia
và Hawaii
Người; các loài động
vật hoang dại và vật
nuôi ăn thịt, ăn cỏ; dơi
hút máu và dơi ăn quả.
2
Lagos
(serotype 2
genotype 2)
Nigeria, cộng hoà Trung
Phi, Nam Phi,
Zimbabwe, Guinea,
Seneral, Ethiopia, Ai Cập
Người, Dơi ăn quả,
mèo, chó.
3
Mokola
(Serotype3,

genotype 3)
Nigeria, cộng hoà Trung
Phi, Zimbabwe,
Ethiopia, Cameroon
Người, chuột trù, mèo,
chó, các loài động vật
gặm nhấm.
4
Duvenhage
(serotype 4,
genotype 4)
Nam Phi, Zimbabwe
Người, dơi ăn côn
trùng.
5
Bat Lyssavirus 1
phân lập từ dơi ở
châu Âu (serotype
4, genotype 5)
Châu Âu
Người, chồn đá, cừu,
dơi ăn côn trùng.
6
Bat Lyssavirus 2
phân lập từ dơi ở
châu Âu (serotype
Châu Âu
Người, dơi ăn côn
trùng.

Genotype
Chủng đại diện
Vùng địa lý lƣu hành
Động vật cảm thụ
4, genotype 6)
7
Bat Lyssavirus
phân lập từ dơi ở
Úc (genotype 7, cấu
trúc gần giống
genotype 1)
Úc
Người, dơi ăn côn
trùng, dơi ăn quả.
8,9,10
Genotype 8, 9, 10
cho tới nay chưa
nghi nhận gây bệnh
trên người
Cộng hoà Trung Á, Tây
Cáp Ca
Dơi ăn côn trùng.
1.2.2. Hình thái:
Vi rút dại có hình viên đạn một đầu tròn, đầu kia dẹt với đường kính
trung bình 75nm, chiều dài dao động từ 100 – 300 nm [12, 25]. Sự thay đổi về
độ dài phản ánh sự hiện diện các hạt trung gian có cấu trúc không hoàn chỉnh
với độ dài ngắn hơn khoảng từ 20 – 50% so với hạt vi rút hoàn chỉnh. Các hạt
trung gian có bộ gien bị cắt xén và vì thế thiếu hụt một số chức năng của vi rút,
chúng nhân lên một cách nhanh chóng và cạnh tranh tích cực với các vi rút có

bộ gien bình thường trong quá trình tạo thành lớp vỏ bao [19].
1.2.3. Cấu trúc
Cấu trúc vi rút dại gồm lõi bên trong là chuỗi xoắn ribonucleoprotein,
bao bọc bên ngoài là một lớp vỏ lipoprotein gồm 2 màng mỏng phospholipid.
Trên bề mặt có những protein G tạo những chồi gai có chiều dài 10nm. Đây là
kháng nguyên chủ yếu kích thích cơ thể tạo ra kháng thể trung hoà và là ngưng
kết tố hồng cầu [16].


Thành phần hoá học của vi rút dại gồm có 67% Protein, 26% Lipid, 1%
ARN và 3% cacbonhydrat [46, 47].






Hình 1.1: Hình ảnh cấu trúc vi rút dại
Hình 1.1: Hình ảnh cấu trúc vi rút dại
1.2.3.1. Các protein cấu trúc của vi rút dại.
Mỗi hạt vi rút dại gồm có ARN sợi đơn và 5 protein [16]
1. Protein L (180kDal) là ARN polymeraza phụ thuộc ARN, hoạt động như
một emzym trong quá trình tổng hợp ARN.
2. Glycoprotein: Protein G (62-67 kDal) có hai đoạn kỵ nước tạo khả năng
xuyên màng của vi rút, chịu trách nhiệm tiếp xúc, nhận biết và gắn vào thụ thể
đặc hiệu trên bề mặt tế bào cảm thụ. Protein G có vai trò sinh bệnh học của vi
rút dại, chúng tạo nên khả năng ái tính với tế bào thần kinh, kích thích hệ miễn
dịch tạo kháng thể trung hoà và ngưng kết hồng cầu [16].
3. Nucleoprotein N: (54 Dal) Protein N đóng vai trò cấu trúc chính trong quá
trình tạo vỏ cho ARN gien và bảo vệ bộ gien. Ngoài ra nó còn có thể điều hoà

sự cân bằng giữa phiên mã và sao mã. Protein N là protein có tính bảo tồn nhất
trong các protein của vi rút dại, trình tự nucleotide của gien mã hoá cho protein
N có độ tương đồng cao trong cùng một genotype, nhưng lại rất khác nhau giữa
các genotype khác nhau. Chính vì vậy mà gien N được ứng dụng rộng rãi trong
chẩn đoán bệnh dại bằng các kỹ thuật sinh học phân tử, đồng thời cũng được sử
dụng để nghiên cứu sự tiến hoá cũng như dịch tễ học phân tử của nhóm
Lyssavirrus [2].


4. Phosphoprotein NS hay M1 (37kDal): Protein M có vai trò điều hoà ARN
polymeraza phụ thuộc ARN trong quá trình polymer hoá.
5. Protein màng M2: (24 kDal) protein M2 chịu trách nhiệm về hình thái và
tiếp xúc qua lại với protein của tế bào.
1.2.3.2. Cấu trúc hệ gien.
Hệ gien của vi rút dại là một chuỗi ARN sợi âm, không phân nhánh có
hằng số lắng 45S và trọng lượng phân tử 4,6 x 10
6
Dalton, chứa khoảng 12.000
nucleotide. Sợi ARN chứa 5 gien có trật tự sắp xếp được bắt đầu từ 3’ –N –M1-
M2 -G-L –5’. ARN sợi âm không có khả năng trực tiếp dịch mã tổng hợp
protein của vi rút mà phải thông qua việc tổng hợp ARN sợi dương bổ trợ
(mARN). ARN của vi rút dại không có khả năng lây nhiễm.
ARN genome của chủng PV (Pasteur virus) có 11.932 nucleotide, 58
nucleotide đầu tiên từ vị trí 3’ của toàn bộ genome là vùng không mã hóa và
cũng chính là vùng mở đầu sao chép. Vùng mở đầu sao chép này được hoạt hóa
bởi bộ ba N, P và L protein. Ngay sau khi vùng mở đầu sao chép được phiên mã
thì 5 mARN mã hóa cho 5 protein cấu trúc của vi rút là N, M1, M2, G và L lần
lượt được tổng hợp và cuối cùng là vùng đuôi không mã hóa gồm 70 nucleotide
tận cùng ở phía đầu 5’ [30, 42].

Hình 1.2: Sơ đồ cấu trúc hệ gien của vi rút dại
1.2.4. Khả năng và cơ chế gây bệnh.
1.2.4.1. Khả năng gây bệnh.
Vi rút dại có thể gây bệnh cho hầu hết các động vật máu nóng, bao gồm
các động vật gần người như chó mèo, dơi, trâu, bò, ngựa, lợn, dê cừu và các
động vật hoang dại như chồn, chồn hôi, chó sói, cáo, gấu, cầy mangu [37].
Trong đó chó là nguồn truyền bệnh chủ yếu và nguy hiểm nhất. Ổ chứa vi rút


dại ở các động vật hoang dại, lây cho động vật gần người từ đó lây truyền sang
người thông qua da bị tổn thương (các vết cắn), thậm chí qua tiếp xúc với niêm
mạc không hề tổn thương [16].
1.2.4.2. Cơ chế gây bệnh.
 Cơ chế lan truyền bệnh dại trong tự nhiên giữa bầy động vật hoang dã là
do sự di chuyển khi đi kiếm mồi hoặc do xuất nhập cảnh súc vật bị dại. Vi rút
lây truyền chủ yếu qua nước bọt qua vết cắn của con vật bị dại [5].
 Cơ chế lan truyền từ súc vật sang người: Do người hít phải khí có chứa vi
rút dại hoặc bị súc vật bị dại cắn, cào, liếm trên da và niêm mạc. Ngoài ra sự
lây truyền vi rút dại qua làm thịt, lột da hay tiêu thụ thịt sống bị nhiễm vi rút dại
cũng là vấn đề đáng quan tâm, đặc biệt đối với nước có tập quán ăn thịt chó như
nước ta [37].
 Sự lây truyền từ người sang người: cho đến nay trên thế giới ghi nhận đã
có 8 trường hợp lây truyền vi rút dại từ người sang người do cấy truyền giác
mạc và nội tạng mà không được kiểm tra [42]. Sự lây truyền vi rút dại từ người
này sang người khác qua vết cắn hoặc qua tiếp xúc với nước dãi của người bệnh
đã được ghi nhận hai trường hợp ở Ethiopia bị lây nhiễm bệnh dại do tiếp xúc
với người nhà bị lên cơn dại [37, 42].
 Vi rút dại xâm nhập vào cơ thể người từ động vật bị dại qua vết cắn, liếm
trên da bị tổn thương hoặc niêm mạc không bị tổn thương. Vi rút có ái tính với
tế bào thần kinh, sau khi xâm nhập vào cơ thể nó tồn tại và nhân lên tại vết

thương từ vài giờ cho đến vài tuần [16]. Sau đó nhanh chóng đi tới các đầu mút
thần kinh cảm giác và vận động của hệ thần kinh ngoại biên rồi di chuyển tới hệ
thần kinh trung ương theo hướng phản hồi của tế bào sợi acxon với tốc độ 0,3
mm/h, tại đó nó tiếp tục nhân lên. Phần cuống não bị nhiễm trước tiên, sau đó
vùng dưới đồi và cuối cùng là phần vỏ não bị tổn thương. Tuy nhiên vào giai
đoạn nhiễm cuối thì toàn bộ hệ thần kinh trung ương cũng như một số mô ngoài
tuyến nước bọt cũng bị nhiễm vi rút. Khi nhân lên trong hệ thần kinh, vi rút dại


gây tổn thương não tuỷ ở các mức độ nặng nhẹ mà biểu hiện lâm sàng khác
nhau [19].
1.3. Dịch tễ học bệnh dại
1.3.1. Tình hình bệnh dại trên thế giới và Việt Nam
Bệnh dại phổ biến trên toàn cầu, từ châu Âu đến châu Á, châu Phi, Mỹ
La Tinh trừ một số vùng không có bệnh dại như Vương Quốc Anh, Nhật Bản,
vùng Bắc cực, Úc hay châu Đại Dương là những vùng đất “biệt lập”. Theo ước
tính của TCYTTG hàng năm có khoảng 40.000 – 50.000 người chết vì bệnh dại,
trong đó 99% số ca tử vong được thông báo từ các nước đang phát triển ở châu
Phi, châu Á và vùng Nam Mỹ [16].
Tại châu Âu, bệnh dại chủ yếu xảy ra ở các nước CHLB Đức, Áo, Thuỵ
Sĩ, Pháp, Thổ Nhĩ Kỳ, Ba Lan, Tiệp Khắc, Hung Ga Ry. Các quốc gia này mặc
dù thường xuyên liên tục thực hiện chương trình giám sát ổ dịch bệnh dại tự
nhiên và dự phòng bằng vắc xin cho động vật hoang dã, súc vật nuôi, nhưng
hàng năm vẫn có tới hàng chục nghìn người phải tới khám và phải sử dụng 1,2
triệu liều vắc xin tại các trung tâm phòng dại [16].
Ở châu Phi và châu Á, bệnh dại hiện tại vẫn là vấn đề y tế công cộng vô
cùng nghiêm trọng. Trong đó chó là nguồn lây chủ yếu, hàng năm con số người
chết vì bệnh dại rất cao. Tại Ấn Độ hàng năm có khoảng 3 triệu người phải tiêm
phòng vắc xin dại, 92 – 95% là do chó cắn. Ở Trung Quốc bệnh dại cũng khá
nghiêm trọng, con số tử vong lên tới hàng nghìn ca trong một năm. Tình trạng

bệnh dại cũng tương tự ở các nước Nepal, Srilanca, Băng La Đét, Indonesia và
con số người chết vì bệnh dại hàng năm ở các nước Đông Nam Á chiếm tới
80% số ca tử vong vì bệnh này trên toàn thế giới [16].
Ở Việt Nam, bệnh dại chủ yếu tập trung ở đồng bằng sông Hồng và sông
Mê Kông. Hàng năm có khoảng 350. 000 – 650. 000 người phải tiêm phòng vắc
xin. Tỷ lệ tử vong do bệnh dại tính trên 100.000 dân, cao nhất ở giai đoạn 1991-
1995 là 0,43. Giai đoạn 1996-2003, thực hiện chỉ thị 92/TTg của Thủ tướng
Chính phủ công tác phòng chống bệnh dại được quan tâm hơn nên tỷ lệ tử vong


giảm xuống còn 0,04/100.000 dân. Tuy nhiên từ năm 2004 đến nay, tỷ lệ tử
vong do bệnh dại có xu hướng gia tăng trở lại. Mỗi năm có khoảng 100 ca tử
vong và trên nửa triệu người phải tiêm phòng mỗi năm, gây tổn thất to lớn về
tính mạng, sức khỏe nhiều người. Các tỉnh có số ca bệnh dại cao nhất từ 2004-
2012 là các tỉnh: Phú Thọ, Tuyên Quang, Yên Bái, Thái Nguyên, Lào Cai, Cao
Bằng, Lạng Sơn, Sơn La, Hà Giang, Nghệ An, Bình Thuận, Hà Nội (khu vực
Hà Tây cũ), Đắc Lắc, Gia Lai, [1, 3] .
1.3.2. Ổ chứa, nguồn truyền bệnh

Hình 1.3. Ổ chứa vi rút dại ở các loài động vật hoang dại trên Thế giới.
Ổ chứa thiên nhiên của vi rút dại thường ở động vật hoang dại máu nóng
như sói, cáo, chồn, các loài dơi hút máu (Mỹ La Tinh), dơi ăn quả (Châu Âu).
Một số loài động vật gần người như trâu, bò, lợn, dê, cừu, ngựa cũng có thể bị
mắc bệnh.
Nguồn bệnh chủ yếu và nguy hiểm đối với người là chó (95 –98%) và
mèo (2 – 3%) [5]. Vi rút dại cư trú chủ yếu ở hệ thần kinh, trong tuyến nước bọt
và vi rút được đào thải theo nước dãi của con vật bị mắc bệnh, vi rút có mặt 3 –
5 ngày, tối đa 10 ngày trước khi có triệu chứng đầu tiên của bệnh. Chính vì vậy

mà người ta chỉ định theo dõi con vật sau khi cắn người trong vòng 10 ngày [5,
10].
1.3.3. Các biện pháp phòng chống bệnh dại
Ở các nước phát triển biện pháp phòng chống bệnh dại chủ yếu hướng tới
các yếu tố truyền bệnh, ổ chứa virus dại ở các động vật máu nóng hoang dại
như chồn, cáo, chó sói. Những chiến dịch chủng ngừa bằng mồi có chứa thức ăn
trộn lẫn vaccine được rải vào các cánh rừng để gây miễn dịch cho động vật
hoang dại, góp phần làm giảm nguy cơ truyền bệnh dại cho người [2].
Ở các nước đang phát triển, biện pháp phòng chống chủ yếu tập trung vào
việc tăng cường sản xuất và nâng cao chất lượng vaccine, huyết thanh phòng
bệnh dại, đẩy mạnh công tác tuyên truyền và giáo dục nhân dân về việc hạn chế
nuôi chó, tiêm chủng thường xuyên cho chó, mèo, cách xử lý khi bị súc vật nghi
dại cắn. Tăng cường công tác giám sát dịch tễ học bệnh dại để biết chính xác
dịch tễ học bệnh dại và thực hiện tiêm phòng cho các đối tượng có nguy cơ phơi
nhiễm.
Đối với bệnh dại ở súc vật: thiết lập hệ thống giám sát trung tâm có trang
thiết bị phòng thí nghiệm chẩn đoán, có đội ngũ chuyên gia theo dõi. Thành lập
chương trình kiểm soát và hạn chế đàn chó lang thang, thực hiện tiêm phòng
thường kỳ cho đàn chó.
Thực hiện giám sát kiểm dịch Quốc tế khi xuất nhập các súc vật qua biên
giới. Tăng cường hợp tác khoa học giữa các nước và khu vực có bệnh dại lưu
hành [2].
1.3.4. Các loại vắc xin tế bào phòng bệnh dại sản xuất trên thế giới
Vaccine phòng bệnh dại lần đầu tiên được nhà bác học Louis Pasteur và
các cộng sự nghiên cứu sản xuất năm 1885. Cho đến nay đã có rất nhiều loại
vaccine các thế hệ ra đời, được sử dụng rộng rãi trên khắp thế giới đã chứng tỏ
hiệu quả bảo vệ khác nhau.
Theo thống kê của TCYTTG các vaccine trên tế bào được sử dụng cho người
gồm [2].

 Vaccine trên tế bào lưỡng bội người (1963) ( HDV) vaccine được sản
xuất từ chủng PM trên tế bào lưỡng bội người WI-38 và được bất hoạt
bởi  propiolacton và tinh chế bằng ly tâm trong đệm sucrose gradient.
Hiện nay được sử dụng khá rộng rãi ở các nước phát triển.
 Vaccine nuôi cấy trên tế bào lưỡng bội bào thai khỉ (RDRV) vaccine
được sản xuất từ chủng CVS - 11, gây nhiễm trên tế bào lưỡng bội phổi
phôi khỉ, bất hoạt bằng  propiolacton, hấp phụ với phosphat nhôm ở
4
0
C.
 Vaccine sản xuất trên tế bào thận chuột đất vàng tiên phát
Canada: dùng chủng CVS - 11
Liên xô cũ: dùng chủng Vnukovo-32, bất hoạt bằng tia cực tím, hiện nay
vẫn đang được sản xuất rộng rãi ở cộng hoà liên bang Nga.
Trung Quốc: dùng chủng Beijing, bất hoạt bằng formalin, hấp phụ với
hydroxit nhôm, đông khô hoặc ở dạng nước và cho đến nay vẫn được sử
dụng rộng rãi ở nước này.
 Vaccine sản xuất trên tế bào thận chó tiên phát: Dùng chủng PM gây
nhiễm trên tế bào thận chó tiên phát, bất hoạt bằng -propiolacton cô đặc
và tinh chế, thêm tá chất là nhôm phosphat, hiện nay được sản xuất tại
Hà Lan với số lượng không nhiều.
 Vaccine sản xuất trên tế bào phôi gà tiên phát (KONDO): Dùng chủng
Flury Hep gây nhiễm lên tế bào phôi gà tiên phát, bất hoạt bằng -
propiolacton, cô đặc bằng siêu lọc, tinh chế bằng siêu ly tâm. Vaccine
này có độ an toàn và hiệu lực cao, được sản xuất và sử dụng tại Nhật Bản
từ 1965.
 Vaccine trên tế bào thường trực Vero (Verorab): sử dụng chủng PM
thích nghi trên tế bào thường trực vero đời 137, vaccine được bất hoạt,
cô đặc và tinh chế sau đó đông khô, vaccine có độ an toàn và tính sinh

miễn dịch cao. Được sản xuất tại Pháp từ 1984.
1.4. Nghiên cứu trong nƣớc liên quan đến đề tài


Trước đây đã có nghiên cứu về dịch tễ học phân tử của bệnh dại tại Việt
Nam do tác giả Yamagata và cộng sự (2007) [52], đã tiến hành phân lập vi rút
dại từ chó tại Thành phố Hồ Chí Minh và một số tỉnh miền Nam Việt Nam. Kết
quả của đề tài là đã so sánh trình tự nucleotide của gien N vi rút dại với một số
chủng từ các nước Châu Á khác, và kiến nghị rằng có sự liên hệ chặt chẽ về mặt
tiến hóa giữa các chủng tại Miền Nam Việt Nam với các chủng từ Thái Lan và
có thể có cùng chung một nguồn gốc.
1.5. Chẩn đoán phòng thí nghiệm
Chẩn đoán xác định bệnh dại trong phòng thí nghiệm dựa vào các phương pháp
sau:
- Xác định kháng nguyên của vi rút bằng kỹ thuật FA hoặc ELISA
- Phân lập và xác định vi rút: phân lập trên tế bào hoặc trên chuột.
- Xác định vật liệu di truyền của vi rút bằng các kỹ thuật sinh học phân
tử.
- Nhận dạng vi rút bằng kháng thể đơn dòng
- Các kỹ thuật huyết thanh học; ELISA, RFFIT, FAVN
1.5.1. Chẩn đoán bệnh dại ở người
1.5.1.1. Khi bệnh nhân đang sống
 Kỹ thuật phân lập vi rút
Mẫu bệnh phẩm là nước bọt, nước tiểu, dịch não tuỷ.
Phân lập vi rút trên não chuột ổ nhắt trắng 1 – 2 ngày tuổi, sau tiêm 3 – 4 ngày
mổ lấy não chuột và xác định vi rút bằng phản ứng miễn dịch huỳnh quang.
Phân lập vi rút trên tế bào NA (C1300) Neuroblastoma của chuột.
Khoảng 20 – 24 giờ sau khi gây nhiễm, nhuộm tế bào bằng kháng thể kháng
dại gắn huỳnh quang sau đó soi trên kính hiển vi huỳnh quang. Mẫu bệnh phẩm
dương tính khi quan sát thấy có hình ảnh phát quang màu xanh trong bào tương

của tế bào. Phân lập vi rút dại trên nuôi cấy tế bào cho phép phát hiện được
lượng vi rút rất ít trong bệnh phẩm và cho kết quả sau 20 – 24 giờ. Phương pháp


phân lập vi rút trên tế bào có độ đặc hiệu cao (99%), độ nhạy 94-97%. Tuy
nhiên phương pháp này đòi hỏi kỹ thuật cao, tốn kém.
 Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang
Là một kỹ thuật đáng tin cậy, được sử dụng từ năm 1979, cho đến nay
đây vẫn là kỹ thuật vàng trong việc chẩn đoán xác định vi rút dại.
Mẫu bệnh phẩm là giác mạc bệnh nhân hoặc lấy từ sinh thiết da vùng gáy.
Lấy mẫu bệnh phẩm phết lên lam kính, nhuộm huỳnh quang với kháng thể
kháng dại, sau đó soi trên kính hiển vi huỳnh quang. Các mẫu dương tính sẽ
thấy xuất hiện các tế bào phát quang, các mẫu âm tính sẽ không thấy hiện tượng
phát quang.
Kỹ thuật này có độ đặc hiệu 99,9% và độ nhạy 99,99%. Cho kết quả
nhanh sau 2 – 3 giờ [16].
 Các kỹ thuật huyết thanh học
Các kỹ thuật huyết thanh học ít được sử dụng để chẩn đoán mà chủ yếu
dùng để định lượng nồng độ kháng thể kháng dại có trong huyết thanh của
người hoặc động vật sau khi tiêm phòng vắc xin để đánh giá hiệu quả bảo vệ
của vắc xin.
Chuẩn độ kháng thể trung hoà có trong huyết thanh của người sau khi
tiêm vắc xin bằng thử nghiệm trung hoà huyết thanh trên chuột (MNT) hoặc thử
nghiệm ức chế tạo đám miễn dịch huỳnh quang (RFFIT) hoặc FAVN.
Kỹ thuật miễn dịch gắn men (ELISA), sử dụng glycoprotein dại tinh
khiết để xác định hiệu giá kháng thể trung hoà có trong huyết thanh người và
động vật. Thử nghiệm cho kết quả nhanh nhưng giá thành đắt [16].
 Các kỹ thuật sinh học phân tử xác định ARN của vi rút dại
Mẫu bệnh phẩm là nước bọt, nước tiểu, dịch não tuỷ.
Phát hiện axit nucleic của vi rút bằng kỹ thuật RT – PCR, nested RT – PCR,

real time PCR, từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao,
cho kết quả nhanh chóng.
1.5.1.2. Sau khi bệnh nhân tử vong


Não tử thi ở các vùng khác nhau như dưới đồi, nhân não, chất xám, tiểu
não.
Các kỹ thuật chẩn đoán trên não tử thi cũng tương tự như các kỹ thuật
chẩn đoán trên lâm sàng, nhưng có thêm kỹ thuật xác định tiểu thể Nergi ở tế
bào thần kinh trong mô não tử thi.
 Kỹ thuật xác định tiểu thể Negri
Não được phết lên lam kính, nhuộm theo phương pháp Seller hay Mann,
soi lên kính hiển vi tìm tiểu thể Negri thường khu trú trong tế bào thần kinh
sừng Amon có kích thước khoảng 0,25 – 25 m, bắt màu hồng Eosin. Phương
pháp này cho kết quả nhanh, sau khoảng 1 giờ.
1.5.2. Chẩn đoán trên động vật
Bệnh phẩm là não động vật nghi dại. Lấy não vùng sừng Amon hai bên,
vùng dưới đồi, cuống não, nhân não, chất xám. Các kỹ thuật chẩn đoán áp dụng
như trên bệnh phẩm não tử thi.
1.6. Các kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong chẩn đoán và nghiên
cứu vi rút dại
1.6.1. Các phương pháp định týp và nghiên cứu sự tiến hóa của vi rút Dại
Phương pháp miễn dịch: Sử dụng kháng thể đơn dòng đặc hiệu với các chủng
đại diện của các kiểu gien để định týp các vi rút dại hoang dại phân lập được.
Phương pháp đòi hỏi phải phân lập được vi rút và phải có hệ thống huyết thanh
chuẩn của từng týp huyết thanh.
Phương pháp sinh học phân tử: Phân tích, so sánh trình tự nucleotide của vi
rút dại cần xác định kiểu gien so với các chủng đại diện của các kiểu gien.
Hầu hết các công trình nghiên cứu về dịch tễ học phân tử của vi rút dại
sử dụng gien N để phân tích kiểu gien và sự tiến hóa của vi rút dại. Tại khu vực

Đông Nam Á (Thái Lan, Philipine, Trung Quốc) cũng đã có nhiều công trình
nghiên cứu về dịch tễ học phân tử, nghiên cứu sâu về cấu trúc di truyền của các
chủng vi rút dại, phân tích sự tiến hóa của chủng vi rút lưu hành [3, 20, 51], các


công trình nghiên cứu này cũng sử dụng gien N để phân tích đặc điểm di
truyền, tiến hóa của vi rút do gien này có các đặc tính sau:
Gien N bao gồm 450 axit amin, tương ứng với 1350 nucleotide, N
protein có tính bảo tồn nhất trong các protein của Lyssavirus, trình tự nucleotide
của gien mã hóa cho N protein có độ tương đồng cao trong cùng một kiểu gien,
nhưng lại rất khác nhau giữa các kiểu gien. Độ tương đồng ở mức độ axit amin
của N protein giữa các chủng vi rút trong cùng một kiểu gien đạt tới 98-99,5%,
trong khi mức độ tương đồng nucleotide chỉ đạt dưới 80% đối với các vi rút
thuộc các kiểu gien khác nhau, [42, 46]. Các công trình nghiên cứu khoa học đó
cho thấy khi phân tích trình tự cách quãng 200 nucleotide của gien N sẽ thu
được kết quả tương tự như khi phân tích toàn bộ trình tự gien N (Smith và CS,
1992; Kissi và CS, 1995) hoặc một đoạn gien khoảng 200 – 300 nucleotide
(Conzelmann và CS, 1990; Bourhy và CS, 1993; Kissi và CS, 1995; Smith và
CS, 1992; Nadine – David và CS, 1994; Kissi và CS, 1995; Nishizono và CS,
2002). Chính vì vậy gien N được ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh dại
bằng các kỹ thuật sinh học phân tử; phân loại kiểu gien (genotyping), xây dựng
bản đồ dịch tễ học phân tử và nghiên cứu sự tiến hóa của vi rút dại so với các vi
rút gây bệnh dại thuộc nhóm Lyssavirus [22, 23, 28, 39, 46, 51].
Ngoài ra trong hệ gien của vi rút dại còn có gien mã hóa cho P protein
cũng là gien khá bảo tồn trong các gien của vi rút dại, có tới 97% sự tương đồng
nucleotide của các chủng vi rút thuộc genotype 1 [46]. Vùng được bảo tồn nhất
trong gien P chính là vùng ưa nước, nằm ở vị trí axit amin 139 – 170 [46] được
sử dụng để thiết kế mồi cho các kỹ thuật chẩn đoán vi rút dại bằng các phương
pháp sinh học phân tử và gien P cũng được sử dụng để nghiên cứu sự tiến hóa
của vi rút dại trong một kiểu gien, nhưng hiệu quả phân loại kiểu gien bằng gien

P tỏ ra không hiệu quả bằng gien N và phải giải trình tự toàn bộ gien P thì khả
năng phân loại genotype mới chính xác.
1.6.2. Kỹ thuật RT – PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain
Reaction)