Nghiên cứu thiết kế chuỗi polypeptide có khả năng ức chế độc tố thần kinh α - CBTX của nọc rắn hổ mang đất (naja kaouthia) bằng phần mềm discovery studi

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
  


ĐINH THỊ LAN



NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ CHUỖI POLYPEPTIDE
CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ĐỘC TỐ THẦN KINH α – CBTX
CỦA NỌC RẮN HỔ MANG ĐẤT (NAJA KAOUTHIA)
BẰNG PHẦN MỀM DISCOVERY STUDIO




LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC





Đề tài được thực hiện tại Phòng Kỹ thuật Di truyền
Viện Công nghệ Sinh học – Viện KH&CN VN


Hà N
ộ

i 2012



ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



Đinh Thị Lan



NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ CHUỖI POLYPEPTIDE CÓ KHẢ NĂNG
ỨC CHẾ ĐỘC TỐ THẦN KINH α – CBTX CỦA NỌC RẮN HỔ MANG
ĐẤT (NAJA KAOUTHIA) BẰNG PHẦN MỀM DISCOVERY STUDIO

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 30


LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC



NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS. TS. Trương Nam Hải


Đề tài được thực hiện tại Phòng Kỹ thuật Di truyền

Viện Công nghệ Sinh học – Viện KH&CN VN


Hà N
ộ
i 2012

Luận văn thạc sĩ – K18 Học viên: Đinh Thị Lan



MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Tổng quan về độc tố nọc rắn 3
1.2. Thụ thể nicotinic acetylcholine và ứng dụng trong y học 5
1.3. Tình hình nghiên cứu trong nước 8
1.4. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 9
1.5. Phần mềm sử dụng trong mô hình hóa và mô phỏng cấu trúc protein 10
1.6. Lựa chọn mục tiêu nghiên cứu 13
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 16
2.1. Vật liệu và trang thiết bị 16
2.2. Phương pháp 17
2.2.1. Chương trình mô phỏng cấu trúc polypeptide 17
2.2.2. Phương pháp mô hình hóa cấu trúc phức hệ polypeptide với α-Cbtx 19
2.2.3. Phương pháp mô phỏng động học phân tử 20
2.2.4. Nhân bản đoạn oligonucleotide bằng PCR 22
2.2.5. Phương pháp thiết kế vector tái tổ hợp mang trình tự oligonucleotide 22
2.2.6. Phương pháp biểu hiện trong qui mô bình tam giác 23

2.2.7. Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn E. coli 24
2.2.8. Phương pháp chuẩn bị mẫu cho tinh chế polypeptide tái tổ hợp 25
2.2.9. Phương pháp tinh chế polypeptide bằng HPLC 26
2.2.10. Phương pháp thử độc tính cấp của độc tố α – Cbtx và polypeptide. 27
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29
3.1. Nghiên cứu thiết kế polypeptide ức chế nọc rắn bằng mô phỏng 29
3.1.1. Kết quả mô hình hóa cấu trúc polypeptide ức chế nọc rắn 29
3.1.2. Kết quả đánh giá chất lượng của mô hình cấu trúc chuỗi polypeptide 30
Luận văn thạc sĩ – K18 Học viên: Đinh Thị Lan


3.1.3. Kết quả tạo phức hệ chuỗi polypeptide với độc tố thần kinh α – Cbtx 31
3.2. Biểu hiện và tinh chế các đoạn polypeptide 35
3.2.1. Tổng hợp các đoạn oligonucleotide bằng PCR 35
3.2.2. Tách dòng các đoạn oligonucleotide trong vector pCR2.1 36
3.2.3. Thiết kế vector biểu hiện pET_peptide_model 36
3.2.4. Kết quả sàng lọc khuẩn lạc đủ điều kiện 37
3.2.5. Kết quả biểu hiện polypeptide tái tổ hợp 38
3.2.6. Kết quả kiểm tra tính tan của các polypeptide được biểu hiện 39
3.2.7. Kết quả tinh chế polypeptide tái tổ hợp trên cột phân tích 40
3.2.8. Kết quả tinh chế polypeptide tái tổ hợp trên cột bán điều chế 41
3.3. Kết quả kiểm tra hoạt tính sinh học của các đoạn polypeptide tái tổ hợp 42
3.3.1. Kết quả thử độc cấp tính của α-cobratoxin và polypeptide 42
3.3.2. Tác dụng của peptide khi tiêm vào chuột đã bị tiêm nọc độc rắn. 44
3.3.3. Tác động của hỗn dịch polypeptide và α-cobratoxin trên chuột 45
Chương 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47
4.1. KẾT LUẬN 47
4.2. KIẾN NGHỊ 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

Luận văn thạc sĩ – K18 Học viên: Đinh Thị Lan





DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Trình tự 5 chuỗi polypeptide được thiết kế 15
(Các amino acid màu đỏ là các amino acid được thay thế) 15
Bảng 2: So sánh mức năng lượng của các phức hệ từ chương trình
“Standard Dynamics Cascade” 31
Bảng 3: Kết quả Standard Dynamics Cascade 34
Bảng 4. Độc tính cấp của α-cobratoxin trên chuột thí nghiệm 43
Bảng 5. Độc tính cấp của peptide trên chuột thí nghiệm 44
Bảng 6: Tác động của peptide lên tỷ lệ chết của chuột đã bị tiêm nọc rắn 44
Bảng 7. Tác động của hỗn dịch peptide và α-cobratoxin trên chuột thí nghiệm 45


Luận văn thạc sĩ – K18 Học viên: Đinh Thị Lan


DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Các kiểu cấu trúc của nAChR 6
Hình 2: Kênh dẫn truyền tín hiệu thần kinh qua synap 6
Hình 3: So sánh trình tự thụ thể nAChR của người và của gà 14
Hình 4: Hệ thống sắc ký HPLC của Shimadzu, Japan 17
Hình 5: Giao diện phần mềm LC solution 26

Hình 6: Kết quả Alignment Structure Modeler của 4 cấu trúc khuôn 29
Hình 7: Cấu trúc peptide mô hình so sánh với các cấu trúc khuôn 30
Hình 8: So sánh giá trị DOPE giữa các mô hình cấu trúc peptide khác nhau 30
Hình 9: Các pose trong kết quả mô phỏng phức hệ Model2_a7 – α – Cbtx 32
Hình 10: Pose 1 (Model2_a7) với ZDock Score cao nhất 33
Hình 11: Pose 546 (Model2_a7) với Rdock score cao nhất 34
Hình 12: Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 2% 35
Hình 13: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt pCR_peptide_model bằng NcoI và
XhoI 37
Hình 14: Các khuẩn lạc được sàng lọc trên môi trường đĩa thạch LBA 38
Hình 15: Điện di protein tái tổ hợp trên gel Tricine-SDS PAGE 16 % 38
Hình 16: Kiểm tra dạng biểu hiện của polypeptide tái tổ hợp 39
Hình 17: Sắc ký đồ qui trình tinh chế polypeptide trên HPLC 40
Hình 18: Sắc ký đồ tinh chế polypeptide bằng cột bán điều chế LC-18 41
Hình 19: Polypeptide được tinh chế bằng HPLC 42




Luận văn thạc sĩ – K18 Học viên: Đinh Thị Lan


NHỮNG TỪ VIẾT TẮT


Amp Ampicillin
DNA Acid Deoxyribonucleic
CHARMm Chemistry at HARvard Molecular Mechanics
dNTPs Deoxyribonucleotide triphosphates
DOPE Discrete Optimized Protein Energy

DS Discovery Studio
E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

FPLC Flow Protein Liquid Chromatography
HPLC High Performance Liquid Chromatography
kDa Kilodalton
LB Luria - Bertani medium
LC
50
Lethal Concentration, 50%
LD
50
Lethal Dose, 50%
MCS Multi cloning site
nAChR

Nicotinic acetylcholine receptor
NMR Nuclear magnetic resonance
PCR Polymerase Chain Reaction
PDB Protein data bank
PDF Probability Density Function

PMSF Phenylmethanesulfonylfluoride
SDS Sodium Dodecyl Sulphate
TAE Tris - acetate - EDTA
Taq DNA polymerase DNA Polymerase của Thermus aquaticus
α-Btx α-bungarotoxin
α-Cbt x α-cobratoxin
Luận Văn Thạc Sĩ – K18 Học viên: Đinh Thị Lan

1

MỞ ĐẦU
Đã từ lâu, các loài rắn độc luôn là chủ đề được nhiều nhà khoa học đặc biệt
quan tâm và hình ảnh con rắn đã trở thành biểu tượng của ngành y dược học. Với 410
loài rắn độc trong tổng số 3000 loài rắn trên toàn thế giới, các nghiên cứu về cấu trúc
và chức năng của các thành phần độc tố có trong nọc rắn đã giúp con người hiểu
được cơ chế gây độc, đồng thời khai thác sử dụng các thành phần của nọc rắn theo
chiều hướng tích cực. Từ đó mà một loạt các sản phẩm có nguồn gốc từ nọc rắn đã ra
đời mang lại các thành tựu to lớn trong các ngành công nghiệp dược và công nghiệp
mỹ phẩm. Các hướng nghiên cứu về phát triển các sản phẩm thuốc và mỹ phẩm có
nguồn gốc từ nọc rắn cũng được phát triển. Một số loại thuốc ra đời và đã thể hiện
được vai trò không thể thiếu trong các phác đồ điều trị như huyết thanh kháng nọc sử
dụng điều trị bệnh nhân bị rắn độc cắn, các loại thuốc giảm đau, thuốc chống viêm
trong thấp khớp, đau cơ hay đau dây thần kinh dưới dạng thuốc tiêm hay thuốc mỡ
bôi ngoài da. Ngoài ra, các thành phần độc tố có trong nọc rắn còn được sử dụng để
bào chế một số loại thuốc có tác dụng điều trị bệnh cao huyết áp, các loại thuốc cầm
máu, chống chảy máu nội tạng, khống chế sự phát triển của tế bào ung thư, làm chậm
sự di căn của các tế bào ung thư,
Theo các nghiên cứu của Koh và cộng sự năm 2006, thành phần của nọc rắn
bao gồm rất nhiều loại protein, enzyme và một số các khoáng chất, trong đó nhiều
thành phần đã được xác định. Độc tố thần kinh của nọc rắn (-Neurotoxins) được
biết đến như là các độc tố thần kinh (neurotoxin) sau synap. Chúng là thành phần độc
nhất, chủ yếu được tìm thấy trong nọc rắn thuộc họ Elapidae and Hydrophiidae [48].
Chúng gây ra sự tê liệt thần kinh bằng cách gắn với các thụ thể nicotinic ở vùng sau
synap của hệ thống thần kinh cơ.
Ngoài các ứng dụng to lớn của nọc rắn trong việc nghiên cứu và phát triển các
loại thuốc trong điều trị thì hàng năm có hàng ngàn ca nhiễm độc dẫn tới tử vong do
bị rắn độc cắn. Theo số liệu thống kê của WHO năm 2009 ước tính trung bình mỗi
năm có khoảng 2.500.000 ca bị rắn độc cắn dẫn đến 125.000 ca tử vong, trong đó chủ

yếu là ở châu Á với 100.000 ca và châu Phi với 20.000 ca [17]. Riêng ở Việt Nam,
hàng năm có khoảng 30.000 ca bị rắn cắn trong đó có 22 % số ca là do rắn độc cắn.
Kháng huyết thanh kháng nọc rắn lần đầu tiên được tìm ra bởi Albert Calmette, một
nhà khoa học Pháp khi đó đang làm việc tại viện Pasteur Sài Gòn vào năm 1894 (là
loại kháng nọc rắn Naja naja). Sau đó vài chục năm, việc điều trị bằng các huyết
thanh kháng nọc đã mang lại cơ hội sống sót cho hàng ngàn bệnh nhân. Tuy nhiên,
Luận văn thạc sĩ – K18 Học viên: Đinh Thị Lan
2

việc sử dụng và bảo quản huyết thanh kháng nọc còn phức tạp, qui mô sản xuất còn
nhỏ hẹp do các hạn chế về mặt công nghệ. Đứng trước nhu cầu của thực tế cần phát
triển một loại thuốc hiệu quả dựa trên nền công nghệ hiện đại chúng tôi tiến hành
thực hiện đề tài: “Nghiên cứu thiết kế chuỗi polypeptide có khả năng ức chế độc tố
thần kinh α – Cbtx của nọc Rắn hổ mang đất (Naja kaouthia) bằng phần mềm
Discovery Studio”, nhằm mục đích thiết kế một polypeptide có ái lực gắn cao nhất
với độc tố α – Cbtx. Polypeptide này sau đó được nghiên cứu tách dòng và biểu hiện
dưới dạng tái tổ hợp trong tế bào E. coli BL21 với hiệu suất cao. Các polypeptide tái
tổ hợp được tinh chế bằng sắc ký lỏng HPLC để phục vụ cho mục đích nghiên cứu
thử nghiệm hoạt tính ức chế độc tố thần kinh α – Cbtx của độc tố nọc rắn.

Luận văn thạc sĩ – K18 Học viên: Đinh Thị Lan
3


Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về độc tố nọc rắn
Nọc rắn là một nguồn khá đa dạng của nhiều hợp chất với một phổ hoạt tính
sinh học rộng. Nhiều protein trong nọc rắn có hoạt tính enzyme của phospholipase
A
2

, proteinase, nucleotidase,

phosphodiesterase, và L-amino acid oxidase. Cùng với
hoạt tính xúc tác có thể tham gia vào hoạt động phân giải của tuyến nọc, các enzyme
này cũng bao gồm một số tác dụng dược học đa dạng như là tác dụng thần kinh,
nhiễm độc cơ, tổn thương cơ tim, tác dụng làm tan và chảy máu cũng như chống
đông máu. Một số protein và polypeptide trong các loại nọc rắn khác không biểu hiện
hoạt tính enzyme và do vậy được mô tả như những protein không có hoạt tính
enzyme. Các protein này thường có kích thước 5 đến 10 kDa bao gồm các độc tố
thần kinh, độc tố gây rối loạn tim, độc tố nhiễm độc cơ, các chất ức chế kênh ion và
các protein chống đông máu. Đến nay hơn 1000 protein trong nọc rắn không có hoạt
tính enzyme đã được xác định và được phân loại thành các họ protein như là: các độc
tố dạng 3 thùy gồm độc tố thần kinh và độc tố rối loạn tim, các chất ức chế serine
protease, các chất lectin, sarafatoxins, các yếu tố kích thích phát triển thần kinh, các
atrial

natriuretic peptide, các peptide kích thích bradykinin, disintegrin và helveprins
[29], [33].
Về phân loại, nọc rắn có thể được chia thành 2 loại: hemotoxic (tấn công mô
và mạch máu) và neurotoxic (tấn công hệ thống thần kinh). Nọc rắn thường không
màu hoặc có màu vàng nhạt phụ thuộc vào lượng L-aminoacide oxidase (riboflavin)
có trong nọc. Nọc rắn không ổn định ở nhiệt độ thường, do vậy để duy trì hoạt tính
sinh học của nọc rắn thì cần thiết phải tiến hành đông khô. Một đặc điểm đặc trưng là
có sự khác nhau về thành phần nọc giữa các loài khác nhau và ngay trong bản thân
mỗi loài. Sự khác nhau về thành phần nọc cũng được thể hiện giữa rắn con và rắn
trưởng thành, giữa các vùng địa lý khác nhau. Các protein nọc rắn, bất kể là có hay
không có hoạt tính enzyme, thường tiến hóa theo hướng phá hủy chức năng của các
mô, cơ quan và hệ thống sinh lý học. Do vậy khi nọc được đưa vào con mồi, nó gây
ra sự tấn công đồng thời trên nhiều mô khác nhau, dẫn đến nhiều cơ quan hoặc hệ
thống bị tổn thương và thường dẫn đến cái chết [44].

Độc tố thần kinh của nọc rắn (α-neurotoxin) cũng được biết đến như là các độc
tố thần kinh (neurotoxin) sau synap. Chúng là thành phần độc nhất, chủ yếu được tìm
Luận văn thạc sĩ – K18 Học viên: Đinh Thị Lan
4

thấy trong nọc rắn thuộc họ Elapidae và Hydrophiidae. Chúng gây ra sự tê liệt thần
kinh bằng cách gắn với các thụ thể nicotinic ở vùng sau synap của hệ thống thần kinh
cơ. Các độc tố thần kinh nọc rắn đã được nghiên cứu rộng rãi về khía cạnh mối quan
hệ giữa cấu trúc và chức năng cũng như tổ chức gen và biểu hiện dưới dạng tái tổ hợp
[9]. Các nghiên cứu đã chứng minh vai trò quan trọng của các độc tố thần kinh nọc
rắn trên phương diện nghiên cứu khoa học và ứng dụng trong Y-Dược.
Hiện nay, các nhà khoa học trên thế giới vẫn đang tích cực giải mã những bí
mật ẩn chứa trong thành phần của các loài rắn độc. Sự hiểu biết sâu hơn về thành
phần nọc và cách thức tiết ra nọc qua hàng triệu năm tiến hóa hứa hẹn sẽ khám phá ra
những loại kháng huyết thanh kháng nọc độc rắn tốt hơn trong tương lai đối với các
nạn nhân bị rắn độc cắn. Quan trọng hơn, các nhà khoa học sẽ khám phá ra nhiều loại
thuốc mới từ nọc rắn để chữa trị các bệnh ung thư, tim mạch và hàng loạt các loại
bệnh khác [30].
Độc tố alpha Cobratoxin (α – Cbtx) có nguồn gốc từ nọc rắn hổ mang đất N.
kaouthia. Độc tố này thuộc nhóm độc tố thần kinh nọc rắn chuỗi dài α-neurotoxin, có
khả năng gắn với ái lực cao với các tiểu đơn vị α của thụ thể nicotinic acetylcholine
tại màng sau synap của khớp nối dây thần kinh – cơ và một số mô tích điện. Độc tố
α – Cbtx được cấu tạo bởi 71 amino acid với 10 Cys tạo 5 liên kết disulfide, trong đó
Cys26-Cys30 tham gia vào quá trình gắn với thụ thể alpha 7 nicotinic acetylcholine
(α7nAChR).
Trình tự amino acid của độc tố α – Cbtx:
IRCFITPDIT SKDCPNGHVC YTKTWCDAFC SIRGKRVDLG CAATCPTVKT
GVDIQCCSTD NCNPFPTRKRP (NCBI ID: P01391)
Trong độc tố α – Cbtx các amino acid Cys 3, 14, 20, 41, 45, 56; Gly17, 40;
Pro46; Asn63; Tyr21 đóng vai trò quan trọng trong hình thành cấu trúc không gian;

Trp25, Arg33, Gly34 đóng vai trò chức năng, Cys26-Cys30, Lys35, Ala43, Ser58 và
Asp60 là những amino acid bảo thủ của nhóm độc tố nọc rắn chuỗi dài. Những bằng
chứng có giá trị liên quan đến ảnh hưởng của tính độc khi biến đổi hóa học đối với
các nhóm bảo thủ cho thấy các amino acid Trp25, Asp27, Arg33, Gly34 và Lys49
đóng vai trò quan trọng trong quá trình gắn của độc tố α – Cbtx đối với thụ thể
acetylcholine [10]. Có 6 amino acid đóng vai trò quan trọng trong liên kết với thụ thể
là Trp25, Asp27, Arg33, Arg36 và Phe65. Những aminoacid này thuộc vùng liên kết
với thụ thể cơ (Torpedo AChR) và thụ thể thần kinh (α7AChR), trong đó, Arg 33 có
vị trí gần với Tyr187 và Pro193 của α7 AChR. Ngoài ra, các amino acid Ala128,
Luận văn thạc sĩ – K18 Học viên: Đinh Thị Lan
5

Lys35, Cys26, Cys30 chỉ gắn chọn lọc với α7 AChR; Lys23 và Lys49 chỉ gắn với
Torpedo AChR [36].
1.2. Thụ thể nicotinic acetylcholine và ứng dụng trong y học
Nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) là các thụ thể tác động theo kiểu
choline, tạo thành những kênh gắn phối tử tại màng tế bào (không qua chất truyền tin
thứ hai). Đây là loại thụ thể thuộc nhóm kênh ion đóng - mở phụ thuộc vào các phối
tử và kênh này được khởi động bằng việc gắn acetylcholine – một trong những chất
dẫn truyền thần kinh nghiên cứu tốt nhất. Khi được giải phóng ra khỏi màng trước
synap, acetylcholine khuếch tán nhanh qua khe synap và kết hợp với cơ quan thụ cảm
ở màng của nơron thứ hai – còn gọi là màng sau synap. Kết quả làm thay đổi tính
thấm của màng làm ion Na
+
đi vào sau synap, gây khử cực màng nơron và làm xuất
hiện điện thế sau synap. Điện thế này nhỏ hơn và kéo dài hơn so với xung thần kinh.
Điện thế sau synap không tuân theo quy luật “tất cả hay không có gì” mà độ lớn nhỏ
của nó phụ thuộc vào số lượng chất dẫn truyền được giải phóng [6].
Dựa trên vị trí và đặc tính dược học, nAChR được chia thành 2 nhóm theo vị
trí định vị là nhóm định vị ở tế bào cơ và nhóm định vị ở tế bào thần kinh trung ương

[12]. Thụ thể nACh là những protein lập thể nằm xuyên màng, kích thước xấp xỉ 290
kDa. Cấu tạo chung gồm 5 tiểu đơn vị được sắp xếp tuần tự quanh một lõi ion trong
một mặt phẳng trực giao với màng tế bào [10]. Mỗi tiểu đơn vị được tạo thành bởi 4
chuỗi xuyên màng (MI, MII, MIII và MIV), ngoài ra còn có thêm vùng liên kết với
phối tử phía đầu –NH
2
, một cấu trúc vòng lớn và dễ biến đổi nằm giữa MIII và MIV.
Chuỗi MII của cả 5 tiểu đơn vị đều tham gia tạo thành lõi dẫn truyền ion [38], [47].
Ngoài cấu tạo đặc trưng của loại kênh ion phụ thuộc phối tử, mỗi nhóm thụ thể
nAChR lại có những sự kết hợp khác nhau của các tiểu đơn vị để tạo ra những nét
đặc trưng riêng. Nhóm thụ thể nAChR cơ cấu tạo dạng 2α1, 1β, 1δ và 1γ. Ngược lại,
thụ thể nAChR thần kinh được cấu tạo từ 5 tiểu đơn vị α cùng loại (α7, α9 hoặc α10)
[17]. Sự kết hợp đa dạng của các tiểu đơn vị trong nhóm thụ thể nAChR tác động lên
hệ thần kinh chính là đặc tính hấp dẫn các nhà nghiên cứu về hoá sinh học và dược
học. Xác định được vai trò của mỗi loại tiểu đơn vị trong các mô tự nhiên sẽ giúp
hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động cũng như vai trò của thụ thể nAChR và điều này chỉ
có thể tiến hành khi chúng ta phát triển được những mẫu dò chọn lọc đối với từng
loại tiểu đơn vị [19].
Luận văn thạc sĩ – K18 Học viên: Đinh Thị Lan
6


Hình 1: Các kiểu cấu trúc của nAChR
(Tiffany J. Davis and Christopher M. de Fiebre, Ph.D.)
Kênh thụ thể acetylcholin là kênh dẫn truyền các tín hiệu thần kinh qua synap
được nghiên cứu sâu nhất và nhiều nhất vì chúng đóng vai trò quan trọng trong quá
trình truyền xung thần kinh. Các xung thần kinh được truyền qua hầu hết các synap
bởi các phân tử nhỏ có khả năng khuếch tán gọi là các chất truyền thần kinh
(neurotransmitters) như acetylcholine. Màng trước synap được tách ra từ màng sau
khớp thần kinh bằng một khe hở khoảng 50 nm, được gọi là khe synap. Điểm kết

thúc của một sợi trục axon trước synap được lấp đầy bằng các bóng synap, mỗi bóng
chứa khoảng 10
4
phân tử acetylcholine (Hình 2). Một xung thần kinh mới xuất hiện
làm tiết ra acetylcholin từ đồng thời khoảng 300 bóng synap, làm tăng lượng
acetylcholine ở khe synap từ 10 nM lên 500 μM trong thời gian nhỏ hơn 1 mili giây
[50].

Hình 2: Kênh dẫn truyền tín hiệu thần kinh qua synap
(www.wikipedia.org; www.mult-sclerosis.org)


Luận văn thạc sĩ – K18 Học viên: Đinh Thị Lan
7

Sự liên kết của acetylcholin với màng sau synap làm thay đổi tính thấm ion
của nó một cách rõ rệt. Phân tử actylcholine đã mở ra một kênh trao đổi ion, tạo ra
tính thấm cân bằng của Na
+
và K
+
. Độ dẫn của cả Na
+
và K
+
tăng trong vòng 0,1 mili
giây, kéo theo một lượng lớn Na
+
vào trong và một lượng nhỏ K
+

ra ngoài. Sự xâm
nhập của Na
+
vào trong gây ra sự khử cực màng sau synap và sinh ra một điện thế
hoạt động. Sự chảy vào của Na
+
lớn hơn rất nhiều so với sự chảy ra của K
+
, do đó
gradient điện thế qua màng là do Na
+
sinh ra. Sự thay đổi tính thấm là do thụ thể
nicotinic acetylcholine điều khiển. Khoảng thời gian để kênh mở ra dưới tác động
của điều kiện sinh lý chỉ được đo bằng mili giây, vì acetylcholine trong khe synap
nhanh chóng bị thủy phân thành acetate và choline do enzyme acetylcholinesterase.
Enzyme này móc mỏ neo vào sau synap bằng liên kết cộng hóa trị với nhóm
glycolipid và có số quay vòng hoạt động rất nhanh (25.000 vòng/giây). Nếu nồng độ
acetylcholin còn lại cao, kênh sẽ tự đóng lại trong thời gian khoảng 1 giây, quá trình
này gọi là sự gây mê [6].
Trong cơ thể, nAChR tham gia vào quá trình dẫn truyền tín hiệu thần kinh từ
hệ thần kinh trung ương đến các cơ quan chức năng. Do vậy, sự biến đổi của thụ thể
nACh ở mức độ gen hay cấu trúc đều dẫn đến những bệnh liên quan đến chức năng
thần kinh. Các thí nghiệm đã cho thấy các thụ thể nicotinic acetylcholine làm trung
gian cho một số chức năng của não bộ như nhận thức và trí nhớ cũng như trong quá
trình diễn ra trạng thái bệnh lí của một số bệnh liên quan đến thần kinh như bệnh tâm
thần phân liệt, bệnh Alzheimer, bệnh Parkinson, hội chứng Tourette và một vài dạng
động kinh [18], [49]. Dựa vào những kết quả nghiên cứu mô hình cấu trúc của
protein liên kết với acetylcholine (AChRP) cho thấy thụ thể nACh là những protein
lập thể với sự chuyển đổi giữa một loạt các trạng thái cấu trúc (nghỉ - hoạt động –
đóng) khi hoạt động. Nếu các phối tử là những chất ức chế (antagonist) thì chúng sẽ

gắn với thụ thể và chuyển thụ thể sang trạng thái nghỉ và làm dừng hoạt động. Trong
trường hợp các phối tử là chất kích thích (agonist) thì sau khi bám nó sẽ giữ thụ thể
trong trạng thái mở và qua đó sự dẫn truyền các tín hiệu thần kinh diễn ra bình
thường [21], [27]. Một số động vật có nọc độc như rắn, bọ cạp, hay ốc sên thường
tiêm hỗn hợp gồm các protein và peptide vào con mồi để làm tê liệt cơ và khiến
chúng không có khả năng trốn thoát. Với vị trí và vai trò quan trọng trong dẫn truyền
tín hiệu thần kinh, thụ thể nACh là đích tác động chủ yếu của các peptide độc tố. Cho
đến nay, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng độc tố thần kinh sau synap được phân lập từ
các loài rắn thuộc hai họ Elapidae và Hydrophiidae là những antagonist gắn với thụ
Luận văn thạc sĩ – K18 Học viên: Đinh Thị Lan
8

thể nACh với tính chọn lọc và ái lực cao. Các độc tố như: α-bungarotoxin (α-Btx),
độc tố thần kinh chuỗi dài có trong nọc rắn cạp nong Bungarus multicinctus, và α-
cobratoxin từ nọc của rắn hổ mang N. naja siamensis (hay còn gọi là N. kaouthia)
đều có khả năng bám vào thụ thể và làm cho thụ thể chuyển sang trạng thái nghỉ. Sử
dụng kỹ thuật NMR và xác định cấu trúc tinh thể đã cho thấy mô hình chung của 2
loại độc tố trên và của nhóm độc tố thần kinh nọc rắn nói chung có dạng 3 thùy, bao
gồm các phiến β liên kết với nhau bởi các vòng nhỏ, được ổn định bởi các cầu
disulfide. Thêm vào đó, đỉnh của cấu trúc thùy thứ 2 tạo thành xoắn α nhỏ có chứa
các amino acid quan trọng liên kết với nAChR [19], [43].
1.3. Tình hình nghiên cứu trong nước
Việt Nam là một nước nhiệt đới thuộc khu vực Châu Á Thái Bình Dương có
90 phần trăm diện tích là rừng rậm và đất nông nghiệp, với bờ biển dài trên 3200
kilomet. Những đặc điểm này thích hợp cho sự phát triển của các loài rắn. Các kết
quả khảo sát đã cho thấy có hai họ rắn độc trú ngụ ở Việt Nam là rắn hổ (Elapidae)
và rắn lục (Viperidae) với 9 loài chính là: rắn hổ đất hay còn gọi là rắn hổ 1 mắt kính
(N. kaouthia), rắn hổ mèo hay rắn hổ 2 mắt kính (N. sumantra), rắn hổ 2 gọng kính
(N. Atra), rắn hổ chúa (King Cobra - Ophiophagus Hannah), rắn cạp nong (Bungarus
Fasciatus), rắn cạp nia (Bungarus Candidus), rắn lục xanh (Green Pit Viper –

Trimeresurus) gồm rắn lục tre môi trắng (Trimeresurus Albolabris) và rắn lục tre
xanh miền nam (Trimeresurus popeorum), và cuối cùng là rắn biển. Mặc dù có một
nguồn tài nguyên các loại rắn độc tương đối phong phú nhưng những nghiên cứu sâu
về thành phần của nọc rắn vẫn còn hạn chế ở Việt Nam. Từ năm 1990, Trịnh Xuân
Kiếm cùng cộng sự đã sản xuất và thử nghiệm thành công kháng huyết thanh kháng
nọc của hai loại rắn độc phổ biến ở miền Nam là N. kaouthia và Calloselasma
rhodostoma [4]. Hoàng Ngọc Anh cùng cộng sự đã phân tách được từ nọc rắn N.
naja 4 phân đoạn chứa các peptide nhỏ có khả năng gây chết khi tiêm vào chuột thí
nghiệm [1]. Gần đây, các nhà khoa học ở Viện vắc xin và chế phẩm sinh học Nha
Trang cũng đã sản xuất và thử nghiệm thành công chế phẩm kháng huyết thanh
kháng nọc rắn tre xanh môi trắng, một loại rắn cũng khá phổ biến ở miền Nam Việt
Nam.
Do các loài rắn trú ngụ ở các vùng sinh thái khác nhau thì sẽ có những đặc
trưng khác nhau. Vì vậy, sự hiểu biết kỹ lưỡng về các thành phần có hoạt tính sinh
học có trong nọc rắn là rất quan trọng trong cả khía cạnh khoa học và thực tiễn. Thêm
vào đó, tính chọn lọc của các độc tố tự nhiên chính là chìa khóa cho các ứng dụng
Luận văn thạc sĩ – K18 Học viên: Đinh Thị Lan
9

khoa học. Các nhà nghiên cứu có thể nhận được các loại thuốc thích hợp xuất phát từ
những độc tố tự nhiên đó. Hiện nay, các độc tố tự nhiên, đặc biệt là có nguồn gốc từ
nọc rắn đang thu hút được sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học ở nhiều
nước trên thế giới về các khía cạnh như phân lập, tinh sạch và tìm hiểu cơ chế phân
tử của các độc tố. Ngoài ra, do lượng độc tố thu được từ tự nhiên bao giờ cũng rất
thấp nên với những kỹ thuật tiên tiến như tổng hợp protein trong các hệ biểu hiện
thích hợp (E. coli hay nấm men Pichia pastoris), khối phổ và mô phỏng động học
phân tử, các độc tố tự nhiên được xem như một mô hình để từ đó tổng hợp nên các
sản phẩm giống với chúng nhưng với số lượng nhiều hơn và được sử dụng làm thuốc
chữa trị rắn cắn và điều trị các loại bệnh trong y học [2], [3], [5], [7].
1.4. Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trong nhiều năm gần đây, độc tố thần kinh từ nọc rắn (snake neurotoxins) đã
thu hút sự chú ý của các nhà dược học và hóa sinh học trên thế giới. Độc tố thần kinh
rắn là các protein gây độc có trong nọc của các loại rắn như rắn hổ mang, rắn cạp
nong, rắn hổ và rắn biển. Chúng ngăn chặn sự dẫn truyền tín hiệu giữa các nơron
thần kinh và gây ra cái chết cho con mồi do ngạt thở. Những độc tố này được phân
loại thành hai nhóm riêng biệt liên quan đến chức năng thần kinh đó là các độc tố
trước synap và các độc tố sau synap. Các độc tố trước synap (hay còn gọi là các -
neurotoxin) ngăn chặn sự giải phóng acetylcholine từ tín hiệu thần kinh xuất phát
phía trước synap. Các độc tố sau synap (hay còn gọi là các -neurotoxin) gắn đặc
hiệu với thụ thể nicotinic acetylcholine nằm phía cuối dây thần kinh vận động và tạo
ra sự cản trở không phân cực của sự truyền dẫn thần kinh cơ [8].
Các độc tố thần kinh sau synap tạo thành một nhóm lớn các protein tương
đồng và chúng lại được phân chia tiếp thành 4 phân nhóm khác nhau là: (i) độc tố
thần kinh chuỗi dài, (ii) độc tố thần kinh chuỗi ngắn và cardiotoxin, (iii) -
neurotoxins và (iv) các độc tố thần kinh không điển hình. Mặc dù vậy, tất cả các độc
tố thần kinh sau synap đều có chung một kiểu cấu trúc gồm ba chuỗi beta chính nằm
song song với nhau. Do vậy, chúng cũng thuộc họ protein có tên gọi là “three-
fingered”.
Các độc tố thần kinh chuỗi ngắn và cardiotoxin tạo bởi một chuỗi polypeptide
dài 60-62 amino acid và được nối với nhau bởi 4 cầu disulfide ở các vị trí giữa C3-
C24, C17-C45, C49-C60 và C61-C66. Quá trình tiết của những protein này được trợ
giúp bởi trình tự tín hiệu tiết kị nước gồm 21 amino acid, sẽ bị loại bỏ trong quá trình
Luận văn thạc sĩ – K18 Học viên: Đinh Thị Lan
10

hoàn thiện. Cho dù giống nhau về độ dài và trình tự chuỗi polypeptide nhưng độc tố
thần kinh chuỗi ngắn và cardiotoxin có những tác dụng riêng biệt về mặt dược học.
Các độc tố thần kinh chuỗi ngắn ngăn chặn các thụ thể nicotinic acetylcholine
trong khi cardiotoxin gây độc đối với tim. Cả hai loại đều gây ra sự phân giải tế bào
bằng cách phá vỡ cấu trúc màng của tất cả các loại tế bào hoạt động cũng như không

hoạt động [39].
Các độc tố chuỗi dài được tạo bởi 70-74 amino acid với một cầu disulfide thứ
năm giữa C30-C34 đặt ở đỉnh của vòng xoắn thứ 2, ngoài ra còn có các cầu disulfide
giống với các độc tố chuỗi ngắn [20]. Ngược lại với các độc tố chuỗi ngắn, độc tố
chuỗi dài có một vài khác biệt ở trình tự cấu trúc bậc I đó là: mất một đoạn từ amino
acid số 4 đến số 16; có thêm một số amino acid ở các vị trí 32, 34, 35 và 36; có sự
thay thế Gly48 ở độc tố chuỗi ngắn bằng Thr48 ở chuỗi dài; sự có mặt của một đoạn
trình tự đầu -COOH gồm 5 đến 9 amino acid.
-Neurotoxins tạo thành một họ mới trong số các độc tố thần kinh có trong
nọc rắn. Cấu trúc của các -neurotoxin gần giống với các độc tố chuỗi dài, được tạo
bởi 66 nhóm amino acid và 5 cầu disulfide [23]. Chúng cũng bị mất một số amino
acid từ vị trí 16 tới vị trí 20 và bổ sung thêm một số amino acid giữa vị trí 36 và 40.
Tuy vậy, sự khác biệt ở -neurotoxin là có thêm một amino acid ở vị trí 62 [23]. Còn
lại các độc tố thần kinh không điển hình cũng được tạo bởi 65 hoặc 66 amino acid
nhưng cầu disulfide thứ năm lại nằm ở vòng xoắn thứ nhất chứ không phải vòng
xoắn thứ hai như đối với độc chuỗi dài và -neurotoxin.
1.5. Phần mềm sử dụng trong mô hình hóa và mô phỏng cấu trúc protein
Discovery Studio (DS), được phát triển bởi hãng Accelrys (Mỹ), là bộ phần
mềm chuyên dùng cho mô hình hóa và mô phỏng cấu trúc của phân tử protein.
Chương trình gồm nhiều module cho các mục đích nghiên cứu cấu trúc protein khác
nhau. DS Modeller tiến hành so sánh trình tự amino acid và cấu trúc không gian của
hai protein, phân tích thông tin về protein, mô hình hóa cấu trúc protein dựa trên cấu
trúc của một hay một số protein tương đồng đã biết, cho phép đưa các đột biến vào
cấu trúc phân tử protein. DS Ligandfit dùng cho gắn phân tử cơ chất hoặc các phối tử
vào vị trí gắn với thụ thể đích, DS Ligand Score tính toán tương tác giữa protein thụ
thể với phối tử dựa trên nhiều thông số khác nhau. DS CHARMm cho phép tính toán
giá trị năng lượng, mức năng lượng nhỏ nhất và tiến hành mô phỏng động học cấu
trúc phân tử. Đặc biệt, trong phiên bản mới hiện nay có thêm module DS TOPKAT
Luận văn thạc sĩ – K18 Học viên: Đinh Thị Lan
11

có chức năng đánh giá định lượng mối quan hệ giữa cấu trúc liên quan đến chức năng
để xác định nhiều chỉ tiêu khác nhau liên quan đến độc tính (LD50, EC50, LC50, log
P ). So với các phương pháp kiểm tra và sàng lọc truyền thống thường mất vài tuần
cho đến vài tháng, công cụ này cho kết quả nhanh, chính xác, tiết kiệm được chi phí
và có thể tiến hành với nhiều mẫu cùng một lúc. Bộ phần mềm Discovery Studio do
được phát triển dựa trên phiên bản Insight II (được chạy trên hệ điều hành Linux,
IRIS với hệ thống máy chủ và máy trạm chuyên dụng có cấu hình cao), được tích hợp
thêm nhiều tính năng hơn và đặc biệt là có thể sử dụng cả trên nền tảng Windows
(2000, XP) nên đã được rất nhiều công ty trong lĩnh vực dược phẩm, công nghệ sinh
học, hóa dược cũng như các trường đại học trên thế giới sử dụng.
Hai nguyên lý cơ bản mà phần mềm Discovery Studio sử dụng để làm việc
một cách hiệu quả với các phức hệ protein là:
a, Nguyên lý chung của mô hình hóa cấu trúc phức hệ protein sử dụng trường
lực
Trong các phương pháp trường lực, năng lượng điện tử với một cấu hình hạt
nhân cho trước được tính bằng cách viết lại Ee dưới dạng một hàm tham số của các
tọa độ hạt nhân. Các tham số đưa vào hàm này được lấy phù hợp với thực nghiệm
hay từ các phương pháp tính toán mức cao hơn. Phân tử được mô hình như hệ các
quả cầu và lò xo, gồm các nguyên tử được giữ với nhau bằng các liên kết. Các
nguyên tử được xử lí như trong cơ học cổ điển theo định luật II Newton.
Năng lượng trường lực được phân tách thành các số hạng mô tả năng lượng cần thiết
để làm biến dạng phân tử theo những kiểu riêng khác nhau.
E
FF
= E
str
+ E
bend
+ E

tors
+ E
vdw
+ E
el
+ E
cross
Trong đó,
E
str
: năng lượng cần để làm thay đổi độ dài liên kết giữa 2 nguyên tử
E
bend
: năng lượng cần để làm thay đổi góc liên kết
E
tors
: năng lượng xoắn, cần để quay quanh một liên kết
E
vdw
, E
el
: năng lượng tương tác nguyên tử-nguyên tử không liên kết
E
cross
: mô tả ảnh hưởng qua lại giữa ba số hạng đầu tiên.
E
FF
: Force Field Energy
Để tìm cấu hình bền của phân tử tương ứng với cực tiểu trên bề mặt thế năng,
ta tiến hành cực tiểu hóa E

FF
theo các tọa độ hạt nhân.
Đối với các phương pháp trường lực, các phép tính đều được viết ở dạng cơ
học cổ điển, do đó cho kết quả tính toán nhanh chóng, vấn đề cốt yếu của các phương
Luận văn thạc sĩ – K18 Học viên: Đinh Thị Lan
12

pháp này là xác định các tham số để đưa vào biểu thức tính. Khi tính cho hệ các phân
tử lớn, không thể xác định tham số cho từng nguyên tử, từng liên kết cụ thể và cũng
không thể xác định lại các tham số khi nghiên cứu các hệ phân tử khác nhau. Vì vậy
cần xây dựng bộ tham số có tính chất khái quát và rút gọn. Trong mỗi bộ tham số
được xây dựng, người ta xác định tham số cho các dạng nguyên tử theo số hiệu
nguyên tử và tính chất liên kết mà nó tham gia. Những bộ tham số này đều phải phù
hợp tương đối với thực nghiệm hoặc các phương pháp tính toán lượng tử mức cao.
Không có bộ tham số nào tuyệt đối tốt hơn các bộ tham số khác và không thể đưa
tham số từ trường lực này vào trường lực khác. Một số trường lực phổ biến như UFF,
Dreiding, Amber, CHARM
b, Kết hợp phương pháp cơ học lượng tử -cơ học phân tử trong mô phỏng động học
phân tử
Một trong những khó khăn chủ yếu của hóa học tính toán khi nghiên cứu các
hệ lớn là cân bằng giữa độ chính xác của kết quả và thời gian tính toán. Các phương
pháp tính toán lượng tử tuy cho kết quả chính xác nhưng lại không thích hợp với
những hệ như vậy do khối lượng tính toán quá lớn và việc thực hiện tính lượng tử
cho những hệ hàng nghìn nguyên tử là điều hoàn toàn không khả thi.
Một trường hợp điển hình là phương pháp kết hợp lợi dụng đặc điểm trong
hầu hết các phản ứng với xúc tác enzyme, quá trình phá vỡ và hình thành liên kết chỉ
xảy ra trên tâm hoạt động có sự tham gia của một số ít các nguyên tử trong phân tử
protein, ảnh hưởng của phần còn lại trên protein thường chỉ là về mặt không gian và
tương tác tĩnh điện. Trong phương pháp kết hợp, mỗi vùng được xử lý bằng một
phương pháp tính khác nhau. Phần hoạt động hóa học được xử lý bằng phương pháp

tính toán lượng tử mô tả chính xác sự phá vỡ, hình thành liên kết hóa học, phần còn
lại có thể được xử lí bằng các phương pháp đỡ tốn kém thời gian hơn. Nhờ đó vừa
mô tả được quá trình hóa học vừa tiết kiệm thời gian.
Trên thế giới cũng đã có nhiều công trình nghiên cứu thành công sử dụng
phần mềm Discovery Studio. Phải kể đến đầu tiên là thành công trong nghiên cứu
xây dựng cấu trúc protein caspase-5 (một họ protease cysteine có vai trò quan trọng
trong tế bào chết theo chương trình, hoại tử và sưng viêm) bằng mô hình hóa tương
đồng và tiến hành Docking với các chất ức chết capase-5 trên phần mềm DS 2.5 để
tìm hiểu cơ chế tác động của chúng [24]. Hay thiết kế thuốc cho điều trị cúm A
H1N1 bằng phần mềm Discovery Studio 2.0 (Accelrys, San Diego, CA, USA) với
trình tự mới của H1N1(2009) được download từ ngân hàng cơ sở dữ liệu trình tự
Luận văn thạc sĩ – K18 Học viên: Đinh Thị Lan
13

virus cúm NCBI. Các khuôn H1N1 có được từ ngân hàng dữ liệu protein (PDB).
Những cấu trúc này đã được công bố năm 2004 và năm 2006 với PDB ID lần lượt là
1RD8 và 2HU0. Từ đó đã xây dựng thành công cấu trúc mới nhất của N1 với độ tin
cậy cao bằng Verify Score plot và Ramachandran plot. Hơn nữa, 365.602 hợp chất
từ ngân hàng cơ sở dữ liệu NCI đã được sàng lọc và lần lượt tiến hành docking với
cấu trúc H1N1 thu được. Qua đó đã chọn lựa được 9 hợp chất là NCI0624650,
NCI0607158, NCI0605741, protoverine, NCI0605737, Kanamycin-C, NCI0608643,
NCI0606258, và NCI060865 có hiệu lực được lựa chọn để tạo ra các loại thuốc
chống H1N1 sử dụng thay thế cho các thuốc mà H1N1 đã trở nên kháng thuốc (cấu
trúc mới nhất của H1N1 đã kháng oseltamivir - loại thuốc điều trị cúm rất hiệu quả
trước đó) [25].
1.6. Lựa chọn mục tiêu nghiên cứu
Thụ thể nicotinic acetylcholine của người và một số động vật khác (nAChR)
được xác định là các protein lập thể nằm xuyên màng, có kích thước xấp xỉ 290 kDa.
Trong cơ thể, nAChR tham gia vào quá trình dẫn truyền tín hiệu thần kinh từ hệ thần
kinh trung ương đến các cơ quan chức năng [10]. Do một nguyên nhân nào đó mà thụ

thể nAChR không có khả năng tiếp nhận acetylcholine sẽ gây nên hiện tượng co giật,
mất tri giác hay bị tê liệt hệ thống thần kinh trung ương. Điều này có thể dễ dàng
nhận thấy ở các bệnh nhân bị rắn cắn, do độc tố nọc rắn xâm nhập vào cơ thể theo
đường máu, chúng len lỏi tới các tế bào cơ hoặc tế bào thần kinh, chúng tương tác ái
lực với các thụ thể cơ hoặc thụ thể thần kinh sau synap, từ đó làm cho các thụ thể này
không còn khả năng nhận acetylcholine, dẫn đến hiện tượng ngưng trệ quá trình
truyền dẫn tín hiệu thần kinh [6]. Các thí nghiệm đã cho thấy các thụ thể nicotinic
acetylcholine làm trung gian cho một số chức năng của não bộ như nhận thức và trí
nhớ cũng như trong quá trình diễn ra trạng thái bệnh lý của một số bệnh liên quan
đến thần kinh như bệnh tâm thần phân liệt, bệnh Alzheimer, bệnh Parkinson, hội
chứng Tourette và một vài dạng động kinh [18], [49].
Cho đến nay, cấu trúc bậc 3 của tiểu phần α7 của thụ thể nAChR của người
chưa được công bố, hầu hết các nghiên cứu đều tập trung nghiên cứu cấu trúc không
gian của thụ thể nAChR của gà. Hiện tại, các cấu trúc được tìm thấy trên ngân hàng
dữ liệu protein PDB chủ yếu là các chuỗi peptide được xây dựa trên trình tự lý thuyết
của gà. Hai phân tử cấu trúc 1kl8 và 1kc4 được xây dựng bởi phương pháp cộng
hưởng từ hạt nhân (NMR) và 4 phân tử cấu trúc gồm 1OL3, 1OL4, 1OL8, 1OL9
được xây dựng bằng phương pháp mô phỏng cấu trúc [12]. Bằng các phép so sánh về
Luận văn thạc sĩ – K18 Học viên: Đinh Thị Lan
14

trình tự giữa tiểu phần α7 của người và của gà cho thấy độ tương đồng giữa hai đoạn
trình tự là 91 %. Một số điểm khác biệt giữa 2 trình tự được quan tâm nghiên cứu
gồm: Ser-183, Arg-185, Val-197 ở người được thay thế bởi các amino acid tương
ứng là Thr, Ser, Ile trên trình tự ở gà.

Hình 3: So sánh trình tự thụ thể nAChR của người và của gà
Các nghiên cứu của các tác giả Moise, Harel và Bourne về cấu trúc của
nAChR đã chỉ ra được vùng trình tự tham gia vào quá trình gắn phối tử với độc tố
thần kinh α – Cbtx nằm trên tiểu đơn vị α7 [12], [37]. Vị trí các amino acid tham gia

vào quá trình gắn với độc tố được xác định gồm Cys192 và Cys193 là những vị trí
gắn với chất chủ vận và chất đối kháng; Tyr 93, 152, 190, 197 có ái lực cao với chất
chủ vận và chất đối kháng. Các nghiên cứu đột biến điểm đối với các nhóm trên đã
gây nên sự thay đổi về ái lực gắn từ 5 – 100 lần [12]. Các amino acid tại các vị trí
Trp-86, Tyr-93; Trp-150, Gly-153; Arg-186, Asp-199 đóng vai trò quyết định trong
việc tham gia vào liên kết gắn với phối tử. Một số các amino acid bảo thủ khác đóng
vai trò quyết định cấu trúc của thụ thể nAChR như Tyr-188, Tyr-195 và Cys-192/193
[21], [36].
Dựa vào các nghiên cứu cấu trúc được công bố, cùng với kết quả so sánh sự
khác biệt giữa trình tự nAChR của người và của gà, chúng tôi quyết định lựa chọn
đoạn trình tự có chiều dài khoảng 30 amino acid bắt đầu từ Leu-176 đến Arg-205
trên trình tự của chuỗi nAChR của người cho mục đích mô phỏng tạo cấu trúc lý
thuyết. Trên đoạn trình tự này, các amino acid nằm ở vị trí Cys -192/193 cùng với
các trình tự bảo thủ khác gồm Tyr-188, Tyr-195, Arg-186 và Asp-197 được giữ
nguyên trong trình tự của chuỗi polypeptide tiềm năng. Các vị trí khác được nghiên
cứu và thay thế bởi một số amino acid phù hợp với mục tiêu tăng cường ái lực của
Luận văn thạc sĩ – K18 Học viên: Đinh Thị Lan
15

chuỗi polypeptide lên độc tố thần kinh α – Cbtx. Trình tự các chuỗi polypeptide với
vị trí các amino acid thay thế được thể hiện màu đỏ như sau:
Bảng 1: Trình tự 5 chuỗi polypeptide được thiết kế
(Các amino acid màu đỏ là các amino acid được thay thế)
TT Tên Trình tự amino acid
1 Model1_a7 LVGIPGKRSE RFYECCKEPY PDVTFTVTMR
2 Model2_a7 LVGIVGKRSE RFDNCCKDEP HGDVTFTVTMR
3 Model3_a7 LVGIVGFRSH RFYECCKDEP HGDVTFTVTMR
4 Model4_a7 LVGIVGFRSH WVYECCKDEP HGDVTFTVTMR
5 Model5_a7 NKDIRGWRHH WVYTCCKDEP HGDVTFTVTMR

Luận văn thạc sĩ – K18 Học viên: Đinh Thị Lan
16

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. Vật liệu và trang thiết bị
- Ngân hàng dữ liệu protein www.rcsb.org
- Hệ thống máy tính Workstation tại Viện Công nghệ sinh học
- Phần mềm Discovery Studio 2.5 của hãng Accelrys (San Diego, CA, USA).
- Chủng E. coli DH5α [end A1 rec A1 hsd R17 sup E44 gyp A96 thi-1 relA1


lac U169 (

80 lacZM15)] được sử dụng làm thể nhận trong thí nghiệm biến
nạp, chọn dòng và nhân các plasmid.
- Chủng vi khuẩn E. coli BL21: [F-omp hsd SB(rBmB)gal dcm (DE3) plysS
(Caml)] được sử dụng là vật chủ cho biểu hiện gen.
- Plasmid pCR2.1 (hãng Invitrogen) được sử dụng để tách dòng và nhân dòng
gen.
- Plasmid pET22b(+) (hãng Novagen) được sử dụng làm vector biểu hiện.
- Máy móc thiết bị cần thiết: các máy móc cần thiết trong sinh học phân tử.
- Các hóa chất cần thiết trong sinh học phân tử được cung cấp bởi các hãng tin
cậy trên thế giới.
- Các dung dịch dùng trong điện di Tricine – SDS – PAGE.
- Dung môi được sử dụng cho tinh chế bằng HPLC gồm có: đệm A (0.1 % TFA
trong nước); đệm B (60 % Acetonitrile, 0.1 % TFA trong nước).
- Cột sử dụng cho mục đích tinh sạch bằng sắc ký HPLC là cột LC-18 của hãng
Supelcosil.

- Chuột BALB/c khỏe mạnh, từ 10-15 tuần tuổi.
- Nọc rắn hổ mang Naja kaouthia (Tiền Giang, Việt Nam).
Luận văn thạc sĩ – K18 Học viên: Đinh Thị Lan
17


Hình 4: Hệ thống sắc ký HPLC của Shimadzu, Japan
2.2. Phương pháp
2.2.1. Chương trình mô phỏng cấu trúc polypeptide
2.2.1.1. Nguyên lý phương pháp
Homology Modeling là một trong những công cụ hữu hiệu để xây dựng một
mô hình cấu trúc dựa trên đặc điểm tương đồng với các cấu trúc đã có sẵn. Công cụ
này thường được dùng để dự đoán cấu trúc không gian của một phân tử protein,
peptide bất kỳ với trình tự đã biết dựa trên cở sở về tỉ lệ tương đồng với các cấu trúc
đã biết. Công cụ này được tích hợp trong phần mềm Discovery Studio 2.5, là sự kết
hợp của một loạt các chương trình con như: DS Sequence Analysis, DS MODELER,
DS Protein Families, DS Validate Protein Structures. Thuật toán như CHARMm
được sử dụng như là một nền tảng cơ bản cho các tính toán trong nghiên cứu cấu
trúc. Các bước thường được tiến hành trong qui trình xây dựng mô hình cấu trúc
phân tử gồm có:
 Nhận dạng các tệp dữ liệu cấu trúc được sử dụng làm khuôn cho quá trình
mô hình hóa dựa vào công cụ BLAST Homology Search.
 So sánh cấu trúc của các tệp dữ liệu (dạng PDB) để tìm ra các vùng cấu trúc
tương đồng và trùng lặp bằng công cụ “Structure Alignment Methods”.
 So sánh trình tự của mô hình peptide cần thiết kế với tệp dữ liệu mang
thông tin đã được so sánh của các cấu trúc khuôn bằng công cụ “Sequence
Alignment Methods”.
 Sử dụng công cụ MODELER để xây dựng mô hình hóa cấu trúc.
Luận văn thạc sĩ – K18 Học viên: Đinh Thị Lan
18

Tùy thuộc vào độ tương đồng của đoạn trình tự cần thiết kế và đoạn trình tự
khuôn, chúng ta có thể lựa chọn các công cụ tìm kiếm với các thông số thiết lập khác
nhau để tìm ra cấu trúc khuôn chính xác nhất.
Một số lưu ý khi tiến hành nhận dạng trình tự khuôn và so sánh trình tự mô
hình với trình tự khuôn, phụ thuộc vào mức độ tương đồng giữa trình tự mô hình và
trình tự khuôn mà chúng ta sẽ sử dụng các phương pháp khác nhau để xác định:
- Khi tỉ lệ tương đồng giữa trình tự mô hình và trình tự khuôn lớn hơn 60%,
công cụ tìm kiếm BLAST có thể dễ dàng tìm kiếm và nhận dạng chính xác
trình tự khuôn cần thiết cho quá trình mô hình hóa.
- Khi tỉ lệ tương đồng giữa trình tự mô hình và trình tự khuôn nằm trong
khoảng từ 25-60%, công cụ BLAST vẫn có thể tìm kiếm và nhận dạng chính
xác trình tự khuôn cần thiết. Tuy nhiên, chúng ta phải thiết lập bổ sung một số
thông số cần thiết cho quá trình tìm kiếm nhằm loại bỏ các kết quả sai trong
quá trình tìm kiếm. Một kỹ thuật được sử dụng để tối ưu hóa kết quả quá trình
tìm kiếm trong trường hợp này là tạo một tệp dữ liệu tìm kiếm (sequence
profiles) sử dụng nguồn dữ liệu đã được chọn lọc.
- Khi tỉ lệ tương đồng giữa trình tự mô hình và trình tự khuôn thấp hơn 25%,
nên sử dụng phương pháp tìm kiếm lặp lại (PSI-BLAST) để nhận dạng trình
tự khuôn và tạo một tệp dữ liệu tìm kiếm (sequence profiles).
2.2.1.2. Tiến hành chạy “Build Homology Models”
- Kích hoạt chương trình “Build Homology Models” trong thư mục “Protein
Modeling” thuộc phần “Protocols Explorer”.
- Trong phần nhập các thông số dữ liệu “Parameters Explorer”, kích chuột vào
“Input Sequence Alignment” và chọn peptide_model_profile_sequence.
- Mở rộng khung nhập gữ liệu “Input Sequence Alignment”, kích chuột vào
“Input Model Sequence” và chọn peptide_model.
- Kích chuột vào “Input Template Structures” và chọn tất cả 4 hoặc 5 cấu trúc
được hiển thị.
- Trong mục “Optimization Level” có thể chọn Low hoặc High, tùy thuộc yêu

cầu.
- Kích “Run” trên thanh công cụ “Protocols toolbar” để tiến hành chạy chương
trình.