Tạo bào tử Bacillus Subtilis biểu hiện Streptavidin gắn kháng thể Biotinyl hóa kháng virus gây bệnh đốm trắng ở tôm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



BÙI THU THỦY




TẠO BÀO TỬ BACILLUS SUBTILIS BIỂU HIỆN
STREPTAVIDIN GẮN KHÁNG THỂ BIOTINYL HÓA
KHÁNG VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TÔM




LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC





Hà Nội - 2011

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Bùi Thu Thủy


TẠO BÀO TỬ BACILLUS SUBTILIS BIỂU HIỆN
STREPTAVIDIN GẮN KHÁNG THỂ BIOTINYL HÓA
KHÁNG VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TÔM

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC


NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN THỊ VÂN ANH




Hà Nội - 2011
Luận văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y
Khóa 2009-2011 1
MỤC LỤC
DANH M i
BNG VIT TT iv
M U 1
U 3
   BACILLUS SUBTILIS  U HIN PROTEIN NGOI LAI
 M 3
1.1.1. N vi khun 3
 Bacillus subtilis 4

1.2. STREPTAVIDIN 10
1.2.1. Gii thiu chung v streptavidin 10
1.2.2. Ca streptavidin 11
1.2.3. Cu to ca biotin 11
-biotin 12
1.2.5. Thit k tr     ca streptavidin vi mt v  n biotin
duy nht 13
M TRNG   15
1.3.1. Gii thiu chung v bm trng  m trng 15
1.3.2. Protein v VP28 ca virus WSSV 17
m trng   17
   B. subtilis biu hi    m  -  ng
dng 18
1.4. PHN T MIN DNG DNG 19
 21
2.1. U 21
2.1.1. Chng vi khun 21
 kit 21
p mi 21
2.1.4. Mm bm trng 22
 22
 23
chit ADN h gen t vi khu 23
t plasmid t vi khun 23
t ADN h gen ca virus t mnhim WSSV 24
Luận văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y
Khóa 2009-2011 2
c hiu bng k thut PCR 24
 25
2.2.6. Bin np vector ch  bin E. coli chng DH5 25

2.2.7. X p enzyme gii hn 26
2.2.8. Phn ng gng T4 ADN ligase 26
2.2.9. Dung h gen ca Bacillus subtilis chng PY79 27
2.2.10. Kim tra s t c gen ca B. subtilis 27
y t 28
2.2.12 Kim tra s biu hin ca protein dung hp b    
min dch (Western blotting) 28
2.2.13.    30
2.2.14. G -strep 30
2.2.15. Nhu-strep  -biotinyl 31
2.2.15. Thu dch nghim trng t mm
bnh 31
2.2.16. Phn t th c (Reverse passive latex agglutination) 31
ng s bn copies ca WSSV bng k thu m
(Realtime PCR) 31
T QU O LUN 33
N GEN STREPTAVIDIN COTB
 GEN B. subtilis 33
 
ng l ngun ADN h gen ca
Streptomyces avidinii cotB t ADN h gen ca B. subtilis i ti
thc hin phn ng PCR vt cho t 33
n gen cotB  35
n gen streptavidin cotB 37
n gen dung hp cotB-streptavidin  gen B. subtilis 40
     BIU HIN PROTEIN DUNG HP COTB-
 M B. subtilis 42
3.2.1. Kim tra kh  ca t B. subtilis  hp 42
3.2.2. Kim tra biu hin ca cotB-    b  
thn dch 43

Luận văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y
Khóa 2009-2011 3
 T CA -STREP V
-BIOTINYL. 44
      t c  -strep v    
-biotinyl 45
   ng s   a phc h  -strep-  
 VP28-biotinyl 48
3.4. PHN   T MIN DCH TH NG KIM TRA
S T CM TR 50
nh n virus trong dch nghin bng Realtime PCR 51
3.4.2        t gi  -strep g  
-biotinyl vi dch nghim WSSV 54
       n   t gi  -strep gn
 -biotinyl v  56
U TIP THEO 60
U THAM KHO 61
C 61
 61





Luận văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y
Khóa 2009-2011 i
DANH MỤC CÁC HÌNH


Trang


nh hin t  Bacillus subtilis
4

a n B. subtilis
4

Cu to n B. subtilis.
5

Chu k sng c
6
H5
n di SDS-PAGE mt s protein ca l
8
6
 axit amin ca cotB v lp lc gch

9
7
H thng biu hi m s dng protein ca l

9
8
 gm 183 axit amin ca streptavidin
11
9
Ca Streptavidin vi 4 tiu phn ging nhau
11


c cu ta biotin
12
11
 trytophan vi biotin
12
12
Ma streptavidin vi
biotin
13
13
Cng (loop) ca streptavidin
13

Streptavidin d
14

 bm trng vm trng xut hin  u
15
16
m trng  
16
17
Phn t hng cu
19
18
a gen dung h gen B. Subtilis
27
19
 vector pDG364
21

20
     c t    hp pDG 364 cotB
streptavidin
32

Kt qu n di sn phn gen streptavidin 
cotB
33
Luận văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y
Khóa 2009-2011 ii


Trang
22
Kt qu n di sn phm ct enzyme gii hn ca vector pDG364
35
23
Kt qu n di sn phm PCR kin lc bng cp mi
364Fw/Rv
36

Kt qu n di  streptavidin 
pDG 364 cotB
37

Kt qu n di sn ph











364
38
26
Kt qu n di 

m tra th  hp bp
mi
39
27
Kt qu n di sn phm ct enzyme gii hn ca vector  hp
pDG364 cotB-streptavidin
40
28








364-cotB-streptavidin
41


Kim tra s t ca gen dung hp trong ADN h gen Bacillus
subtilis
42

 
43
31
Kt qu thn dch kim tra s biu hin ca protein dung
hp
44
32
Kim tra kh  n c   v   biotinyl  

45
33
M-strep gn v -biotinyl
o qun
46

Kim tra kh  n c   v   biotinyl  

47

Bi th hi -biotinyl hp ph 
-strep    
49
36
ng ct
51
37

Kim tra s t ca virus trong mu dch nghin
52
38
Kt qu n di sn phm PCR kim tra WSSV   pha

52
Luận văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y
Khóa 2009-2011 iii

Kt qu  bn copies trong dung dch virus  
n 
54

Kim tra kh n t c
55

Phn   t gi  -strep-    
 g
57

Phn   t gi  -strep-    
VP28- biotinyl v 
59
Luận văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y
Khóa 2009-2011 iv
BẢNG VIẾT TẮT

APS Ammonium Persulphate
BSA Albumin huy
CBB Coomassie Blue Brillant

dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate
EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid
kDa Kilodalton
LB Luria Bertani
PAGE n di gel polyacrylamide (Polyarylamide Gel Electrophoresis)
PBS Mui chm phosphate (Phosphate Buffered Saline)
PCR Phn ng chui polymerase (Polymerase Chain Reaction)
PMSF Phenyl Methylsulphonyl Fluoride
PVDF Polyvinylidere Fluoride
RPLA Phn t th c ( Reverse Passive Latex
Agglutination)
SDS Sodium Dodecyl Sulphate
TEMED -Tetramethyl-Ethylenediamine
WSSV m trng (White Spot Syndrome Virus)


Luận văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y
Khóa 2009-2011 1

MỞ ĐẦU
 Bacillus subtilis t trong nhc
nhi t bn nhic hc bit




 
. Hbiu hin 



, 













t
b. 

 mt 




 v.v 




















 , 






 



 

















, 









, 





 v.v
























H Sin

, 













 hoc v c biotinyl
. BBacillus subtilis b





 (gi t-
strep) 





 

 

-strep  c s
dng t chng nh kh  gn v c biotinyl
 vi nhiu   n nhit, bn v       
c ng nht c micromet, hy vng s    
a vi sinh ve  phc v 
ng d
m trng   (WSSV) 

tr bin  ,  yu ng tn hi kinh
t li vi  gii. Hit
bin php cha tr hu hii vi bnh bnh do virus WSSV gy ra. Do
vn st trong
vi a b  m tr   t nhi  
cs d   n s  t c       
n dch, que th 
 u kin tin cho vi 
nghi           ng th   
nghit cao.
Luận văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y
Khóa 2009-2011 2








,  Tạo bào tử Bacillus
subtilis biểu hiện streptavidin gắn kháng thể biotinyl hóa kháng virus gây
bệnh đốm trắng ở tôm vi m-n kt   vi
 m trng  nhm
n s t c m trng trong m n ng
g kt      n d   
nhin, d  tii rung

Luận văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y
Khóa 2009-2011 3

Chƣơng I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1   BACILLUS SUBTILIS  U HIN PROTEIN NGOI LAI
 MT 
1.1.1. Nội bào tử vi khuẩn
N t dng sc bit ca vi khun, gp  mt s vi khun
  Bacillus, Clostridium, Sporosarcina )    
(Sporomusang sng tr c nghiu
ng, nhi i t  sinh ra mt  
ph  nm [1].
N   i nhi  i 90
0
C), vi
tia t ngot dit khui s n. Trong
th ca vi khu hin bt c mt hoi cht
i ta gng n (cryptobiosis). Tui th ca n
g sng t m
tui 25 tri mt tinh th mui 250 trii.
  m quan trng thc tin ln
c vi sinh vt hc thc phc. S d t
u thun li. Th nhnh c
 cp     c chng minh bi
trong thc t dng rt nhiB. subtilis, B. natto 
phn ph n phm cha tr n h 
Mt s sn ph  c sn xut r php [10].
a, mt thc th phc ty ( B. subtilis 
   c to ra ch  (6-8 gi  
s ng hp) theo mc cht ch, s rp cho viu
 thit k c phc tp.
Hi      u ch yu thuc hai chi Bacillus 
Clostridium. Clostridium sng k , t  bin d

Bacillus sng hi  bin d
t [15 nh  Bacillus  tr  ng
 m.
Luận văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y
Khóa 2009-2011 4

Hình 1: Hình ảnh hiển vi điện tử quét của bào tử Bacillus subtilis [22]
1.1.2. Bào tử Bacillus subtilis
1.1.2.1. Cấu tạo nội bào tử B.subtilis
V        u hoc elip   ng
ng 0.8-

Hình 2: Hình dạng ngoài của nội bào tử B. subtilis [30]
V cu to, n p bao b 
t lp v i ca t , 
th n l ng 3 nm, cha
3-15 lp protein (chim 50-80% protein tng s ci vi
nhi chc, chi vt ca n.
 cha mt s  ny
mm c. N p v (cortex), chim 36-60% th a
nc cu to t i t
ut thm thu ca lp v 
c ca t u so vc
 (khong 40%). Cu a
Luận văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y
Khóa 2009-2011 5
- spore wall) bao quanh th sinh ch
ng ca t t th ng v
mi ch).

Hình 3: Cấu tạo nội bào tử B. subtilis. IC (Inner coat): l (outer
coat): lp p v. gap: khong trng gia li lp
v. Cl: khi bn cu to [8].
        i sao n    
 y. 15% trng
a n c kt hp v
c bi  i
nhi h n
. Gy trong n mt loi
 tht v
ADN c o v ADN chng li sc x, s 
cht.
c thp (10-30% so vi t ng) ca th sinh cht
  i nhit
rng nhi y t t ho 
i mc nhnh trong th sinh ch 
bo v chng l
2
O

2
. Cu cha mt s
Luận văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y
Khóa 2009-2011 6
enzyme sa cha ADN. ADN s c sa chy m
ng sau khc ho li. S  ng xy ra khi
ng thiu chc biu ngu
 n phi chi. V m 
n [2
- t nhim sc.
- T i xng, to ra m gn
.
- Ti c x.
- L      a 2 l     u
ng h
- K  








Hình 4: Chu kỳ sống của bào tử [25]
S ny m s xt s 
cht ho ny mc khy
mt nhanh (kho ny m
 cht h t axit amin, hoc mt mu
   t.





    i tii
   p th         b 
i v.
1.1.2.2. Một số protein đặc trƣng của lớp áo bào tử B. subtilis
n cu to c 
l l  ng l
Luận văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y
Khóa 2009-2011 7
 ng u v  y
rng l thc ra r co li hoc phng to [14]
m then ch

  kh 
 ny mm.
 B. subtilis t 
lng 1 li
mt s lo8].
Bảng 1: Một số protein trong lớp áo bào tử vi khuẩn B. subtilis
Lp trung ca 4 loh 5
kDa), cotB (59 kDa), cotG (37 kDa), cotC (12 kDa). u cha
nh lp li 12- bi].
 a nhiu loi protein b mt vn
 u cn k.  gii, nhn biu hin
mt protein ngo m mi ch tp trung ch yi protein
ca l       c t, hai yu t  a l   
n thi  ny mm.



  dng cotB hay cotC trong h thng
biu hin b m           a
ch d dung hp vi mm biu
hin protein ngoi lai  m B. subtilis

Lo
peptide
KLPT
(kDa)
   


cotA
65


cotB
59


cotC
12


cotD
11



cotE
24


cotG
24


cotH
42,8



Luận văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y
Khóa 2009-2011 8

Hình 5: Ảnh điện di SDS-PAGE một số protein của lớp áo ngoài bào tử [7,12 ].
1.1.2.3. CotB - yếu tố dung hợp
 cp  t protein nm  l.
  cho cotB chu s u khin bi hai yu t 

 t loi
protein gn votB ch din ra trong t  
y ra  trong t c tng hp trong t t
ca t c l
c nhng bng chng cho thy mi quan h ph thuc gia cotB vu t
ng c
ca cotB [14]. otC, cotB c dung hp vi
 i trc chuyn d ng h thng
biu hin  m men.

   t trong nh  m ni bt khi s d o t 
thng biu hin b mt [6].
u tc mc to b lp li gm 27
m t
50%  u C.
Luận văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y
Khóa 2009-2011 9
Hình 6: Trình tự axit amin của cotB với 3 trình tự lặp lại liên tiếp đƣợc gạch
chân gồm 27 axit amin giàu serine [156
Vic thit k mt protein dung h    d   
 u hin protein dung h m c ti
trong nhii gic nhiu kt qu khi
 nghim thc t [13,14]. Nhng h th  


Hình7: Hệ thống biểu hiện trên bề mặt bào tử sử dụng protein của lớp áo bào tử.
Protein dung hợp gồm phần màu xanh dƣơng là protein chuyên chở và phần màu
hồng là một protein ngoại lai [14]
Dc thit k protein dung h
cu u hin nhiu loa vi khu m
vi ti to ra mt th h vaccine th hai bn, d bo qu s dng.
Luận văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y
Khóa 2009-2011 10
Mt trong nhc biu hi m B.
subtilis n peptide 459 axit amin u C cc t u- terminal
fragment of the tetanus toxin, vit tn dung hp.
c ri 1,5x10
3
 c biu hi
mt ca mn b c hiu c

nghic tiy  c hiu vi
TTFC trong huyc m 
 phn ng li l l i thp [13,31]. Rt gn
y, u ca D. ng s s dng hai yu t dung h
 ch t B. subtilis biu hi
cm trng WSSV (gi t-VP28). -
c s dng vaccine dng uc b sung v
xanh. Nhng s liy, m
trng, t l t vong c-VP28 -
v  i ch          l t vong  
Nhng kt qu b biu hi 
kh ng li bm trng   [8]. Nh
gi trong sn xut vaccine th h m ng ung
hay dng xng mt s bnh nguy him hi
bnh lao  i, b  Nh thu bo qun
trong mt thn, d i
hiu qu kinh t   ng cho vin
vaccine th h mi.
1.2. STREPTAVIDIN
1.2.1. Giới thiệu chung về streptavidin
K t        bi Chaiet ng s,
 c ng dng nhi   c y h    c bit
        [5, 17   c sinh ra bi
Streptomyces avidinii     khong 60 kDa, gm 4 ti 
ging hc g. Gen streptavidin 
gm 183 axit ami  u. Streptavidin
m 159 axit amin [4]
    i sau d    -127 axit amin vi v   u
-13 hoc Glu-).
Luận văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y

Khóa 2009-2011 11






Hình 8: Trình tự gồm 183 axit amin của streptavidin (A), protein trƣởng thành của
nó (B) và trình tự lõi gồm 125-127 axit amin (C) [18].
i kh t vi
biotin, m c g16]. Vi hng s
a phc h 
d
~ 4x10
-14
 t trong nh
k mnh nhc bin t c ti nay.  gn d 
vi nhiu lo   sinh h     hydrate  
nh  t vi streptavidin [6].  


c ng dc tin.
1.2.2. Cấu trúc của streptavidin
Mi ti streptavidin gm 8 chui  chy song song k n
vi nhau bt hydro, t (- barrel structure). Mi
chui  i tng), v t vi
biotin nm     Hai ti    t vi nhau b  t
hydro ti xng [18]. Ci xc th cu
u c).

Hình 9: Cấu trúc không gian của streptavidin với 4 tiểu phần giống nhau [20].
1.2.3. Cấu tạo của biotin
Luận văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y
Khóa 2009-2011 12
c bi
7

h
10
H
16
N
2
O
3
t hp ch thiu  m sinh vt.
Ch      n chuy     
n 
V cu to, biotin g       chui
 u t0). Kh cng
244 Da [18].
Hi      c nhi g sn xu i dng gn
i d
gn d    t vi gc sulfhydro hay axit amin

lysine c protein.

Hình10: Công thức cấu tạo và cấu hình không gian của biotin [24]
1.2.4. Tƣơng tác streptavidin-biotin
Gi t bn gi
u c nh
 c Van der Waals gia Trp-79, Trp-92, Trp-108 ca mt
ti -120 ca ti i xng k i biotin [28).

Hình 11: Tƣơng tác giữa 4 phân tử trytophan (màu xanh) với biotin (màu vàng) [28]
Luận văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y
Khóa 2009-2011 13
Th i li biotin va
).

Hình 12: Mạng lƣới liên kết hydro trong vùng tƣơng tác giữa streptavidin với biotin [26]
Cu cng (loop)  cui chu2)

Hình 13: Cấu trúc thòng lọng (loop) của streptavidin [27]
Hi mi quan h gia ca h thc cao
i nhiu lc thit k thuc mi hay nhng cht gn (ligand)

1.2.5. Thiết kế trạng thái đơn hóa trị của streptavidin với một vị trí gắn biotin
duy nhất
 tr    t ti   duy nh  c gi  
biotin s git 10
4
l n biotin c tham gia
ca tiu ph nh. Tuy  t hng s    
n vic thit k u phn vi nhiu

ting dng [10].
Luận văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y
Khóa 2009-2011 14
 yu hi to ra streptavidin tr 
t bin dn ti axit amin  mt s v i s
thay th i kt qu. Tt bin thay th ng thi asparagine 23
rc gia
streptavidin vi biotin nhiu l   K
d
ch  ng 7x10
-5
. Trong mt
         t bin thay th     
rtate. Dt bic s c trn vi
dc ggm 6 Histidin (6Histag) theo t
l 3:1.    n g c ti      m mui
phosphate PBS (phosphate buffered saline). Cun hp s c tinh sch
nh ct Nickel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA). Bt k
c streptavidin  du ph bt ho 
mt tiu phn duy nh gn vi biotin vc gng d
thu (14

14B) 

ng s a streptavidin d
tr i K
d
~ 4,8x10
-14


-14
[20].
A
B

Hình 14: Streptavidin dạng đơn hóa trị
Luận văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y
Khóa 2009-2011 15
A: Dạng tetramer ban đầu với 4 vị trí gắn với biotin đƣợc thiết kế thành dạng đơn
hóa trị với 3 tiểu phần bị bất hoạt (màu xám) và chỉ một tiểu phần có thể gắn với
biotin [10].
B: Ba axit amin bị gây đột biến (ảnh trái) và streptavidin dạng đơn hóa trị (ảnh phải)
1.3. VIRUS M TRNG  
1.3.1. Giới thiệu chung về bệnh đốm trắng ở tôm và virus gây bệnh đốm trắng
Hi chng m trng  ng gp  s
virus m trc gi tt l
c pht hin t nm 1993 ti khu vc ng Nam  [20]m
virus WSSV thng pht b   ng 45-   
nh do virus WSSV mang nhng du hiu c trng nh b n, l d, cp m
ao, xut hin cc m trng nh p v kt hp vi hin tng  
virus s   nhiu b phn c 
trng, m  virus  sinh sn rm bnh
np tnh cho c 
9].

Hình 15: Tôm bị bệnh đốm trắng với các đốm trắng xuất hiện ở đầu [31]
V ng truyn bnh, b 
nhau. Th nht, b truyn t  m Th hai, b
Th ba, ngun
c c nhim virus m trvirus m tr

n ti trong khong cu t ng l mn t 5-
40 ph pH t 4- ng  nhi 0
o
 ch cht khi
nhi n 80
o
 n ti ca virus m trng trong
c rt cao. Th , b ng c 
Luận văn Thạ c sĩ Khoa họ c Bùi Thu Thủ y
Khóa 2009-2011 16
i, Th 
dn te mc bnh.
Virus m trng  i virus 
bin  ,  yu ng tn hi kinh t li vi
 gii. Mm, virus s  lan rt
ng bnh cng v  y sinh
c c x Baculoviridae bi v
virus a 1 nucleocapsit vng xo
t 13 protein th yu. n khi b gen ca WSSV gm 305 kb
c git qu   ch ra rng b gen c
cha 181 c m (open reading frame, ORF) bao gm 39 protein c
vi 9 protein v, 6 protein v trong s    c d m
       
nh v nh v
trong lp v  ging vi  t c
virus hoc cn nac x
h virus mNimaviridae thuc chi Whispovirus [19, 21].

Hình 16: Virus gây bệnh đốm trắng ở tôm [29]
n nay, nh bc quan trng nht

m virus WSSV  virus   ch, do vy 
 ca virus c tc ti
. Ph t  r m phc t c khin
WSSV tr  x 