Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã cho thụ thể neurokinin-1 ở người Việt Nam

ĐA
̣
I HO
̣
C QUÔ
́
C GIA HA
̀
NÔ
̣
I
TRƯƠ
̀
NG ĐA
̣
I HO
̣
C KHOA HO
̣
C TƯ
̣
NHIÊN



Lê Hồng Thu

TÁCH DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ CHO
THỤ THỂ NEUROKININ-1 Ở NGỪƠI VIỆT NAM




LUÂ
̣
N VĂN THA
̣
C SI
̃
KHOA HO
̣
C





H Ni - 2012


ĐA
̣
I HO
̣
C QUÔ
́
C GIA HA

̀
NÔ
̣
I
TRƯƠ
̀
NG ĐA
̣
I HO
̣
C KHOA HO
̣
C TƯ
̣
NHIÊN



Lê Hồng Thu



TÁCH DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ CHO
THỤ THỂ NEUROKININ-1 Ở NGƯỜI VIỆT NAM

Chuyên nga
̀
nh: Sinh học thực nghiệm
M số: 604230

LUÂ
̣
N VĂN THA
̣
C SI
̃
KHOA HO
̣
C
NGƢƠ
̀
I HƢƠ
́
NG DÂ
̃
N KHOA HO
̣
C: PGS.TS. Võ Thị Thƣơng Lan





H Ni - 2012



M U 1
 TU 11

1.1 TH TH T VI G PROTEIN 11
1.1.1. G protein 11
1.1.2. Th th t vi G protein 11
1.2 H TACHYKININ  NG V 14
1.3 TH TH H  TH NEUROKININ-1 18
1.3.1. Gii thiu chung v th th h tachykinin 18
1.3.2. Th th neurokinin  1 20
1.4 NG DNG CA TH TH NEUROKININ-U TR
BNH 23
1.5 VECTOR BIU HI TH
NEUROKININ-1 26
U 28
U 28
2.1.1. Mu vt 28
p mi s dng 28
 thng vector 29
2.1.4. Chng vi khun 29
t b 29
U 30
 u 30
 thu u 31
ng s 31
2.2.2.2. Phn c 32

2.2.2.3. Phn ng PCR (Polymerase Chain Reaction) 32
2.2.2.4. Tinh sch DNA b 33
2.2.2.5. N 33
2.2.2.6. K thut bin np 33
c khun lc 34
 34

t ct s dng enzyme gii hn 35
2.2.2.10. K thut n di 36
 cDNA ca cDNA-NK1 36
T QU O LUN 37
 TH NEUROKININ-1
T PHI 37
3.1.1. Tng hp cDNA t mu phi 37
3.1.2. Khu-NK1 c th neurokinin-1 . 37
3.1.3. Khu-NK1 c th neurokinin-1 . 39
--NK1 c th
neurokinin-1 41
 th neurokinin-1 44
3.1.6. Gi  th neurokinin-1 49
3.2. THIT K VECTOR BIU HI TH
NEUROKININ-1 49
3.2.1. Thit k mi 49
3.2.2.   th neurokinin-
1 52
3.2.3. Gi  th neurokinin-1 trong vector biu hin
56
KT LUN NGH 57

KT LUN 57
KIN NGH 57
U THAM KHO 58



\

DAN


 -
 
 12.

neurokinin  
:  --
-
neurokinin-1 30.
-
neurokinin-1 30.
: 

-NK1. 30.

 -
5.
. -1 36
 -

               QIAquick Gel

              
 40.
        
3
/R
3
   -   -
3 41.
h 17: 











 1-3  1

F3/NK1 R3 43.

 18: 





 ctor pCDNA 3, pEGFP-N1    
Hind   Bam
HI 44.
19: 











  3-
NK1 46.
 20: 


















 1-
NK1 47.



DNA Dedeoxyribonuleic acid
pb 
kb kilobase = 1000 bp
dNTP deoxyribonucleoside triphosphate
E.col Escherichia coli
LB Lubertani Both
PCR Polymerase Chain Reception
RNA Ribonucleic acid
GPCR G protein coupled receptor
TACR Tachykinin Receptor
TM Transmembrane
IL 
CIN V Chemotherapy induced nausea and vomiting


  G
protein
 
 
 
              
neurokinin- 
neurokinin-g
,  Tuy
nh  

 
 n  
“Tách dòng và thiết kế
vector biểu hiện gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 ở ngườiViệt Nam. 

       - Protein    






Ch-¬ng 1. U
1.1 
1.1.1. G protein
G p
.  

    [4].
G p46
          GTPases   
  


), beta (G



). Hai 
beta (G





); 


) [29].
G protein 
G   

 G protein 
(350-500 acid amine) [45],   
.
      G protein  ,
 [52].

 1:  G protein (GPCRs) [56].
H
p R  
              
, 

 
              
G dinh
  [3, 60].
, t   amino 
 , 3 , 
(cytoloop) carboxyl  (). 

amino 
     carboxyl.      -   
amino --carboxyl
-C
ta  amino 
  [51].

2G protein [60].
  cho
C


51].
GPC. 

(hormone, photon, 
   .   G  
  
G

.  

-G


 enzyme  cAMP 
  




inositol triphosphate/diacetyl glycerol (IP
3
/DAG)
alpha trong G 
 [29,
38].
V, GPCR vai
 ,
  ion, 
   [51, 60].     
 
  Theo 
  [3, 4].
1.2 H



  [15, 45].
              
  .
             
 21]. 
 
 14
 ,  SP
50].  
             neurokinin A
(NKA)  (NKB) 31, 33].
  
            
neuromedin K)            


1:   [61]



SP
Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-
Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH
2


1971



NKA
His-Lys-Thr-Asp-Ser-
Phe- Val-Gly-Leu-Met-NH
2


1983


NKB
Asp-Met-His-Asp-Phe-
Phe-Val-Gly-Leu-Met-NH
2


1983


Neuropeptide-
Asp-Ala-Gly-His-Gly-Gln-Ile-Ser-
His-Lys-Arg-Lys-Asp-Ser-
Phe-Val-Gly-Leu-Met-NH
2



Neuropeptide K
Asp-Ala-Asp-Ser-Ser-Ile-Glu-
Lys-Gln-Val-Ala-Leu-Leu-Lys-

Ala-Leu-Tyr-Gly-His-Gly-Gln-
Ile-Ser-His-Lys-Arg-His-Gly-
Gln-Ile-Ser-His-Lys-Arg-Lys-Asp-Ser 
Phe-Val-Gly-Leu-Met-NH
2


1985


              
carboxyl Phe-X-Gly-Leu-Met-NH
2

20].











H3- 
      TAC1 (hay PPT-A)   
TAC3 (hay PPT-B) 
gen Tac1  Tac2    TAC1       

neuropeptide-  [3, 7
mRNA TAC1 
---
PPT) [34

-PPT-
-PPT--PPT-A mARN
, 37
Gen PPT-A







 



              
      -Arg, Arg-  -Lys  
      4, 47].     
 preprotachykinin
 (NKA,
. n
amino 12]. TAC3 (PPT-B)
 cho neurok trong [7].
 Yu Zhang 
              

 gen TAC4 (PPT-C)   [39, 54].


 
 n kinh 

       . K       
tachykinin 

 [27] 
  . 
          
  
 [8, 21].

  
, 
,   6, 8, 40]. 
tachykinin, 

 ch
8, 16, 25

1.3 -1

hykinin (TACR)  
G protein .  
    
 . N



 [45].

 
tachykinin  Tr
)
[3, 9, 10, 35]. 
NK1 [21].
2: 3]
Tachykinin

SP
NK1 > NK2 > NK3
NKA
NK2 > NK3 > NK1
NKB
NK3 >> NK2 > NK1
Neuropeptide-
NK2 > NK1 >> NK3
Neuropeptide K
NK2 > NK1 >> NK3

B3.
3:   [3, 23, 28]







2
10
4


398
407
465





46,364
43,851
51,104



 [22].

 
. NK2    
390  
3].


-
  
2+

         
phosphoinositol 
3


26, 42].
 
  16, 18,
55]. 

 
. 


 
46, 14].
 1


-1
    -              
d

B [24].
 G
protein
carboxyl 
amino Tacid amine

Cys105-TM TM4; amino 

carboxyl 58]; Asp-
Arg-Tyr 3  Lys/Arg-Lys/Arg-XX- carboxyl  
G protein (HA).













4:  carboxyl
.
G-hai 
h  carboxyl 
  [5, 11, 22].  

. 

protein,  
carboxyl 
 
 carboxyln
 4)
[30

carboxyl  
22]. 



carboxyl






Disulfit



Disulfit


 4: 
NK1 [30].




 carboxyl

407
311




-



nhanh

-

kh
-8


               
neurokinin-    
 
 virus HIV [48].
           

    
2+
   


   
3

DAG. IP
3

 

2+

    
2+
    
. 
Hai   
   adenylate cyclase [35].
t
13].
28].
, gen NK1  

mRNA . 
 Q   
[13
30, 22].


-

55].
1.4      NEUROKININ-  

  
quan.
  
           

   :         ,   
S  

n Tuy 


             . T 

 
 [13], 

              
c
 .






].

 
   



 
-
  

               
   
 . N

  
41, 43


 

Mesolimbic 

44SP 





 

               
   
2+
        



6].




- 


-



NK1 [3]. T-


 [43].

  . 

neurokinin-   

          [59] 
5   184, 333, 370, 641, 996 A
G  
C T. 
5.
Bng 5:   protein gi th neurkinin-1  i
Vit Nam so v 
Acid amin
 M81797.1)
Acid amin
(cDNA t i Vit Nam)
R - Arginine (62)
G - Glycine

T  Threonine (124)
A - Alanine
Y  Tyrosine (214)
C - Cysteine
E - Glutamic acid (332)
G - Glycine


 
-1 

cDNA -1  
, 
-1 
Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho
thụ thể neurokinin – 1 ở người Việt Nam”.
1.5         
NEUROKININ-1



     carbonhydrate 